FI64640B - Foerfarande foer framstaellning av en kombinations-dna-molekylsom innehaoller en foer insulin kodande nukleotidsekvens hocsom kan anvaendas vid framstaellning av en insulin produ rcende mikroorganism - Google Patents

Description

RSFl W (11)kuulutusjulkaisu ¢4640 MA 1 1 ' ' UTLÄGGNI NGSStCRIFT U ^ C {45) Patentti cyörnoity 12 1C 1933 (51) Kv.ik.'Jint.a.3 c /)2 N 15/00 SUOMI—FINLAND (11) —ρ»·ηη«ιβΐΜΐη* 781675 (22) Hikemlipttvl — Ansdknlnpdig 26.05.78 (23) Alkupllvl—Gtltlghuttdig 26.05*78 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentllj 28.11.78

Patentti· la rekisterihallitus .... οη no o, 1 (44) NlhtSviksIpanon ja kuuLJulkalnin pvm. — 31.UO.Oj

Patent· och registerstyrelsen An»ök*n utlagd och utUkriften pubticsnd (32)(33)(31) Pyydetty «uolkeu» —B*jtrd prlorltat 27· 05 · 77 09.06.77, 19.0U.78, 19.0U.78, 21.0U.78, 26.0U.78, 26.0U.78 USA(US) 8013U3, 805023, 897709, 897710, 898887, 899002, 899003 (71) The Regents of the University of California, 2200 University Avenue,

Berkeley, California 9U720, USA(US) (72) William J. Rutter, San Francisco, California, Howard Michael Goodman,

San Francisco, California, Axel Ullrich, San Francisco, California,

John Mitchell Chirgvin, San Francisco, California, Raymond Louis Pictet,

San Francisco, California, Peter Horst Seebure^ San Francisco, California, USA(US), John Shine, Curtin, A.C.T., Australia-Australien(AU) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä insuliinia koodaavan nukleotidieekvenssin sisältävän ja insuliinia tuottavan mikro-organismin valmistuksessa käytettävän yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av en kombinations-DNA-molekyl som innehäller en för insulin kodande nukleotidsekvens och som kan användas vid fram-ställning av en insulin producerande mikroorganism Tämä keksintö koskee menetelmää insuliinia koodaavan nukleoti- disekvenssin sisältävän ja insuliinia tuottavan mikro-organismin valmistuksessa käytettävän yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi.

Tässä selityksessä käytetään seuraavia symboleja ja lyhenteitä: DNA - deoksiribonukleiinihappo RNA - ribonukleiinihappo cDNA - komplementaarinen DNA

(syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sekvenssistä) mRNA - lähetti-RNA tRNA - siirtäjä-RNA

dATP - deoksiadenosiinitrifosfaatti 64640 2 dGTP - deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP - deoksisytidiinitrifosfaatti A - adeniini T - tyrniini G - guaniini C - sytosiini

Tris - 2-amino-2-hydroksietyyli-1,3-propaanidioli EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo ATP - adenosiinitrifosfaatti TTP - tymidiinitrifosfaatti

Hind III-tunnistuskohta - sekvenssi A ^AGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hind ΙΙΙ-endonukleaasin avulla Hsu I-tunnistuskohta - sekvenssi A IaGCTT, spesifisesti ti lohkaistu nuolen kohdalla Hsu I-endonukleaasin avulla.

Hae III-tunnistuskohta - sekvenssi GG Ice, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae ΙΙΙ-endonukleaasin avulla.

Col El - kolisiini El:ää muodostava plasmidi poly dA - polydeoksiadenylaatti oligo ^12-18 " °ligocieoksitymidylaatti (12-18 emästä)

Alu I-tunnistuskohta - sekvenssi AG ^CT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Alu I-endonukleaasin avulla.

BAm HI-tunnistuskohta - sekvenssi G ^GATCC, spesifisesti lohkaistu nuolen Bam HI - endonukleaasin avulla.

Bgl I-tunnistuskohta - sekvenssi GCCNNNN ^NGGC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Bgl I-endonukleaasin avulla (Huom: N tarkoittaa nukleotidia).

Eco Rl-tunnistuskohta - sekvenssi G ^AATTC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Eco RI-endonukleaasin avulla.

Eco RII-tunnistuskohta - sekvenssi IcCAGG tai icCTGG, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Eco RlI-endonukleaasin avulla.

Hae 11-tunnistuskohta - sekvenssi AGCGC iT, AGCGC Jr C , GGCGC 4'Γ tai GGCGC i C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae II-endonukleaasin avulla.

Hinc II-tunnistuskohta - sekvenssi GTTAAC, GTTGAC, GTCAAG tai GTCGAC, spesifisesti lohkaistu Hinc II-endonukleaasin avulla.

3 6 4 64 0

Pst I-tunnistuskohta - sekvenssi CTGCA^G, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Pst I-endonukleaasin avulla.

Sai I-tunnistuskohta - sekvenssi G JrTCGAC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sal I-endonukleaasin avulla. Sst I - tunnistuskohta - sekvenssi GAGCT^, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sst I-endonucleaasin avulla.

DNA:n emässekvenssin biologinen merkitys on siinä, että se on geneettisen informaation säilytyspaikka. On tunnettua, että DNA:n emässekvenssi on koodi, jonka, mukaisesti kaikkien solun valmistamien proteiinien aminohappojen järjestys määräytyy. Lisäksi sekvenssin osilla saattaa olla tehtävänä säädellä proteiinin valmistusajankohtaa ja määrää. Säätely-yksiköiden luonne tunnetaan vaillinaisesti. Kunkin säikeen emässekvenssiä käytetään templaattina, kun DNA toisiintuu solunjakaantumisessa.

Tapa, jolla DNA:n emässekvenssi-informaatiota käytetään proteiinien aminohappojärjestyksen määräämiseen, on pääpiirteiltään sama kaikilla elävillä organismeilla.

On osoitettu, että jokainen proteiineissa tavallisesti esiintyvä aminohappo määräytyy yhden tai useamman trinukleo-tidin eli triplettisekvenssin mukaan. Näin ollen jokaista proteiinia varten on olemassa vastaava DNA-segmentti, joka sisältää proteiinin aminohappojärjestystä vastaavan triplettisekvenssin. Geneettinen koodi on esitetty seu-raavassa taulukossa.

Geneettinen koodi

Fenyylialaniini. (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

Isoleusiini (Ile) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metion.iini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiinihappo (Asp) GAK

Seriini (Ser) QRS Glutamiinihappo (Glu) CAJ

Proliini (Pro) CCL Kysteiini (Cys) TGK

Treoniini (Thr) ACL Tryptofaani (Try) TGG

Alaniini (Ala) GCL Arginiini (Arg) WGZ

Tyrosiini (Tyr) TAK Glysiini (Gly) GGL

4 64640

Päätesignaali TAJ

Päätesigr.aali TGA

Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti tarkoittaa DNA:n trinukleotidia, jossa on 5'-pää vasemmalla ja 3'-pää oikealla. Kirjaimet edustavat puriini- ja pyrimidiiniemäk-siä, joista nukleotidisekvenssi muodostuu.

A = adeniini G = guaniini C = sytosiini T = tyrniini

X = T tai C, jos Y on A tai G X = C, jos Y on C tai T

Y = A, G, C tai T, jos X on C

Y = A tai G, jos X on T

W = C tai A, jos Z on A tai G W = C, jos Z on C tai T Z=A, G, C tai T, jos W on C Z = A tai G, jos W on A QR = TC, jos S on A, G, C tai T QR = AG, jos S on T tai C S = A, G, C tai T, jos QR, on TC S = T tai C, jos QR on AG J = A tai G K = T tai C L = A, T, C tai G M = A, C tai T

Transskriptioksi nimitetään ensimmäistä vaihetta siinä biologisessa prosessissa, jolla nukleotidisekvenssi-informaatio muunnetaan aminohapposekvenssiksi. Tässä vaiheessa kopioidaan ensin RNA:lla se DNA-segmentti, jonka sekvenssi määrittelee valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksi-riboosi on korvattu riboosilia ja tymiinin tilalla käytetään urasiilia. RNA:n emäkset voivat asettua samanlaisiksi emäspareiksi kuin DNA:n emäkset. Näin ollen DNA-nukleo-tidisekvenssin RNA-transskriptio on komplementaarinen kopioitavan sekvenssin kanssa. Tällainen RNA on nimeltään lähetti-RNA (mRNA), koska sen tehtävänä on toimia välittä- 5 64640 jänä solun geneettisen järjestelmän ja proteiineja syntetisoivan järjestelmän välillä.

Solun sisällä käytetään mRNA-.ta templaattina siinä monimutkaisessa prosessissa, johon sisältyy lukuisia entsyymejä ja solujärjestelmia, ja joka johtaa tietyn aminohapposekvenssin syntymiseen. Tätä prosessia nimitetään mRNArn translaatioksi.

Usein esiintyy myös lisävaiheita, joissa translaatio-prosessissa syntetisoitu aminohapposekvenssi muunnetaan funktionaaliseksi proteiiniksi. Insuliini on esimerkki tästä.

Insuliinin välitön prekursori on yksittäinen poly-peptidi, nimeltään proinsuliini, joka sisältää kaksi insuliiniketjua, A ja B, joita yhdistää peptidi C, ks. Steiner, D.F., Cunningham, D., Spigelman, L. ja Aten, B. Science 157, 697 (1967). Viimeaikaisen tiedon mukaan insuliinin mRNAtn alkuperäinen translaatiotuote ei ole proinsuliini vaan preproinsuliini, joka sisältää 20 lisäami-nohappoa proinsuliinin aminopäässä, ks. Cahn., S.J.,

Keim, P. ja Steiner D.F., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 1964 (1976) ja Lomedico, P.T. ja Saunders, G.F., Nucl.

Acids. Res. 3, 381 (1976). Preproinsuliinin rakenne voidaan esittää seuraavasti: NH0(pre-peptidi)-ketju B-(ketju O-ketju A-C00H.

Monet lääketieteen tai tutkimuksen kannalta merkittävät proteiinit sijaitsevat korkeampien organismien, kuten selkärankaisten, soluissa tai ovat näiden solujen valmistamia. Näitä ovat mm. insuliinihormoni, muut peptidihor-monit, kuten kasvuhormoni, verenpainetta säätelevät hormonit ja monet teollisesti, lääketieteellisesti tai tutkimuksellisesti merkittävät hormonit. Näitä proteiineja on usein vaikea uuttaa organismista käyttökelpoisia määriä, ja tämä ongelma on varsin vaikea ihmisistä peräisin olevien proteiinien kohdalla. Näin ollen tarvitaan menetelmiä, joilla tällaisia proteiineja voidaan valmistaa riittäviä määriä soluissa organismin ulkopuolella. Tietyissä tapauk- 6 64640 sissa on mahdollista saada aikaan sopivia solulinjoja, joita voidaan pitää elossa kudosviljelytekniikalla. Kudosviljely on kuitenkin hidasta, elatusaine kallista, olosuhteiden säätely tarkkaa ja saanto pieni. Lisäksi on usein vaikeata säilyttää solulinja vakiona siten, että halutut erityisominaisuudet säilyvät.

Sitä vastoin mikro-organismeja, kuten bakteereja, on suhteellisen helppo kasvattaa kemiallisesti määritellyissä elatus-aineissa. Fermentointitekniikka on pitkälle kehittynyttä. Organismien kasvattaminen nopeasti ja suurilla saannoilla on mahdollista. Lisäksi eräät mikro-organismit ovat·geeniensä ja omineisuuksiensa puolesta perusteellisesti tutkittuja ja tunnettuja.

Näin ollen on erittäin toivottavaa pystyä siirtämään lääketieteellisesti merkittävän proteiinin .geneettinen koodi organismista, joka tavallisesti tekee proteiinin,.sopivaan mikro-organismiin. Tällä tavalla mikro-organismi voi valmistaa proteiinia säädellyissä kasvuolosuhteissa ja'proteiinia voidaan.saada haluttu määrä. Valmistuskustannuksia voidaan ehkä myös oleellisesti pienentää, jos proteiinia valmistetaan tällaisella menetelmällä. Lisäksi, mahdollisuus eristää ja siirtää tietyn proteiinin valmistuksen määrittelevä geneettinen sekvenssi mikro-organismiin, jonka geneettinen tausta , tunnetaan hyvin, tarjoaa suuriarvoisen tutkimuskeinon, kun halutaan tietää, kuinka tämän proteiinin synteesi on säädelty ja kuinka proteiinia muokataan synteesin jälkeen..Geneettisiä sekvenssejä voida?· myös muuntaa niin, että saadaan terapeuttisilta tai funktionaalisiin ominaisuuksiltaan muuntuneita proteiineja.

Tämä keksintö sisältää menetelmän edellä selostettujen tavoitteiden saavuttamiseksi. Kyseessä on moni vaiheinani menetelmä, joka sisältää entsyymien katalysoimia reaktioita·. Näiden entsyymi-reaktioiden luonnetta selostetaan tähän mennessä tiedossa olevien seikkojen perusteella.

Käänteistransskriptaasi (DNA-polymeraasi) katalysoi RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesiä RNA-templaatin, DNA-templaatin ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin, dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, läsnäollessa. Reaktio lähtee käyntiin DNA-templaatin oi-kovalenttisella sitoutumisella mRNA:n 3'-päähän ja sen jälkeen seuraa tarvittavien deoksinukleotidien asteittainen liittäminen kasvavan ketjun 3'-päähän mRNA-nukleotidisekvenssin 7 64640 määrittelemänä emäspareina. Saatua molekyyliä voidaan pitää hiusneularakenteena, joka sisältää alkuperäisen RNA:n liittyneenä yksittäisellä DNA-säikeellä komplementaariseen DNA-säikeeseen. Käänteistransskriptaasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä DNA-templaattia, jolloin saatu tuote on kaksisäikeinen DNA-hiusneula, jonka toisessa päässä säikeitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972) ja Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.F. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).

Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka pystyvät hydrolysoimaan fosfodiesterisidoksia kaksisäikeises-sä DNAtssa niin, että DNA-säikeeseen muodostuu katkoskohta.

Jos DNA on suljetun silmukan muotoinen, silmukan rakenne muuttuu lineaariseksi. Tämän tyyppisen entsyymin pääaasi-allinen ominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tätä sekvenssiä nimitetään restriktio-endonukleaasin tunnistamiskohdaksi. Restriktioendonukle-aaseja on eristetty useista eri lähteistä ja karakterisoitu tunnistamiskohtiensa nukleotidisekvenssin perusteella. ;

Eräät restriktioendonukleaasit hydrolysoivat fosfodiesteri- sidokset samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että . . . 1 syntyy tylppä pää. Eräät katalysoivat sellaisten sidosten j hydrolyysiä, joita erottaa toisistaan muutama nukleotidi, ja molekyylin kumpaankin päähän syntyy vapaa yksisäikeinen alue. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomplementaa-risia ja siten kohesiivisia, ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenliittämiseen. Koska tietyn entsyymin voidaan ennustaa pilkkovan saman tunnistamiskoh-dan omaavia DMA-molekyylejä, syntyy samat kohesiiviset päät, ja näin ollen on mahdollista yhdistää restriktio- ,

endonukleaasilla käsiteltyjä heterologisia DNA-sekvensseja I

muihin samalla tavalla käsiteltyihin sekvensseihin, ks.

Roberts, R.J. Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Eestrik-tiokohdat ovat kuitenkin melko harvinaisia, mutta restriktio- 8 64640 endonukleaasien käyttökelpoisuutta on voitu parantaa syntetisoimalla sellaisia kaksisäikeisiä oligonukleotideja, joissa on tunnistamiskohtasekvenssi· Näin ollen voidaan melkeinpä mikä tahansa DNA-segmentti liittää mihin tahansa toiseen segmenttiin siten, että molekyylin päihin liitetään tarvittava restriktio-oligonukleotidi, tuote asetetaan tarvittavan restriktioendonukleaasin vaikutukselle alttiiksi niin, että syntyy tarvittavat kohesiiviset päät, k.s Heyneker, H.L., Shine, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W., Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. ja Riggs, A.D., Nature 263, 748 (1976) ja Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H. W., Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Sl-endonukleaasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan yksisäikeisen DNA:n fosfodiesterisidoksia tai kaksisäikeisessä DNAtssa olevia yksisäikeisiä liitoskohtia, ks. Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

DNA-ligaasi on entsyymi, joka kykenee katalysoimaan fosfodiesterisidoksen syntymisen kahden sellaisen DNA-seg-mentin välille, joissa on 5'-fosfaatti ja 3'-hydroksyyli, vastaavasti, ja jollainen saattaa muodostua kahdesta DNA-fragmentista, joita kohesiiviset päät pitävät yhdessä. Entsyymin normaalina toimintatapana pidetään sitä, että se yhdistää toisen säikeen rinnalle syntyvät useat tytär-DNA-fragmentit toisiinsa. DNA-ligaasi voi kuitenkin sopivissa olosuhteissa katalysoida sellaisten tylppien päiden yhtymisen, joissa kaksi tylppäpäistä molekyyliä yhtyy kovalent-tisesti, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 67, 1468 (1970).

Alkalinen fosfataasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan fosfaattiestereitä, DNA:n 5'-päätefosfaatit mukaanluettuina .

Tämän keksinnön sisältämän menetelmän osavaiheessa sijoitetaan tietty DNA-fragmentti DNA-vektoriin, kuten plasmidiin. Plasmidi on nimitys, jota käytetään mistä tahansa itsenäisesti replikoituvasta DNA-yksiköstä, joka on 9 64640 mikrobisolussa eikä kuulu isäntäsolun oinaan genomiin.

Plasmidi ei ole geneettisesti sitoutunut isäntäsolun kromosomiin. Plasmidi-DNA esiintyy rengasmaisina kaksisäikei-sinä molekyyleinä, joiden molekyylipaino tavallisesti on muutama miljoona, joidenkin jopa yli 10 , ja ne edustavat tavallisesti vain pientä prosenttimäärää solun kokonais-DNA:sta. Plasmidi-DNA voidaan tavallisesti suuren koko-eronsa vuoksi erottaa isäntäsolun DNA:sta. Plasmidit voivat toisiintua isäntäsolun jakaantumisnopeudesta riippumatta ja joskus niiden jakaantumisnopeutta voidaan säädellä kasvuolosuhteita muuttamalla. Vaikka plasmidi esiintyykin suljettuna renkaana, siihen voidaan keinotekoisesti liittää DNA-segmentti niin, että syntyy mole-kyylipainoltaan suurempi rekombinoitu plasmidi, jonka repli-koitumiskyky ja geenien ekspressiokyky eivät ole oleellisesti muuttuneet. Näin ollen plasmidi toimii hyödyllisenä vektorina, joka siirtää DNA-segmentin uuteen isäntäsoluun. Rekombinoitua DNA:ta käyttävään teknologiaan soveltuvia plasmideja ovat varsinkin sellaiset, jotka sisältävät va-lintarkoituksiin sopivia geenejä, kuten geenejä, jotka aiheuttavat lääkeaineiden vastustuskykyä.

Tämän keksinnön käytännöllisen toteutustavan valaisemiseksi selostetaan rotan insuliinigeenin eristäminen ja siirto.yksityiskohtaisesti. Kohteeksi valittiin insuliini, koska sillä on keskeinen merkitys kliinisessä lääketieteessä ja perustutkimuksessa. Alaan perehtyneet pystyvät selostetun menetelmän avulla eristämään insuliinigeenin organismista, ihminen mukaanluettuna.

Insuliini eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1922. Nykyisin tämän hormonin käyttö sokeritaudin hoidossa tunnetaan hyvin. Vaikka teurastamoilta tulevat naudan ja sian haimat ovat insuliinilähteitä, tästä hormonista tulee olemaan pulaa, koska diabeetikkojen määrä maailmassa kasvaa. Lisäksi joillakin diabeetikoilla kehittyy haitallinen allergia naudan ja sian insuliinille. Siksi on erittäin toivottavaa, jos pystyttäisiin tuottamaan riittävästi ihmisen insu- 10 64640 liinia maailmanlaajuista tarvetta tyydyttämään. Jos ihmisen insuliinia voitaisiin tuottaa bakteerien avulla, tämä päämäärä olisi saavutettavissa. Tämän keksinnön tekemiseen asti on päämäärän saavuttamista kuitenkin vaikeuttanut se, että ei ole ollut olemassa menetelmää, jolla insuliinigeeni voitaisiin siirtää bakteereihin.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) mRNA eristetään haimakudoksen saarekesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi 4-m guanidiumtiosyanaatin ja 0,05...1,0-m /3-merkaptoetanolin seosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribo-nukleaasihajoamista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNA:sta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsvymin avulla sellainen cDNA, jolla on insuliinia koodaava nukleotidisekvenssi, ja mainittu cDNA muutetaan kaksi-säikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistuskohtasekvens-sit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jälkeen cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteeriplasmidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n tai Eco RI:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla, esim. inkuboimalla pH:ssa 7,6 37°C lämpötilassa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jossa on ko-hesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivektorin 5'-fos-faattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasil-la pH:ssa 8,0 65°C lämpötilassa 30 minuutin ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät pääse liittymään toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plasmidivektori ja kohdassa c) saatu cDNA toisiinsa sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, esim. pH:ssa 7,6 14°C:ssa tunnin ajan, käyttäen molaarista ylimäärää plasmidivektoria, jotta saadaan insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli.

Tämän keksinnön sisältämän menetelmän käytännöllistä puolta valotetaan selostamalla rotan insuliinin nukleotidisekvenssin eris- 11 64640 täminen, siirto bakteereihin ja replikoituminen niissä. Samalla tavoin on rotan kasvuhormonin nukleotidisekvenssi eristetty, siirretty ja replikoitu bakteereissa. Menetelmä soveltuu myös ihmisestä eristetyn nukleotidisekvenssin, kuten ihmisen insuliinin ja kasvuhormonin sekä muiden polypeptidihormonien, siirtämiseen.

Tämä keksintö sisältää menetelmän, jolla tietyn nukleotidisekvenssin omaava DNA-molekyyli voidaan eristää ja siirtää mikro-organismiin ja alkuperäinen DNA:n nukleotidisekvenssi löytää replikoitumisen jälkeen organismista.

Tämän keksinnön sisältämän menetelmän eri vaiheet voidaan jakaa neljään ryhmään.

1. Halutun solukon eristäminen korkeammasta organismista

Tietyn proteiinin geneettiselle koodille on olemassa kaksi mahdollista lähdettä, nimittäin lähdeorganismin DNA tai DNA:n RNA-transkriptio. Yhdysvaltain kansallisten terveysinstituuttien (National Institutes of Health) tämän hetkisten turvallisuusvaatimusten mukaan ihmisen geenejä, olivatpa ne millaisia tahansa, voidaan sijoittaa rekombinoituun DNArhan ja sen jälkeen bakteereihin vain silloin, kun geenit ovat perusteellisesti puhdistettuja, tai kun käytössä on erityisen suuria riskejä sisältävälle työskentelylle tarkoitetut tilat (P4), ks. Federal Register, Voi. 41, No. 131, 1967-07-07, s. 27902 - 27943. Edullisesti lähdetään sellaisen spesifisen mRNA:n eristämisestä, joka sisältää halutun proteiinin koodin. Tässä toimintatavassa on lisäksi se etu, että solusta uutettu mRNA voidaan puhdistaa helpommin kuin solusta uutettu DNA. Varsinkin on mahdollista käyttää sitä seikkaa, että pitkälle erikoistuneissa organismeissa, kuten selkärankaisissa, on tietyissä paikoissa tiettyjä solukkoja, joiden tehtävänä on tuottaa jotakin kyseeseen tulevaa proteiinia. Vaihtoehtoisesti tällainen solukko voi esiintyä jossakin organismin kehitysvaiheessa. Suurin osa tällaisen solukon soluista eristetystä mRNArsta sisältää halutun nukleotidisekvenssin. Näin ollen eristettävän solukon ja eristysmenetelmän valinnassa voidaan ottaa huomioon ne edut, joita eristettävän mRNA:n alkuperäinen puhtausaste tarjoaa.

12 64640

Useimmissa kudoksissa, rauhasissa ja elimissä soluja yhdistää kuituinen sidekudos, joka on koostunut pääasiassa kollageenista, mutta voi kudoksesta riippuen sisältää myös muita rakenneproteiine-ja, polysakkarideja ja kivennäisainevarastoja. Solujen eristäminen tietystä kudoksesta edellyttää menetelmiä, joilla solut voidaan irroittaa sidekudoksesta. Tietyn erikoistuneen solutyypin eristäminen ja puhdistaminen sisältää näin ollen kaksi päävaihetta, jotka ovat solujen erottaminen sidekudoksesta ja halutun solutyypin erottaminen muuntyyppisistä kudoksen soluista. Esimerkkinä selostetaan menetelmä, jolla voidaan eristää haiman Langerhansin saarekkeet, jotka sopivat insuliinin mRNA-koodin eristämiseen.

Insuliinia tuottavia soluja voidaan johtaa muistakin lähteistä, kuten sikiöasteella olevan vasikan haimasta tai viljellyistä saarekekasvainsoluista. Puhtaiden saarekesolujen eristäminen on tällöin paljon yksinkertaisempaa, varsinkin jos käytetään puhtaita soluviljelmiä. Edellä selostettua saarekesolujen eristämismenetelmää ei tällöin tarvittaisi, mutta se on kuitenkin edullinen menetelmä yleisen käyttökelpoisuutensa vuoksi.

Usein voidaan havaita, että halutun mRNA:n osuutta voidaan lisätä, jos käytetään hyväksi solun kykyä reagoida ulkoisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi hormonikäsittely saattaa aiheuttaa halutun mRNA:n tuotannon lisääntymisen. Muita menetelmiä ovat kasvatus tietyssä lämpötilassa ja/tai tietyssä ravinteessa tai muussa kemiallisessa aineessa. Eristettäessä rotan kasvuhormonin mRNA:ta viljeltyjen rotan aivolisäkesolujen käsittely kilpirauhashormonilla ja glukokortikoideilla lisäsi synergistisosti kasvuhormonin mRNA:n määrää merkittävästi.

2. mRNA:n uuttaminen Tärkeä piirre tässä keksinnössä on se, että solu-uutteesta poistetaan RN-aasiaktiivisuus käytännöllisesti katsoen kokonaan. Uutettava mRNA on yksisäikeincn polynukleotidi, jossa ei ole mitään komplementaarista säiettä. Main ollen yhdenkin fosfodiesterisidok-sen hydrolyyttinen katkeaminen sekvenssissä tekisi koko molekyylin 13 64640 kykenemättömäksi siirtämään vahingoittumatonta geneettistä sekvenssiä mikro-organismiin. Kuten edellä mainittiin, RN-aasi on laajalle levinnyt ja se on hyvin aktiivinen ja poikkeuksellisen pysyvä.

Sitä on iholla, se kestää tavalliset lasitavaroiden pesumenetelmät ja joskus se kontaminoi orgaaniset kemikaalit. Haimasolu-uutteita käsiteltäessä vaikeudet ovat erittäin suuret, sillä haima tuottaa ruuansulatusentsyymejä ja on siten hyvin RN-aasipitoinen. RN-aasi-epäpuntaus koskee kuitenkin kaikkia kudoksia ja tässä selostettua RN-aasiaktiivisuuden tuhoamismenetelmää voidaan soveltaa kaikkiin soluinin. Menetelmän poikkeuksellinen tehokkuus esitetään muuttumattoman mRNA:n eristämisessä haiman, saarekesoluista.

Tässä keksinnössä käytetään kaotrooppisen anionin, kaotroop-pisen kationin ja disulfidisidoksia pilkkovan reagenssin yhdistelmää solujen rikkomisen aikana ja kaikkien niiden operaatioiden aikana, jotka tarvitaan käytännöllisesti katsoen proteiinit-toman RNä:n aikaansaamiseksi. Edellä mainittujen reagenssien yhteisvaikutuksen tehokkuus on todettu käytännössä eristämällä käytännöllisesti katsoen vahingoittumaton mRNA hyvällä saannolla rotan haimasta eristetyistä Langerhansin saarekkeista.

Sopivien kaotrooppisten ionien valinta riippuu niiden vesiliukoisuudesta ja saatavuudesta. Sopivia kaotrooppisia anioneja ovat mm. guanidinium, karbamoyyliguanidinium, guanyyliguanidinium, litium tms. Sopivia kaotrooppisia anioneja ovat mm. jodidi, perklo-raatti, tiosyanaatti, dijodisalisylaatti tms. Tällaisten anionien ja kationien muodostamien suolojen suhteellinen tehokkuus määräytyy niiden liukoisuuden mukaan. Esimerkiksi litiumdijodisalisylaatti on voimakkaampi denaturantti kuin guanidiniumtiosyanaatti, mutta sen liukenevuus on vain noin 0,1 M ja se on myös suhteellisen kallista, Guanidiniumtiosyanaatti on etusijalle asetettava kationi-anioniyhdistelmä, koska sitä on helposti saatavissa ja sen liukenevuus vesiliuoksiin · on hyvä, jopa noin 5 M.

Tioliyhdisteiden, kuten y^-merkaptoetanolin, tiedetään rikkovan tioli-disulfidivaihtoreaktiolla proteiinien molekyylinsisäisiä disulfidisidoksia. /^-merkaptoetanolin lisäksi tunnetaan useita sopivia tioliyhdisteitä, kuten ditiotreitoli, kysteiini, propanoli-dimerkaptaani tms. Vesiliukoisuus on tarpeellinen vaatimus, sillä tioliyhdistetta pitää olla läsnä suuri ylimäärä molekyyllnsisäisiin 14 64640 disuliideihxn verrattuna, jotta vaihtoreaktio tapahtuisi käytännöllisesti katsoen täydellisesti. y^-merkaptoetanoli on asetettava etusijalle, koska sitä on helposti saatavissa kohtuulliseen hintaan.

Tietyn kaotrooppisen suolan tehokkuus on suoraan verrannollinen sen väkevyyteen, kun halutaan inhiboida RN-aasi uutettaessa RNA:ta soluista tai Kudoksista. Edullinen väkevyys on sen vuoksi suurin väkevyys, joka voidaan käytännössä toteuttaa. Sen, että tässä keksinnössä onnistutaan säilyttämään mRNA vahingoittumattomana uuton aikana, arvellaan johtuvan siitä nopeudesta, jolla RN-aasi denaturoituu, ja denaturoitumisasteesta. Näin ilmeisesti selittyy guanidiniumtiosyanaatin paremmuus hydrokloridiin nähden, vaikka hydrokloridi on denaturointiaineena vain hieman heikompi. Denatu-rointiaineen tehokkuus määritellään siksi kynnysväkevyydeksi, joka tarvitaan proteiinin täydelliseen denaturoimiseen. Toisaalta proteiinien denaturoitumisnopeus riippuu usein denaturantin väkevyyden suhteesta kynnysarvoon 5 -10 potenssiin korotettuna, ks. Tanford, C.A. , Adv. Prot. Chein. 23 , 121 ( 1968 ). Kvalitatiivisesti tämä suhde merkitsee sitä, että guanidiniumhydrokloridia vain hieman tehokkaampi denaturantti pystyy denaturoimaan proteiinin monta kertaa nopeammin samana konsentraationa.

Disulfidisidoksia katkaisevan reagenssin käyttö yhdessä denaturantin kanssa tekee mahdolliseksi jälkimmäisen vaikutuksen ja tehostaa sitä, koska RN-aasimolekyyli muuttuu kokonaan avautuneeksi. Tioliyhdistecn ajatellaan auttavan denaturointiprosessin etenemistä, koska se estää nopean denaturoinnin, joKa voi tapahtua, jos mo1ekyy1insisaiset disulfidisidokset jätetään koskemattomiksi. Lisäksi mRNA-valmisteen sisältämä RN-aasiepäpuhtaus säilyy käytännöllisesti katsoen inaktiivisena, vaikka denaturanttia ja tiolia ei olisikaan läsnä. Disulfidisidoksia katkaisevat reagenssit, joissa on tioliryhmiä, ovat jossain määrin tehokkaita minä tahansa konsentraationa, mutta on edullista käyttää suurta tioliryhmien ylimäärää molokyylinsisäisiin disulfidisidoksiin verrattuna, sillä tällöin vaihtoreaktio saadaan ajetuksi molokyy1insisäisten disulfi-disidosten katkeamisen suuntaan. Toisaalta koska monet tioliyhdis-teet ovat pahanhajuisia ja suurten väkevyyksien kanssa on epämiellyttävä työskennellä, on käytännön syistä olemassa väkevyyden yläraja. Kun /3-merkaptoetanolia käytetään vahingoittumattoman RNA:n erottamiseen rotan haimasta, on alueella 0,05-1,0 M olevat väkevyydet havaittu tehokkaiksi, ja optimaalisen väkevyyden katsotaan olevan 0,2 M.

64640 Väliaineen pH voi olla missä tahansa välillä 5,0-8,0, kun mRNA uutetaan soluista.

Solujen rikkomisen jälkeen RNA erotetaan solun proteiineista ja DNArsta. Tähän tarkoitukseen on kehitetty useita menetelmiä, jotka kaikki sopivat ja ovat alaan perehtyneiden tuntemia. Ennestään käytetty tavallinen menetelmä on etanolisaostus, jolla RNA saostetaan selektiivisesti. Tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä on edullisempaa jättää saostusvaihe pois ja kerrostaa homogenaat-ti suoraan 5,7 M cesiumkloridiliuokseen sentrifugiputkessa ja sen jälkeen suorittaa sentrifugointi seuraavassa julkaisussa kuvatulla tavalla: Glisin, V., Crkvenjakov, R. ja Byus, C., Biochemistry 13, 2633 (1974). Tämä menetelmä on edullinen, koska RN-aasille vahingollinen ympäristö voidaan säilyttää koko ajan ja saadaan hyvällä saannolla RNA:ta, joka ei sisällä DNA:ta eikä proteiinia.

Edellä kuvatulla menetelmällä saadaan soluhomogenaatin koko RNA puhdistetuksi. Tästä RNA:sta on kuitenkin haluttua mRNA:ta vain osa. Puhdistusta jatkettaessa käytetään hyväksi sitä seikkaa, että korkeampien organismien soluissa mRNA:ta prosessoidaan transkription jälkeen siten, että siihen liitetään polyadenyyli-happoa. Tällainen poly-A-sekvensseja sisältävä mRNA voidaan erottaa selektiivisesti kromatografiapylväässä, jossa on täytteenä selluloosaa, johon on liitetty oligotymidylaattia, ks. Avis, H. ja Leder, P. edellä. Edellä kuvattu menetelmä on sopiva silloin, kun tarvitaan käytännöllisesti katsoen puhdasta, vahingoittumatonta ja translaatiokelpoista mRNA:ta RN-aasia runsaasti sisältävistä lähteistä.

Tietyissä tapauksissa, kuten käytettäessä kudosviljelmäso-luja rnRNA-lähteenä, RN-aasiepäpuhtaus voi olla niin vähäinen, ettei edellä kuvattua RN-aasin inhibointia tarvita. Tällöin ennestään tunnetut RN-aasiaktiivisuuden poistomenetelmät riittävät.

3. cDNA:n muodostaminen Tässä yhteydessä viitataan kuvaan 1, jossa on kaavioesitys menetelmän jäljellä olevista vaiheista. Nyt on ensimmäisenä vaiheena puhdistetun mRNA:n kanssa komplementaarisen DNA-sekvenssin muodostaminen. Tämän reaktion entsyymiksi valitaan käänteistranskriptaa-si, vaikka periaatteessa voitaisiin käyttää mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka kykenee muodostamaan komplementaarisen DNA-säikeen käyttämällä mRNA:ta templaattina. Reaktio voidaan suorittaa ennes- 16 64640 tään tunnetuissa olosuhteissa siten, että mRMA:ta käytetään templaattina ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin seosta DNA- säikeer. prekursorina. On edullista, jos yksi deoksinukleosiditrifos- 32 faateista on merkitty oC-asemassa P-atomilla, sillä sen avulla voidaan seurata reaktiota, se toimii merkkinä erotusmenetelmissä, kuten kromatografiässä ja elektroforeesissa, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia päätelmiä, ks. Efstratiadis, A., et ai·3 edellä.

Kuten kuvasta ilmenee, käänteistranskriptaasin reaktio-tulos on kaksisäikeinen hiusneularakenne, jossa RNA-säiettä ja DNA-säiettä yhdistää toisiinsa ei-kovalenttinen sidos.

Kaänteistranskriptaasireaktion tuote poistetaan reaktio-seoksesta tunnetuilla menetelmillä. On havaittu hyödylliseksi käyttää fenoliuuton, kromatografiän ("Sephadex G-100", Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja etanoliuuton yhdistelmää.

Kun cDIJA on syntetisoitu entsymaattisesti, RNA-templaatti voidaan poistaa. Ennestään tunnetaan useita menetelmiä, joilla RNA voidaan hajottaa selektiivisesti DNAtn läsnäollessa. Emäshydrolyysi on edullinen menetelmä, koska se on hyvin selektiivinen ja sitä voidaan helposti säädel1ä pH:n avulla.

Lmäshydrolyysm ja neutraloinnin jälkeen P:llä merkitty cDNA voidaan haluttaessa väkevöidä etanolisaostuksella.

Tällaisen kaksisälkeisen hiusneula-cDNA:n syntetisointi tapahtuu sopivan entsyymin, kuten DNA-nolymeYwasin tai käänteistranskriptaasin avulla. Reaktio-olosuhteeet ovat aikaisemmin kuvatun kaltaiset, /32 . . . . .

P:llä merkitty nukleosiditrifosfaatti mukaanluettuna. Käänteis— transkriptaasia saadaan useista lähteistä. Linnun myeloblastosis-virus on edullinen lähde. Virusta on saatavissa tohtori D.J. Beard'ilt. Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida', joka valmistaa virusta National Institutes of Health'in kanssa tekemällään sopimuksella.

Kun cDHA-hiusneula on muodostettu, saattaa olla edullista puhdistaa se reaktioseoksesta. Kuten aikaisemmin mainittiin, on havaittu edulliseksi käyttää fenoliuuttoa, kromatografiaa ("Sephadex G-100") ja etanolisaostusta, kun DNA halutaan saada puhdistetuksi proteiiniepäpuhtauksista.

17 64640 hiusneularakenne voidaan muuntaa tavalliseksi kaksisäikei-seksi DNA-rakenteeksi siten, että komplementaarisia säikeitä yhdistävä yksittäinen säie poistetaan. On olemassa useita entsyymejä, jotka kykenevät spesifisesti hydrolysoimaan DNA:n yksisäikeisiä osia. Tähän tarkoitukseen hyvin sopiva entsyymi on Aspergillus oryzaesta eristetty Sl-nukleaasi (valmistaja Miles Research Products, Elkhart, Indiana)Kun DNA-hiusneularakenne käsitellään Sl-nukleaasilla, saadaan hyvällä saannolla sellaisia molekyylejä, joissa on emäsparipäät. Tämän jälkeen suoritetaan uutto, kroma-tografia ja etanolisaostus, kuten edellä on kuvattu. Efstratiadis et ai. ovat edellä mainitussa julkaisussa selostaneet mRNA:n kaksi-säikeisten cDNA-transkriptioiden syntetisointia käänteisen transkrip-taasin ja S.l-nukleaasin avulla.

Tylppäpäisten cDNA-molekyylien osuutta voidaan mahdollisesti lisätä, jos suoritetaan käsittely E. colin DNA-polymeraasi I:llä neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Entsyymin cksonukleaasiaktiivisuuden ja polymoraasiaktiivisuudcn yhteisvaikutus toimii siten, että ulkoneva 3'-pää poistuu ja ulkoneva 5'-pää täyttyy. Mäin voidaan varmistaa, että· mahdollisimman suuri määrä cUHA-molekyylejä osallistuu seuraavan vaiheen liittämisreak— tioihin.

Keksinnön sisältämän menetelmän seuraavassa vaiheessa käsitellään cDNA-tuotteen päät niin, että kuhunkin päähän saadaan restrik-tioen.donukleaasin tunnistamiskohdan sekvenssi. Käytännön syyt määräävät päihin liitettävän DNA-fragmentin valinnan. Päihin lisättävä sekvenssi valitaan restriktioendonukleaasin perusteella ja tämä puolestaan valitaan sen DNA-vektorin perusteella, johon cDNA liitetään. Valittavassa plasmidissa pitäisi olla vähintään yksi kohta, johon restriktioendonukleaasin katkaisuvaikutus voi kohdistua. Esimerkiksi plasmidi pMB9 sisältää yhden tunnistamiskohdan entsyymille Kind III. Hind III eristetään Haemophilus influenzaesta ja puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Smith, H.O. ja Wilcox, K.'W. , J.Mol. Biol. 51 , 379 (1970 ). Haemophilus aegyptious-organismin entsyymi Hae III puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchison III, C.A., J. Virol. 10, 42 (1972). Haemophilus suis-organismin entsyymi, Hsu I, katalysoi saman paik-kaspesifisen hydrolyysin samassa tunnistamiskohdassa kuin Hind III. Näin ollen näitä kahta entsyymiä voidaan pitää funktionaalisesti vaihtoehtoisina.

18 64640

Kaksois-cDNA:n päihin liittämistä varten on edullista käyttää kemiallisesti syntetisoitua kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III:n tunnistamiskohdan. Kaksisäikeisen dekanukleo-tidin sekvenssi on esitetty kuvassa 1,.ks. Heyneker, H.L. , et ai. ja Scheller, R.H., et ai. edellä. Alalla työskenteleville on tarjolla useita tällaisia tunnistamiskohtasekvenssejä, ja tästä syystä on mahdollista valita kaksois-DNA:n päät, kussakin tapauksessa tarvittavalle restriktioendonukleaasille sopiviksi.

Restriktiokohtasekvenssien liittäminen cDNA:n päihin voidaan toteuttaa menetelmällä, jota nimitetään tylppään päähän liittämiseksi, ja jolloin katalysoidaan DNA-ligaasilla, joka on puhdistettu seuraavalla menetelmällä: Panet, A., et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Edellä mainitut Sgaramella, V., et ai. ovat selostaneet tylppään päähän liittämisreaktiota. Tylppään päähän liittämisessä, jossa reaktio tapahtuu tylppäpäisen cDNA:n ja suuren molaarisen ylimäärän kanssa kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III endonukleaasin tunnistamiskohdan, saadaan tuotteeksi cDNA, jonka kummassakin päässä on Hind III:n restriktio-kohtasekvenssi. Kun reaktiotuote käsitellään Hind III-endonukleaa-silla, tapahtuu katkeaminen restriktiokohdassa ja muodostuu yksi-säikeiset itsekomplementoituvat 5'-päät, kuten kuvasta 1 ilmenee.

4. Yhdistelmä-DNA:n siirtovektorin muodostaminen Tällä hetkellä käyttöön hyväksyttyjä sopivia siirto-vektoreita ovat rcuti. useat bakteriofagilambdajohdannaiset (ks. esiia. Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E., Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.A.,

Grunwald, D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schuram, J.W.,

Sheldon, E.L. ja Smithies, 0., Science 196, 161 (1977)) ja col El-plasmidijohdannaiset (ks. esim. Rodriguez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanism, in the Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J. Rutter, C.E. Γοχ, Eds. (Academic Press, NY, 1976) ss.

471-477). Col El:stä johdetuille plasmideille on ominaista suhteellisen pieni koko, sillä niiden molekyylipaino on muutaman miljoonan luokkaa, ja se, että normaaliolosuhteissa plasmidi-DNA:n kopioiden luku isantäsolu.a kohti on 20-40, mutta se saadaan nostetuksi tuhanteen tai sitäkin suuremmaksi, kun isäntäsolut käsitellään kloramfeni-kolilla. Isäntäsolun kyky suurentaa sisältämäänsä geenimääraä tekee 19 64640 tietyissä olosuhteissa tutkijan säädellessä mahdolliseksi sen,' että isäntäsolu tuottaa pääasiassa plasmidigeenien koodaamia proteiineja. Näin ollen tällaiset col El-johdannaiset ovat edullisia siirto-vektoreita tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä. Sopivia col El-johdannaisia ovat mm. plasmidit pMB-9, jonka sisältämä geeni aiheuttaa vastustuskyvyn tetrasykliinille, ja pBR-313, pBR-315, pBR-316, p3R-317 ja pBR-322 , jotka sisältävät tetrasykliini-· resistenssigeenin ja ampisilliiniresistenssigeenin. Resistenssiä aiheuttavan geenin läsnäolo tarjoaa sopivan keinon, jolla voidaan valita solut, jotka ovat infektoituneet plasmidilla, sillä tällaiset pesäkkeet kasvavat lääkkeen läsnäollessa, mutta jos plasmidia ei ole, solut eivät kasva. Tämän selityksen sisältämässä esimerkeissä käytettiin col El:stä johdettua plasmidia, joka sisälsi e.m.

resistenssigeenin ja yhden Hind III-tunnistus-kohdan.

Plasmidia pBR-322 on pitkälle karakterisoitu.

Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 95) on kuvannut tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin. Plasmidin e pBR322 molekyylipaino on 2,7 x 10 daltonia (Bolivar F.,

Gene 4 (1978) 121), ja se sisältää ampisilliiniresistens-

R R

sin (Ap :n) ja tetrasykliiniresistenssin (Te :n) aiheutta-

R

vat geenit. Edellä mainitussa Ap -geenissä on yksi

R

endonukleaasin Pst 1 tunnistuskohta. Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista endonukleaaseista:

Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi pBR322 sisältää yhden Eco Rl: n tunnistuskohdan, kaksi Hind II:n tunnistuskohtaa, viisi Eco RII:n tunnistuskohtaa, kolme Bgl I:n tunnistus-kohtaa, 12 Alu I:n tunnistuskohtaa, 12 Hae II:n tunnistus-kohtaa ja 17 Hae III:n tunnistuskohtaa. Tunnistuskohdat on merkitty renkaan muotoiseen pBR322-plasmidiin sivulla 103

D

Bolivarin et ai. julkaisussa. Ap -geeni häviää lohkaistaessa plasmidi Pst I:n tunnistuskohdasta ja liitettäessä n vierasta DNA:ta siihen. Samoin Te häviää lohkaistaessa pBR 322 endonukleaaseilla Hind III, Vai I tai Bam I ja liitettäessä vierasta DNA:ta niiden tunnistuskohtaan.

20 64640

Liitettäessä DNA Pst I:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi- naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka 5 ovat sekä ampisilliinisensitiivisiä (Ap ) että tetrasyklii-

R

ni resistenttejä (Te ) samoin liittämällä DNA Hind III:n Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi-naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliini-sensitiivisiä. Siirtäjävektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun neljään tunnistuskohtaan liitettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtäjä vektorin lääkeaine resistenssiominaisuuksien perusteella eli siitä, onko se ampisilliinisensitiivinen ja tetrasykliiniresis-tentti tai ampisilliiniresistentti ja tetrasykliini-sensitiivinen. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida poistamalla siihen liitetty vieras DNA, määrittämällä muodostuneiden kahden tuotteen molekyylipaino ja vertaamalla näitä lähtöaineiden molekyylipainoihin. Lisäksi karakterisointia voidaan täydentää merkitsemällä siirtäjävektoriin eri endonukleaasien tunnistuskohdat. Siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi voidaan myös määrittää. Mainitun plasmidin pBR322 koko nukleotidisekvenssi on esitetty J. Sutcliffen väitöskirjassa "Nucleotide Sequence of pBR322", Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA.

Samoin plasmidia pBR313 on pitkälle karakterl---soitu. Tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin ovat kuvanneet Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 75).

g

Plafemidin pBR313 molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia, ja se sisältää ampisilliiniresistenssin (Ap ) ja tetrasyk- liiniresistenssin (Te ) aiheuttavat geenit. Plasmidin

P

pBR313 Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista nukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Plasmidin pBR313 tunnistuskohdat eri endonukleaaseille on määritetty täydellisesti, ja tästä tuloksena saatu tunnis-tuskohtakartta on esitetty sivulla 8U öolivarin et ai. julkaisussa. Liitettäessä vierasta DNA:ta Hind III:n.

Sai I:n tai Bam Hirn tunnistuskohtaan tetrasykliiniresis-tenssi häviää. Täten yhdistelmä-DNA-molekyylejä löydetään 64640 kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtäjävektori voidaan karakterisoida lääkeaineresistenssiominaisuuksien, siirretyn DNA-sekvenssin, restriktioentsyymien tunnistuskohtakartan ja edellä mainittujen molekyylipainojen perusteella.

Kolmas plasmidi, jota on pitkälle karakterisoitu, on pMB 9. Tämän plasmidin valmistusmenetelmän ovat esittäneet Rodriguez, R.L. et ai. (edellä) ja Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 75). Plasmidin pMB 9 g molekyylipaino on 3,5 x 10 daltonia, ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan geenin. Tämä plasmidi Sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seu-raavista endonukle*a§eistar Eco Rl, Hind III, Sal I ja Bam HI. Näistä kolmen jälkimmäisen tunnistuskohdat si-jaitsevat Te -geenissä. Liitettäessä vierasta DNA:ta Hind III:n, sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetra-sykliiniresistenssi häviää. Siirtäjävektori, joka sisältää vierasta DNA:ta joissakin näistä kohdista, voidaan karakterisoida tämän ominaisuuden perusteella. Tämä siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi, vertaamalla molekyyli-painoja ja tunnistuskohta-analyysillä, kuten edellä on kuvattu.

Plasmidia pSCIOI on pitkälle karakterisoitu. Cohen, S.H et ai. (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293) ovat kuvanneet tämän plasmidin syntetisoinnin ja alustavan karakterisoinnin. Karakterisointia ovat täydentäneet Cohen, S.N. et ai (Proc.Nat.Acad. Sei.USA 70 (1973) 32^0 Boyer, H.W. et ai (Recombinant Molecules), Beers, R.F. ja Basset, E.G. toim. , Raven Press, New York, s. 13 (1977) ja Cohen, S.N. et ai (Recombinant Molecules, s. 91).

g

Plasmidin pSCIOI molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia,

R

ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan geenin. Te -geeni sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seuraavista endonukleaaseistä: Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi plasmidi pSCIOI sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, yhden Hpa I:n tunnistuskohdan, yhden Sma . I:n tunnistuskohdan ja neljä Hinc II:n tunnistuskohtaa. Tetrasykliiniresistenssi häviää halkaistaessa pSCIOI endo-nukleaaseilla Hind III, Sal I tai Bam HI ja liitettäessä vierasta DNA:ta näiden tunnistuskohtaan. Liitettä- 64640 22 essä DNA Hind III:n, sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan rekombinaatiomolekyylsjä löydetään viljelmistä, jotka ovat tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtäjävektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun kolmeen kohtaan liitettyjä vierasta DNA:ta, voidaan karaketerisoida siirtä-jävektorin resistenssiominaisuuksien perusteella. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida (a) poistamalla siirretty vieras DNA-sekvenssi, määrittämällä molekyylipainot ja vertaamalla niitä keskenään, (b) laatimalla tunnistuskohtakartta ja (c) määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi.

Voidaan käyttää useita vektoreita transformoitaessa Bacillus subtilista. Nämä vektorit on johdettu mikro-organismista Staphylococcus aureus (ks. Fordanescu, S., J. Bakteriol. 124 (1974) 597 ja Ehrlich, S. D., Pröc.

Nat. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 1680). Näillä plasmideilla on määrätty resistenssi ja niillä on määrättyjä restriktio-endunukleaasitunnistuskohtia. Esimerkiksi plasmidilla pC194 aikaansaadaan resistenssiä klooriamfenikolille .(Cm), se sisältää yhden ainoan Hind ΙΙΙ-kohdan ja sen molekyyli-paino 23 64640 g on 1,8 x 10 daltonia. Vieras DNA liittyy siten plasmidin pC194 Hind ΙΙΙ-kohtaan. Vieraan DNAtn sisältävä siirto-vektori voidaan karakterisoida sen resistenssin perusteel-la (Cm ). Siirtovektori voidaan myös karakterisoida poistamalla liitetty DNA määrittelemällä kahden tuotteen mo-lekyylipaino, verrattuna lähtöaineiden molekyyli-painoon. Voidaan myös määrittää liitetyn DNA:n sekvenssi.

Rekombinoidut plasmidit muodostetaan siten, että sekoitetaan keskenään restriktioendonukleaasilla käsiteltyä plasmidi-DNA:ta ja cDNArta, jonka pääteryhmät ovat vastaavasti käsitellyt. Plasmidi-DNA:ta käytetään suuri molaarinen ylimäärä cDNA:han verrattuna, jotta cDNA-segmentit muodostaisivat mahdollisimman vähän kombinaatteja toistensa kanssa.

On edullista käyttää sellaista menetelmää, jolla niiden pesäkkeiden lukumäärä saadaan mahdollisimman pieneksi, joista rekombinoitua plasmidia etsitään.

Menetelmässä toimitaan siten, että restriktioendonukleaasilla katkaistu plasmidi-DNA käsitellään alkalisella fosfataasilla (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, Freehold,

New Jersey). Alkalinenfoefataasi poistaa 5'-päiden fosfaatit endonukleaasin synnyttämistä plasmidin päistä ja estää plasmidi-DNA:n itseligaation. Näin ollen renkaanmuodos-tus ja samalla transformaatio riippuu siitä, että tapahtuu 5'-fosforyloidut päät sisältävän DNA-fragmentin liittyminen. Kuvattu menetelmä vähentää ilman rekombinaatiota tapahtuvan transformaation suhteellista esiintymistä määrään, joka on alle 1-10 .

Tämä keksintö perustuu siihen, että DNA-ligaasin katalysoima reaktio tapahtuu DNA:n 5'-fosfaattipääteryhmän ja DNA:n 31-hydroksyylipääteryhmän välillä. Jos 5'-fosfaatti puuttuu, ei liittymisreaktiota tapahdu. Kun kaksisäikei-set DNA:t pitää yhdistää, on olemassa kolme tilannetta, kuten taulukosta 1 ilmenee.

24 64640

Taulukko 1

Tapaus Reagoivat yhdisteet Ligaasituote ' i - I 3’ 5' 3' 5’ --n;1 H o ro- -o-p-o-- -ΟΡΟ-,Η + 2 3HO-- -O-P-O--+2H2° 5’ 3’ 5’ 3’ II 3’ 5’ 3’ 5’ -OH l!2C ?-0---O-P-O-- -OH + OH---OH HO--2^ 5’ · 3’ 5’ 3’ III 3’ 5’ _0Il _ ei reaktiota -OH + HO- 5’ 3’

Taulukossa 1 on kaksisäikeinen DNA esitetty kaaviolli-sesti yhtenäisinä yhdensuuntaisina viivoina ja niiden vastaavat 5’- ja 3'-pääteryhmät on merkitty hydroksyy-leiksi (OH) tai fosfaateiksi (OPO^H^). Tapauksessa I on kummassakin reagoivassa molekyylissä päissä 51-fosfaatti, ja näin ollen molemmat säikeet yhtyvät toisiinsa kovalent-tisesti. Tapauksessa II on liitettävistä päistä vain toisessa 5'-fosfaatti ja näin ollen vain toinen liitettävistä säikeistä liittyy toiseen kovalenttisesti ja toiseen säikeeseen jää epäjatkuvuuskohta. Kovalenttisesti liittymätön säie pysyy assosioituneena liittyneeseen säikeeseen vetysiltojen avulla, jotka esiintyvät vastakkaisten säikeiden komplementaaristen emäsparien välillä. Tapauksessa ITI ei kummassakaan reagoivassa päässä ole 5'-fosfaattia eikä yhdistymisreaktiota tapahdu.

Näin ollen pitää poistaa 5'-fosfaattiryhmä sellaisesta päästä, jonka liittyminen toiseen halutaan estää.

25 64640 Käytettäväksi sopii mikä tahansa 51-fosfaattiryhmän poistomenetelmä, joka ei muuten vahingoita DNA-rakennetta.

Mieluiten käytetään alkalisen fosfataasin katalysoimaa hydrolyysiä.

Edellä kuvattu menetelmä on hyödyllinen myös siinä tapauksessa, että lineaarinen DNA-molekyyli halutaan katkaista kahteen alafragmenttiin, tavallisesti restriktio-endonukleaasia käyttämällä, ja sen jälkeen rekontruoida alkuperäiseksi sekvenssiksi. Alafragmentit voidaan puhdistaa erikseen ja haluttu sekvenssi voidaan rekontruoida yhdistämällä alafragmentit. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää DNA-ligaasia, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colista saatua ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, I.R., J. Biol. Chem 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointia restriktio-endonukleaasikäsittelyllä saaduista alafragmenteista parantaa suuresti se, jos voidaan käyttää menetelmää, jossa sopimattomien sekvenssien rekonstruoinnilta vältytään. Sopimaton tulos voidaan välttää, jos halutun sekvenssin omaava homogeenisen pituinen cDNA fragmentti käsitellään reagenssilla, joka kykenee poistamaan 5'-päätefosfaatti-ryhmät cDNA:sta ennen kuin homogeeninen cDNA lohkeaa res-triktioendonukleaasin vaikutuksesta. Tässä alkalinen fosfataasi on edullinen entsyymi. 51-päätefosfaatit ovat rakenteellinen edellytys DNA-ligaasin alafragmentteja yhdistävälle vaikutukselle. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää kovalenttisesti, joissa ei ole 5'-päätefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan yhdistää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5’-päätefosfaatin, joka on muodostunut restriktioendonukleaasin eristettyyn DNA:hän kohdistaman katkaisevan vaikutuksen tuloksena.

26 6 4 64 0

Edellä selostettu menettely estää sopimattomimman liittymisreaktion, nimittäin sen, että kaksi fragmenttia liittyy käänteisessä järjestyksessä eli takaosa etuosaan eikä etuosa takaosaan. Muita mahdollisia sivureaktioita, kuten dimeroitumista tai renkaanmuodostusta ei saada estetyiksi, koska nämä tapahtuvat reaktiotyypin II mukaisesti, vrt. taulukkoa 1 edellä. Tällaiset sivureaktiot ovat kuitenkin vähemmän haitallisia, koska ne johtavat fysikaalisesti indentifioitaviin ja erotettaviin tuotteisiin, kun taas käänteinen rekombinaatio ei sitä tee.

Edellä kuvattujen menetelmien valaisemiseksi rotan insuliinin cDNA-koodi on eristetty ja rekombinoitu plasmi-din kanssa. DNA-molekyyleillä transformoituva bakteerikanta oli E. coli X-1776. Transformoidut bakteerit erotettiin suorittamalla viljely tetrasykliinipitoisessa kasvualustassa. Erään transformoitujen solujen sisältämän rekombinoidun plasmidin DNA:n havaittiin sisältävän liittyneen DNA-fragmentin, jonka pituus oli noin 410 nukleotidia. Samalla menetelmällä eristettiin ja analysoitiin myös muita rekombinantteja. Liitetyt fragmentit irroitettiin plasmi-dista Hind III- tai Hsu I-endonukleaasikäsittelyllä ja niiden DNA-sekvenssi analysoitiin seuraavalla menetelmällä: Maxam, A.M. ja Gilbert, W. , Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 74, 560 (1977). Liitettyjen DNA-fragmenttien nukleo-tidisekvenssi havaittiin ylipitkäksi ja se sisälsi koodin rotan koko proinsuliini I:lle ja prepeptidisekvenssin kolmelletoista aminohapolle, kaikkiaan 23 aminohaposta. Jäljempänä on esitetty, millainen tämä nukleotidisekvenssi on.

Juuri kuvatulla menetelmällä voidaan eristää ja puhdistaa korkeamman organismin geeni, myös ihmisen geeni, ja siirtää se mikro-organismiin, jossa se replikoituun Selostuksessa kuvataan uusia rekombinoituja plasmideja, jotka sisältävät eristetyn geenin kokonaan tai osia siitä.

64640

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä kuvataan rotan insuliinin mRNA:n uutto ja eristys, sille komplementaarisen DNA:n syntetisointi ja karakterisointi. Rotan saarekesolujen valmistamiseksi nukutetun rotan haima infusoitiin Hank'in suolaliuoksella infusoimalla takakautta haimatiehyeeseen. Hank’in suolaliuos on alaan perehtyneiden tuntema standardiliuos, jota myy mm. Grand Island Biological Supply Company,

Grand Island, New York. Haima poistettiin, jauhettiin Hank'in liuoksessa 0°C:ssa ja kollagenaasin ja soijapavun 'trypsiini-inhibiittorin annettiin vaikuttaa. Kaikki toimenpiteet suoritettiin 0-4°C:ssa, ellei toisin ilmoiteta. Viimeksimainitun toimenpiteen olosuhteet olivat erittäin kriittiset. 30 millilitran lasiputkeen laitettiin kaksi jauhettua rotan haimaa Hank'in liuoksessa niin, että kokonaistilavuudeksi tuli 8 ml. Kaikki lasiputket oli esi-käsitelty silikonilla ("Siliclad", Clay-Adams Divison, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey). Inkuboin-tiseos sisälsi 12 mg kollagenaasia, joka on Clostridium histolyticumista valmistettu entsyymi (valmistusmenetelmä: Mandi, I., Mackennan, J.D. ja Howes, E.L., J. Clin. Invest. 32, 1323 (1943)), tyyppi CLS IV, ja jota saa Worthington Biochemical Corporationista, Freehold,

New Jersey, ja 1 mg soijapavun trypsiini-inhibiittoria, jota saa Sigma Chemical Companystä, St. Louis, Missouri. Putkea ravisteltiin nopeudella 90 ravistusta minuutissa 37°C:ssa 25 minuutin ajan. Kollagenaasin vaikutuksen optimaalista edistymistä oli tarkkailtava jatkuvasti.

Jos inkubointi oli liian lyhyt, saarekesolujen irtaantuminen jäi epätäydelliseksi, ja jos inkubointiaika oli liian pitkä, saarekesolut- alkoivat liueta. Inkuboinnin jälkeen putkea sentrifugoitiin 1 minuutti nopeudella 200 r/min. Emäliuos dekantoitiin ja hiukkaset pestiin Hank'in liuoksella, ja sentrifugointi ja pesu toistettiin yhteensä viisi kertaa. Lopullisen sentrifugoinnin jälkeen hiukkaset suspendoitiin 15 ml:aan "Ficoll"-liuosta (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Ruotsi), jonka tiheys oli 1,085. Sen jälkeen lisättiin 8 ml "Ficoll"-liuosta, jonka tiheys oli 1,080, 5 ml "Ficoll"-liuosta, jonka tiheys oli 1,060, 2* 6 4 6 4 0 ja putkea sentrifugoitiin heiluvassa kuppiroottorissa ensin 5 minuuttia nopeudella 500 r/min ja sen jälkeen 5 minuuttia nopeudella 2000 r/min. Tämän menettelyn seurauksena rakkulasolut jäivät putken pohjalle ja saarekesolut nousivat gradienttiin ja muodostivat rintaman kahden ylimmän kerroksen väliin. Saarekesolukerros sisälsi epäpuhtauksina hermosoluja, imusolmukkeita ja sidekudosta. Suuret epäpuhtaushiukkaset poistettiin materiaalista kerroksessa. Materiaalin loppuosa sijoitettiin leikkelymikroskooppiin, ja näkyvät epäpuhtaudet poistettiin käsin mikropipetillä. Tämän jälkeen soluvalmiste sekoitettiin Hank'in liuokseen ja sentrifugoitiin. Emäliuos dekantoitiin ja solumateri-aali varastoitiin nestemäiseen typpeen.

200 rotasta kootut saarekesolut homogenisoitiin U°C:ssa 4M guanidiniumtiosyanaatissa ("Tridom",

Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Sveitsi), joka sisälsi 1 MyVmerkaptoetanolia, ja joka oli puskuroitu pH-ar-voon 5,0. Homogenaatti kerrostettiin 1,2 ml:n kanssa 5,7 M CsCl, joka sisälsi 100 mM EDTA, ja sentrifugoitiin 15°C:ssa 18 tuntia nopeudella 37 000 r/m Beckman-ultra-sentrifugin roottorissa SW 50,1 (Beckman Instrument Company, Fullerton, California). RNA kulkeutui putken pohjalle.

Polyadenyloitu RNA eristettiin koko RNA-valmis-teesta kromatografisesti oligo(dT)selluloosan avulla menetelmällä, jonka ovat esittäneet Aviv, H. ja Leder, P., vrt. edellä.

Rotan Langerhansin saarekkeiden koko polyadenyloitu RNA transkriboitiin cDNA:ksi linnun myeloblastosis-viruk-sen käänteistransskriptaasin avulla, joka oli saatu tohtori D.J. Beard'ilta (Life Science Inc., St. Petersburg, Florida). Reaktio tapahtui seoksessa, jossa oli 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 9 mM MgCl2> 30 mM NaCl, 20 mMyö-merkapto-etanolia, 1 mM kutakin kolmea deoksiribonukleosiditrifos-faattia, joissa ei ollut radioaktiivisuutta, 250 ^uM

neljättä deoksinukleosiditrifosfaattia, joka oli merkit- 32 ty Ot- P:llä, jonka spesifinen aktiivisuus oli 50-200 Ci/mol, 20 ^ug/ml oligo-dT-^_18 (Collaborative Research, Waltham, Massachusetts), 100 ^ug/ml polyadenyloitua RNA:ta ja 2 00 yksikköä/ml käänteistransskriptaasia. Seosta inkuboi- 29 6 4 6 4 0 tiin 45°C:ssa 15 minuuttia. Tämän jälkeen lisättiin EDTA-Na^ niin, että väkevyydeksi tuli 25 mM, liuos uutettiin itsensä suuruisella tilavuudella fenolia, joka oli kyllästetty vedellä, ja sen jälkeen vesifaasi kromatografoitiin Sephadex G-100-pylväässä (halkaisija 0,3 cm, korkeus 10 cm) käyttämällä eluenttia, jossa oli 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl ja 2 mM EDTA. Välisiiatilavuudella eluoituneer seen nukleiinihappoon lisättiin ammoniumasetaattia, pH 5,0, niin, että väkevyydeksi tuli 0,25 M, ja saostettiin etanolilla. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla, liuotettiin 50 ^ulraan juuri valmistettua 0,1 M NaOH ja inku-boitiin 20 minuuttia 70°C:ssa niin, että RNA hydrolysoitui.

Seos neutraloitiin lisäämällä IM natriumasetaattia, pH 4,5, 3 2 ja P'-cDNA-tuote saostettiin etanolilla ja liuotettiin veteen. Osa yksisäikeistä cDNA:ta analysoitiin natiivilla polyakryyliamidigeelillä seuraavalla menetelmällä: Dingman, C.W. ja Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659, (1968).

32

Geelit kuivattiin ja if-DNA tutkittiin autoradiografiällä käyttäen "Kodak No-Screen NS-2T"-filmiä (Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York). Elektroforeesi-kuvion mukaan arvioituna cDNA oli heterodisperssi. Tunnettujen standardien mukaan arvioituna se sisälsi ainakin yhtä cDNA-lajia, jossa oli noin 450 nukleotidia.

Esimerkki la

Toistettiin esimerkki 1, käyttäen kuitenkin eri /i)-merkaptoetanolipitoisuuksia saarekesolujen homogeni-sointivaiheessa, nimittäin 0,05 M, 0,2 M, 0,6 M ja 0,8 M. Kaikilla näillä pitoisuuksilla saatiin sama lopputulos, eli mRNA:n hajoaminen RN:aasin vaikutuksesta ei tapahtunut.

Esimerkki Ib

Toistettiin esimerkit 1 ja la, käyttäen kuitenkin eri pH:ta saarekesolujen homogenisointivaiheessa, nimittäin pH 6,0, 7,0 ja 8,0. Kaikilla näillä pH-arvoilla saatiin sama lopputulos, eli mRNA:n hajoamista RN:aasin vaikutuksesta ei tapahtunut.

30 64640

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä kuvataan rotan insuliinin kaksi-säikeisen cDNA:n syntetisointi ja karakterisointi. Komplementaarisen säikeen syntetisoimiseksx esimerkissä 1 tuotteeksi saatu yksicäikemen cDNA käsiteltiin käänteis- transskriptaa.silla.ReaKlioseos sisälsi 50 ^ Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl^, 10 mH ditiotreitolia, 50 mM kutakin kolmea deoksiribonukleosiditrifosfaattia, jotka eivät 3 2 olleet radioaktiivisesti merkittyjä, 1 mM oi.- P:llä merkittyä nukleosiditrifosfaattia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 1-10 Ci/mmol, 50 /Ug/ml cDNA ja 220 yksik-r köä/ml käänteistransskriptaasia. Reaktioseosta inkuboi-tiin 120 minuuttia 45°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA-Na2 niin, että väkevyydeksi tuli 25 mM, uutettiin fenolilla, kromatografoitiin Sephadex G-100:lla ja saostettiin etanolilla. Erä reaktiotuotetta, jonka aktiivisuus oli 500-1000 sykäystä minuutissa, analysoitiin geelielektroforeesilla esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Standardinäytteisiin vertaamalla löydettiin hetero-disperssi kaista, jonka pituus oli noin 450 nukleotidia.

Erä esimerkin 1 ja esimerkin 2 DNA-reaktiotuotetta käsiteltiin erikseen restriktioendonukleaasilia Hae III ja suoritettiin samanlainen geelielektroforeesi. Endonukleaasi katkaisi kummankin tuotteen ja geelielektroforeesissa havaittiin kaksi radioaktiivista kaistaa. Kaksisäikeisen cDNA:n katkaisussa syntyneet kaistat edustivat käytännöllisesti katsoen samanpituisia tuotteita kuin yksisäi-keisen cDNA:n katkaisussa syntyneet.

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä selostetaan, kuinka esimerkissä 2 valmistettuun kaksisäikeiseen rotan saareke-cDNA:hän kytketään Hind III'n dekanukleotiditunnistamiskohta tylppään päähän tapahtuvana liittämisenä. Esimerkin 2 kaksi-säikeistä reaktiotuotetta, jonka väkevyys oli 2-5 ^,ug/ml, käsiteltiin ensin 30 minuuttia 22u:ssa ja sitten 15 minuuttia 10°C:ssa 30 yksiköllä Sl-nukleaasia, jonka aktiivisuus oli 1200 yksikköa/ml (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana), liuoksessa, jossa oli 0,03 M natriumasetaattia, 4,5, 0,3 M nairiumkloridia ja 4,5 mM ZnC^· Reaktio lope- 31 64640 tettiin lisäämällä Tris-emästä niin, että loppuväkevyy-deksi tuli 0,1 M, EDTA:ta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 25 mM, ja E. colin tRNArta (valmistettu seuraavalla menetelmällä: von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, S.P. Colowick ja N.O. Kaplan, Eds., Voi. 12A, s. 588 (1967)) 40 yUg/ml. Reaktioseos uutettiin fenolilla, kroma- tografoitiin Sephadex G-100:lla ja välisijatilavuudella 32 eluoitu P-cDNA saostettiin etanolilla. Tällä käsittelyllä saatiin hyvällä saannolla cDNA-molekyylejä, joissa oli emäsparipäät, jotka tarvitaan kemiallisesti syntetisoitujen dekanukleotidien liittämiseksi tylppään päähän.

Hind ΙΙΙ-dekameerit valmistettiin seuraavalla menetelmällä: Scheller, R.H. Dickerson, R.E., Boyer, H.W.,

Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Hind ΙΙΙ-dekameerien liittäminen cDNArhan suoritettiin inkuboimalla 1 tunti l^°C:ssa liuoksessa, jossa oli 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM ditio-treitolia, 3 mM Hind III dekameeria, jonka aktiivisuus oli 105 sykäystä minuutissa pikomoolia kohti, ja noin 500 yksikköä/ml T4 DNA-ligaasia. Tämän jälkeen reaktioseosta kuumennettiin 65°C:ssa 5 minuuttia ligaasin inaktivoimi-seksi. Sitten käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 150 yksiköl-lä/ml Hsu I- tai Hind ΙΙΙ-endonukleaasia ja tämän jälkeen lisättiin kaliumkloridia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 50 mM,^-merkaptoetanolia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 1 mM, ja EDTArta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 0,1 mMf New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts, myy Hind III- ja Hae III-endonukleaasi^. Reaktiotuote analysoitiin geelielektroforeesilla samoin kuin esimerkissä 1 ja havaittiin piikki, joka vastasi noin 450 nukleotidin sekvenssiä, ja lisäksi Hind ΙΙΙ-dekameerien katkenneita fragmentteja.

Esimerkki 3a

Eco-RI-dekanukleotiditunnustamiskohdat kytkettiin esimerkin 2 mukaiseen cDNA:han, kuten on selitetty esimerkissä 3. (Eco-RI-dekameerit oli valmistettu Scheller et ai:n edellä mainitun artikkelin mukaisesti, ja niillä oli sekvenssi 5'-CCGAATTCGG-3'). Tämän jälkeen tuote digestoitiin Eco'RI:llä, jolloin käytettiin samoja 32 64640 reaktio-olosuhteita kuin edellä (ks. digestointi Hsu I:llä ja Hind 111:11a). Eco Rl saatiin New England Prolabs’ilta. Reaktiotuote analysoitiin geelielektroforeettisesti (kuten esimerkissä 1 on selitetty), ja todettiin noin 450 nukleotidin sekvenssiä vastaava piikki, sekä Eco-RI-dekameerien fragmentteja.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä muodostetaan rekombinoitu plasmidi ja karakterisoidaan se replikoitumisen tapahduttua.

Plasmidi pMB-9 DNA (valmistusmenetelmä: Rodriguez, R.L., Boliver, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M., ICN-UCLA symposium on Molecular and Cellular Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter ja C.F. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976), ss. 471-477) katkaistiin Hind III-restriktiokohdasta Hsu I-endonukleaasilla, ja sen jälkeen käsiteltiin alkalisella fosfataasilla BAPF (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Reaktio-seoksessa oli entsyymiä 0,1 yksikköä 1 ^ug DNA:ta kohti ja inkubointi tapahtui 25 mM Tris-HCl-liuoksessa, pH 8, 65°C:ssa 30 minuutin ajan, ja sen jälkeen fosfataasi poistettiin fenoliuutolla. Etanolisaostuksen jälkeen lisättiin fosfataasilla käsitelty plasmidi-DNA cDNA:han, jossa oli Hind III-kohesiiviset päät, niin, että suhteeksi tuli 3 moolia plasmidia 1 cDNA-moolia kohti. Seosta inkuboitiin 1 tunti 14°C:ssa liuoksessa, jossa oli 66 mM Tris, pH 7,6, 6,6 mM MgCI^, 10 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP ja 50 yksikköä/ml T4 DNA-ligaasia.

Seos lisättiin suoraan E.coli X-1776-solususpen-sioon, jonka solut oli valmistettu transformaatioon seuraavasti. Soluja kasvatettiin 37°C:ssa solutiheyteen g noin 2 x 10 solua/ml 50 ml:ssa ravinneliuosta, joka sisälsi 10 g/1 tryptonia, 5 g/1 hiivauutetta, 10 g/1 nat-riumkloridia, 2 mM natriumhydroksidia, 100 ^ug/ml diaminopimeliinihappoa ja 40 ^,ug/ml tymiiniä. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla 5 minuuttia nopeudella 5 000 r/min 5°C, suspendoitiin 20 ml:aan kylmää 10 mM natriumkloridiliuosta, sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin jälleen transformointipuskuriin, jossa oli 75 mM CaCl^, 140 mM NaCl ja 10 mM Tris, pH 7,5, ja pidettiin 5 minuuttia jäässä. Tämän jälkeen solut sentrifugoitiin 33 64640 ja suspendoitiin jälleen 0,5 mitään transformaatiopus-kuria. Transformaatio suoritettiin sekoittamalla keskenään 100 ^,ul solususpensiota ja 50 ^,ul rekombinoitua DNA: ta (1 ^.ug/ml) . Seosta inkuboitiin ensin 15 minuuttia 0°C:ssa, sitten H minuuttia 25°C:ssa ja lopuksi 30 minuuttia 0°C:ssa. Sitten solut siirrettiin agarmaljoihin valituissa olosuhteissa kasvatettaviksi.

Rekombinoitujen plasmidien seulonta tapahtui siten, että läsnä oli 5 ^ug/ml tetrasykliiniä Hind III-kohdan transformaatiota varten. Tietty rekombinantti, nimeltään pAU-Γ, eristettiin. Epäpuhtaita plasmidivalmis-teita, joissa oli 2-5 ^,ug pAU-l:stä eristettyä DNAtta, käsiteltiin Hsu'I-endonukleaasiylimäärällä. Lisättiin EDTA-Na2:ta niin, että loppuväkevyydeksi tuli 10 mM, ja sakkaroosia niin, että loppuväkevyydeksi tuli 10 % (paino/tilav) ja seos erotettiin polyakryyliamidi-geelillä (8 %). DNA löydettiin kohdasta, joka vastasi noin HIO emäsparin pituutta.

Esimerkki Ha. (i) Esimerkki H toistettiin, paitsi että .plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR-322 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla tavalla (Gene 2 (1977) 95). Käytetyt olosuhteet olivat muuten samat, paitsi että yhdistelmäkloonien lopullinen selektio suoritettiin viljelemällä niitä väliaineessa, joka sisälsi 20 ^ug/ml tetrasykliiniä. Yhdistelmäklooniin siirretty DNA-sekvenssi erotettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin HIO emäsparin pituinen DNA-fragmentti, jonka nukleotidi-sekvenssi on esitetty taulukossa 1.

(ii) Esimerkki H toistettiin, paitsi että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Gene 2 (1977) 75). Käytetyt olosuhteet olivat muuten samat paitsi että yhdistelmä-kloonien lopullinen selektio suoritettiin kohdassa (i) 34 64640 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin HIO emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1.

(iii) Esimerkki 4 toistettiin, paitsi että plasmidin pMB-9 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSCIOI DNA:ta, joka oli valmistettu Cohenin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Proc. Nat. Acad. Sei.

USA 70 (1973) 1293). Käytetyt olosuhteet (yhdistelmä-kloonien selektiomenetelmä mukaanlukien) olivat esimerkin 4 mukaiset. Yhdistelmäklooniin siirretty DNA-sekvenssi erotettiin, jolloin saatiin noin 410 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 4b. Esimerkit 4 ja 4a toistettiin, paitsi että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E.colia RRI tai E. colia H3101. Käytetyt olosuhteet olivat samat kuin esimerkissä 4 ja 4a, ja saatiin samat tulokset.

Esimerkki 5

Esimerkin 4 mukaista plasmidin pAU-1 DNArta puhdistettiin edelleen elektroforeesilla 6 % polyakryy-liamidigeelillä. Tämän jälkeen DNA eluoitiin geelistä

. OO

ja merkittiin inkuboimalla P-ATP:n ja polynukleo- tidikinaasin kanssa Maxam'in ja Gilbert'in kuvaamissa olosuhteissa(ks. Proc.Natl.Acad,Sei., USA, 74 (1977) sivut 560-). Entsyymi katalysoi radioaktiivisen fosfaat-tiryhmän siirtymisen f1 'P-ATP:stä DNA:n 5'-päihin. Entsyymi saatiin E. colista seuraavalla menetelmällä: Panet, A., et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Näin merkitty DNA katkaistiin Hae III-endonukleaasilla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja molemmat fragmentit, joista toisessa oli noin 265 ja toisessa noin 135 emäs-paria, erotettiin polyakryyliamidigeelillä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eristetyt fragmentit saatettiin alttiiksi spesifisille katkaisureaktioille ja suoritettiin sekvenssianalyysi edellä mainitulla Maxam’in ja Gilbert'in menetelmällä. Taulukossa 1 on esitetty 35 6 4 6 4 0 yhdistelmä tämän koesarjan tuloksista ja samanlaisten koesarjojen tuloksista, joissa tutkittiin cDNArta käyttämällä Col El:stä johdettuja plasmidivektoreita, kuten pMB-9 ja pBR-322. Sekvenssin 5'-päässä on määrittelemätön noin 50-120 nukleotidia sisältävä sekvenssi ja 3'-päässä olevan poly-dA:n pituus vaihtelee. Sekvenssi on aikaansaatu parhaan tämänhetkisen tiedon perusteella. Vastaava rotan proinsuliini I:n aminohapposekvenssi alkaa numerolla 1 merkitystä triplettikohdasta ja loppu numerolla 86 merkittyyn triplettikohtaan. Katkoviivalla merkitty sekvenssi on vielä hieman epävarma.

-/ *~ U *7 0 S §" § s s e e, ί: og υ o:? u y ^ u -r U ,T1 *lt

υ * uH

o ö S y u ^ υ U < < u > H >^ · -r. < u P ^ ί; u t-. 0 u y « u ?· 13 ^ ^ ϋ: {j ^ S cy ^ 3 ~ μ H Su 5? £ h £ « u d

U h 2 2 H

U U < H .

u ^ o u h *

Ö - ö s ^ O

f-· s a y ^ t H u ^ H p 5 H 2 < U 2 :* bs 13 . b s £ £

U o d · · u c ^ u ‘H

3 ^ o S u 8 « U u S ^ U il) £ -ö >- Ö 5 g « -¾ s? g s p y 5 •—H U υ u u < m

3 r- U O H H 'H

T) ^ H H H t!0

H H υ U < 3 P

U < ί ^ u 4' Ö · H ϋ ö 21 g e ss § i:

r-x UI O

P H “ y 3! <» u υ « -i <, 3 u 9f < O H1, -tl

U ύ ΰ ti H

u P o υ .f 3 y ° U υ H ^

! H ^ y u -H

{ υ · li u ίο ^ r ' 2< s oi: - ί ^ t R u u < } « l; - ί y 3 S i-

-Ö l- U <J

f—I

oj (

P • H

>4 **0 ,2 37 64640

Esimerkki 6 Tässä esimerkissä eristetään, puhdistetaan ja siirretään ihmisen insuliinin nukleotidisekvenssi plasmidiin oleellisilta osiltaan esimerkeissä 1-4 kuvatulla tavalla lähtien ihmisen haima-kudoksesta, joka on saatu esim. luovutetusta haimasta tai juuri kuolleen ruumiista tai haimasaarikasvaimesta. Oleellisilta osiltaan esimerkissä 4 kuvatulla tavalla valmistetaan mikro-organismi, joka sisältää ihmisen insuliinin A-ketjun ja B-ketjun nukleotidisekvenssi-koodin. Ihmisen insuliinin A-ketjun tunnettu aminohapposekvenssi on seuraava: 1 10 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys- Ser- Leu- Tyr- .

20 ·

Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

Ihmisen insuliinin B-ketjun tunnettu aminohapposekvenssi on seuraava: 1 10 Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- 20 30

Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

Aminohapposekvenssit on numeroitu siitä päästä, jossa on vapaa aminoryhmä, ks. Smith, L.F., Diabetes 21 (suppl. 2), 458 (1972).

Claims (1)

1. 64640 38 Patenttivaatimus Menetelmä insuliinia koodaavan nukleotidisekvens-sin sisältävän ja insuliinia tuottavan mikro-organismin valmistuksessa käytettävän yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) mRNA eristetään haimakudoksen saarekesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi 4-m gua-nidiniumtiosyanaatin ja 0,05...1,0-m /J-merkaptoetanolin seosta pHrssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNArn ribonukleaa-sihajoamista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNArsta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sellainen cDNA, jolla on insuliinia koodaava nukleotidi-sekvenssi, ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-kohtasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNArn päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jälkeen cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteeriplasmidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla esim. inku-boimalla pHrssa 7,6 37°C lämpötilassa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jossa on kohesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek-torin 51-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasilla pHrssa 8,0 65°C lämpötilassa 30 minuutin ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät pääse liittymään toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plasmidivektori ja kohdassa c) saatu cDNA toisiinsa sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, esim. pHrssa 7,6 14°C:ssa tunnin ajan, käyttäen molaarista ylimäärää plasmidivektoria, jotta saadaan insuliinia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä yhdietei-mä-DNA-molekyyli. 39 6 4 6 4 0 Förfarande för framställning av en kombinations-DNA-molekyl som innehäller en för insulin kodande nukleo-tidsekvens och som kan användas vid framställning av en insulin producerande mikroorganism, kännetecknat därav, att a) mRNA isoleras ur öceller av bukspottkörtel-vävnad genom att homogenisera dessa i närvaro av ett ribo-nukleas inhiberande ämne vilket kan utgöras t.ex. av en blandning av 4-m guanidiumtiocyanat och 0,05 - 1,0-m /&-merkaptoetanol, vid ett pH av 5,0 - 8,0, varvid säledes nägot ribonukleassönderfall av mRNA ej sker, b) ur den erhällna mRNA framställes pä i och för sig känt sätt med tillhjälp av ett reverstransskriptasenzym en sadan cDNA, vilken har en för insulin kodande nukleo-tidsekvens, och den nämnda cDNA oravandlas tili tväträdig, c) tili den erhällna tväträdiga cDNArns ändar fo-gas restriktionsendonukleasens igenkänningsställesekvenser pä i och för sig känt sätt, varvid säsom restriktionsendo-nukleas användes samtna enzym som i följande steg d) , var-efter cDNA kapas med tillhjälp av nämnda restriktionsendo-nukleas sä, att kohesiva ändar uppstär, d) en bakterieplasmidvektor öppnas med tillhjälp av en restriktionsendonukleas, t.ex. med Hind III, Hsu I eller Eco RI, pä och i för sig känt sätt t.ex. genom att inkubera vid ett pH av 7,6 och en temperatur av 37°C i 2 timmar, för erhällande av en öppnad plasmidvektor med kohesiva ändar, e) den i punkt d) erhällna plasmidvektorns 5'-fos-fatändgrupper hydrolyseras genom behandling med t.ex. al-kalisk fosfatas vid ett pH av 8,0 och en temperatur av 65°C i 30 minuter, varvid de i punkt d) nämnda kohesiva ändarna ej kan förenas med varandra f) den enligt punkt e) behandlade plasmidvektorn och den i punkt c) erhällna cDNA kopplas tili varandra pä i och för sig känt sätt, genom att inkubera i närvaro av en DNA-ligas och ATP, exempelvis vid pH 7,6 och temperatu-