FI64953C - Foerfarande foer framstaellning av en rekombinant-dna-molekyl som innehaoller en foer tillvaexthormon kodande nukleotidsekvens och som kan anvaendas vid framstaellning av en tillvaexthormon producerande mikroorganism - Google Patents

Description

64953

Menetelmä kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän ja kasvuhormonia tuottavan mikro-organismin valmistuksessa käytettävän yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi 5

Jakamalla erotettu hakemuksesta 781675 Tämä keksintö koskee menetelmää kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän ja kasvuhormonia 10 tuottavan mikro-organismin valmistuksessa käytettävän yhdis-telmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että ! a) mRNA eristetään aivolisäkesoluista homogenoimal-15 la ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi 4-m guanidinium-tiosya-naatin ja 0,05...1,0-m jb -merkaptoetanolin seosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribonukleaasihajoamista ei tapahdu, 20 b) valmistetaan saadusta mRNA:sta sinänsä tunnetul la tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sellainen cDNA, jolla on kasvuhormonia koodaava nukleotidisek-venssi, ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistuskoh- 25 tasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä ) tunnetulla tavalla, jolloin restriktioenÖonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jälkeen cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, 30 d) avataan bakteerin plasmidivektori restriktio endonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla, esim. inkuboi-malla pH:ssa 7,6 37°C lämpötilassa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jolla on kohesiiviset päät, _ - V" 2 64953 e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek-torin 5'-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä es'imerkiksi alkalisella fosfataasilla pH:ssa 8,0 65°C lämpötilassa 30 minuutin ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset 5 päät eivät voi liittyä toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plas-midivektori ja kohdassa c) saatu cDNA sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, esim. pH:ssa 7,6 14°C lämpötilassa tunnin ajan, käyttäen 10 plasmidivektorin moolista ylimäärää, jotta saadaan kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä yhdistel-mä-DNA-molekyyli.

Tässä selityksessä käytetään seuraavia symboleja ja lyhenteitä: «f

15 DNA - deoksiribonukleiinihappo RNA - ribonukleiinihappo cDNA - komplementaarinen DNA

(syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sekvenssistä) mRNA - lähetti-RNA 20 tRNA - siirtäjä-RNA

dATP - deoksiadenosiinitrifosfaatti dTTP - deoksitymidiinitrifosfaatti dGTP - deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP - deoksisytidiinitrifosfaatti 25 A - adeniini T - tyrniini G - guaniini « C - sytosiini

Tris - 2-amino-2-hydroksietyyli-1,3-propaanidioli 30 EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo ATP - adenosiinitrifosfaatti TTP - tymidiinitrifosftaatti 3 64953 ί

Hind ΙΙΙ-tunnistuskohta - sekvenssi A •'AGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hind ΙΙΙ-endonukleaasin avulla Hsu I-tunnistuskohta - sekvenssi A lAGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hsu I-endonukleaasin avulla.

5 Hae III-tunnistuskohta - sekvenssi GG Ice, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae III-endonukleaasin avulla.

Col El - kolisiini El:ää muodostava plasmidi poly dA - polydeoksiadenylaatti 10 oligo flT, 0 ΊΟ - oligodeoksitymidylaatti (12-18

Iz “lo emästä)

Alu I-tunnistuskohta - sekvenssi AG ^CT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Alu I-endonukleaasin avulla.

BAm HI-tunnistuskohta - sekvenssi G ^GATCC, spesifisesti 15 lohkaistu nuolen Bam HI - endonukleaasin avulla.

Bgl I-tunnistuskohta - sekvenssi GCCNNNN ^NGGC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Bgl I-endonukleaasin avulla (Huom: N tarkoittaa nukleotidia).

Eco Rl-tunnistuskohta - sekvenssi G ^AATTC, spesifisesti 20 lohkaistu nuolen kohdalla Eco Rl-endonukleaasin avulla.

Eco RII-tunnistuskohta - sekvenssi icCAGG tai AcCTGG, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Eco RlI-endonukleaasin avulla.

Hae II-tunnistuskohta - sekvenssi AGCGcirT, AGCGC«tc, 25 GGCGC \^T tai GGCGcJ-C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae II-endonukleaasin avulla.

Hinc II-tunnistuskohta - sekvenssi GTTAAC, GTTGAC, GTCAAG tai GTCGAC, spesifisesti lohkaistu Hinc II-endonukleaasin avulla.

30 Pst I-tunnistuskohta - sekvenssi CTGCA *G , spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Pst I-endonukleaasin avulla.

Sal I-tunnistuskohta - sekvenssi G ^TCGAC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sal I-endonukleaasin avulla.

4 64953

Sst I - tunnistuskohta - sekvenssi GAGCT^C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sst I-endonukleaasin avulla.

DNA:n emässekvenssin biologinen merkitys on siinä, että se on geneettisen informaation säilytyspaikka. On 5 tunnettua, että DNA:n emässekvenssi on koodi, jonka mukaisesti kaikkien solun valmistamien proteiinien aminohappojen järjestys määräytyy. Lisäksi sekvenssin osilla saattaa olla tehtävänä säädellä proteiinin valmistusajankohtaa ja määrää. Säätely-yksiköiden luonne tunnetaan vaillinaisesti. 10 Kunkin säikeen emässekvenssiä käytetään templaattina, kun DNA replikoituu solunjakaantumisessa.

Tapa, jolla DNA:n emässekvenssi-informaatiota käytetään proteiinien aminohappojärjestyksen määräämiseen, on pääpiirteiltään sama kaikilla elävillä organismeilla.

15 On osoitettu, että jokainen proteiineissa tavallisesti esiintyvä aminohappo määräytyy yhden tai useamman trinukleo-tidin eli triplettisekvenssin mukaan. Näin ollen jokaista proteiinia varten on olemassa vastaava DNA-segmentti, joka sisältää proteiinin aminohappojärjestystä vastaavan 20 triplettisekvenssin. Geneettinen koodi on esitetty seu-raavassa taulukossa.

Geneettinen koodi

Fenyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

25 Isoleusiini (Ile) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiinihappo (Asp) GAK

Seriini (Ser) QRS Glutamiinihappo (Glu) CAJ

Proliini (Pro) CCL Kysteiini (Cys) TGK

30 Treoniini (Thr) ACL Tryptofaani (Try) TGG

Alaniini (Ala) GCL Arginiini (Arg) WGZ

Tyrosiini (Tyr) TAK Glysiini (Gly) GGL

Päätesignaali TAJ

Päätesignaali TGA

35 Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti tarkoittaa DNA:n trinukleotidia, jossa on 5'-pää vasemmalla ja 3’-pää 64953 oikealla; kirjaimet edustavat puriini- ja pyrimidiiniemäk-siä, joista nukleotidisekvenssi muodostuu.

A = adeniini G = guaniini 5 C = sytosiini T = tyrniini

X = T tai C, jos Y on A tai G X = G, jos Y on C tai T Y = A, G, C tai T, jos X on C 10 Y - A tai G, jos X on T

W = C tai A, jos Z on A tai G W = C, jos Z on C tai T Z = A, G, C tai T, jos V on C Z = A tai G, jos VJ on A 15 QR = TC, jos S on A, G, C tai T

QR = AG, jos S on T tai C S = A, G, C tai T, jos QR, on TC S = T tai C, jos QR on AG J = A tai G 2 0 K = T tai C

L = A, T, C tai G M = A, C tai T

Transkriptioksi nimitetään ensimmäistä vaihetta siinä biologisessa prosessissa, jolla nukleotidisekvenssi-25 informaatio muunnetaan aminohapposekvenssiksi. Tässä vaiheessa kopioidaan ensin RNA:11a se DNA-segmentti, jonka sekvenssi määrittelee valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksi-riboosi on korvattu riboosilla ja tymiinin tilalla käyte-30 tään urasiilia. RNA:n emäkset voivat asettua samanlaisiksi emäspareiksi kuin DNA:n emäkset. Näin ollen DNA-nukleo-tidisekvenssin RNA-transskriptio on komplementaarinen kopioitavan sekvenssin kanssa. Tällainen RNA on nimeltään lähetti-RNA (mRNA), koska sen tehtävänä on toimia välittä- T— 64953 jänä solun geneettisen järjestelmän ja proteiineja syntetisoivan järjestelmän välillä.

Solun sisällä käytetään mRNA:ta templaattina siinä monimutkaisessa prosessissa, johon sisältyy lukuisia entsyy-5 mejä ja solujärjestelmiä, ja joka johtaa tietyn aminohappo-sekvenssin syntymiseen. Tätä prosessia nimitetään mRNA:n translaatioksi.

Usein esiintyy myös lisävaiheita, joissa translaatio-prosessissa syntetisoitu aminohapposekvenssi muunnetaan funk-10 tionaaliseksi proteiiniksi.

Monet lääketieteen tai tutkimuksen kannalta merkittävät proteiinit sijaitsevat korkeampien organismien, kuten selkärankaisten, soluissa tai ovat näiden solujen valmistamia. Näitä ovat mm. peptidihormonit, kuten kasvuhormoni.

15 Näitä proteiineja on usein vaikea eristää käyttö kelpoisia määriä, ja tämä ongelma on varsin vaikea ihmisistä peräisin olevien proteiinien kohdalla. Näin ollen tarvitaan menetelmiä, joilla tällaisia proteiineja voidaan valmistaa riittäviä määriä soluissa organismien ulkopuolella.

20 Tietyissä tapauksissa on mahdollista saada aikaan sopivia solulinjoja, joita voidaan pitää elossa kudosviljelyteknii-kalla. Kudosviljely on kuitenkin hidasta, elatusaine kallista, olosuhteiden säätely tarkkaa ja saanto pieni. Lisäksi on usein vaikeata säilyttää solulinja vakiona siten, että 25 halutut erityisominaisuudet säilyvät.

Sitä vastoin mikro-organismeja, kuten bakteereja, on suhteellisen helppo viljellä kemiallisesti määritellyissä elatusaineissa. Fermentointitekniikka on pitkälle kehittynyttä. Organismien viljeleminen nopeasti ja suurilla saan-30 noilla on mahdollista. Lisäksi eräät mikro-organismit ovat geeniensä ja ominaisuuksiensa puolesta perusteellisesti tutkittuja ja tunnettuja.

7 64953 Näin ollen on erittäin toivottavaa pystyä siirtämään lääketieteellisesti merkittävän proteiinin geneettinen koodi organismista, joka tavallisesti tekee proteiinin, sopivaan mikro-organismiin. Tällä tavalla mikro-organismi voi 5 syntetisoida proteiinia säädellyissä kasvuolosuhteissa ja proteiinia voidaan saada haluttu määrä. Valmistuskustannuksia voidaan ehkä myös oleellisesti pienentää, jos proteiinia syntetisoidaan tällaisella menetelmällä. Lisäksi mahdollisuus eristää ja siirtää tietyn proteiinin valmistuksen 10 määrittelevä geneettinen sekvenssi mikro-organismiin, jonka geneettinen tausta tunnetaan hyvin, tarjoaa suuriarvoisen tutkimuskeinon, kun halutaan tietää kuinka tämän proteiinin synteesi on säädelty ja kuinka proteiinia muokataan synteesin jälkeen. Geneettisiä sekvenssejä voidaan myös muuntaa 15 niin, että saadaan terapeuttisilta tai funtionaalisilta ominaisuuksiltaan muuntuneita proteiineja.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä on monivaiheinen menetelmä, joka sisältää entsyymien katalysoimia reaktioita. Näiden entsyymireaktioiden luonnetta selostetaan tähän men-20 nessä tiedossa olevien seikkojen perusteella.

Käänteistransskriptaasi (DNA-polymeraasi) katalysoi RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesiä RNA-templaatin, DNA-templaatin ja neljän deoksinukleosi-ditrifosfaatin, dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, läsnäollessa. Reak-25 tio lähtee käyntiin DNA-templaatin ei-kovalenttisella sitoutumisella mRNA:n 3'-päähän ja sen jälkeen seuraa tarvittavien deoksinukleotidien asteittainen liittäminen kasvavan ketjun 3'-päähän mRNA-nukleotidisekvenssin määritteleminä emäspareina. Saatua molekyyliä voidaan pitää hiusneu-30 larakenteena, joka sisältää alkuperäisen RNA:n 64953 liittyneenä yksittäisellä DNA-säikeellä komplementaariseen DNA-säikeeseen. Käänteistransskriptaasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä DNA-templaattia, jolloin saatu tuote on kaksisäikeinen 5 DNA-hiusneula, jonka toisessa päässä säikeitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972) ja Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.F. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).

Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka pys-10 tyvät hydrolysoimaan fosfodiesterisidoksia kaksisäikeises-sä DNA:ssa niin, että DNA-säikeeseen muodostuu katkoskohta. Jos DNA on suljetun silmukan muotoinen, silmukan rakenne muuttuu lineaariseksi. Tämän tyyppisen entsyymin pääasiallinen ominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vai-15 kutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tätä sekvenssiä nimitetään restriktio-endonukleaasin tunnistuskohdaksi. Restriktioendonukle-aaseja on eristetty useista eri lähteistä ja karakterisoitu tunnistuskohtansa nukleotidisekvenssin perusteella.

20 Eräät restriktioendonukleaasit hydrolysoivat fosfodiesteri-sidokset samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää. Eräät katalysoivat sellaisten sidosten hydrolyysiä, joita erottaa toisistaan muutama nukleotidi, ja molekyylin kumpaankin päähän syntyy vapaa yksisäikeinen 25 alue. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomplementaa-risia ja siten kohesiivisia, ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenliittämiseen. Koska tietyn entsyymin voidaan ennustaa pilkkovan saman tunnistuskoh-dan omaavia DNA-molekyylejä, syntyy samat kohesiiviset 30 päät, ja näin ollen on mahdollista yhdistää restriktio- endonukleaasilla käsiteltyjä heterologisia DNA-sekvenssejä muihin samalla tavalla käsiteltyihin sekvensseihin, ks. Roberts, R.J. Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Hestrik-tiokohdat ovat kuitenkin melko harvinaisia, mutta restriktio- n 9 64953 endonukleaasien käyttökelpoisuutta on voitu parantaa syntetisoimalla sellaisia kaksisäikeisiä oligonukleotideja, joissa on tunnistuskohtasekvenssi. Näin ollen voidaan melkeinpä mikä tahansa DNA-segmentti liittää mihin tahansa 5 toiseen segmenttiin siten, että molekyylin päihin liitetään tarvittava restriktio-oligonukleotidi, tuote asetetaan tarvittavan restriktioendonukleaasin vaikutukselle alttiiksi,niin että syntyy tarvittavat kohesiiviset päät, k.s Heyneker, H.L., Shine, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W., 10 Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. ja Riggs, A.D., Nature 263, 748 (1976) ja Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H. W. , Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Sl-endonukleaasi on yleisentsyymi, joka kykenee 15 hydrolysoimaan yksisäikeisen DNA:n fosfodiesterisidoksia tai kaksisäikeisessä DNA:ssa olevia yksisäikeisiä liitoskohtia, ks. Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

DNA-ligaasi on entsyymi, joka kykenee katalysoimaan fosfodiesterisidoksen syntymisen kahden sellaisen DNA-seg-20 mentin välille, joissa on 5'-fosfaatti ja 3’-hydroksyyli, vastaavasti, ja jollainen saattaa muodostua kahdesta DNA-fragmentista, joita kohesiiviset päät pitävät yhdessä. Entsyymin normaalina toimintatapana pidetään sitä, että se yhdistää toisen säikeen rinnalle syntyvät useat tytär-DNA-25 fragmentit toisiinsa. DNA-ligaasi voi kuitenkin sopivissa olosuhteissa katalysoida sellaisten tylppien päiden yhtymisen, joissa kaksi tylppäpäistä molekyyliä yhtyy kovalent-tisesti, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 67, 1468 (1970).

30 Alkalinen fosfataasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan fosfaattiestereitä, DNA:n 5'-päätefosfaatit mukaanluettuina.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän osavaiheessa sijoitetaan tietty DNA-fragmentti DNA-vektoriin, kuten 35 plasmidiin. Plasmidi on nimitys, jota käytetään mistä tahansa Itsenäisesti repiikoituvasta DNA-yksiköstä, joka on ___ -· r~ 10 64953 mikrobisolussa eikä kuulu isäntäsolun oinaan genomiin. Plasrai-di ei ole geneettisesti sitoutunut isäntäsolun kromosomiin. Plasmidi-DNA esiintyy rengasmaisina kaksisäikeisinä molekyyleinä, joiden molekyylipaino tavallisesti on muutama miljoo- g 5 na, joidenkin jopa yli 10 , ja ne edustavat tavallisesti vain pientä prosenttimäärää solun kokonais-DNA:sta. Plasmidi-DNA voidaan tavallisesti suuren kokonsa vuoksi erottaa isäntäsolun DNAtsta. Plasmidit voivat replikoitua isäntäsolun jakaan-tumisnopeudesta riippumatta ja joskus niiden jakaantumisno-10 peutta voidaan säädellä kasvuolosuhteita muuttamalla. Vaikka plasmidi esiintyykin suljettuna renkaana, siihen voidaan keinotekoisesti liittää DNA-segmentti niin, että syntyy molekyy-lipainoltaan suurempi rekombinoitu plasmidi, jonka replikoi-tumiskyky ja geenien ekspressiokyky eivät ole oleellisesti 15 muuttuneet. Näin ollen plasmidi toimii hyödyllisenä vektorina, joka siirtää DNA-segmentin uuteen isäntäsoluun. Rekombi-noitua DNA:ta käyttävään teknologiaan soveltuvia plasmideja ovat varsinkin sellaiset, jotka sisältävät valintatarkoituk-siin sopivia geenejä, kuten geenejä, jotka aiheuttavat lääke-20 aineiden vastustuskykyä.

Kyky siirtää tietyn korkeamman organismin normaalille aineenvaihdunalle välttämättömän proteiinin geneettinen koodi mikro-organismiin, kuten bakteeriin, avaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien tuottamiselle 25 viljelemällä. Tämä taas tarjoaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien määrän lisäämiselle tai korvaamiselle sellaisilla proteiineilla, jotka on valmistettu transformoiduilla mikro-organismeilla, kun korkeamman organismin kyky tuottaa tällaisia proteiineja on puutteellinen, ja voi- 11 64953 daan ajatella esimerkiksi mahdollisuutta saada aikaan symbioottinen suhde tämän keksinnön avulla syntetisoidun mikro-organismin ja kroonista tai äkillistä puutostautia sairastavan ihmisen välille, jolloin tässä selostetulla tavalla 5 geneettisesti transformoitu mikro-organismi siirrostettai-siin tai muulla tavalla liitettäisiin ihmiseen kompensoimaan ihmisen aineenvaihdunnassa ilmenevää patologista puutteellisuutta.

Esimerkkeinä tähän keksintöön kuuluvista spesifi-10 sistä DNA-sekvensseistä siirretään rotan kasvuhormonin ja ihmisen kasvuhormonin rakennegeeni bakteeriin.

Kyseisessä prosessissa haluttu solukko eristetään ensin parannetulla menetelmällä. mRNA eristetään soluista muuttumattomana uudella menetelmällä, jossa RNA-aasi-15 aktiivisuus on käytännöllisesti katsoen kokonaan hävitetty. Vahingoittumaton mRNA puhdistetaan uutteesta pylväs-kromatografisesti ja se saatetaan käänteistransskriptaasi-entsyymin vaikutukselle alttiiksi komplementaarisen säikeen (cDNA) syntetisoimisessa tarvittavien neljän 20 deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Tässä ensimmäisessä vaiheessa käänteistransskriptaasinavulla saatuun tuotteeseen kohdistetaan menettely, jolla ribonukleotidi-sekvenssi poistetaan selektiivisesti. Jäljelle jäänyttä deoksinukleotidisekvenssiä, joka on komplementaarinen al-25 kuperäisen mRNA:n kanssa, inkuboidaan toisessa reaktiossa käänteistransskriptaasin tai DNA-polymeraasin kanssa neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Saatu tuote on kaksinkertainen cDNA, jonka komplementaariset säikeet ovat liittyneet toisiinsa yksinkertaisella säikeellä toi-30 sesta päästä. Siten tämä tuote käsitellään yksinkertaiselle 12 64953 säikeelle spesifisellä nukleaasilla, joka katkaisee yksinkertaisen yhdistävän säikeen. Saatua kaksisäikeistä cDNA:ta pidennetään lisäämällä kumpaankin päähän tietty DNA, joka sisältää restriktioentsyymin tunnistuskohdan sekvenssin.

5 Lisäys katalysoidaan DNA-ligaasi-entsyymillä. Tämän jälkeen pidennetty cDNA käsitellään restriktioendonukleaasilla, joka tuottaa itsekomplementoituvat yksisäikeiset päät kaksois-säikeen kummankin säikeen 5'-päähän.

Plasmidi-DNA, jossa on saman restriktioendonukleaasin 10 tunnistuskohta, käsitellään entsyymillä siten, että polynukleotidisäie katkeaa ja muodostuu itsekomplementoituvat yksisäikeiset nukleotidisekvenssit 5'-päihin. Yksisäi-keisten päiden 5’-päätefosfaattiryhmät poistetaan, jotta plasmidi ei pystyisi muodostamaan isäntäsolua transformoi-15 vaa rengasrakennetta. Valmistettua cDNArta ja plasmidi-DNA:ta inkuboidaan yhdessä DNA-ligaasin läsnäollessa. Kuvatuissa reaktio-olosuhteissa voi elinkelpoinen suljettu rengasplasmidi-DNA syntyä vain, jos siihen sisältyy cDNA-seg-mentti. cDNA-sekvenssin sisältävä plasmidi siirretään tä-20 män jälkeen sopivaan isäntäsoluun. Sellaiset solut, jotka ovat saaneet elinkelpoisen plasmidin, tunnistetaan kasvatuksessa pesäkkeistä, joilla on plasmidille kuuluva geneettinen ominaisuus, kuten lääkkeenvastustuskyky. Tämän jälkeen viljellään niitä puhtaita bakteerikantoja, joissa on cDNA-25 sekvenssin sisältävä rekombinoitu plasmidi, ja rekombinoitu plasmidi eristetään uudelleen. Tällä tavalla voidaan valmistaa suuria määriä rekombinoitua plasmidi-DNA:ta ja spesifinen cDNA-sekvenssi voidaan eristää tästä endonukleolyyt-tisellä lohkaisulla sopivan restriktioentsyymin avulla.

Il 13 64953 Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla tietyn nukleo-tidisekvenssin omaava DNA-molekyyli voidaan eristää ja siirtää mikro-organismiin ja alkuperäinen DNA:n nukleotidisek-venssi löytää replikoitumisen jälkeen organismista, ja jonka 5 menetelmän eri vaiheet voidaan jakaa neljään ryhmään: 1. Halutun solukon eristäminen korkeammasta organismista

Tietyn proteiinin geneettiselle koodille on olemassa kaksi mahdollista lähdettä, nimittäin lähdeorganismin DNA 10 tai DNA:n RNA-transskriptio. Yhdysvaltain kansallisten ter-veysinstituuttien (National Institutes of Health) tämänhetkisten turvallisuusvaatimusten mukaan ihmisen geenejä, olivatpa ne millaisia tahansa, voidaan sijoittaa rekombinoituun DNA:han ja sen jälkeen bakteereihin vain silloin, kun geenit 15 ovat perusteellisesti puhdistettuja, tai kun käytössä on erityisen suuria riskejä sisältävälle työskentelylle tarkoitetut tilat (P4), ks. Federal Register, Voi. 41, No. 131, 1967-07-07, ss. 27902 - 27943. Näin ollen missä tahansa ihmisen proteiinin valmistukseen tähtäävässä menetelmässä, ku-20 ten tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä, on lähdettävä sellaisen spesifisen mRNA:n eristämisestä, joka sisältää halutun proteiinin koodin. Tässä toimintatavassa on lisäksi se etu, että solusta uutettu mRNA voidaan puhdistaa helpommin kuin solusta uutettu DNA. Varsinkin on mahdollista käyt-25 tää hyväkseen sitä seikkaa, että pitkälle erikoistuneissa organismeissa, kuten selkärankaisissa, on tietyissä paikoissa tiettyjä solukkoja, joiden tehtävänä on tuottaa jotakin kyseeseen tulevaa proteiinia. Vaihtoehtoisesti tällainen solukko voi esiintyä jossakin organismin kehitysvaiheessa.

30 Suurin osa tällaisen solukon soluista eristetystä mRNA:sta sisältää halutun nukleotidisekvenssin. Näin ollen 14 64953 eristettävän solukon ja eristysmenetelmän valinnassa voidaan ottaa huomioon ne edut, joita eristettävän mRNA:n alkuperäinen puhtausaste tarjoaa.

Useimmissa kudoksissa, rauhasissa ja elimissä solu-5 ja yhdistää kuituinen sidekudos, joka on koostunut pääasiassa kollageenista, mutta voi kudoksesta riippuen sisältää myös muita rakenneproteiineja,polysakkarideja ja kivennäis-ainevarastoja. Solujen eristäminen tietystä kudoksesta edellyttää menetelmiä, joilla solut voidaan irrottaa sidekudok-10 sesta. Tietyn erikoistuneen solutyypin eristäminen ja puhdistaminen sisältää näin ollen kaksi päävaihetta, jotka ovat solujen erottaminen sidekudoksesta ja halutun solutyypin erottaminen muun tyyppisistä kudoksen soluista. Tämän keksinnön sisältämiä menetelmiä voidaan soveltaa monenlaisista 15 kudoksista saatavien erityyppisten solujen eristämiseen.

Usein on todettu, että halutun mRNA:n osuutta voidaan lisätä käyttämällä hyväksi solun kykyä reagoida ulkoisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi hormonikäsittely saattaa aiheuttaa halutun mRNA:n tuotannon lisääntymisen. Muita mene-20 telmiä ovat viljely tietyssä lämpötilassa ja/tai tietyssä ravinteessa tai muussa kemiallisessa aineessa. Eristettäessä rotan kasvuhormonin mRNA:ta viljeltyjen rotan aivolisäke-solujen käsittely kilpirauhashormonilla ja glukokortikoideil-la lisäsi synergisesti kasvuhormonin mRNA:n määrää merkittä-25 västi.

2. mRNA:n uuttaminen Tärkeä piirre tässä keksinnössä on se, että solu-uutteesta poistetaan RN-aasiaktiivisuus käytännöllisesti katsoen kokonaan. Uutettava mRNA on yksisäikeinen polynuk-30 leotidi, jossa ei ole mitään komplementaarista säiettä. Näin ollen yhdenkin fosfodiesterisidoksen hydrolyyttinen katkeaminen sekvenssissä tekisi koko molekyylin kykenemättömäksi siirtämään vahingoittumatonta geneettistä sekvenssiä mikro-

II

15 64953 organismiin. Kuten edellä mainittiin, RN-aasi on laajalle levinnyt ja se on hyvin aktiivinen ja poikkeuksellisen pysyvä. Sitä on iholla, se kestää tavalliset lasitavaroiden pesumenetelmät ja joskus kontaminoi orgaaniset kemikaalit.

5 Tässä keksinnössä käytetään kaotrooppisen anionin, kaotrooppisen kationin ja disulfidisidoksia pilkkovan rea-genssin yhdistelmää solujen rikkomisen aikana ja kaikkien niiden operaatioiden aikana, jotka tarvitaan käytännöllisesti katsoen proteiinittoman RNA:n aikaansaamiseksi.

10 Sopivien kaotrooppisten ionien valinta riippuu nii den vesiliukoisuudesta ja saatavuudesta. Sopivia kaotrooppi-sia anioneja ovat mm. guanidinium, karbamoyyliguanidinium, guanyyliguanidinium, litium tms. Sopivia kaotrooppisia anioneja ovat mm. jodidi, perkloraatti, tiosyanaatti, dijodi-15 salisylaatti tms. Tällaisten anionien ja kationien muodostamien suolojen suhteellinen tehokkuus määräytyy niiden liukoisuuden mukaan. Esimerkiksi litiumdijodisalisylaatti on voimakkaampi denaturantti kuin guanidiniumtiosyanaatti, mutta sen liukenvuus on vain noin 0,1 M ja se on myös suhteellisen 20 kallista. Guanidiniumtiosyanaatti on etusijalle asetettava kationi-anioniyhdistelmä, koska sitä on helposti saatavissa ja sen liukenevuus vesiliuoksiin on hyvä, jopa noin 5 mol/1.

Tioliyhdisteiden, kuten /S-merkaptoetanolin, tiedetään rikkovan tioli-disulfidivaihtoreaktiolla proteiinien 25 molekyylinsisäisiä disulfidisidoksia. /S-merkaptoetanolin lisäksi tunnetaan useita sopivia tioliyhdisteitä, kuten di-tiotreitoli, kysteiini, propanolidimerkaptaani tms. Vesiliukoisuus on tarpeellinen vaatimus, sillä tioliyhdistettä pitää olla läsnä suuri ylimäärä molekyylinsisäisiin disul-30 fideihin verrattuna, jotta vaihtoreaktio tapahtuisi käytännöllisesti katsoen täydellisesti,/S-merkaptoetanoli on asetettava etusijalle, koska sitä on helposti saatavissa kohtuulliseen hintaan.

Tietyn kaotrooppisen suolan tehokkuus on suoraan ver-35 rannollinen sen väkevyyteen, kun halutaan inhiboida RN-aasi uutettaessa RNA:ta soluista tai kudoksista. Edullinen väkevyys

______ TTT

16 64953 on sen vuoksi suurin käytännössä toteutettavissa oleva väkevyys. Sen, että tässä keksinnössä onnistutaan säilyttämään mRNA vahingoittumattomana uuton aikana, arvellaan johtuvan siitä nopeudesta, jolla RN-aasi denaturoituu, ja denaturoitu-5 misasteesta. Näin ilmeisesti selittyy guanidiniumtiosyanaatin paremmuus hydrokloridiin nähden, vaikka hydrokloridi on dena-turointiaineena vain hieman heikompi. Denaturointiaineen tehokkuus määritellään siksi kynnysväkevyydeksi, joka tarvitaan proteiinin täydelliseen denaturoimiseen. Toisaalta proteiinien 10 denaturoitumisnopeus riippuu usein denaturantin väkevyyden suhteesta kynnysarvoon 5-10 potenssiin korotettuna, ks. Tan-ford, C. A., Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968). Kvalitatiivisesti tämä suhde merkitsee sitä, että guanidiumhydrokloridia vain hieman tehokkaampi denaturantti pystyy denaturoimaan proteii-15 nin monta kertaa nopeammin samana konsentraationa. RN-aaside-naturaation kinetiikan ja mRNA:n säilymisen välistä suhdetta soluista tapahtuvan uuton aikana ei nähtävästi ole havaittu eikä tutkittu ennen tätä keksintöä. Jos edellä oleva analyysi on oikea, pitäisi edullisen denaturantin olla sellainen, jolla 20 on matala kynnysväkevyys denaturoinnissa ja suuri vesiliukoisuus. Tämän vuoksi guanidiniumtiosyanaatti on edullisempi kuin litiumdijodisalisylaatti, vaikka viimeksimainittu on voimakkaampi denaturantti, sillä guanidiniumtiosyanaatti on liukoi-sempi, ja näin ollen sitä voidaan käyttää sellaisena väkevyy-25 tenä, että RN-aasi inaktivoituu nopeammin. Edellä oleva analyysi selittää myös, miksi guanidiniumtiosyanaatti on edullisempi kuin lähes yhtä liukoinen hydrokloridi (syanaatti on hieman voimakkaampi denaturantti kuin hydrokloridi).

Disulfidisidoksia katkaisevan reagenssin käyttö yhdessä 30 denaturantin kanssa tekee mahdolliseksi jälkimmäisen vaikutuksen ja tehostaa sitä, koska RN-aasimolekyyli muuttuu kokonaan avautuneeksi. Tioliyhdisteen ajatellaan auttavan denatu-rointiprosessin etenemistä, koska se estää nopean denaturoin-nin, joka voi tapahtua, jos molekyylinsisäiset disulfidisidok-35 set jätetään koskemattomiksi. Lisäksi mRNA-valmisteen sisältämä RN-aasi epäpuhtaus säilyy käytännöllisesti katsoen inaktiivisena, vaikka denaturanttia ja tiolia ei olisikaan läsnä. Disulf idisidoksia katkaisevat reagenssit, joissa on tioliryhmiä, 17 64953 ovat jossain määrin tehokkaita minä tahansa konsentraationa, mutta on edullista käyttää suurta tioliryhmien ylimäärää mo-lekyylinsisäisiin disulfidisidoksiin verrattuna, jolloin vaih-toreaktio saadaan ajetuksi molekyylinsisäisten disulfidisidos-5 ten katkeamisen suuntaan. Toisaalta, koska monet tioliyhdis-teet ovat pahanhajuisia ja suurten väkevyyksien kanssa on epämiellyttävä työskennellä, on käytännön syistä olemassa väkevyyden yläraja. Kun /^-merkaptoetanolia käytetään vahingoittumattoman RNA:n erottamiseen, on alueella 0,05 - 1,0 M 10 olevat väkevyydet havaittu tehokkaiksi, ja optimaalisen väkevyyden katsotaan olevan 0,2 M.

Väliaineen pH voi olla missä tahansa välillä 5,0 - 8,0, kun mRNA uutetaan soluista.

Solujen rikkomisen jälkeen RNA erotetaan solun prote-15 iineista ja DNA:sta. Tähän tarkoitukseen on kehitetty useita menetelmiä.

Tavallinen käytetty menetelmä on etanolisaostus, jolla RNA saostetaan selektiivisesti. Tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä on edullisempaa jättää saostusvaihe pois ja 20 kerrostaa homogenaatti suoraan 5,7 M cesiumkloridiliuokseen sentrifugiputkessa ja sen jälkeen suorittaa sentrifugointi julkaisussa Glisin, V., Crvenjakov R. ja Byus, C., Biochemistry 13, 2633 (1974) kuvatulla tavalla. Tämä menetelmä on edullinen, koska RN-aasille vahingollinen ympäristö voidaan säi-25 lyttää koko ajan ja saadaan hyvällä saannolla RNA:ta, joka ei sisällä DNA:ta eikä proteiinia.

Edellä kuvatulla menetelmällä saadaan soluhomogenaatin koko RNA puhdistetuksi. Tästä RNA:sta on kuitenkin haluttua mRNA:ta vain osa. Puhdistusta jatkettaessa käytetään hyväksi 30 sitä seikkaa, että korkeampien organismien mRNA:ta prosessoidaan transskription jälkeen siten, että siihen liitetään poly-adenyylihappoa. Tällainen poly-A-sekvenssejä sisältävä mRNA voidaan erottaa selektiivisesti kromatografiapylväässä, jossa on täytteenä selluloosaa, johon on liitetty oligotymidylaattia, 35 ks. Avis, H. ja Leder, P. edellä. Edellä kuvattu menetelmä sopii silloin,kun tarvitaan käytännöllisesti katsoen puhdasta, vahingoittumatonta ja translaatiokelpoista mRNA:ta RN-aasia 64953 18 Γ runsaasti sisältävistä lähteistä. mRNA:n puhdistus ja sen jälkeiset in vitro-toimenpiteet voidaan suorittaa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla mille tahansa mRNA:lie huolimatta lähde-organismista.

5 Tietyissä tapauksissa, kuten käytettäessä kudosviljel- mäsoluja mRNA-lähteenä, RN-aasiepäpuhtaus voi olle niin vähäinen, ettei edellä kuvattua RN-aasin inhibointia tarvita. Tällöin ennestään tunnetut RN-aasiaktiivisuuden poistomenetelmät riittävät.

10 3. cDNA:n muodostaminen Tässä yhteydessä viitataan kuvioon 1, jossa on kaavio-esitys menetelmän jäljellä olevista vaiheista. Ensimmäisenä vaiheena on puhdistetun mRNArn kanssa komplementaarisen DNA-sekvenssin muodostaminen. Tämän reaktion entsyymiksi valitaan 15 käänteistransskriptaasi, vaikka periaatteessa voitaisiin käyttää mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka kykenee muodostamaan komplementaarisen DNA-säikeen käyttämällä mRNA:ta templaattina. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa siten, että mRNA:ta käytetään templaattina ja neljän deoksinuk-20 leosiditrifosfaatin seosta DNA-säikeen prekursorina. On edullista, jos yksi deoksinukleosiditrifosfaateista on merkitty <Z-32 asemassa P-atomilla, sillä sen avulla voidaan seurata reaktiota, se toimii merkkinä erotusmenetelmissä, kuten kromatogra-fiässä ja elektroforeesissa, ja sen avulla voidaan tehdä kvan-25 titatiivisia päätelmiä, ks. Efstratiadis, A., et ai.,edellä.

Kuten kuvasta ilmenee, käänteistransskriptaasin reaktio-tulos on kaksisäikeinen hiusneularakenne, jossa RNA-säiettä ja DNA-säiettä yhdistää toisiinsa ei-kovalenttinen sidos.

Käänteistransskriptaasireaktion tuote poistetaan reak-30 tioseoksesta tunnetuilla menetelmillä. On havaittu hyödylliseksi käyttää fenoliuuton, kromatografiän ("Sephadex G-100", Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja etanoliuuton yhdistelmää.

Kun cDNA on syntetisoitu entsymaattisesti, RNA-templaat-ti voidaan poistaa. Ennestään tunnetaan useita menetelmiä, joil-35 la RNA voidaan hajottaa selektiivisesti DNA:n läsnäollessa.

Aikai inen hydrolyysi on edullinen menetelmä, koska se on hyvin selektiivinen ja sitä voidaan hyvin helposti säädellä pH:n avulla.

32

Alkalisen hydrolyysin ja neutraloinnin jälkeen P:llä merkitty 19 64953 cDNA voidaan haluttaessa väkevöidä etanolisaostuksella.

Tällaisen kaksisäikeisen hiusneula-cDNAtn syntetisointi tapahtuu sopivan entsyymin, kuten DNA-polymeraasin tai kään- teistransskriptaasin avulla. Reaktio-olosuhteet ovat aikaisem- 32 5 min kuvatun kaltaiset, Ptllä merkitty nuklosiditrifosfaat-ti mukaanluettuna. Käänteistransskriptaasia saadaan useista lähteistä. Linnun myeloblastosis-virus on edullinen lähde. Virusta valmistaa tri D. J. Beard, Life Sciences Incorporated,

St. Petersburg, Florida, National Institutes of Health'in kansio sa tekemällään sopimuksella.

Kun cDNA-hiusneula on muodostettu, saattaa olla edullista puhdistaa se reaktioseoksesta. Kuten aikaisemmin mainittiin, on havaittu edulliseksi käyttää fenoliuuttoa, kromatografiaa ("Sephadex G-100") ja etanolisaostusta, kun DNA halutaan saada 15 puhdistetuksi proteiiniepäpuhtauksista.

Hiusneularakenne voidaan muuntaa tavalliseksi kaksisäi-keiseksi DNA-rakenteeksi siten, että komplementaarisia säikeitä yhdistävä yksittäinen säie poistetaan. On olemassa useita entsyymejä, jotka kykenevät spesifisesti hydrolysoimaan DNA:n yk-20 sisäikeisiä osia. Tähän tarkoitukseen hyvin sopiva entsyymi on Aspergillus oryzaesta eristetty S1-nukleaasi (valmistaja Miles Research Products, Elkhart, Indiana). Kun DNA-hiusneularaken-ne käsitellään S1-nukleaasilla, saadaan hyvällä saannolla sellaisia molekyylejä, joissa on emäsparipäät. Tämän jälkeen suo-25 ritetaan uutto, kromatografia ja etanolisaostus, kuten edellä on kuvattu. Efstratiadis et ai. ovat edellä mainitussa julkaisussa selostaneet mRNA:n kaksisäikeisten cDNA-transskriptioi-den syntetisointia käänteistransskriptaasin ja S1-nukleaasin avulla.

Tylppäpäisten cDNA-molekyylien osuutta voidaan mahdolli-30 sesti lisätä, jos suoritetaan käsittely E. colin DNA-polyme-raasi I:llä neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Entsyymin eksonukleaasiaktiivisuuden ja polymeraasiaktiivisuu-den yhteisvaikutus toimii siten, että ulkoneva 3'-pää poistuu ja ulkoneva 5'-pää täyttyy. Näin voidaan varmistaa, että mah-35 dollisimman suuri määrä cDNA-molekyylejä osallistuu seuraavan vaiheen liittämisreaktioihin.

Keksinnön sisältämän menetelmän seuraavassa vaiheessa käsitellään cDNA-tuotteen päät niin, että kuhunkin päähän saadaan restrik- 20 64953 tioendonukleaasin tunnistuskohdan sekvenssi. Käytännön syyt määräävät päihin liitettävän DNA-fragmentin valinnan. Päihin lisättävä sekvenssi valitaan restriktioendonukleaasin perusteella ja tämä puolestaan valitaan sen DNA-vektorin perusteel-5 la, johon cDNA liitetään. Valittavassa plasmidissa pitäisi olla vähintään yksi kohta, johon restriktioendonukleaasin kat-kaisuvaikutus voi kohdistua. Esimerkiksi plasmidi pMB9 sisältää yhden tunnistuskohdan entsyymille Hind III. Hind III eristetään Haemophilus influenzaesta ja puhdistetaan seuraavalla 10 menetelmällä: Smith, H. O. ja Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51, 379 (1970). Haemophilus aegyptious-organismin entsyymi Hae III puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchison III, C. A., J. Virol. 10, 42 (1972). Haemophilus suis-organismin entsyymi, Hsu I, katalysoi saman paikka-15 spesifisen hydrolyysin samassa tunnistuskohdassa kuin Hind III. Näin ollen näitä kahta entsyymiä voidaan pitää funktionaalises-ti vaihtoehtoisina.

Kaksois-cDNA:n päihin liittämistä varten on edullista käyttää kemiallisesti syntetisoitua kaksisäikeistä dekanukleo-20 tidia, joka sisältää Hind III:n tunnistuskohdan. Kaksisäikei-sen dekanukleotidin sekvenssi on esitetty kuvassa 1, ks. Hey-neker, H. L., et ai., ja Scheller, R. H. et ai., edellä. Alalla työskenteleville on tarjolla useita tällaisia tunnistuskoh-tasekvenssejä, ja tästä syystä on mahdollista valita kaksois-25 DNA:n päät kussakin tapauksessa tarvittavalle restriktioendo-nukleaasille sopiviksi.

Restriktiokohtasekvenssien liittäminen cDNA:n päihin voidaan toteuttaa menetelmällä, jota nimitetään tylppään päähän liittämiseksi, ja jolloin katalysoidaan DNA-ligaasilla, 30 joka on puhdistettu seuraavalla menetelmällä: Panet, A. et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Edellä mainitut Sgaramella, V., et ai. ovat selostaneet tylppään päähän liittämisreaktiota. Tylppään päähän liittämisessä, jossa reaktio tapahtuu tylppäpäisen cDNAin ja suuren molaarisen ylimäärän kanssa kaksisäi-35 keistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III endonukleaasin tunnistamiskohdan, saadaan tuotteeksi cDNA, jonka kummassakin päässä on Hind III:n restriktiokohtasekvenssi. Kun reaktio- li 21 64953 tuote käsitellään Hind ΙΙΙ-endonukleaasilla, tapahtuu katkeaminen restriktiokohdassa ja muodostuu yksisäikeiset itse-komplementoituvat 5'-päät, kuten kuviosta 1 ilmenee.

4. Yhdistelmä-DNA:n siirtovektorin muodostaminen 5 Tällä hetkellä käyttöön hyväksyttäviä sopivia siir- tovektoreja ovat mm. useat bakteriofagilambdajohdannaiset (ks. esim. Blattner, F. R., Williams, B. G., Blechl, A. E., Denniston-Thompson, K., Faber, H. E., Furlong, L. A., Grun-wald, D. J., Kiefer, D. 0., Moore, D. D., Schumm, J. W., 10 Sheldon, E. L. ja Smithies, 0., Science 196, 161 (1977)) ja Col El-plasmidijohdannaiset (ks. esim. Rodriquez, R. L., Bolivar, S., Goodman, H. M., Boyer, H. W. ja Betlach, M.

N., INC-UCLA Symposium on Molecular Mechanism in the Control of Gene Expression, D. P. Nierlich, W. J. Rutter, C. F. Fox, 15 Eds. (Academic Press, NY, 1976) ss. 471 - 477). Col E1:stä johdetuille plasmideille on ominaista suhteellisen pieni koko, sillä niiden molekyylipaino on muutaman miljoonan luokkaa, ja se, että normaaliolosuhteissa plasmidi-DNA:n kopioiden luku isäntäsolua kohti on 20 - 40, mutta se saa-20 daan nostetuksi tuhanteen tai sitäkin suuremmaksi, kun isän-täsolut käsitellään kloramfenikolilla. Isäntäsolun kyky suurentaa sisältämäänsä geenimäärää tekee tietyissä olosuhteissa tutkijan säädellessä mahdolliseksi sen, että isäntäsolu tuottaa pääasiassa plasmidigeenien koodaamia proteiineja.

25 Näin ollen tällaiset Col E1-johdannaiset ovat edullisia siirtovektoreita tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä. Sopivia Col E1-johdannaisia ovat mm. plasmidit pMB-9, jonka sisältämä geeni aiheuttaa vastustuskyvyn tetrasykliinille, ja pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 ja pBR-322, jotka si-30 sältävät tetrasykliiniresistenssigeenin ja ampisilliini-resistenssigeenin. Resistens- ______ - τ~ _ 22 6 4 9 5 3 siä aiheuttavan geenin läsnäolo tarjoaa sopivan keinon, jolla voidaan valita solut, jotka ovat infektoituneet plasmidilla, sillä tällaiset pesäkkeet kasvavat lääkkeen läsnäollessa, mutta jos plasmidia ei ole, solut eivät 5 kasva. Tämän selityksen sisältämässä esimerkeissä käytettiin col Elrstä johdettua plasmidia, joka sisälsi e.m. resistenssigeenin ja yhden Hind III-tunnistuskoh-dan.

Plasmidia pBR-322 on pitkälle karakterisoitu.

10 Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 95) on kuvannut tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin. Plasmidin e pBR322 molekyylipaino on 2,7 x 10° daltonia (Bolivar F.,

Gene 4 (1978) 121), ja se sisältää ampisilliiniresistens-

R R

sin (Ap :n) ja tetrasykliiniresistenssin (Te :n) aiheutta- 15 vat geenit. Edellä mainitussa Ap -geenissä on yksi

R

endonukleaasin Pst 1 tunnistuskohta. Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista endonukleaaseista:

Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi pBR322 sisältää yhden

Eco Rl: n tunnistuskohdan, kaksi Hind II:n tunnistuskohtaa, 20 viisi Eco RII:n tunnistuskohtaa, kolme Bgl I:n tunnistus- kohtaa, 12 Alu I:n tunnistuskohtaa, 12 Hae II:n tunnistus- kohtaa ja 17 Hae III:n tunnistuskohtaa. Tunnistuskohdat on merkitty renkaan muotoiseen pBR322-plasmidiin sivulla 103

Bolivarin et ai. julkaisussa. Ap -geeni häviää lohkaistaessa 25 plasmidi Pst I:n tunnistuskohdasta ja liitettäessä

R

vierasta DNA:ta siihen. Samoin Te häviää lohkaistaessa pBR 322 endonukleaaseilla Hind III, Vai I tai Bam I ja liitettäessä vierasta DNA:ta niiden tunnistuskohtaan.

Liitettäessä DNA Pst I:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi- 30 naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka

S

ovat sekä ampisilliinisensitiivisiä (Ap ) että tetrasykliä-ni-resistenttejä (Te ) samoin liittämällä DNA Hind III:n Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi-naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka 35 ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliini- sensitiivisiä. Siirtäjävektori, joka sisältää johonkin edel- 23 64953 lä mainittuun neljään tunnistuskohtaan liitettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtäjävektorin lääke-ainesresistenssiominaisuuksien perusteella eli siitä, onko se ampisilliinisensitiivinen ja tetrasykliiniresis-5 tentti tai ampisilliiniresistentti ja tetrasykliini- sensitiivinen. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida poistamalla siihen liitetty vieras DNA, määrittämällä muodostuneiden kahden tuotteen molekyylipaino ja vertaamalla näitä lähtöaineiden molekyylipainoihin. Li-10 säksi karakterisointia voidaan täydentää merkitsemällä siirtäjävektoriin eri endonukleaasien tunnistuskohdat. Siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi voidaan myös määrittää. Mainitun plasmidin pBR322 koko nukleotidisekvenssi on esitetty J. Sutcliffen väitöskirjassa "Nucleotide 15 Sequence of pBR322", Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA.

Samoin plasmidia pBR313 on pitkälle karakterisoitu. Tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin ovat kuvanneet Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 75).

g 20 Plasmidin pBR313 molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia,

R

ja se sisältää ampisilliiniresistenssin (Ap ) ja tetrasyk-liiniresistenssin (Te ) aiheuttavat geenit. Plasmidin pBR313 Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista nukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI.

25 Plasmidin pBR313 tunnistuskohdat eri endonukleaaseille on määritetty täydellisesti, ja tästä tuloksena saatu tunnis-tuskohtakartta on esitetty sivulla 84 Bolivarin et ai. julkaisussa. Liitettäessä vierasta DNA:ta Hind III:n.

Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetrasykliiniresis-30 tenssi häviää. Täten yhdistelmä-DNA-molekyylejä löydetään kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtäjävektori voidaan karakterisoida lääkeaineresistenssiominaisuuksien, siirretyn DNA-sekvenssin, restriktioentsyymin tunnistuskohtakartan 35 ja edellä mainittujen molekyylipainojen perusteella.

24 64953

Kolmas plasmidi, jota on pitkälle karakterisoitu, on pMB 9. Tämän plasmidin valmistusmenetelmän ovat esittäneet Rodriguez, R.L. et ai. (edellä) ja Bolivar, F., et ai., (Gene 2 (1977) 75). Plasmidin pMB 9 g 5 molekyylipaino on 3,5 x 10 daltonia, ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan geenin. Tämä plasmidi sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seu-raavista endonukleaaseista: Eco Rl, Hind III, Sal I ja Bam HI. Näistä kolmen jälkimmäisen tunnistuskohdat si-10 jaitsevat Te -geenissä. Liitettäessä vierasta DNA:ta

Hind III:n, sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetra-sykliiniresistenssi häviää. Siirtäjävektori, joka sisältää vierasta DNA:ta joissakin näistä kohdista, voidaan karakterisoida tämän ominaisuuden perusteella. Tämä siir-15 täjävektori voidaan edelleen karakterisoida määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi, vertaamalla molekyyli-painoja ja tunnistuskohta-analyysillä, kuten edellä on kuvattu.

Voidaan käyttää useita vektoreita transformoitaessa 20 Bacillus subtilista. Nämä vektorit on johdettu mikro-organismista Staphylococcus aureus (ks. Fordanescu, S., J. Bakteriol. 124 (1974) 597 ja Ehrlich, S.D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 1680). Näillä plasmideilla on määrätty resistenssi ja niillä on määrättyjä restriktio-25 endonukleaasikohtia. Esimerkiksi plasmidilla pC194 aikaansaadaan resistenssiä klooriamfenikolille (Cm), se sisältää yhden ainoan Hind ΙΙΙ-kohdan ja sen molekyylipaino g on 1,8 x 10 daltonia. Vieras DNA liittyy siten plasmidin pC194 Hind ΙΙΙ-kohtaan. Vieraan DNA:n sisältävä siirto-30 vektori voidaan karakterisoida sen resistenssin perusteel-la (Cm ). Siirtovektori voidaan myös karakterisoida poistamalla liitetty DNA määrittelemällä kahden tuotteen molekyylipaino, verrattuna lähtöaineiden molekyyli-painoon. Voidaan myös määrittää liitetyn DNA:n sekvenssi.

35 Sopivan isännän valinnassa on monia mahdollisuuksia samoin kuin plasmidin valinnassa.

Il 25 6 4 9 5 3 Tässä selityksessä kuvattuihin mentelmiin on kehitetty E. coli-kanta X-1776, jonka NIH on hyväksynyt, kun käytetään P2-työskentelytiloja, ks. Curtiss III, R., Ann, Rev. Microbiol. 30, 507 (1976). E. coli RR-1 on sopiva, kun P3-5 työskentelytilat ovat käytettävissä.

Rekombinoidut plasmidit mudostetaan siten, että sekoitetaan keskenään restriktioendonukleaasilla käsiteltyä plasmidi-DNA:ta ja cDNA:ta, jonka pääteryhmät ovat vastaavasti käsitellyt. Plasmidi-DNA:ta käytetään suuri molaarinen 10 ylimäärä cDNA:han verrattuna, jotta cDNA-segmentit muodostaisivat mahdollisimman vähän kombinaatteja toistensa kanssa. Aikaisemmissa menetelmissä tämä on johtanut siihen, että suurin osa kierrossa olevista plasmideista on sellaisia, jotka eivät sisällä cDNA-fragmenttia. Näin ollen valintaprosessis-15 ta on tullut vaivalloinen ja aikaavievä. Aikaisemmin tämä ongelma on ratkaistu siten, että on yritetty rakentaa sellaisia DNA-vektoreita, joissa on restriktioendonukleaasin tun-nistuskohta sopivan merkkigeenin keskellä siten, että rekombi-nantin liittäminen jakaa geenin ja samalla geenin koodaama 20 toiminta häviää.

On edullista käyttää sellaista menetelmää, jolla niiden pesäkkeiden lukumäärä saadaan mahdollisimman pieneksi, joista rekombinoitua plasmidia etsitään. Menetelmässä toimitaan siten, että restriktioendonukleaasilla katkaistu plas-25 midi-DNA käsitellään alkalisella fosfataasilla (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Alkalinen fosfataasi poistaa 5'-päiden fosfaatit endonukleaa-sin synnyttämistä plasmidin päistä ja estää plasmidi-DNA:n itseligaation. Näin ollen renkaanmuodostus ja samalla trans-30 formaatio riippuu siitä, että tapahtuu 5'-fosforyloidut päät sisältävän DNA-fragmentin liittyminen. Kuvattu menetelmä vähentää ilman rekombinaatiota tapahtuvan transformaation suh- 4 teellistä esiintymistä määrään, joka on alle 1 - 10 .

Tämä keksintö perustuu siihen, että DNA-ligaasin katalysoima 35 reaktio tapahtuu DNA:n 5'-fosfaattipääteryhmän ja DNA:n 3'-hydroksyy 1 i-pääteryhmän välillä. Jos 5'-fosfaatti puuttuu, ei liittymisreaktiota tapahdu. Kun kaksisäikeiset DNA:t pitää yhdistää, on olemassa kolme tilannetta, kuten taulukosta 1 ilmenee: ____ .. τ:- 26 64953

Taulukko 1

Tapaus Reagoivat yhdisteet Ligaasituote 5 I 3' 5' 3' 5' -OH II 0 PO- --O-P-O-- -OPO,IL+ 2 3H0- -O-P-O--i-2H2o 5' 3’ 5’ 3’ II 3’ 5' 3’ 5' --Oli H-0,?-0---O-P-O- 10 -OH + 3OH---OH HO-^*U2° 5' · 3' 3’ 3’ III 3’ 5' _OH HO_ ei rc^tiota -OH + HO- 15 5' 3·

Taulukossa 1 on kaksisäikeinen DNA esitetty kaaviollisesta yhtenäisinä yhdensuuntaisina viivoina ja niiden 20 vastaavat 5'- ja 3'-pääteryhmät on merkitty hydroksyy-leiksi (OH) tai fosfaateiksi (OPOgH^)· Tapauksessa I on kummassakin reagoivassa molekyylissä päissä 5'-fosfaatti, ja näin ollen molemmat säikeet yhtyvät toisiinsa kovalent-tisesti. Tapauksessa II on liitettävistä päistä vain 25 toisessa 5'-fosfaatti ja näin ollen vain toinen liitet tävistä säikeistä liittyy toiseen kovalenttisesti ja toiseen säikeeseen jää epäjatkuvuuskohta. Kovalenttisesti liittymätön säie pysyy assosioituneena liittyneeseen säikeeseen vetysiltojen avulla, jotka esiintyvät vastakkais-30 ten säikeiden komplementaaristen emäsparien välillä. Ta pauksessa III ei kummassakaan reagoivassa päässä ole 5 '-fosfaattia eikä yhdistymisreaktiota tapahdu.

Näin ollen pitää poistaa 5'-fosfaattiryhmä sellaisesta päästä, jonka liittyminen toiseen halutaan estää.

64953 27 Käytettäväksi sopii mikä tahansa 5'-fosfaattiryhmän poistomenetelmä, joka ei muuten vahingoita DNA-rakennetta. Mieluiten käytetään alkalisen fosfataasin katalysoimaa hydro lyy siä..

5 Edellä kuvattu menetelmä on hyödyllinen myös siinä tapauksessa, että lineaarinen DNA-molekyyli halutaan katkaista kahteen alafragmenttiin, tavallisesti restriktio-endonukleaasia käyttämällä, ja sen jälkeen rekonstruoida alkuperäiseksi sekvenssiksi. Alafragmentit voidaan puhdis-10 taa erikseen ja haluttu sekvenssi voidaan rekonstruoida yhdistämällä alafragmentit. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää DNA-ligaasia, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei.

15 USA 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colista saatua ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, I.R., J. Biol. Chem 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointia restriktio-20 endonukleaasikäsittelyllä saaduista alafragmenteista parantaa suuresti, jos voidaan käyttää menetelmää, jossa sopimattomien sekvenssien rekonstruoinnilta vältytään. Sopimaton tulos voidaan välttää, jos halutun sekvenssin omaava homogeenisen pituinen cDNA fragmentti käsitellään 25 reagenssilla, joka kykenee poistamaan 5’-päätefosfaatti-ryhmät cDNA’.sta ennen kuin homogeeninen cDNA lohkeaa res-triktioendonukleaasin vaikutuksesta. Tässä alkalinen fosfataasi on edullinen entsyymi. 5’-päätefosfaatit ovat rakenteellinen edellytys DNA-ligaasin alafragmentteja yhdistävälle 30 vaikutukselle. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää kovalenttisesti, joissa ei ole 5’-päätefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan yhdistää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5’-päätefosfaatin, joka on muodostunut restriktioendonukleaasin eristettyyn DNA:han kohdistaman 35 katkaisevan vaikutuksen tuloksena.

28 64953

Edellä selostettu menettely estää sopimattomimman liittymisreaktion, nimittäin että kaksi fragmenttia liittyisi käänteisessä järjestyksessä eli takaosa etuosaan eikä etuosa takaosaan. Muita mahdollisia sivureaktioita, 5 kuten dimeroitumista tai renkaanmuodostusta ei saada estetyksi, koska nämä tapahtuvat reaktiotyypin II mukaisesti, vrt. taulukkoa 1 edellä. Tällaiset sivureaktiot ovat kuitenkin vähemmän haitallisia, koska ne johtavat fysikaalisesti indentifioitaviin ja erotettaviin tuottei-10 siin, kun taas käänteinen rekombinaatio ei sitä tee.

Edellä kuvattujen menetelmien valaisemiseksi rotan kasvuhormonin cDNA-koodi eristettiin, rekombinoitiin plasmidin kanssa ja siirrettiin E. coliin. Kun E. coli oli replikoitunut. voimakkaasti, 15 eristettiin noin 800 nukleotidia sisältävä sekvenssi ja havaittiin, että se sisälsi koodin rotan koko kasvuhormonille sekä osille prokursoripeptidiä ja osan translatoitu-matonta 5'-aluetta.

Juuri kuvatulla menetelmällä voidaan eristää 20 3a puhdistaa korkeamman organismin geeni, myös ihmisen geeni, ja siirtää se mikro-organismiin, jossa se toi-siintuu. Selostuksessa kuvataan uusia rekombinoituja plasmideja, jotka sisältävät eristetyn geenin kokonaan tai osia siitä. Selostuksessa kuvataan uusia, mikro-25 organismeja, joita ei tähän mennessä ole löydetty luonnosta, ja joiden geneettinen rakenne sisältää korkeamman organismin geenin. Seuraavissa esimerkeissä kuvataan re-kombinoituja plasmideja, jotka sisältävät osia rotan kas-vuhormonigeenistä ja ihmisen kasvuhormonigeenistä sekä 30 uusia mikro-organismeja, jotka sisältävät mainittuja geenejä.

Il 29 64953

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä selostetaan rotan kasvuhormonin rakennegeenin DNA-sekvenssin eristys ja puhdistus.

Kun on kyse muista kuin ihmisestä peräisin ole-5 vista geeneistä turvallisuusmääräykset eivät vaadi cDNArn eristämistä erikoisen puhtaana. Näin ollen on mahdollista eristää rotan kasvuhormonin rakennegeenin koko cDNA siten, että eristetään elektro-foreettisesti noin 800 emäsparia sisältävä DNA, jonka 10 tiedetään vastaavan rotan kasvuhormonin tunnettua aminohapposekvenssiä. Rotan kasvuhormonin mRNA:n lähteenä käytettiin viljeltyjä rotan aivolisäkesoluja, jotka olivat solupolven GH-1 alaklooni, ja joita myy American Type Culture Collection, ks. Tashjian, A.H., 15 et ai., Endochrinology 82, 342 (1968). Kun tällaisia soluja kasvatetaan normaaliolosuhteissa, kasvuhormonin mRNA edustaa vain pientä prosenttiosuutta eli noin 1-3 % RNA:n sisältävästä kokonais-poly-A:sta. Kasvuhormonin mRNA:n tasoa pystyttiin kuitenkin nostamaan 20 kilpirauhashormonien ja glukokortikoidien synergisti- g sellä vaikutuksella. RNA saatiin 5 x 10 solusta, jotka oli kasvatettu suspensioviljelmässä, johon oli 4 vuorokautta ennen solujen talteenottoa lisätty 1 mM deksame-tasonia ja 10 nM L-trijodityroniinia. Polyadenyloitu 25 RNA eristettiin viljeltyjen solujen sytoplasmisesta kalvojakeesta, ks. Martial, J.A., Baxter, J.D., Goodman, H.M. ja Seeburg, P.H., Proc. Natl. Acad. Sei.

US 74, 1816 (1977) ja Bancroft, F. C., Wu, G. ja Zubay, G., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 70, 3646 (1973).

30 mRNA puhdistettiin ja transskriboitiin kaksisäikeisek- si cDNA:ksi (ks. kantahakemuksen esimerkkejä 1-3). Gee-lielektroforeesifraktioinnissa havaittiin heikko, mutta silti selvä kaista, joka vastasi noin 800 emäsparin pituista DNA:ta.

30 64953

Koko viljeltyjen aivolisäkesolujen mRNA:sta transskriboidun cDNA: n käsittely Hha I-endonukleaasilla antoi kaksi elektroforeettisessa erotuksessa ilmenevää suurempaa DNA-fragmenttia, jotka vastasivat noin 320 5 nukleotidia (fragmentti A) ja 240 nukleotidia (fragmentti B). Kun fragmenttien A ja B nukleotidisek-venssit analysoitiin kantahakemuksen esimerkissä 5 kuvatulla tavalla, havaittiin, että nämä fragmentit olivat todella rotan kasvuhormonin koodin osia, kun verrattiin julkaistuihin 10 rotan kasvuhormonin aminohapposekvenssitietoihin ja muihin tunnettuihin kasvuhormonisekvensseihin, ks. Wallis, M. ja Davies, R.V.N., Growth Hormone and Realted Peptides (Eds., Copecile, A. ja Muller, E.E.) ss. 1-14 (Elsevier, New York, 1976) ja Dayhoff, M.O., 15 Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, suppl. 2, ss. 120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1976). Kun 800 emäsparia sisältävä kaksisäikeinen cDNA eristettiin elektroforeettisesti edellä kuvatulla tavalla ja sille suoritettiin saman-20 lainen Hha I-endonukleaasikäsittely, päätuotteiden joukosta löydettiin kaksi fragmenttia, jotka vastasivat pituudeltaan fragmentteja A ja B.

Koska noin 800 emäsparia sisältävää rotan kasvuhormonin cDNA:ta ei puhdistettu restriktioendonukle-25 aasikäsittelyä varten, oli tarpeen käsitellä DNA parittomien yksisäikeisten päiden poistamiseksi. Tällaisten parittomien päiden poistaminen tapahtui ennen elektroforeettista erotusta liuoksessa, joka sisälsi 25 ^ul 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl^, 10 mM 30 ^-merkaptoetanolia, 1 mM ATP ja dATP, dTTP, dGTP

ja dOTP (200 ^uM kutakin). Kun seosta inkuboitiin 10 minuuttia 10°C:ssa 1 yksikön kanssa E. colin DNA-polyme-raasi I:tä, saatiin ulkonevat 3 *-päät poistetuiksi ja

H

64953 31 ulkonevat 5'-päät täytetyiksi eksonukleolyyttisesti. Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis/ Indiana, myy DNA-polymeraasi I:tä.

Noin 800 emäsparia sisältävään rotan kasvuhormonin cDNA:han liitettiin Hind ΙΙΙ-tunnistuskohta kantahakemuksen esimerkis-5 sä 3 kuvatulla tavalla. Plasmidi pBR-322, jossa oli ampisil-liinille vastustuskyvyn antava geeni ja Hind ΙΙΙ-kohta siinä geenissä, joka antaa vastustuskyvyn tetrasykliinille, käsiteltiin Hind III endonukleaasilla ja alkalisella fosfataasilla kantahakemuksen esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Käsiteltyyn 10 plasmidiin liitettiin 800 emäsparia sisältävä rotan kasvuhormonin cDNA DNA-ligaasin avulla kantahakemuksen esimerkin 3 mukaisella tavalla. Ligaasireaktioseos käytettiin E. coli X-1776-solususpension transformointiin kantahakemuksen esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Rekombinanttipesäkkeet valit-15 tiin sen perusteella, että ne kasvoivat ampisilliiniä sisältävällä alustalla, mutta eivät kasvaneet alustalla, joka sisälsi 20 jag/ml tetrasykliiniä. Saatiin kymmenen sellaista pesäkettä, joissa oli plasmidi, johon oli liittyneenä noin 800 emäsparia sisältävä osa, joka irtosi Hind III-katkaisulla.

20 800 emäsparia sisältävää rotan kasvuhormonin DNA:ta eristettiin preparatiivinen määrä rekombinanttikloonista pRGH-1 ja eristetyn DNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin kantahakemuksen esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Löydetty nukleotidisekvenssi sisälsi 5'-päässä alueen, jossa rotan 25 kasvuhormonia vastaavaa translaatiota ei ollut tapahtunut, ja sekvenssin 26 aminohapolle, jotka ovat kasvuhormonin pre-kursoriproteiinissa ennen eritystä. Taulukossa 1 on myös esitetty geenisekvenssistä johdettu mRNA-sekvenssi. Ennustettu aminohapposekvenssi vastaa kohtia 1 ja 8 lukuunottamatta 30 hyvin rotan kasvuhormonin osia, joita Wallis ja Davies ovat selostaneet (vrt edellä), ja jotka koskevat kohtia 1 - 43, 65 - 69, 108 - 113, 133 - 143 ja 150 - 190.

•β 32 I 64953

H

§ £ ^ 3 £ 2 y a H "2 " Η ^ ο H

>> u jo π h o o ;? <; d' p ^ o CW 2 h 5 ¥ ”H « £ 3 0 C. υ DU 3 £ a otJ u £ j 3 j 3 3 3 3 u 3 8^,3 L3 3 3 a 3 3 a 5*5 et *< 3 -2 j j =o f L 3 3 j3 n'i 3 3 3 ^ 33 2 33 33 23 3 £2 < 0.g 3 J U J J < υ J O O d ~ H < Si. £ ·§§ -a a a 5¾ ss s.$ a 3 z-% a .¾¾^ —— ~* ^ ^ r-Jcj f— H l? u rrcj u CO £ >? “ CL? ML? »—| Ο ΙΛ r- -ir- S“i gg* “-' oi cG »*= 5S s* 3Ö s O0)° 29 « y £ a «U too D u C.U d f §H a.H <c < u £ h < 3 3 3 < 6 3 $SS j3 u d S3 «a £o «JU wo 3 ^< < o << < b <e c ic a S 3g 2 h 3 3 a < sa ä 3 ' = ^ ? w a * 3 f jo j o od j a a a aa st a % m u h «a a a oh a a s a ~ a ^ $ g £ J u > u - < 3 a £< g a ε a a 5«i &« a a 'oa at ^a · aa aa < wdg 28 sa a- sa s^ »h >-o < - . „*| *« << ^ S5 sc ¢8 «8 8 o o c jo 3a £fa «a sa 2a sa « - ο τ-,ς o «-< <0 <0 <0 2 < a a a a "3 ή h w p1 < a h SrS< a a § s a «a 22a 4,0 ' υο 0.H od ί ^ saa ^aaaa aa1 <ϋ ΐΰ οι > o o s a s u fp a ilia ^ 0 >> ο οη-?

h 11¾ -i- 38 · $;j «0 Sg 38 38 X

4> C ω c-o vjH do co cti „ ., ,. . j in ( mc aio S X- J3 “ 0 c-o u. h who jisi <u w<: οϋ υ3 << <ö aa aa 'ggi 5a S a 2« r< sa ^aa I -2a sa aa aa sa «< ^o a 152 <o j- -< <b aa aa a*^ aa. a <!: :¾ is s % a 2 a La aa a ^ 3« 30 3«- 5 §:|> .z< o. u h h o a 33 a a 3d a s|:i la 5a 33 “a ss aa a <U g OI ·υ oo << 00 JO < u < 3^e aa aa sa «μ «h oh h ^ <s a·^ aa ^3 3a saa e -h iij sa aa j? a ?, h 30 o, o «od ej-iiW Cx O 3 tl 3o ®ia «H m < ^ o 5

T) Ti UU ° ^ JO JO <0 < o H

"§*Sd M J μ χ-Η ^a 01 J CL H to O a e d^a jF h -f h jo me u o h eeg α· J t- < h h e o < o <00 oo0 a aa ° a 000 e o o e o >_ u own a a p o a a a 3 o ^ £ a r* e n .r. o a s 2. a a

ΙΛ O .r (J ° OU tx-o ϋ υ H ϋ U tn < r-1 o H H

ojg> a a £3 aa «a * o «o «oh -M ^ ^ -e od S -? ^ H i®a J <- e. o >n <: o 3 0¾ O < <U -* O n< co J«2 < 2-¾¾ a aa La ?< oo- >,υ uu u <

*Ö E M <? CO d' cd LH C* O --<0 4j H di H H

H<3tx O <0 JJ P-i O P.O 00 Hz e x: e o a at^ l a aa ^h 3° e o joa 'e UJ H< J -< oo od >3< e a ^ S' H 23 3 H 3 d "» O «o o 0 00 3 j s % aa 33 3a 3aa a 2a aa aa 5·η 3<j d.o 3o < • p-a 3a 33 aa aa aa ^h <

1 υ ^ t-»r-< ·—* CJ <. O i-JOU

- 2” o aa u e e- -e ex o y h v-o2 - ^ 3a aa 33 sa a

II

33 64953

Esimerkki 2

Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR-322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pMB-9 DNA (valmistusmenetelmä: Rodriquez, R. L., Bolivar, F., Good-5 man, H. M., Boyer, H. W. ja Betlach, M., INC-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, D. P. Wierlich, W. J. Rutter ja C. F. Fox, Eds. (Academic Press, New York 1976), ss. 471 - 477). Käytetyt olosuhteet olivat muuten samat kuin esimerkissä 1, paitsi että selektio suoritettiin 10 kantahakemuksen esimerkin 4 mukaisella tavalla. Yhdistel-mäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 3 15 Tässä esimerkissä selostetaan ihmisen kasvuhormo nin koko rakennegeenin eristys ja puhdistus.

Ihmisen kasvuhormonin mRNA:n eristys suoritettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, mutta biologisena lähteenä käytettiin ihmisen aivolisäke-20 kasvaimen kudosta. Viisi hyvänlaatuista ihmisen aivolisä-kekasvainta, jotka oli poistettu leikkauksella ja nopeasti jäähdytetty nestemäisessä typessä, ja jotka painoivat 0,4 - 1,5 g kukin, sulatettiin ja jauhettiin 4°C:ssa liuoksessa, joka sisälsi 4 M guanidiniumtiosyanaattia ja 1 M 25 merkaptoetanolia, ja joka oli puskuroitu pH-arvoon 5.

34 6 4 9 5 3

Homogenaatti kerrostettiin 1,2 raitaan 5,7 M CsCl, joka sisälsi 100 mM EDTA, ja sentrifugoitiin 18 tuntia 15°C:ssa nopeudella 37 000 r/min Beckman-ultra-sentrifugin roottorilla SW 50,1 (Beckman Instrument 5 Company, Fullerton, California). RNA kulkeutui putken pohjalle. Jatkopuhdistus tapahtui käyttämällä oligo-dT-pylvästä ja sakkaroosigradienttisedimentointia esimerkeissä 1, 2 ja 3 kuvatulla tavalla. Noin 10 % näin eristetystä RNAtsta koodasi kasvuhormonia päätellen 10 reaktioaktiivisen aminohappoprekursorin sisällyttämises tä vehnänalkiosta saatuun antikasvuhormonisaostusmate-riaaliin soluttomassa translaatiosysteemissä, ks.

Roberts, B.E. ja Patterson, B.M., Proc. NatL. Acad. Sei.

USA 70, 2330 (1973). Ihmisen kasvuhormonin cDNA val-15 niistettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 ku vatulla tavalla. Ihmisen kasvuhormonin cDNA fraktioitiin geelielektroforeettisesti ja kloonaukseen valittiin jae, joka liikkui noin 800 nukleotidia vastaavaan kohtaan. Valittu jae käsiteltiin DNA-polymeraasi I:llä 20 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja sen jälkeen näihin liitettiin Hind Ill-tunnistuskohdat. Tämän jälkeen cDNA rekoxnbinoitiin DNA-ligaasin avulla plasmidiin pBR-322, joka oli käsitelty alkalisella fosfataasilla. E. coli X-1776 transformoitiin rekombinoidulla DNA:11a ja valittiin 25 kasvuhormonin DNA:n sisältävä kanta. Kasvuhormonin DNA:n sisältävää kantaa kasvatettiin preparatiivinen määrä ja kasvuhormonin DNA eristetään nukleotidisekvenssin määrittämistä varten. Kasvuhormonin kloonatun DNA:n havaittiin sisältävän ihmisen kasvuhormonin koko aminohappo-30 sekvenssin nukleotidikoodin. Ihmisen kasvuhormonin ensim mäiset 23 aminohappoa ovat H2N-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-P?i§-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-. Sekvenssin loppuosa on esitetty taulukossa 2 .

li γη 35 fcs 64953 li 53 -Ö ¢2 «ä . Jg ss- 8^ υυ a-o ^ υ 1/1»- '2 £ O u j u 23 {-? »3 »2 g υ ω o go *-· u u ^ o u o ®^Γ> Uu

".S =>'-} 3 0 3t, ° <U

•Sh Cu u O e» H J^r· « U

C «:·; . . uu oo % 8 $g 8 S c > O S ii “‘3 C.U cv; 9 „\ o ΰ c υ C O u "? ’5 3U h " UI— "7 S? UI H o —I u £*ä «g << <·< Gb 5 u 25Ö · is ^ Sb 2b a g CU „„ · <U ^ H CO H - ,J- «H ui ^ c > r- r ' - --· ·' < -2 £ £ 1 0)32 * <- . M < o M _ ., < .1 .¾¾ c< . **5 - f- ' S H ϋ!υ M u ä T »n a u ·· J'- «*H . 3G £ ,i ho i ^ O H e u _ .. , - u υ ϊΆ-ζ. .. —< rh: ^ o e <- n(, o s1 h h e - u!: H · w - ^o ö ^ S >- ^ o co ^ U:^ W < “1^

(Λ — e u- ., . . ^ ^ H

•H 01- -1 JZ u CU ‘“‘J e < . o .5 z S 5 3 . p 3 Si g li 35 S3 3g §C8 §§ 3 s g .

li 22 p ΪΗ 35 sv “2 a - s js 2: ^ °-J cc se a i «i s§ ”s; as n b s< - s 3>C «O 2 i ^ 3 H £ £ C.O ^ 3 5 -S r; “ Jo ΰ < J2< 6 H.i3R e - j{ H 2υ g- y hS> - O £ d b >.;C w *“ fc ^ < O J2 t u s1 S5g iH sS -5¾ ^ |§ g 3.8 = < Sp‘5 Jö ?e 3 a SS is S3 Ju 3-5 h 81 ^ -·η§ 5g ’ gb § 3 -S o f- 3»; -jo g· y «o v u y |& s s :;: ii= £s g

SS s% *'* S3 32 5g 5.3 S

H OU r;3 ^ ~ C 0)H H

Sw co u u *ö> h £< b! o — ω u %% O O e- ^ >υ Hi

ς:Π U. SS

•3 </> H H v ,j 3 ° ° -1 0> O U

Q -H w u £1 ®{ J-j <uu i:u r1 P ui μ.

μ α £ o -Ό wc j^o *r >> u

Co H< ui|- J υ oh e .5 c-u /? O O-uh g· y «o >.0 Cu p E UI —. OI- CO U u < u — b Γίυ 4*0 5 5 < o 3 u l( ,, : < 0 υ o u < 'JL- oi; Su sy ο-Η >. o Λί -H -e H -1-1 ^ ·- ΙΛ H £ H Ό ^ < -cu

W H e e J „, , , ^ ° -HH U U

C Irt V ,j £ O rJU CU r-,.

SS <b ,¾¾ hi •ä^ ~ ^υ hy «o Z υυ A® y h y h H -e u i7u bi y -< u

Rw ; M· <0 u u U u ^ {3 ir» 36 64953

Esimerkki 4.

Esimerkki 3 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR-322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pMB-9 DNA:ta, joka oli valmistettu Rodricjuez' in et ai. kuvaamalla mene-5 telmällä (edellä). Kaikki reaktio-olosuhteet olivat samat, paitsi että lopullinen selektio suoritettiin kantahakemuk-sen esimerkin 4 mukaisesti. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin DNA-fragmentti, joka sisälsi noin 800 emäs-10 paria, ja jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 3· n

Claims (1)

1. 37 64953 Patenttivaatimus Menetelmä kasvuhormonia koodaavan nukleotidisek-venssin sisältävän ja kasvuhormonia tuottavan mikro-orga- 5 nismin valmistuksessa käytettävän yhdistelmä-DNA-mole-kyylin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) mRNA eristetään aivolisäkesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi 4-m guanidinium- 10 tiosyanaatin ja 0,05...1,0-m /5-merkaptoetanolin seosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribonukleaasihajoa-mista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNA:sta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sel- 15 lainen cDNA, jolla on kasvuhormonia koodaava nukleotidi-sekvenssi, ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-kohtasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina 20 on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jälkeen cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteerin plasmidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n 25 tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla, esim. inkuboi-malla pHrssa 7,6 37°C lämpötilassa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jolla on kohesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek- 30 torin 5'-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasilla pHrssa 8,0 65°C lämpötilassa 30 minuutin ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät voi liittyä toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plas- 35 midivektori ja kohdassa c) saatu cDNA sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa»esim. pH:ssa 7,6 14°C lämpötilassa tunnin ajan, käyttäen plas- 38 64953 midivektorin moolista ylimäärää, jotta saadaan kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli. 39 64953 Förfarande för framställning av en rekombinant-DNA-molekyl som innehäller en för tillväxthormon kodande nuk-5 leotidsekvens och som kan användas vid framställning av en tillväxthormon producerande mikroorganism, känne-t e c k n a t därav, att a) mRNA isoleras ur hjärnbihangsceller genom att homogenisera dessa i närvaro av ett ribonukleas inhiberande 10 ämne, vilket kan utgöras t.ex. av en blandning av 4-m gua-nidiumtiocyanat och 0,05...1,0-m /i-merkaptoetanol, vid ett pH av 5,0...8,0, varvid säledes nägot ribonukleassönder-fall av mRNA ej sker, b) ur den erhälinä mRNA framställes pä i och för 15 sig känt sätt med tillhjälp av ett reverstransskriptasenzym en sadan cDNA, vilken har en för tillväxthormon kodande nukleotidsekvens, och nämnda cDNA:n omvandlas tili tvä-trädig, c) tili den erhällna tväträdiga cDNA:ns ändar fogas 20 restriktionsendonukleasens igenkänningsställesekvenser pä och i för sig känt sätt, varvid säsom resktriktionsendonuk-leas användes samma enzym som i följande steg d), varefter cDNA kapas med tillhjälp av nämnda resktriktionsendonukleas sä, att kohesiva ändar uppstär, 25 d) en bakterieplasmidvektor öppnas med tillhjälp av en restriktionsendonukleas, t.ex. med Hind III, Hsu I el-ler Eco Rl, pä och i för sig känt sätt t.ex. genom att in-kubera vid ett pH av 7,6 och en temperatur av 37°C i 2 timmar för erhällande av en öppnad plasmidvektor med kohe-30 siva ändar, e) den i punkt d) erhällna plasmidvektorns 5'-fos-fatändgrupper hydrolyseras genom behandling med t.ex. al-kalisk fosfatas vid ett pH av 8,0 och en temperatur av 65°C i 30 minuter, varvid de i punkt d) nämnda kohesiva ändarna 35 ej kan förenas med varandra, f) den enligt punkt e) behandlade plasmidvektorn och den i punkt c) erhällna cDNA kopplas tili varandra pä