PL140200B1 - Method of obtaining recombined bacterial plasmide containing polynucleotide of insuline coding sequence - Google Patents

Method of obtaining recombined bacterial plasmide containing polynucleotide of insuline coding sequence Download PDF

Info

Publication number
PL140200B1
PL140200B1 PL1978207176A PL20717678A PL140200B1 PL 140200 B1 PL140200 B1 PL 140200B1 PL 1978207176 A PL1978207176 A PL 1978207176A PL 20717678 A PL20717678 A PL 20717678A PL 140200 B1 PL140200 B1 PL 140200B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
sequence
plasmid
cdna
cells
Prior art date
Application number
PL1978207176A
Other languages
English (en)
Other versions
PL207176A1 (pl
Original Assignee
University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US05897710 external-priority patent/US4363877B1/en
Priority claimed from US05/898,887 external-priority patent/US4264731A/en
Application filed by University Of California filed Critical University Of California
Publication of PL207176A1 publication Critical patent/PL207176A1/pl
Publication of PL140200B1 publication Critical patent/PL140200B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57518—Placental lactogen; Chorionic somatomammotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia zrekombinowanego plazmidu bakteryjnego za¬ wierajacego nukleotydowa sekwencje kodujaca hormon insuline. Plazmid otrzymany sposobem wedlug wynalazku przenosi sie do mikroorganiz¬ mu, w którym DNA moze sie replikowac i ewen¬ tualnie modyfikuje sie ten mikroorganizm.Wytworzony sposobem wedlug wynalazku zre- kombinowany plazmid o specyficznej sekwencji nukleotydowej pochodzacej z wyzszego organizmu oraz mikroorganizm zawierajacy jako czesc swego genetycznego wyposazenia te specyficzna sekwen¬ cje nukleotydowa, kodujaca insuline, sa nowe.Wedlug wynalazku plazmid wytwarza sie przez ekstrakcje mRNA kodujacego insuline z komórek izolowanych z organizmu wytwarzajacego insuli¬ ne, wydzielenie tego mRNA, synteze pierwszej ni¬ ci cDNA o sekwencji kodujacej insuline na mRNA jako matrycy, synteze drugiej nici cDNA na pier¬ wszej nici jako matrycy z wytworzeniem dwunicio- wego DNA i sprzezenie tego dwuniciowego DNA z plazmidem bakteryjnym, sposobem polegajacym na tym, ze: a) homogenizuje sie komórki wyizolo¬ wane z organizmu wytwarzajacego insuline w o- becnosci kompozycji inhibitujacej RNaze, zawie¬ rajacej anion chaotropowy, kation chaotropowy i srodek przerywajacy wiazanie dwusiarczkowe i ekstrahuje sie mRNA z komórek, b) oddziela sie w sposób znany poliadenylowany mRNA od innych komponentów zhomogenizowanych komó- 2 rek, c) inkubuje sie wydzielony mRNA z odwrot¬ na transkryptaza w obecnosci dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, z wytworzeniem nici cDNA kodujacej insuline, d) inkubuje sie cDNA z odwrotna tran- 5 skryptaza lub polimeraza DNA w obecnosci dATP, dCTP, dGTP i dTTP z wytworzeniem dwunicio¬ wego DNA, e) do konców dwuniciowego DNA do¬ daje sie w sposób znany wiazaca sekwencje DNA komplementarna * do konców po odszczepieniu 10 przez endonukleaze represyjna wybrana do od- szczepienia bakteryjnego plazmidu E. coli, do któ¬ rego ma byc przylaczony dwuniciowy DNA, f) odszczepia sie plazmid bakteryjny wybrana endonukleaza represyjna i odszczepiony plazmid 15 poddaje sie dzialaniu alkalicznej fosfatazy, po czym g) inkubuje sie dwuniciowy DNA, zawiera¬ jacy wiazace sekwencje i plazmid bakteryjny pod¬ dany dzialaniu alkalicznej fosfatazy w obecnosci ligazy DNA i ATP z wytworzeniem plazmidu * majacego sekwencje nukleotydowa kodujaca in¬ suline.W sposobie wedlug wynalazku jako uklad ha¬ mujacy aktywnosc RNAazy stosuje sie uklad za- 25 wierajacy anion i kation chaotropowy oraz czyn¬ nik rozrywajacy wiazanie dwusiarczkowe, taki jak p-merkaptoetanol. Stosowanym kationem chaotropowym korzystnie jest kation guanidynio- wy, a anionem chaotropowym anion tiocyjania- *• nowy. 140 2003 Korzystnie jako uklad hamujacy aktywnosc RNAazy stosuje sie uklad zawierajacy 4 m roz¬ twór tiocyjanianu guanidyniowego i 0,2 m 0-mer- kantoetanóla. w* etapie g) sposobu wedlug wynalazku inkubu- *je sie plazmid bakteryjny z dwuniciowym cDNA zawierajacymi polinukleotyd o sekwencji koduja¬ cej, insuline; • przy czym wybrane aktywne konce czasteczek DNA zabezpiecza sie przed wzajem¬ nym polaczeniem sie za pomoca poddania ich wste¬ pnej obróbce odczynnikiem zdolnym do usuniecia koncowych grup 5' fosforanowych, razem z enzy¬ mem ligaza DNA.Taki sposób postepowania zabezpiecza laczenie sie ze soba aktywnych konców poddanych wste¬ pnej obróbce.Jako czynnik odpowiedni do wstepnej obróbki aktywnych konców stosuje sie alkaliczna fosfataze.Polaczenie mikroorganizmu z plazmidem bak¬ teryjnym zwiazanym z DNA prowadzi do otrzy¬ mania mikroorganizmu o sekwencji kodujacej in¬ suline.Przy wytwarzaniu plazmidu bakteryjnego zawie¬ rajacego polinukleotyd o sekwencji kodujacej in¬ suline, sposobem wedlug wynalazku, w etapie a) z organu wytwarzajacego insuline, np. z wstepnie oczyszczonych komórek wysepek Langerhansa trzustki lub tkanki nowotworu wysepek izoluje sie komórki zawierajace mRNA kodujacy insuli¬ ne przez poddanie tkanki zawierajacej te komór¬ ki i inne, dzialaniu enzymu hydrolitycznego i in¬ hibitora trypsyny, po czym frakcjonuje sie hydro- lizowana tkanke i z uzyskanych komórek zasad¬ niczo wolnych od komórek zanieczyszczajacych i komórkowego debris ekstrahuje sie mRNA w obecnosci ukladu hamujacego aktywnosc RNA¬ azy, po czym w etapie b) oddziela sie poliadeny- lowany mRNA zasadniczo od bialka, DNA i in¬ nych RNA i c) syntetyzuje sie jednoniciowy cDNA zawierajacy polinukleotyd o sekwencji kodujacej insuline, po czym w etapie d) syntetyzuje sie dwuniciowy cDNA, w którym jedna nic zawiera nukleotyd o sekwencji komplementarnej do sek¬ wencji mRNA i e) plazmid bakteryjny zawiera¬ jacy aktywne konce, zdolny do laczenia sie z dwuniciowym cDNA laczy sie w etapie g) z dwuniciowym cDNA zawierajacym polinukleo¬ tyd o sekwencji kodujacej insuline i uzyskuje plazmid bakteryjny zawierajacy polinukleotyd o sekwencji koduJ4cej insuline. Wytworzony sposo- '< bem wedlug wynalazku plazmid bakteryjny laczy sie ewentualnie z mikroorganizmem w celu uzys¬ kania mikroorganizmu zawierajacego polinukle¬ otyd o sekwencji kodujacej insuline.Jako enzym hydrolityczny odpowiedni do wy¬ odrebniania komórek wysepkowych z trzustki stosuje sie empirycznie wyselekcjonowany prepa¬ rat kolagenazy, przy czym reakcje hydrolizy pro¬ wadzi sie w szklanym, silifconowanym naczyniu lub w naczyniu ze sztucznego tworzywa. « W niniejszym opisie uzyto symboli i skrótów o nastepujacym znaczeniu: DNA — kwas dezoksyrybonukleinowy RNA — kwas rybonukleinowy cDNA — komplementarny DNA (enzymatycznie • 200 4 syntetyzowany na podstawie sekwencji mRNA) mRNA —informacyjny RNA tRNA — przenoszacy RNA dATP — dezoksyadenozynotrójfosforan dGTP — dezoksyguanozynotrójfosforan dGTP — dezoksycytydynotrójfosforan A — adenina T — tymina G — guanina 10 C — cytozyna Tris — 2-amino-2-hydroksyetylopropanodiol-l,3 EDTA — kwas etylenodwuaminoczterooctowy ATP — adenozynotrójfosforan TTP — tymidynotrójfosforan * miejsce Alu I — sekwencja AG |CT, ulegajaca specyficznej hydrolizie w miejscu zaznaczonym strzalka pod wplywem endonukleazy Alu I miejsce Barn HI — sekwencja G|GATCC, ule¬ gajaca specyficznej hydrolizie w miejscu zazna¬ czonym strzalka pod wplywem endonukleazy Barn HI miejsce Bgl I — sekwencja GCCNNNN | NGGC, ulegajaca specyficznej hydrolizie w miejscu za¬ znaczonym strzalka pod wplywem endonukleazy Bgl I (Uwaga: N oznacza dowolny nukleotyd) miejsce Eco RI — sekwencja G^AATTC, ulega¬ jaca specyficznej hydrolizie w miejscu zaznaczo¬ nym strzalka pod wplywem endonukleazy Eco RI miejsce Eco RH — sekwencja |CCAGG lub |CCTGG, ulegajaca specyficznej, hydrolizie w miejscu zaznaczonym strzalka pod wplywem endonukleazy Eco RII miejsce Hae II — sekwencja AGCGC |T lub AGCGCIC lub GGCGClT lub GGCGC | C, ulega¬ jaca specyficznej hydrolizie w miejscu zaznaczo¬ nym strzalka pod wplywem endodukleazy Hae II miejsce Hinc II — sekwencja GTTAAC lub GTTGAC lub GTCAAG lub GTCGAC, ulegajaca specyficznej hydrolizie pod wplywem endonukleazy Hinc II miejsce Pst I — sekwencja CTGCA| G, ulegajaca specyficznej hydrolizie w miejscu zaznaczonym strzalka pod wplywem endonukleazy Pst I miejsce Sal I — sekwencja G^TCGAC, ulegajaca specyficznej hydrolizie w miejscu zaznaczonym strzalka pod wplywem endonukleazy Sal I miejsce Sst I — sekwencja GAGCT| C, ulegaja¬ ca specyficznej hydrolizie w miejscu zaznaczo¬ nym strzalka pod wplywem endonukleazy Sst I.Biologiczne znaczenie sekwencji zasad w DNA polega na tym, ze przechowuje ona informacje genetyczna. Wiadomo, ze sekwencja zasad w DNA sluzy jako kod wyznaczajacy sekwencje amino¬ kwasów we wszystkich bialkach wytwarzanych przez komórke. Poza tym, odcinki o okreslonej sekwencji spelniaja funkcje regulatorów, kontro¬ lujac synchronizacje wytwarzania bialek i ich ilosci.Istota tych elementów regulujacych jest tylko czesciowo poznana. Wreszcie, sekwencja zasad kazdej nici sluzy jako matryca do replikacji DNA towarzyszacej podzialowi komórki.Sposób w jaki informacja zawarta w sekwencji zasad w DNA determinuje sekwencje aminokwa¬ sów w bialkach , jest podstawowym procesem,5 który w szerokim zakresie wystepuje powszechnie we wszystkich zyjacych organizmach. Wykazano, ze kazdy z aminokwasów zazwyczaj wystepuja¬ cych w bialkach, jest determinowany przez jedna lub wiecej sekwencji trójnukleotydowych czyli trypletowych. Totez, dla kazdego bialka istnieje odpowiedni odcinek DNA zawierajacy sekwencje trypletów odpowiadajaca sekwencji aminokwaso- wej bialka. Kod genetyczny przedstawiono w za¬ laczonej tablicy.W biologicznym procesie przetwarzania infor¬ macji zawartej w sekwencji nukleotydów w stru¬ kturalna sekwencje aminokwasów pierwszym sta¬ dium jest tak zwana transkrypcja. W studium tym, dany odcinek DNA, posiadajacy sekwencje specy- fikujaca majace powstac bialko, jest najpierw ko¬ piowany w RNA. RNA jest to polinukleotyd po¬ dobny do DNA, z ta róznica, ze zamiast dezoksy- rybozy zawiera ryboze, a zamiast. tyminy — ura¬ cyl. Zasady w RNA sa zdolne do sparowania sie w ten sam sposób, jaki wystepuje w DNA. W re¬ zultacie w wyniku transkrypcji sekwencji nukle¬ otydów DNA do RNA otrzymuje sie sekwencje komplementarna do sekwencji kopiowanej. Taki RNA okreslany jest jako informacyjny RNA (mRNA), poniewaz jego rola polega na posredni¬ czeniu miedzy aparatem genetycznym a aparatem syntetyzujacym bialko w komórce.W komórce, mRNA sluzy jako matryca w zlo¬ zonym jprocesie zachodzacym przy udziale bardzo wielu enzymów i organelli komórki, którego wy¬ nikiem jest synteza bialka o specyficznej sekwen¬ cji aminokwasowej. Proces ten okresla sie jako translacje mRNA.Czesto wystepuja dodatkowe stadia zwane prze¬ twarzaniem, które prowadza do przetworzenia sekwencji aminokwasów uzyskanej w procesie translacji w bialko funkcjonalne. Przykladem jest powstawanie insuliny. . Kod genetyczny Fenyloalanina (Phe) TTK; Histydyna (His) CAK Leucyna (Leu) XTY; Glutamina (Gin) CAJ Izoleucyna (Ile) ATM; Asparagina (Asn) AAK Metionina (Met) ATG; Lizyna (Lys) AAJ Walina (Val) GTL; Kwas asparaginowy (Asp) GAK Seryna (Ser) CRS; Kwas glutaminowy (Glu) CAJ Prolina (Pro) CCL; Cysteina (Cys) TGK Treonina (Thr) ACL; Tryptofan (Try) TGG Alanina (Ala) GCL; Arginina (Arg) WGZ Tyrozyna (Tyr) TAK; Glicyna (Gly) GGL Sygnal zakonczenia TAJ; Sygnal zakonczenia TGA; Klucz: Kazdy trzyliterowy tryplet oznacza trójnu- kleotyd DNA, posiadajacy koniec 5' z lewej stro¬ ny i koniec 3' z prawej. Litery oznaczaja zasady purynowe lub pirymidynowe tworzace sekwencje nukleotydowa.A = adenina G = guanina C = cytozyna T = tymina X = T lub C, jezeli Y oznacza A lub G X = C, jezeli Y oznacza C lub T Y = A, G, C, lub T, jezeli X oznacza C Y = A lub G, jezeli X oznacza, T 2M 6 W — C lub A, jezeli Z oznacza A lub G W = C, jezeli Z oznacza C lub T Z = A, G, C lub T, jezeli W oznacza C Z = A lub G, jezeli W oznacza A 5 QR = TC, jezeli S oznacza A, G, C lub T QR = AG, jezeli S oznacza T lub C S = A, G, C lub T, jezeli QR oznacza TC S = T lub C, jezeli QR oznacza AG J = A lub G io K = T lub C L = A, T, C lub G M = A, C lub T Bezposrednim prekursorem insuliny jest poje¬ dynczy polipeptyd, nazwany proinsulina, który za- 15 wiera dwa lancuchy insulinowe A i B polaczone innym peptydem C. Patrz: D. F. Steiner, D. Cun- ningham, L. Spigelman i B. Aten. Science 157, 697 (1967). Ostatnio doniesiono, ze wstepnym pro¬ duktem translacji mRNA insuliny nie jest pro- 20 insulina jako taka, ale preproinsulina, która za¬ wiera ponad 20 dodatkowych aminokwasów przy aminowym koncu proinsuliny, Patrz: S. J. Cahn.P. Keim i D. F. Steiner, Proc. Natl. Acad. Sci., St. Zjedn. Ameryki 73, 1964 (1976) oraz P. T. Lo- 25 medico i G/F. Saunders, Nuci. Acids Res., 3, 381 (1976). Budowe czasteczki preproinsuliny mozna przedstawic schematycznie w sposób nastepujacy: NH2-(pre-peptyd)-lancuch B-(peptyd C)-lancuch A-COOH. 30 Stwierdzono, ze w komórkach wyzszych orga¬ nizmów, takich jak organizmy kregowców, znaj¬ duje sie wiele bialek o znaczeniu leczniczym i ba¬ dawczym lub, ze bialka te sa wytwarzane przez komórki tych organizmów. Do bialek tych naleza 35 na przyklad hormon insulina, inne hormony pep- tydowe, takie jak hormon wzrostu, bialka biorace udzial w regulacji cisnienia krwi i rózne enzymy o znaczeniu przemyslowym, leczniczym lub nau¬ kowym. Czesto trudno jest otrzymac uzyteczne 40 ilosci bialek tego rodzaju w drodze ekstrakcji z komórek organizmu. Problem ten jest szczegól¬ nie ostro zarysowany w przypadku bialek, pocho¬ dzenia ludzkiego. Dlatego wystepuje potrzeba dys¬ ponowania metodami wytwarzania wiekszych iló- 45 sci tego rodzaju bialek przez komórki spoza or¬ ganizmu. W pewnych przypadkach jest rzecza mo¬ zliwa otrzymanie odpowiednich linii komórko¬ wych, które mozna utrzymywac metodami stoso¬ wanymi w hodowli tkanek. Jednakze wzrost ko- w morek w hodowli tkankowej jest powolny, podlo¬ ze jest kosztowne, warunki musza byc dokladnie kontrolowane, a wydajnosci sa niskie. Co wiecej, czesto trudno jest utrzymac hodowana linie ko¬ mórkowa z zachowaniem zadanei charakterystyki 85 zróznicowania.W przeciwienstwie do tego, drobnoustroje ta¬ kie jak bakterie latwo rosna na chemicznie zdefi¬ niowanych podlozach. Technologia fermentacji jest bardzo rozwinieta i proces ten mozna precy- * zyjnie kontrolowac. Wzrost organizmów jest szybki i mozliwe jest uzyskanie wysokich wydajnosci.W dodatku, niektóre drobnoustroje zostaly doklad¬ nie scharakteryzowane pod wzgledem genetycznym i faktycznie naleza do najlepiej scharakteryzowa¬ li nych i zbadanych organizmów.1#0 38v Tak wiec wysoce pozadana bylaby metoda za¬ pewniajaca przenoszenie gcsra kodujacego bialko o znaczeniu ieeaucrFnl, i organiamu, fetory nor¬ malnie wytwarz* to bialko, ito odpowiedniego drobnoustroju. W ten sposób bialka* moze byc wy¬ twarzane przez drobnoustrój w kontrolowanych warunkach wzrostu i otrzymywane w zadanych ilosciach. Dzieki tej metodzie mozliwe jest takze zasadnicze obnizenie ogólnych kosztów wytwarza¬ nia zadanego bialka. Poza tym, mozliwosc izolo¬ wania i przenoszenia sekwencji genetycznej de¬ terminujacej wytwarzanie okreslonego bialka, do drobnoustroju o dobrze poznanym aparacie gene¬ tycznym, stanowi narzedzie badawcze o wielkiej wartosci poznawczej, jesli chodzi o kontrole syn¬ tezy takiego bialka oraz przetwarzania go po syn¬ tezie. Takze wyizolowane odcinki o okreslonej sekwencji genetycznej mozna przeksztalcac tak, aby kodowaly rózne bialka o zmienionych wlasci¬ wosciach leczniczych lub funkcjonalnych.Osiagniecie powyzszych celów umozliwia zasto¬ sowanie sposobu wedlug wynalazku, opartego na zlozonym ukladzie etapów obejmujacych reakcje katalizowane przez enzymy. W niniejszym opisie scharakteryzowano te reakcje enzymatyczne tak, jak sa one rozumiane dotychczas.Odwrotna transkryptaza katalizuje synteze DNA komplementarnego do nici matrycy RNA, w obec¬ nosci: matrycy RNA, primera oligodezoksyrybonu- kleotydowego i czterech dezoksylukleozydotrójfos- foranów, to jest dATP, dGTP, dCTP i dTTP. Re¬ akcje inicjuje niekowalencyjne zwiazanie primera oligodezoksynukleotydowego z koncem 3' mRNA, po czym nastepuje stopniowe dodawanie do kon¬ ca 3' wydluzajacego sie lancucha odpowiednich dezoksynukleotydów, determinowane przez paro¬ wanie zasad z okreslona sekwencja nukleotydowa mRNA. Strukture otrzymanej czasteczki mozna scharakteryzowac jako podobna do szpilki do wlo¬ sów. Zawiera ona oryginalny RNA razem z kom¬ plementarna nicia DNA zwiazane jednoniciowa petla DNA. Odwrotna transkryptaza jest takze zdolna do katalizowania podobnej reakcji z zasto¬ sowaniem jako matrycy jednoniciowego DNA i w tym przypadku otrzymywany produkt stano¬ wi dwuniciowy DNA podobny do szpilki do wlo¬ sów, zawierajacy petle z jednoniciowego DNA la¬ czaca jeden zespól konców. Patrz: H. Aviv i P.Leder, Prac. Natl. Acad. Sci., St. Zjedn. Ameryki, 69, 1408 (1972) orafc A. Efstratiadis, F. C. Kafatas, A. F. Maaan i T. Maniatis, Celi, 7, 279 (1976).Endonukleazy restrykcyjne sa to enzymy zdol¬ ne do hydroli2ów#fiia wiazan fosfedwtrestrowych w rfwumciowym DWA. PóWod&fa one przez to przerwanie ciaglosci nici DNA. W przypadku, gdy DNA wystepuje w postaci zamknietej petii, petla ta przeksztalcona zostaje w strukture liafówa.Podstawowa ceche cbarafeterystycaiia tego- rodzaju enzymu stanowi to, ±e przejawia on aktywnosc hydralit#czna tylfco w tym miejscu, w kt&tym wystepuje specyficzna sekwencja nukleotydowa.Taka sekwencja okreslana Jest terminem: miej¬ sce rozpoznawania dla endemukleszy restrykcyjnej.Efidoaufedeazy róstr^fccyjas wpizoltttowno a tóin-yeh zródel i scharakteryiowwio pod wzglecem Sek¬ wencji nukleotydowej i ich miejsc rozpoznawa¬ nia. Niektóre endonukleazy restrykcyjne hydroli- zuja wiazania fosfodWuestrowe w tym samym punkcie w obu T&ciach powodujac powstanie * wolnych konców. Inne katalizuja hydrolize wia¬ zan oddzielonych od siebie kilkoma nukleotydarni, powodujac utworzenie na kazdym koncu rozszcze¬ pionej czasteczki wolnych jednonieiowych odcin¬ ków. Takie jednoniciowe konce sa samokomple- !• mentarne i przez to „lepkie", moga posluzyc do ponownego polaczenia zhydrolizowanego DNA. Po¬ niewaz kazdy DNA podatny na rozszczepienie dzialaniem takiego enzymu zawiera takie samo miejsce rozpoznawania, tworza sie takie same ii „lepkie" konce tak, ze mozliwe staje sie pola¬ czenie odcinków DNA z heterologicznej sekwen¬ cji, poddanych uprzednio dzialaniu endonukleazy restrykcyjnej, z podobnie potraktowanymi odcin¬ kami o innej sekwencji. Patrz: R. J. Roberts, Crit. ao Rev. Biochem., 4, 123 (1976). Miejsca rozpoznawa¬ nia wystepuja wzglednie rzadko, jednakze ogólna uzytecznosc endonukleazy restrykcyjnej bardzo wzrosla dzieki chemicznej syntezie dwuniciowych oligonukleotydów zawierajacych sekwencje miejsca 25 rozpoznawania. Dzieki temu praktycznie kazdy odcinek DNA mozna sprzegac z dowolnym in¬ nym odcinkiem po prostu przez przylaczenie od¬ powiedniego oligonukleotydu zawierajacego miejsce rozpoznawania do konców czasteczki, a nastepnie ae poddanie tak otrzymanego produktu hydrolitycz- nemu dzialaniu odpowiedniej endonukleazy restryk¬ cyjnej, otrzymujac w ten sposób zadane „lepkie" kon¬ ce. Patrz: H. L. Heyneker, J. Shine, H. M. Goodman, H. W. Boyer, J. Rosenberg, R. E. Dickerson,S. A. es Narang, K. Itakura, S. Lin i A. D. Riggs, Nature, 263, 748 (1976) oraz R. H. Scheller, R. E. Dicker- son, H. W. Boyer, A. D. Riggs i K. Itakura, Scien¬ ce 196, 177 (1977).Endonukleaza SI jest enzymem o szerokiej spe¬ cyficznosci, zdolnym do hydrolizowania wiazan fosfodwuestrowych jednoniciowego DNA oraz za¬ sadniczo dwuniciowego DNA w miejscach jedno¬ nieiowych lub petli. Patrz. V. M. Vegt, Eur. J.Biochem., 33, 192 (1973).Ligaza DNA jest enzymem zdolnym do katali¬ zowania tworzenia sie wiazania fosfodwuestrowe- go pomiedzy dwoma odcinkami DNA zawieraja¬ cymi, odpowiednio grupe 5' fosforanowa i 3'hydro- yj ksylowa, na przyklad moze ono byc utworzone przez dwa odcinki DNA polaczone ze soba „lep¬ kimi" koncami. Przyjmuje sie, ze normalne dzia¬ lanie enzymu polega na laczeniu naciec pojedyn¬ czej nici w zasadniczo dwuniciowej czasteczce §* DNA. Jednakze, w odpowiednich warunkach, li¬ gaza DNA zdolna jest do katalizowania laczenia sie wolnych konców, przez co dwie czasteczki majace wolne konce zostaja polaczone kowalen¬ cyjnie. Patrz: V. Sgaramella, J. H. Van de Sande- i* i G. H. Khorana, Proc. Natl. Acad. Sci. St. Zjedn.Ameryki 67, 1468 (1970).Fosfataza alkaliczna jetft enzymem o szerokiej specyficznosci, zdblflym d<* ftydfttlizowania estrów fosforanowy** irtt&ztne z T koncowymi wiazfeitta- •*'" mi fosforanowymi \# BlfA.140: 9 Nastepne stadium ogólnego procesu stanowi in- sercja specyficznego odcinka DNA do wektora przenoszacego DNA, takiego jak plazmid. Plazmid jest terminem stosowanym dla kazdej autonomicz¬ nie replikujacej sie jednostki DNA, która mozna * wykryc w komórce mikroorganizmu, a nie nale¬ zacej do genomu komórki gospodarza. Plazmid nie jest genetycznie zwiazany z chromosomem ko¬ mórki gospodarza. Odcinki DNA plazmidu wyste¬ puja w postaci dwuniciowych kolistych czaste- 10 czek, na ogól o ciezarze czasteczkowym rzedu kilku milionów daltonów, aczkolwiek niektóre pla¬ zmidy maja ciezar czasteczkowy wiekszy niz 108 daltonów. Zazwyczaj stanowia one tylko niewielka czesc ogólnego DNA komórki. DNA plazmidu za- 15 zwyczaj daje sie oddzielic od DNA komórki gos¬ podarza, dzieki temu, ze róznia sie one bardzo miedzy soba rozmiarami. Plazmidy moga repliko¬ wac sie niezaleznie od szybkosci podzialu komórek gospodarza i w pewnych przypadkach szybkosc 10 ich replikacji moze byc kontrolowana przez ba¬ dacza poprzez zmiane warunków wzrostu. Chociaz plazmid jest zamknietym pierscieniem, mozliwe jest wprowadzenie do plazmidu w sposób sztucz¬ ny, odcinka DNA z utworzeniem zrekombinowane- 25 go plazmidu o zwiekszonych wymiarach czastecz¬ ki i to bez zasadniczego-wplywu na jego zdolnosc do replikacji i do ekspresji jakichkolwiek prze¬ noszonych przez niego genów. Totez plazmid slu¬ zy jako uzyteczny wektor przenoszacy odcinek 30 DNA do nowej komórki gospodarza. Plazmidy, które sa uzyteczne w technologii rekombinacji DNA, zazwyczaj zawieraja geny przydatne w ce¬ lach selekcyjnych, takie jak geny opornosci na leki. 135 W celu objasnienia praktycznego zastosowania sposobu wedlug wynalazku, ponizej szczególowo opisano izolacje i przeniesienie genu insuliny szczurzej, hormonu o zasadniczym znaczeniu z punktu widzenia medycyny klinicznej i badan podstawowych. Opisany sposób moze byc stoso¬ wany przez specjalistów w tej dziedzinie do izo¬ lacji genu insuliny z innych organizmów, wlacza¬ jac w to czlowieka. 45 Insuline\wyizolowano pierwszy raz w 1922 r.Obecnie jest dobrze znane zastosowanie tego hor¬ monu do leczenia cukrzycy. Pomimo tego, ze rzeznie dostarczaja trzustki wolowe i swinskie jako zródlo insuliny, powieksza sie niedobór tego M hormonu w miare wzrostu ilosci przypadków cu¬ krzycy na swiecie. Co wiecej u niektórych cuk¬ rzyków powstaja reakcje alergiczne na insuline wolowe i swinska, wywolujace szkodliwe skutki.Totez bardzo pozadana jest mozliwosc wytwarza- M nia insuliny ludzkiej w ilosciach wystarczajacych do pokrycia zapotrzebowania w skali ogólnoswia¬ towej. Cel ten moze byc osiagniety dzieki wy¬ twarzaniu ludzkiej insuliny w komórkach bakte¬ ryjnych. Jednakze osiagniecie tego celu nie bylo 60 dotychczas mozliwe, poniewaz przeszkoda byl brak opracowanych metod wprowadzania genu insuliny do komórki bakteryjnej. Takie postepo¬ wanie umozliwia plazmid wytwarzanych sposo¬ bem wedlugwynalazku. w 10 Zdolnosc do otrzymywania DNA o specyficznej sekwencji, stanowiacej kod genetyczny dla specy¬ ficznego bialka, umozliwia takie modyfikowanie sekwencji nukleotydowej sposobami chemicznymi lub biologicznymi, ze ostatecznie wytworzone spe¬ cyficzne bialko takze jest zmodyfikowane. W ten sposób mozna na przyklad wytwarzac zmodyfi¬ kowana insuline na specjalne zamówienie, wyni¬ kajace ze specyficznego trybu leczenia. Genetycz¬ na zdolnosc wytwarzania pokrewnego insulinie bialka o dowolnej sekwencji aminokwasowej, wykazujacego zasadniczo takie same wlasciwosci jak insulina, moze byc w ten sposób nadana dro¬ bnoustrojowi.Mozliwosc przenoszenia kodu genetycznego spe¬ cyficznego bialka, niezbednego w normalnym metabolizmie danego wyzszego organizmu, do mi¬ kroorganizmu takiego jak bakteria, oznacza isto¬ tne mozliwosci wytwarzania tego rodzaju bialka w drodze hodowli. To z kolei daje wyrazna mo¬ zliwosc zwiekszenia ilosci wytwarzania bialek lub ich zastapienie bialkami wytworzonymi w mikro¬ organizmach zmodyfikowanych przy pomocy plaz¬ midu wytworzonego sposobem wedlug wynalazku, w tych przypadkach, gdy zdolnosc do normalnego funkcjonowania w odniesieniu do wytwarzania bialek tego rodzaju jest ograniczona. Sugeruje to tez mozliwosc ustanowienia symbiotycznej za¬ leznosci miedzy mikroorganizmami zmodyfikowa¬ nymi przy pomocy plazmidu wytworzonego spo¬ sobem wedlug wynalazku a czlowiekiem cierpia¬ cym na przewlekle lub ostre choroby polaczone z niedoborem pewnego skladnika lub skladników, przy czym mikroorganizmy te moga byc implan- towane lub w inny sposób zwiazane z czlowie¬ kiem w celu skompensowania patologicznego nie¬ doboru w jego metabolizmie.W niniejszym opisie podano sposób izolowania kwasu nukleinowego o specyficznej sekwencji nu¬ kleotydowej, zawierajacej informacje genetyczna, syntezy DNA o specyficznej sekwencji nukleo¬ tydowej i przenoszenia DNA do mikroorganizmu gospodarza.Wynalazek umozliwia przenoszenie DNA o spe¬ cyficznej sekwencji genu preproinsuliny szczurzej do bakterii. Na tej podstawie mozna stwierdzic, ze plazmid wytworzony sposobem wedlug wyna¬ lazku nadaje sie do przenoszenia DNA o zadanej sekwencji z organizmu wyzszego, takiego jak kre¬ gowce, do dowolnego mikroorganizmu. W niniej¬ szym opisie przez wyzszy organizm rozumie sie kazdy organizm eukariotyczny o zróznicowanych tkankach, wlacznie, ale nie tylko, z owadami, mieczakami, roslinami, kregowcami, w tym ssaka¬ mi, przy czym ta ostatnia kategoria obejmuje bydlo, swinie, naczelne i ludzi. Przez mikroorga¬ nizm rozumie sie jakikolwiek zyjacy organizm o mikroskopowych wymiarach, odpowiadajacy ter¬ minowi protista, czy to prokariotyczny, czy euka¬ riotyczny, wlacznie na przyklad z bakteriami, pierwotniakami, glonami i grzybami, przy czym ta ostatnia kategoria obejmuje równiez drozdze.W sposobie wedlug wynalazku najpierw izoluje sie wybrana populacje komórek. Nienaruszony mRNA ekstrahuje sie z komórek metoda, w któ-140 200 11 12 rej cala aktywnosc RNAazy jest zahamowana.Nienaruszony informacyjny RNA wyodrebnia sie z ekstraktu metoda chromatografii kolumnowej i poddaje dzialaniu enzymu — odwrotnej tran- skryptazy dzialajacej w obecnosci czterech dezo- ksynukleozydotrójfosforanów, koniecznych do syn¬ tezy komplementarnej nici (cDNA). Produkt tej pierwszej reakcji zachodzacej z udzialem odwrot¬ nej transkryptazy poddaje sie nastepnie obróbce selektywnie usuwajacej sekwencje rybonukleoty- dowa. Pozostaly dezoksynukleodyt, komplemen¬ tarny do oryginalnego mRNA inkubuje sie w trakcie drugiej reakcji z odwrotna transkrypta- za lub polimeraza DNA w obecnosci czterech dezoksynukleozydotrójfosforanów. Otrzymany pro¬ dukt stanowi podwójna strukture cDNA, której komplementarne nici polaczone sa na jednym koncu jednoniciowa petla. Nastepnie tak otrzy¬ many produkt poddaje sie dzialaniu nukleazy specyficznej dla jednoniciowego DNA, która roz¬ szczepia jednoniciowa petle. Otrzymany dwuniciowy cDNA wydluza sie nastepnie przez dodanie na obu koncach specyficznego DNA zawierajacego sekwencje miejsca rozpoznawania enzymu restryk¬ cyjnego. Addycje te katalizuje enzym ligaza DNA, po czym wydluzony cDNA zadaje sie endonukle- aza restrykcyjna otrzymujac samokomplementarne jednoniciowe konce 5' w kazdej z obu nici.DNA plazmidu, zawierajacy miejsce rozpozna¬ wania tej samej endonukleazy restrykcyjnej pod¬ daje sie dzialaniu enzymu w celu rozszczepienia nici polinukleotydowej i wTytworzenia samokom- plementarnych jednoniciowych sekwencji nukle- otydowych na konce 5'. Koncowe grupy 5' fosfo¬ ranowe na jednoniciowych koncach usuwa sie, aby uchronic plazmid przed wytworzeniem struk¬ tury kolistej, równiez zdolnej do transformowania komórki gospodarza. Otrzymany cDNA i DNA plazmidu inkubuje sie razem w obecnosci ligazy DNA. W opisanych warunkach reakcji, tworze¬ nie zywotnego DNA plazmidu o zamknietej struk¬ turze kulistej moze zajsc tylko wtedy, gdy zo¬ stanie wlaczony odcinek cDNA. Nastepnie plaz¬ mid zawierajacy sekwencje cDNA wprowadza sie do komórki odpowiedniego gospodarza. Komórki które otrzymaly zywotny plazmid wykrywa sie dzTeki wystapieniu kolonii posiadajacych ceche genetyczna nadana przez plazmid, taka jak opor¬ nosc na leki. Po tym nastepuje wzrost czystych szczepów bakteryjnych zawierajacych zrekombino- wany plazmid z wbudowana sekwencja cDNA i powtórne izolowanie tego plazmidu. W ten spo¬ sób mozna wytwarzac w duzych ilosciach DNA zrekombinowanego plazmidu, jak równiez ponow¬ nie izolowac z niego odcinki cDNA o specyficznej sekwencji za pomoca rozszczepienia endonukleoli- tycznego, przy uzyciu odpowiedniego enzymu re¬ strykcyjnego.Plazmid wytworzony sposobem wedlug wynalaz¬ ku umozliwia izolowanie i przenoszenie do mikro¬ organizmu gospodarza odcinka o zadanej sekwen¬ cji nukleotydowej, uzyskanego z organizmu wyz¬ szego, wlacznie z czlowiekiem. Sposób jest uzy¬ teczny przy przenoszeniu genu kodujacego specy¬ ficzne bialko o wartosci leczniczej lub przemyslo¬ wej oraz w mikrobiologicznej syntezie bialka te¬ go rodzaju. Stosujac plazmid wytworzony sposo¬ bem wedlug wynalazku, odcinek nukleotydu o sekwencji kodujacej insuline izoluje sie ze 5 szczura, przenosi sie do bakterii i w nich repli¬ kuje sie. Sposób ten mozna zastosowac do prze¬ niesienia z materialu ludzkiego odcinka o okreslo¬ nej sekwencji nukleotydowej, kodujacej insuline ludzka. io Przy pomocy plazmidu wytworzonego sposobem wedlug wynalazku izoluje sie czasteczki DNA o specyficznej sekwencji nukleotydowej i przeno¬ si sie do mikroorganizmu, przy czym po replikacji w zastosowanym mikroorganizmie znajduje sie 15 równiez DNA o orygnialnej sekwencji nukleoty¬ dowej.Kolejne stadia sposobu wedlug wynalazku moz¬ na podzielic na cztery ogólne kategorie. 1. Izolacja zadanej populacji komórek wyzszego 20 organizmu.Istnieja dwa potencjalne zródla genetycznej sekwencji kodujacej specyficzne bialko: DNA, którego zródlem jest sam organizm i RNA tran- skrybowany z DNA. Zgodnie z obecnie obowiazu- 25 jacymi w St. Zjedn. Ameryki wymaganiami do¬ tyczacymi bezpieczenstwa, wydanymi przez Natio¬ nal Institutes of Health, geny ludzkie jakiego¬ kolwiek rodzaju mozna wlaczyc do zrekombino¬ wanego DNA, a nastepnie do bakterii tylko po 30 bardzo starannym oczyszczeniu tych genów, albo w specjalnych warunkach, odpowiednich dla pra¬ cy o wysokim stopniu ryzyka (P4). Patrz: Fede- ral Register, tom 41, Nr 131, 7 lipca 1967, strony 27 902—27 943. Dlatego, w przypadku kazdej meto- 05 dy potencjalnie uzytecznej w wytwarzaniu ludz¬ kiego bialka, takiej jak sposób wedlug wynalazku, korzystne jest izolowanie specyficznego mRNA o sekwencji nukleotydowej, kodujacej zadane bial¬ ko. Przyjecie tego sposobu postepowania daje 40 dalsza korzysc polegajaca na tym, ze mRNA mo¬ zna latwiej oczyszczac niz wyekstrahowac z ko¬ mórki DNA. W szczególnosci, korzystny jest fakt, ze w wysoko zróznicowanych organizmach takich jak kregowce, mozna zidentyfikowac specyficzna 45 populacje komórek o specyficznym umiejscowie¬ niu w organizmie, których najwazniejsza funkcja jest wytwarzanie danego bialka. Alternatywnie, populacja taka moze wystepowac przejsciowo w czasie rozwoju organizmu. W populacjach ko- 50 morek tego rodzaju duza czesc mRNA wyizolo¬ wanego z komórek bedzie zawierac zadana sek¬ wencje nukleotydowa. Totez, wybór populacji ko¬ mórek do izolacji i zastosowana metoda izolacji moga byc w zasadzie korzystne z punktu widzenia 55 wyjsciowej czystosci mRNA izolowanego z tego zródla.W wiekszosci tkanek, gruczolów i organów ko¬ mórki sa utrzymywane w skupieniu przez wyste¬ pujaca zasadniczo w postaci wlókien siec tkanki 60 lacznej, zlozonej glównie z kolagenu, ale mogacej zawierac równiez, w zaleznosci od tkanki, inne strukturalne bialka, polisacharydy lub zlogi mi¬ neralne. Izolacja komórek z danej tkanki wyma¬ ga zastosowania metody uwalniania komórek «5 z podloza tkanki lacznej. Izolacja i oczyszczanie140: !3 specyficznego typu zróznicowanych komórek obej¬ muje zatem dwa glówne stadia: oddzielanie komórek od podloza tkanki lacznej i oddzielanie komórek zadanego typu od wszystkich innych komórek wystepujacych w tkance. Zasady pracy stanowia- 5 ce istote sposobu wedlug wynalazku, opisane w niniejszym opisie nadaja sie do izolacji komó¬ rek róznych typów z róznych zródel tkankowych.Ponizej opisano sposób izolowania wysepek Lan- gerhansa z trzustki, odpowiedni do izolacji mRNA 10 kodujacego insuline.Komórki wytwarzajace insuline moga pochodzic z innych zródel, takich jak plodowa trzustka cie¬ leca lub hodowla komórek nowotworu wysepek.W takich przypadkach izolacja czystych komórek 15 wysepkowych bedzie o wiele prostsza, zwlaszcza przy zastosowaniu czystych hodowli komórkowych.Powyzszy omówiony sposób izolowania komórek wysepkowych nie jest w tych przypadkach nie¬ zbedny, jednakze metoda zachowuje swe walory, 20 a to dla jej ogólnej stosowalnosci.Czesto mozna stwierdzic, ze udzial zadanego mRNA wzrasta w wyniku korzystnej odpowiedzi komórki na zewnetrzne bodzce, na przyklad po¬ dzialanie hormonem moze spowodowac wzmozenie 25 wytwarzania pozadanego mRNA. Do innych metod nalezy .prowadzenie hodowli w szczególnej tempe¬ raturze lub zastosowanie specyficznego* skladnika odzywczego wzglednie innej substancji chemicz¬ nej. 30 2. Ekstrakcja mRNA.Wazna cecha znamienna sposobu wedlug wy¬ nalazku jest w istocie calkowite usuniecie aktyw¬ nosci RNAazy w ekstrakcie komórkowym. Ek¬ strahowany mRNA stanowi pojedyncza nic poli- Q5 nukleotydowa, niesparowana z jakakolwiek ni¬ cia komplementarna. Dlatego, hydrolityczne roz¬ szczepienie pojedynczego wiazania fosfodwuestro- wego w sekwencji, powodowaloby calkowita bez- uzytecznosc czasteczki w przenoszeniu nienaruszo- *° nej sekwencji genetycznej do mikroorganizmu.Jak to zaznaczono w powyzszej czesci opisu en¬ zym RNAaza jest szeroko rozpowszechniony, aktywny i wyjatkowo stabilny. Znaleziono go na skórze, wytrzymuje on zwykle metody mycia tt szkla i czasami zanieczyszcza organiczne odczyn¬ niki chemiczne. Szczególnie ostro trudnosci te wy¬ stepuja przy obróbce ekstraktów z komórek trzustki, poniewaz trzustka jest zródlem enzymów trawiennych, a stad zawiera duzo RNAazy. Jed- 50 nakze problem zanieczyszczania RNAaza wyste¬ puje we wszystkich tkankach i sposób wedlug wynalazku eliminowania aktywnosci RNAazy na¬ daje sie do wszystkich tkanek. Wyjatkowa skutecz¬ nosc sposobu wedlug wynalazku ilustruje wykonana 55 z powodzeniem izolacja nienaruszonego mRNA z wyodrebnionych komórek wysepkowych trzustki.W sposobie wedlug wynalazku, w trakcie de¬ zintegracji komórki oraz w czasie wszystkich ope¬ racji koniecznych do oddzielania RNA zasadniczo 60 walnego od bialka, stosuje sie lacznie anion cha- otropowy kation haotropowy oraz czynnik roz¬ rywajacy wiazania dwusiarczkowe. Skutecznosc lacznego dzialania wyzej wymienionych czynników wykazano przez ich uzycie do izolacji zasadniczo M 14 niezdegradowanego mRNA z wydzielonych wyse¬ pek Langerhansa trzustki szczura i to z dobra wydajnoscia.Dobór odpowiednich jonów chaotropowych opiera sie na ich rozpuszczalnosci w wodzie i do¬ stepnosci. Do odpowiednich kationów chaotropo¬ wych naleza takie kationy jak guanidyniowy, karbamoiloguanidyniowy, guanyloguanidyniowy, litowy itp. Do odpowiednich anionów chaotropo¬ wych naleza takie aniony jak jodkowy, nadchlo- ranowy, tiocyjanianowy, dwujodosalicylanowy itp.Wzgledna efektywnosc soli utworzonych przez po¬ laczenie takich anionów i kationów, okresla cze¬ sciowo ich rozpuszczalnosc, na przyklad dwujodo- salicylan litowy jest silniejszym czynnikiem de¬ naturujacym niz tiocyjanian guanidyniowy, ale jego rozpuszczalnosc wynosi tylko okolo 0,1 M, a poza tym jest on stosunkowo drogi. Tiocyjanian guanidyniowy stanowi korzystne polaczenie ka¬ tion—anion, poniewaz jest latwo dostepny i od¬ znacza sie wysoka rozpuszczalnoscia w srodowis¬ kach wodnych, az do okolo 5 M.Znane jest stosowanie zwiazków tiolowych, ta¬ kich jak /?-merkaptoetanol, do rozrywania wew- natrzczasteczkowych wiazan dwusiarczkowych w bialkach, na zasadzie reakcji wzajemnej wy¬ miany tiol-dwusiarczek. Liczne odpowiednie zwia¬ zki tiolowe sa skuteczne pod tym wzgledem, a to oprócz P-merkaptoetanolu, dwutiotreitol, cysteina, dwutiopropanol itp. Niezbedna wlasciwoscia jest rozpuszczalnosc w wodzie, poniewaz zwiazek tio- lowy musi wystepowac w duzym nadmiarze w stosunku do wewnatrzczasteczkowych wiazan dwusiarczkowych, aby reakcja wzajemnej wymia¬ ny zaszla w zasadzie calkowicie. Korzystny jest (3-merkaptoetanol z powodu jego dostepnosci i przystepnej ceny.Przy hamowaniu aktywnosci RNAazy w trak¬ cie ekstrakcji RNA z komórek lub tkanek, sku¬ tecznosc uzytej soli chaotropowej zalezy bezpo¬ srednio od jej stezenia. Korzystnym stezeniem jest najwyzsze stezenie, które moze byc prak¬ tycznie zastosowane. Przyjmuje sie, ze skutecz¬ nosc sposobu wedlug wynalazku w zachowaniu nienaruszonego mRNA podczas ekstrakcji, polega na szybkosci denaturacji RNAazy oraz na zakresie tej denaturacji. Mozna w ten sposób wytlumaczyc na przyklad wyzszosc tiocyjanianu guanidyniowego nad chlorowodorkiem, mimo tego, ze chlorowodo¬ rek jest tylko nieznacznie slabszym czynnikiem denaturujacym. Skutecznosc denaturanta definiuje sie jako stezenie progowe konieczne do uzyskania calkowitej denaturacji bialka. Z drugiej strony szybkosc denaturacji wielu bialek zalezy od war¬ tosci stezenia denaturanta, w odniesieniu do war¬ tosci progowej, podniesionej do 5—10 potegi.Patrz: C. A. Tanford, Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968).Jakosciowo, stosunek ten sugeruje, ze denatu- rant tylko nieznacznie silniejszy niz chlorowodo¬ rek guanidyniowy, uzyty w tym samym stezeniu, moze denaturowac bialko wielokrotnie szybciej.Zwiazek pomiedzy kinetyka denaturacji RNA¬ azy a zachowaniem nienaruszonego mRNA pod- * czas jego ekstrakcji z komórek, nie byl dotych-140 200 16 czas, o ile wiadomo, badany lub wykorzystany.Powyzsze rozwazania, o ile sa prawidlowe, suge¬ ruja, ze korzystnym denaturantem bedzie taki zwiazek, który wykazuje niskie progowe stezenie denaturujace, a zarazem wysoka rozpuszczalnosc w wodzie. Z tego powodu tiocyjanian guanidynio- wy jest korzystniejszy od dwujodosalicylanu li¬ towego, nawet pomimo tego, ze ten ostatni jest silniejszym denaturantem. Jednakze rozpuszczal¬ nosc tiocyjanianu guanidyniowego jest o wiele wieksza i dlatego moze on byc stosowany w ste¬ zeniu umozliwiajacym szybsza dezaktywacje RNA- azy. Rozwazania powyzsze wyjasniaja takze, ze tiocyjanian guanidyniowy jest korzystniejszy od chlorowodorku o porównywalnej rozpuszczalnosci, mimo ze ten pierwszy zwiazek jest nieco silniej¬ szym denaturantem.Uzycie czynnika rozrywajacego wiazania dwu¬ siarczkowe lacznie z denaturantem wzmaga i podwyzsza skutecznosc i efektywnosc denatu- ranta dzieki umozliwieniu calkowitego rozfaldo- wania czasteczki RNAazy. Uwaza sie, ze zwiazek tiolowy podwyzsza poczatkowa szybkosc denatu- racji przez zapobieganie raptownej renaturacji, która moze zachodzic, gdy wewnatrzczasteczkowe wiazania dwusiarczkowe pozostana nienaruszone.Poza tym, jakokolwiek ilosc RNAazy pozostalej jako zanieczyszczenia w preparacie mRNA nie bedzie wykazywac aktywnosci, nawet w nieobec¬ nosci denaturanta i tiolu. Czynniki rozrywajace wiazania dwusiarczkowe, zawierajace grupy tiolo- we, beda w pewnym zakresie wykazywac aktyw¬ nosc w kazdym stezeniu, pomimo tego, ze ogólnie mówiac, duzy nadmiar grup tiolowych w sto¬ sunku do wewnatrzczasteczkowych wiazan dwu- siarczkowych jest korzystny, jesli chodzi o prze¬ suniecie równowagi reakcji wzajemnej wymiany w kierunku rozszczepienia wewnatrzczasteczko¬ wych wiazan dwusiarczkowych. Z drugiej strony, liczne zwiazki tiolowe sa cuchnace i nieprzyjemne przy stosowaniu w wyzszych stezeniach tak, ze praktycznie istnieje ich górne stezenie. Przy uzy¬ ciu p-merkaptoetanolu stwierdzono, ze skutecz¬ ne stezenia mieszcza sie w zakresie od 0,05 M do 1,0 M, przy czym stezenie 0,2 M jest uwazane za optymalne przy izolowaniu niezdegradowanego RNA z trzustki szczura. pH srodowiska w czasie ekstrakcji mRNA z ko¬ mórek moze byc dowolne w zakresie 5,0—8,0.Po zakonczenia stadium dezintegracji komórek, RNA mozna oddzielac od-pozostalych bialek i DNA kilkoma, znanymi metodami. Zazwyczaj stosowa¬ na jest metoda polegajaca na wytraceniu etano¬ lem z selektywnym wtraceniem RNA. W sposo¬ bie wedlug wynalfcekw korzystnie pomija sie sta¬ dium wytracania i nanosi zhomogenizowana war¬ stwe bezposrednio na «5,7 m roztwór chloru- oezu w probówce do wiarowania, po czym odwirowuje w sposób opisany przez V. Glisina* R Crkvenja¬ kowa i "C. Byusa w Bipehemistry, 13, 2633 (1974).Metoda ta jest korzystna dlatego, ze utrzymuje sie otoczenie ciagle niekorzystne dla RNAazy, a RNA wyodrebnia sie z, wysoka wydajnoscia i jest on pozbawiony DNA i bialka.Metoda wyzej opisana uzyskuje sie oczyszcze¬ nie calego RNA od zhomogenizowanych komórek.Jednakze, tylko czesc tego RNA stanowi zadany mRNA. W celu dalszego oazyszczenia zadanego i mRNA, wykorzystano fakt, ze w komórkach or¬ ganizmów wyzszych mRNA po transkrypcji jest dalej przetwarzany w komórce przez przylacze¬ nie kwasu poliadenylowego. Taki mRNA, zawie¬ rajacy przylaczone sekwencje poli A, mozna se- 10 lektywnie dzielic na kolumnach chromatograficz¬ nych zawierajacych celuloze z przylaczonym oligo- tymidylenem, jak to opisali H. Aviv i P. Leder j. w. Powyzsza metoda wystarcza do uzyskania ze zródel bogatych w RNAaze zasadniczo czyste- 15 go, nienaruszonego i nadajacego sie do translacji mRNA. Oczyszczanie mRNA i nastepujaca po tym obróbke in vitro przeprowadzic mozna zasadni¬ czo w ten sam sposób jak dla kazdego dowolne¬ go mRNA, niezaleznie od organizmu sluzacego ja- 20 ko zródlo.W pewnych warunkach, np. w przypadku uzy¬ cia jako zródla mRNA komórek z hodowli tka¬ nek, zanieczyszczenie RNAaza moze byc na tyle niskie, ze powyzej opisana metoda hamowania 25 aktywnosci RNAazy moze okazac sie zbyteczna.W takich przypadkach wystarczaja dotychczaso¬ we znane metody redukowania aktywnosci RNA¬ azy. 3. Tworzenie cDNA. 30 Rysunek fig. 1 przedstawia schematycznie po¬ zostale stadia procesu. Pierwszym stadium tego procesu jest tworzenie sekwencji DNA komple¬ mentarnej do oczyszczonego mRNA. Enzymem wy¬ branym dla tej reakcji jest odwrotna transkryp- 35 taza, aczkolwiek w zasadzie uzyc mozna kazdego enzymu zdolnego do tworzenia nici DNA wiernie komplementarnej do mRNA uzytego jako matry¬ ca. Reakcje mozna prowadzic w znanych, uprzed¬ nio opisanych warunkach przy uzyciu mRNA 40 jako matrycy i mieszaniny czterech dezoksynukle- ozydotrójfosforanów jako prekursorów dla nici DNA. Korzystne jest wprowadzenie jednego z de- zoksynukleozydotrójfosforanów znakowanego 32P w pozycji a w celu sledzenia postepu reakcji, za- 45 pewnienia wskaznika odzyskania produktu po pro¬ cesach rozdzielania, takich jak chromatografia lub elektroforeza oraz w celu ilosciowego ustalenia wydajnosci. Patrz: A. Efstratiadis i wsp., j. w.Jak to uwidacznia diagram na rysunku, produkt 50 reakcji katalizowanej przez odwrotna transkryp- taze ma dwuniciowa strukture szpilki do wlosów z niekowalencyjnym wiazaniem miedzy nicia RNA a DNA.Produkt reakcji katalizowanej przez odwrotna 55 transkryptaze wyodrebnia sie z mieszaniny reak¬ cyjnej znanymi metodami. Stwierdzono, ze uzy¬ teczne jest polaczenie ekstrakcji fenolem, chro¬ matografii na SephadeK1 G^1T)0 i wytracania etanolem. w Po zsyntetyzowaniu cDNA metoda enzymatycz¬ na mozna usunac matryce RNA. Znane sa rózne metody selektywnej degradacji RNA w obecno¬ sci DNA. Korzystna metoda jest* hydroliza alka- 1 znak ochronny, Pharmacia Inc., Uppsala, Szwe¬ cjam*w* » liczac. Jest ona wysoce selektywna i moze byc Latwa kontrolowana za pomoeap ustalania pH.Po przeprowadzeniu reakcji hydrolizy alkalicz¬ nej, a nastepnie zobojetniania mozna,, jesli to jest pozadane zatezyc cDNA znakowany 32P przez wytracenie etanolem.Synteza dwuniciowego cQNA o strukturze szpil¬ ki do wlosów prz/egrowadza sie stosnjac odpowied¬ ni enzym, takir jak polimeraza DNA lub odwrot¬ na transkryptaza. Reakcje prowadzi, sie w. war runkach podetaych do poprzednio opisanych, wlaczajac w to uzycie dezoksynukleozydotrojfos- foranu znakowanego 82F w pozycji a. Odwrotna transkryotaze mozna uzyskac z rozmaitych zródel.Dogodpiym zródlem jest wirus ptasiej bialaczki mielabiastycznej. Wirus mozna otrzymac od dr D. J. Bearda z Life Sciences Incorporated, St.Petersburg, Floryda, który zajmuje sie j^go wy¬ twarzaniem na podstawie; kontraktu z, Nationa, In&titutes ot Health.Po wytworzeniu cDNA o strukturze szpilki, da wlosów, dogodnie jest wydzielic BNA, z miesza¬ niny reakcyjnej' Jak poprzednio opijano, stwier¬ dzono, ze korzystne jest prowadzenie stadiów ekstrakcji fenolem, chromatografii na S.ephadex.G—100 i wytracania etanolem w celu otrzymania DNA wolnego od zanieczyszczen, bialkowych, Strukture szpilki do wlosów przeprowadza sie w zwykla .strukture dwuniciowegP DNA usuwajac jednoniciowa petle laczaca konce komplementar¬ nych nici. Do tego celu, sluzy szereg enzymów zdolnych do specyficznego hydralitycznego roz¬ szczepienia DNA w obszarze jednoniclowym. Do¬ godnym enzymem tego typu jest nukleaza SI wy¬ izolowana z Aspergillus oryzae. Enzym ten mozna otrzymac z Miles Research Products, Elkhart, In¬ diana. Poddanie DNA o strukturze szpilki do wlo¬ sów dzialaniu nukleazy SI prowadzi do otrzy¬ mania z wysoka wydajnoscia czasteczek cDNA o koncach ze sparowarowanymi zasadami. Nastep¬ nie stosuje sie ekstrakcje, chromatografie i wy¬ tracanie etanolem, jak podano wyzej. Uzycie od¬ wrotnej transkryptazy i nukleazy SI w syntezie dwuniciowego cDNA transkrybowanego z mRNA opisali Efstratiadis i wsp., j. w.Udzial czasteczek cDNA o wolnych koncach mozna ewentualnie zwiekszyc dzialajac polimera¬ za I DNA z Eschericha coli w obecnosci czterech dezoksynukleozydotrójfosforanów. Laczne zastoso¬ wanie enzymatycznej egzonukleazy i polimerazy prowadzi do usuniecia wszytkich wystajacych konców 3' i uzupelnienia wszystkich wystajacych konców 5'. W ten sposób zapewnia sie maksymal¬ na ilosc czasteczek cDNA. w nastepujacej po tym reakcji wiazania.Nastepne stadium sposobui wedlug wynalazku obejmuje, obróbke konców otrzymanego cDNAv w celu. uzyskania odoawiedniej, sekwencji, na. kaz¬ dym koncu, zawierajacej, miejsce rozpoznawania endonukieazy restrykcyjnej, Wy&or. odcinka DKfA który, ma byc dolaGzpn# do t#ch. konców, zalezy od mozliwosci, dogodnego postepowania* Sakwen- cje: odcinka* który, ma^ by^c dolaczony do konców DNA, dopasowuja sie do, wybranej, endonukieazy, restrykcyjnej, a< ten z kolei, wybór zalezy od do- 10. 2Q brania wektora, przenoszacego DNA, z którym cDNA ma byc reJcombmowany, Wybrany plazmid powinien posiadac przynajmniej jedno, miejsce, wrazliwe na rozszczepienie dzialaniem endonukie¬ azy, restrykcyjnej, np. plazrnid pME3, zawjera, jed¬ no miejsce rozpoznawania enzymu Hind III.Hind III wyodrebnia, sie z, Hemophilus infjuenzae i oczyszcza, metoda podana przez H» O. Smitha i, K, W, Wileoxa w, J, MoJr EjoL 5,1, 379 (1970).Enzym Hae III z ^moAhiius aegypjipus, oczy¬ szczacie metoda, opijana nrzez, J. M. Midd.letona, Hi H. Ed^ella i C. A. Hutchisona Ul. w J< ViroL 10„ 42, (1972)., Enzym z-Hemophilus, suis, oznaczo¬ ny Hsu ^ katalizuje te s,ama specyficzna pod 15 wzgledem miejsca, hydrolize, w tym samy111 miej¬ scu rozpoznawania^ co; IJind IJI. Ta dwa enzymy, sa wdec funkcjonalnie wymienialne.Dogodnie, uzywki sie chemicznie, zsyntetyzpwa-. nego dwuniciowego dekanukleotydu zawierajace¬ go sekwencja miejsca, rozpoznawania Hind III w celu przylaczenia go do, konców ppdwójnegp cDNA, Dwuniciowy dekanu,kle.ptyd, posiada sek¬ wencje przedstawiona na rys, 1, Patrz: H. 1^. Hey- neker i wsp., oraz R. H, Scheller, j, w. Rozmaite syntetyczne odcinki o sekwencji miejsca rozpo¬ znawania sa dostepne tak, ze mozliwe jest takie przygotowanie konców podwójnego DNA, ahy byly one wrazliwe na dzialanie którejkolwiek z licznych endonukleaz restrykcyjnych.Przylaczenie odcinka o sekwencji miejsca rozpo¬ znawania, do konców cRNA. mozna przeprowadzic w dowolny znany sposób. Metoda z wyboru jest reakcja wiazania wolnych, konców, katalizowana przez ligazs E|NA oczyszczona metoda opisana przez A. Paneta. i. wsp., w Biochemistry, 12, 5045 (1973), Reakcje wiazania wolnych kpncpw opisali V. §garameUa i wsp., j. w. Produktem reakcji wiazania wolnych konców, zachodzacej pomiedzy cDNA o wolnych koncach i dwoniciowym delca- nukleptydem zawierajacym miejsca, rozpoznawania endonukieazy Hind. III, uzytym w duzym molo¬ wym nadmiarze, jest cDNA posiadajacy na kaz¬ dym koncu odcinek o sekwencji miejsca rozpo¬ znawania Hind III- Wynikiem dzialania na pro¬ dukt reakcji endonukleaza PJind III jest rozszcze¬ pienie w miejscu rozpoznawania, polaczone z ut¬ worzeniem jednonipiowych sarnokpmplementar- nych konców 5', jak to przedstawiono na. rys 1. 4* PiTO^gfttpwsMaie ^ekambjnowanegp wektor* przena*zac£g< DNA.W, zasadzie, dp; przygotowania rekpmfcinatorpw z gQNA w^twprzpnyoh^ w sppsób jak. wyzej opi¬ sano, mpzna, u±yA waelu, rp^ych DJJA waruspwyjch i pjazmidpwyAh, ^aaa^e^ni wymogiem jest, aby wektor przenpspag)* 9N&. bj*l; zupiny dp, wnir kania do. komórki gpsppidarz§ a» n9&teBnie ule¬ gal replikacji w, tej, kprnpr^e, Eoz|i ty^n, p;pw.i- n\en, on RPjs^iaiJaA determinant, gc^ptyczjRy, dzi^ któremu niozna, wysele^pjonowac te- Hpmórfci gospodarka, do lc^ych- wail^af wektor- Je^naKse zp, w^gleflów. he?pipczensiwaf zakres wyb&ril ppwiniejTi byc\ ojar^nicftony, dp tyc^i rpdyar jpw we^tarAw pr^npsz^ypjh, które uw^^anp sa za. pdPAwiednie dp wyicprzystania. w. doswiadczer niacji tego typu, zgodnie zr w^typzny^n^ N/ I. H, 3Q ^ * 55140 200 19 2* Wykaz zatwierdzonych wektorów przenoszacych DNA stale sie powieksza, w miare odkrywania nowych wektorów i zatwierdzania ich przez NIH Recombinant DNA Safety Committe. W sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac- kazdy DNA 5 wirusowy i plazmidowy, który posiada opisane cechy przydatne, wlacznie z tymi, dla których aprobata NIH bedzie mogla byc udzielona póz¬ niej. Do odpowiednich wektorów przenoszacych, które ostatnio zatwierdzono do uzycia nalezy sze- io reg pochodnych bakteriofaga lambda (patrz np.F. R. Blattner, B. G. Williams, A. E. Blechl, K.Denniston — Thompson, H. E. Faber, L. A. Fur- long, D. J. Grunwald, D. O Kiefer, D. D. Moore, J. W. Sohumm, E. L. Sheldon i O. Smithies, 15 Science, 196, 161, (1977), oraz pochodne plazmidu col El, patrz. np. R. L. Rodriguez, S. Bolivar, H. M. Goodman, H. W. Boyer i M. N. Betlach, ICW — UCLA Symposium on Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, wyd. D. 20 P. Nierlich, W. J. Rutter, C. F. Fox (Academic Press, NY, 1976) strony 471—477. Plazmidy po¬ chodzace od col El charakteryzuja sie wzglednie malymi rozmiarami, posiadaja ciezar czasteczko¬ wy rzedu kilku milionów daltonów i odznaczaja 25 sie taka wlasciwoscia, ze po podzialaniu na ko¬ mórki gospodarza chloramfenikolem, ilosc kopii DNA plazmidu na komórke gospodarza moze wzrosnac od 20—40, jak to ma miejsce w warun¬ kach normalnych, do tysiaca lub wiecej. Zdolnosc 30 zwielokrotniana genów w komórce gospodarza umozliwia, przy zachowaniu odpowiednich warun¬ ków i pod kontrola, wytwarzanie przez komórke gospodarza przede wszystkim bialek kodowanych przez geny wprowadzane przez plazmid. Z tego 35 powodu, w sposobie wedlug wynalazku, korzyst¬ nymi wektorami przenoszacymi sa pochodne col El.Do odpowiednich pochodnych col El naleza: plazmidy: pMB9, przenoszacy gen opornosci na ^ tetracykline i pBR313, pBR315, pBR316, pBR317 oraz pBR322, które zawieraja oprócz genu opor¬ nosci na tetracykline, takze gen opornosci na ampicyline. Obecnosc genów opornosci na leki za¬ pewnia dogodny sposób selekcjonowania komórek * zainfekowanych skutecznie przez plazmid, ponie¬ waz kolonie takich komórek beda rosnac w obec¬ nosci leku, podczas gdy komórki, które nie otrzy¬ maly plazmidu, nie beda rosnac, ani tworzyc kolo¬ nii. W doswiadczeniach opisanych w niniejszym 50 opisie jako specyficzne przyklady zastosowania sposobu wedlug wynalazku, uzyto plazmidu pocho¬ dzacego od col El, zawierajacego oprócz wyzej opisanego markera opornosci na leki, takze jedno miejsce rozpoznawania Hiiid III. 55 Plazmid pBR322 jest szeroko opisany. F. Bolivar i wsp., Gene 2, 95 (1977) opisal jego synteze i po¬ dal charakterystyke. Ciezar czasteczkowy plazmi¬ du pBR322 wynosi 2,7X10* daltonów (skorygowa¬ ny; F. Bolivar, Gene 4, 121 (1978). Przenosi on gen opornosci na ampicyline (ApR) i gen opor¬ nosci na tetracykline (TcR). Gen ApR posiada jedno miejsce rozpoznawania endonukleazy Pst I.Gen TcR posiada po jednym miejscu rozpoznawa¬ nia kazdej z endonukleaz Hind III, Sal I i Barn ^ 60 HI. Ponadto plazmid pBR322 zawiera jedno miej¬ sce rozpoznawania Eco RI, dwa miejsca rozpozna¬ wania Hinc II, piec miejsc rozpoznawania Eco RH, trzy miejsca rozpoznawania Bgll dwanascie miejsc rozpoznawania Alu I, dwanascie miejsc rozpoznawania Hae II i siedemnascie miejsc roz¬ poznawania Hae III. Kolista mape miejsc rozpo¬ znawania plazmidu pBR322 podano na str. 103 ar¬ tykulu Bolivara i wsp. j. w. Opornosc na ampi¬ cyline zanika, jesli pBR322 podda sie rozszcze¬ pieniu w miejscu Pst I i wbudowuje tam DNA.Analogicznie opornosc na tetracykline zanika, je sli pBR322 poddaje sie rozszczepieniu endonukle- aza Hind III, Sal I lub Barn HI i wbudowuje DNA. Po wlaczeniu DNA w miejscu Pst I zre- kombinowane czasteczki wydziela sie poprzez ho¬ dowle w koloniach wrazliwych na ampicyline (Aps) i opornych na tetracykline (TcR). Analo¬ gicznie po wlaczeniu DNA do jednego z miejsc Hind III, Sal I lub Barn HI zrekombinowane czasteczki wydziela sie poprzez hodowle kolonii opornych na ampicyline, a wrazliwych na tetra¬ cykline. Wektor przenoszacy zawierajacy obcy DNA wlaczony w jednym z tych czterech miejsc, mozna opisac pod katem jego wlasciwosci oporno¬ sci na leki jako ApSTcR lub ApRTc'S. Wektor przenoszacy mozna dalej scharakteryzowac usuwa¬ jac wlaczony DNA i okreslajac ciezary czasteczko¬ we obu produktów w porównaniu do ciezarów czasteczkowych substancji wyjsciowych. Dalsza charakterystyka obejmuje sporzadzenie mapy miejsc rozpoznawania wektora przenoszacego. Po- .nadto mozna okreslic sekwencje wlaczonego DNA.Podobnie dobrze znanym plazmidem jest plaz¬ mid pBR313. Jego synteze i charakterystyke opi¬ sali F. Bolivar i wsp., Gene 2, 75 (1977). Plazmid pBR313 ma ciezar czasteczkowy 5,8XCL06 daltonów i jest nosnikiem genu opornosci na ampicyline (ApR) oraz genu opornosci na tetracykline (TcR). pBR313 zawiera po jednym miejscu rozpoznawa¬ nia nukleaz Hind III, Sal I i Barn HI w obre¬ bie genu TcR. Dokladna analiza pBR313 z zasto¬ sowaniem endonukleaz restrykcyjnych pozwolila na sporzadzenie mapy miejsc rozpoznawania, któ¬ ra podano na str. 84 artykulu Bolivara i wsp., j. w. Wlaczenie obcego DNA, w którymkolwiek z miejsc Hind III, Sal I lub Barn HI powoduje zanik TcR. Zrekombinowane czasteczki wydziela sie droga selekcji szczepów opornych na ampicy¬ line i wrazliwych na tetracykline. Wlasciwosci wektora przenoszacego zwiazane z opornoscia na leki, jak i sekwencje miejsc rozpoznawania wla¬ czonego DNA oraz ciezary czasteczkowe mozna okreslic jak powyzej. Trzecim dobrze znanym plazmidem jest pMB9. Otrzymuje sie go sposo¬ bem podanym przez R. L. Rodrigueza i wsp. j.w. oraz F. Bolivara i wsp., Gene 2, 75 (1977). Plaz¬ mid pMB9 ma ciezar czasteczkowy 3,5Xl66 daltonów i jest nosnikiem genu opornosci na tetracykline TcR. Posiada po jednym miejscu rozpoznawania endonukleaz Eco RI, Hind III, Sal I i Barn HI.Trzy ostatnie miejsca rozpoznawania ulokowane sa w obrebie genu TcR. Wlaczenie obcego DNA w którymkolwiek z miejsc Hind III, Sal I lub Barn HI powoduje zanik TcR. Wektor przenoszacyt4(tt(W 21 22 zawierajacy obcy ENA w jednym z tych miejsc mozna opisac pod katem tej wlasciwosci. Wektor ten mozna dokladniej opisac analizujac sekwencje wlaczonego DNA, porównujac ciezary czasteczko¬ we i analizujac miejsca rozpoznawania jak po¬ wyzej.Plazmid pSCIOl jest szeroko opisany. Jego syn¬ teze i wstepna charakterystyke podali S. H. Cohen i wsp. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 1293 (1973).Dodatkowe informacje podano w pracach S. N.Cohena i wsp., Proc. Nat. Acad. Scie USA, 70, 3240 (1973), H. W. Boyera i wsp. Recombinant Mo- lecules, wydanej przez R. F. Beersa i E. G. Bas¬ seta, Raven Press, Nowy Jork, str. 13 (1977) i S. N. Cohena i wsp., Recombinant Molecules, str. 91. pSCIOl ma ciezar czasteczkowy 5,8iX106 dalto- nów i jest nosnikiem genu opornosci na tetracy- kline (TcR). W obrebie tego genu wystepuja po¬ jedyncze miejsca rozpoznawania endonukleaz Hind III, Sal I i Barn HI. Ponadto pSCIOl zawiera jed¬ no miejsce rozpoznawania Eco RI, jedno miejsce Hpa I, jedno miejsce Sma I i cztery miejsca Hinc II. Rozszczepienie pSCIOl przez Hind III, Sal I lub Barn HI i wlaczenie w tych miejscach DNA powoduje zanik TclR. Po wlaczeniu DNA w jednym z miejsc Hind III, Sal I lub Barn HI zrekombinowane czasteczki wydziela sie poprzez hodowle w koloniach wrazliwych na tetracykli- ne. Wektor przenoszacy zawierajcy obcy DNA wlaczony w jednym z tych trzech miejsc mozna scharakteryzowac w odniesieniu do opornosci na leki. Wektor ten mozna dokladniej opisac: a) usu¬ wajac wlaczony DNA i okreslajac i porównujac ciezary czasteczkowe, b) sporzadzajac mape miejsc rozpoznawania i c) okreslajac sekwencje wlaczo¬ nego DNA, jak podano wyzej.Bakteriofagi uzyteczne jako wektory przenosza¬ cych, to klasa pochodnych faga lamda zwana Charon, a zwlaszcza Charon 3A, Charon 4A i Cha¬ ron 16A. Fagi te zostaly dobrze zbadane. Blatner i wsp., j. w. opisali ich synteze i wlasciwosci. Na str. 161 podano ich mape genetyczna z zaznacze¬ niem miejsc rozpoznawania endonukleaz. Genotyp kazdego z nich podano na str. 164, wraz z wy¬ nikami rozszczepiania dana endonukleaza restryk¬ cyjna i sposobem sprawdzenia skutecznosci wklo- nowania do nich obcego DNA. Na przyklad wla¬ czenie obcego DNA w miejscu Eco RI Charona 16A przejawia sie utrata genu Lac 5. Rozwój zre- kombinowanego faga na bakterii Lac powoduje wystapienie bezbarwnych plytek. Tak wiec wek¬ tor przenoszacy zawierajacy obcy DNA wlaczony w odpowiednim miejscu mozna scharakteryzowac w odniesieniu do wlasciwosci genetycznych wek¬ tora przenoszacego, np. bezbarwne plytki na bak¬ terii Lac. Wektor przenoszacy mozna dalej scha¬ rakteryzowac usuwajac wlaczony DNA i okresla¬ jac ciezary czasteczkowe dwóch produktów w po¬ równaniu z ciezarami czasteczkowymi elementów wyjsciowych. Nastepnie mozna sporzadzic mape miejsc rozpoznawania wektora przenoszacego, jak równiez okreslic sekwencje wlaczonego DNA.Podobnie X gt 1VES. XB, pochodna faga lambda, jest dobrze znany. Jego synteze i wstepna chara¬ kterystyke podali D. i!remeier i wsp., Nature, 263, 526 (1976). Dalsza charakterystyke mozna znalezc w pracy P. LedeTa i wsp., Science, 19$, 175 (1977).W obu powyzszych pracach okreslono genotyp te¬ go faga. Drugi z artykulów podaje ponadto pozy- * cje dwóch mkjsc rozpoznawania Eco RI i dwóch miejsc Sst I. Fag ten zawiera ponadto cztery miej¬ sca Bani HI; po hydrolizie otrzymuje sie frag¬ menty o dlugosci 5,4X)10S, 19,3X10* 3,8X10* i 11,4 X10* par zasad. 10 Analize endonukleazami restrykcyjnymi opisano na str. 527 artykulu Tiemeiera i wsp., j. w. Frag¬ ment XB usuwa sie poprzez trawienie z uzyciem Eco RI i rozszczepienie z uzyciem Sst I. Taki sposób postepowania zapobiega rekombinacji 15 z fragmentem XB. Obcy DNA zawierajacy niespa- rowane zasady w miejscu Eco RI wlacza sie do faga w miejscach Eco RI. Analize przy uzyciu endonukleaz restrykcyjnych podano na str. 527 artykulu Tiemeiera i wsp., }. w. Fragment XB 20 usuwa sie poprzez trawienie z uzyciem Eco RI i rozszczepienia przy uzyciu Sst I. Zapobiega to rekombinacji z fragmentem XB. Obcy DNA zawie¬ rajacy niesparowane zasady w miejscu Eco RI wlacza sie do faga w miejscach Eco RI. Wyste- £ powanie w fagach zrekombinowanych klonów ba¬ dano droga hybrydyzacji in situ, opisanej przez W.D. Bentona i R. W. Davisa, Science, 196, 180 (1977).Wektor przenoszacy mozna scharakteryzowac po¬ przez: a) usuniecie wlaczonego DNA, okreslenie 30 i porównanie ciezarów czasteczkowych, b) anali¬ ze przy uzyciu endonukleaz restrykcyjnych i c) okreslenie sekwencji wlaczonego DNA wyzej podanym sposobem.Podobnie do wyboru plazmidu, mozliwosc wy- 135 boru odpowiedniego gospodarza jest w zasadzie bardzo szeroka, ale znacznie zwezona ze wzgle¬ dów bezpieczenstwa. Rozpowszechnilo sie zastoso¬ wanie szczepu E. coli oznaczonego X-1776, który uzyskal zatwierdzenie NIH do stosowania w proce- 40 sach opisywanego typu, przy zapewnieniu odpowied¬ nich warunków ograniczajacych (P2). Patrz: R. Cur- tiss III, Ann.Rev. Microbiol, 30, 507 (1976). E. coli RR-1 jest odpowiedni w tym przypadku, gdy mozliwe jest zachowanie warunków ograniczajacych P3. 46 Tak, jak w przypadku plazmidów, nalezy rozu¬ miec, ze w sposobie wedlug wynalazku stosowac mozna szczepy komórek gospodarza, które mozna zmodyfikowac wybranym wektorem przenoszacym, wlaczajac w to prostista inne niz bakterie, np. 50 drozdze, jesli tylko szczepy te zostaly zatwierdzone do uzycia zgodnie z wytycznymi NIH.Zrekombinowane plazmidy przygotowuje sie przez zmieszanie DNA plazmidu poddanego uprzednio dzialaniu endonukleazy restrykcyjnej M z cDNA o grupach koncowych poddanych podob¬ nemu dzialaniu. W celu zminimalizowania mozli¬ wosci rekombinowania odcinków cDNA ze, soba, DNA plazmidu wprowadza sie w molowym nad¬ miarze wzgledem cDNA. 60 W przypadku dotychczasowych metod prowa¬ dzilo to do tego, ze wiekszosc plazmidów zamy¬ kala sie koliscie bez wlaczenia odcinka cDNA.W wyniku tego, transformowane komórki zawiera¬ ly glównie plazmid, a nie plazmidy, które ulegly * rekombinacji z cDNA, co prowadzilo do bard2o140 zmudnego i czasochlonnego procesu, selekcji. Do¬ tychczas rozwiazywano tep problem* usilujac wy¬ nalezc wektory przenoszace ONA zawierajace miej$jca;ji,roapc^qawj«Bi^ fei^oauukleacsy w srpdku odpo^edniegb genu -^ markera tak, aby powla- 5 czeniu rekombinanta . podzielic - gen, powodujac w ten sposób utrate funkcji kodowanej przez gen.Korzystnie, stosuje sie -metode pozwalajaca na zmniejszenie ilosci kolonii, do screeningu zrekom- binowanych plazmidów. Sposób ten polega na 10 dziaJaniu, na naciety endonukleaza restrykcyjna DNA plazmid, fosfataza alkaliczna, enzymem han¬ dlowo dostepnym z róznych zródel, takich jak Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey. Przez dzialanie fosfataza alkaliczna 15 usuwa sie z konców plazmidu, utworzonych pod dzialaniem endonukleazy, koncowe grupy 5' fosfo¬ ranowe, chroniac w ten sposób DNA plazmidu przed laczeniem sie ze soba. W rezultacie utwo¬ rzenie struktury kolistej, a stad transformacja, 20 zalezec bedzie od wprowadzenia odcinka DNA za¬ wierajacego koncowe grupy 5' fosforanowe. Opi¬ sany sposób pozwala zmniejszyc wzgledna czesto¬ tliwosc transformacji bez rekombinacji do mniej niz 1 na104. 25 Podstawa wynalazku jest fakt zachodzenia ka¬ talizowanej ligaza DNA reakcji pomiedzy 5' koncowa grupa fosforanowa DNA a 3' koncowa grupa hydroksylowa DNA. Jezeli 5' koncowa gru¬ pa fosforanowa zostanie usunieta, reakcja lacze- 30 nia sie nie zajdzie. W przypadku gdy dwunicio- wy DNA ma byc polaczony, mozliwe sa trzy sy¬ tuacje, jak to przedstawiono w tablicy 1.Tablica 1 Przy¬ padek I II III Reagenty 3' 5' OH H2OsPO—- OPO*H2i+HO 5' 3' 3' 5' -^-OH+H2OsP-0 ---OH HO 5' 3' 3' 5' OH HO "f + -OH HO- 5' 3' Produkt reakcji 'katalizowanej ligaza DNA 3' 5' O-P-O ____0-P-0 +2H20 5' 3' 3' 5' O-P-O— OH HO hH20 5' 3' brak reakcji 1 55 W tablicy 1, dwumiciowy DNA schematycznie przedstawiono grubymi liniami równoleglymi, na¬ tomiast jego grupy koncowe, odpowiednio 5' i 3', oznaczono jako hydroksyl (OH) lub fosforan (OPOiHj). W przypadku I, 5' fosforany wystepu- M ja na obu koncach reagentów, czego wynikiem jest kowalencyjne zwiazanie obu nici. W przy¬ padku IJ, tylko jedna nic, która ma ulec zwia¬ zaniu, zawiera koncowy 5' fosforan, w wyniku < czego tylko jedna nic zostanie zwiazania kowalen- «5 200 24 cyjnie, pozostawiajac nieciaglosc drugiej nici.Nic nie zwiazana kowalencyjnie pozostaje pola¬ czona z nicia zwiazana, dzieki wiazaniom wodoro¬ wym pomiedzy komplementarnymi parami zasad przeciwleglych nici. Zjawisko to jest znane.W przypadku III, zaden z konców reagentów nie zawiera 5' fosforanu, wobec czego nie moze zajsc reakcja wiazania sie.Niepozadanym reakcjom wiazania sie mozna zapobiec powodujac usuniecie koncowych grup 5' fosforanowych z odpowiednich konców reagentów, do laczenia sie których nie chcemy dopuscic.Mozna zastosowac kazda odpowiednia metode usuwania grup 5' fosforanowych, nie powodujaca uszkodzenia struktury DNA. Korzystnie stosuje sie hydrolize katalizowana przez enzym, fosfataze alkaliczna.Dla zilustrowania opisanych powyzej metod, wy¬ izolowano cDNA kodujacy insuline szczurza i pod¬ dano go rekombinacji z. plazmidem. Do modyfiko¬ wania E. coli X-1776 uzyto czasteczek DNA. Trans* formanty wyselekcjonowano przez wzrost na pod¬ lozu zawierajacym tetracykline. Stwierdzono, ze DNA zrekombinowanego plazmidu, otrzymany ze zmodyfikowanych przez transformacje komórek zawiera wlaczony odcinek DNA o dlugosci 410 riu- kleotydów. Otrzymano takze i zbadano inne zre- kombinowane plazmidy, otrzymane podobnymi me¬ todami. Wlaczone odcinki uwolniono z plazmidu za pomoca trawienia z udzialem endonukleazy Hind III lub HSU I i poddano analizie sekwencji DNA metoda opisana przez A. M. Maxama i W.Gilberta w Proc. Nat. Acad.-Sci. St. Zjed. Ame¬ ryki 74, 560, (1977). Stwierdzono, ze sekwencja nukleotydów wlaczonych odcinków DNA pokrywa sie w calkowitym obszarem kodujacym proinsuline I szczurza, jak równiez 13 z 23 aminokwasów prepeptydu. Sekwencje nukleotydów podano w po¬ nizszej czesci opisu.Opisany proces jest ogólnie przydatny do izo¬ lowania i oczyszczania genów wyzszego organiz¬ mu, wlaczajac w to geny ludzkie, oraz do prze¬ noszenia ich do mikroorganizmów i replikacji w nich. Opisano nowe zrekomibinowane plazmidy, zawierajace calosc, albo czesc izolowanego genu.Opisano takze nowe mikroorganizmy, dotychczas nieznane w naturze, zawierajace jako czesc ich wyposazenia genetycznego, gen pochodzacy z wyz¬ szego organizmu: W ponizszej czesci opisu zamie¬ szczono przyklady, opisujace szczególowo kazde stadium procesu wyizolowywania, oczyszczania i przenoszenia genu insuliny szczurzej do E. coli, w celu wyrazniejszej oceny wlasciwosci i przy¬ datnosci wynalazku. W nastepujacych przykladach scharakteryzowano zrekomibinowane plazmidy za¬ wierajace czesc genu insuliny szczurzej i gen in¬ suliny ludzkiej oraz nowe mikroorganizmy zawie¬ rajace powyzsze geny.Przyklad I. Opisana metoda przedstawia eks- tatócje i izolacje iiriRNA insuliny szczurzej, synte¬ ze DNA komplementarnego do niego i charaktery¬ styke komplementarnego DNA.W celu otrzymania oczyszczonych komórek wy¬ sepek szczura, trzustke znieczulonego szczura pod¬ dano infuzji solnym roztworem Hanka, stosujac*mw* 335 26 infuzje wsteczna do przewodu trzustki. Solny roz¬ twór Hanka jest to standardowy roatwór jniesza- niny soli, znany i dostepny z róznych zródel, ta¬ kich jak Grand Island Biological Supply Compa¬ ny, Grand Island, New Jork. Nastepnie trzustke usuwa sie, miele w roztworze Hanka w tam. 0° i poddaje trawieniu kolagenaza i inhibitorem trypsyny z soi. Wszystkie te czynniki wykonuje sie w temp .0—4° Ct jezeli tego inaczej nie zama¬ czono. Warunki tego procesu trawienia byly w najwyzszym stopniu krytyczne. Dwie zmielone trzustki szczurze, w podlozu Hanka o ogólnej ob¬ jetosci 8 ml umieszczono w 80 ml szklanej pro¬ bówce. Wszystkie szklane probówki fcyly silikono- wane2). Mieszanina inkubacyjna zawierala 12 mg kolagenazy, enzymu otrzymanego z Clostridium histolyticum, zasadniczo metoda podana przez I. Mandla, J. D. Mackennana i E. L. Howese w J.Glin. Invest., 32, 1328 (1943), typ CLS, IV, otrzy¬ many z Worthington Rioehemical Corporation, Freehold, New Jersey i 1 mg inhibitora trypsyny z soi otrzymanego z Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Inkubacje prowadzi sie w tern. 37°C w ciagu 25 min., wstrzasajac z szyb¬ koscia 90 wstrzasów/min. Dla1 upewnienia sie, ze trawienie z udzialem kolagenazy przebiega w optymalnym nasileniu, konieczna jest ciagla kontrola procesu. W przypadku zbyt krótkiej in¬ kubacji komórki wysepkowe zostaja niecalkowicie uwolnione, natomiast, gdy inkubacja trwa zbyt dlugo, komórki zaczynaja ulegac lizie. Po zakon¬ czeniu inkubacji probówke wiruje sie w ciagu 1 min przy 200 g. Supernatant dekantuje sie, a osad przemywa roztworem solnym Hanka i czynnosci te powtarza pieciokrotnie. Po konco¬ wym wirowaniu, osad zawiesza sie w 15 ml Ficoll3), o gestosci 1,085. Naklada sie 8 ml war¬ stwe Ficoll o gestosci 1,080, nastepnie 5 ml o ge¬ stosci 1,060 i- wiruje, stosujac wirówke laborato¬ ryjna, przez 5 minut przy 500 xg, a nastepnie przez 5 minut przy 2000 xg. W wyniku przepro¬ wadzenia tych procesów, graniaste komórki po¬ zostaja na dnie probówki, a komórki wysepkowe ukladaja sia w gradiencie i gromadza sie miedzy dwoma górnymi warstwami. Pasmo komórek wy- sepkowych zawiera jako zanieczyszczenie komórki ukladu nerwowego, gruczolów limfatycznych i tkanki lacznej. Duze zanieczyszczajace fragmen¬ ty usuwa sie z materialu pasma. Zakonczenie pre¬ paratyki nastepuje przy uzyci,u mikroskopu ana¬ litycznego, gdzie widoczne materialy zanieczy¬ szczajace usuwa sie z pasma recznie, stosujac mikropipete. Preparat komórkowy rozciencza sie nastepnie roztworem Hanka i wiruje. Supernatant dekantuje sie, a ocad komórkowy przechowuje yr stanie zamrozenia w cieklym, azocie.¦Komórki wysepkowe z 2Q0 szczurów zbiera sie raiem i homogenizuje w 4 m tiocyjanianie guani- 4&yftiowraA zawijajacym 1 m 0-nierkaptoetano- 2) felicland, znak ochronny, Clay-Adams Divi- sion, Becton-Dickinsoon Inc., Parsippany, New Jersey, a) Znak ochronny, £fcwgwacaa ^m^aj Company, Urosala, Szwecja. 4) TRJDOM, znak ochronny) Fluka AG Chemi- sche Fabrik, fiuchs, Szwajcaria. 10 15 20 25 30 05 40 45 50 ss *o lu, buforowym do pH 50 i w itemperaturze 4°C, Otrzymany produkt nawarstwia sie na 1,2 ml. -5,7 m CsCl zawierajacego 1«00 ^nmoli EDTA i wfruje pczez 1? Bedzin przy 37 000 obr/min, w uKrawirowce Beckmana typu SW 501 w tem¬ peraturze 15°C (Beckman In&trujuent Company, iFullerton, Kalifornia). RNA przemieszczal sie do dna popeifeówlki Poliadenyiowany RNA izoluje sie metoda chro¬ matografii calego preparatu RNA na oligofcFDce- lulozie wedlug metody H. A*iva i P. Lederai, j, w.Do transkrypcji calej ilosci'poliadenylowanego RNA z wysepek Langerhansa szczura, w cDNA uzywa sie odwrotnej transkryptazy otrzymanej z wirusa ptasiej bialaczki mieloblastycznej, do- tarczanego przez D. J. Bearda z Lrife Science Inc., St. Petersburg, Floryda. Reakcje prowadzi sie w srodowisku zawierajacym: 50 mmoli Tris-HCl o pH 8,3, 9 mmoli MgCl*, 30 mmoli Nad, 20 mmoli p-merl^aptoetanolu, po 1 mmolu kazdego z trzech nieradioaktywnych dezoksyrytoonukleozy- dotirójfosforanów, 250 ^moli czwartego dezdksy- nukleozydotrójfosforanu znakowanego &P w pozy¬ cji a, o aktywnosci wlasciwej 1,35X10*2— 7,4X10'i2 Bq na mol 20 ng/ml oligo-dti2_i8 produkcji Col- laborative Research, Waltham, Massachusetts, 100 #g/ml poliadenylowanego RNA i 200 jednostek/ml odwrotnej transkryptazy. Mieszanine te inkubuje sie w temperaturze 45°C przez 15 minut. Po do¬ daniu EDTA-Na2 do stezenia 25 mmoli otrzymany roztwór ekstrahuje sie taka sama objetoscia fe¬ nolu nasyconego woda, nastepnie faze wodna pod¬ daje sie chromatografii na kolumnie Sephadex G-100 o srednicy 0,3 cm i wysokosci 10 cm, w 10 mmolach Tris-HCl o pH 9,0, 100 mmolach NaCl i 2 mmolach EDTA. Kwas nukleinowy wy- eluowany w objetosci martwej po dodaniu octa¬ nu amonu, pH 6,0 do stezenia 0,25 m wytraca sie etanolem. Osad zbiera sie przez odwirowanie i rozpuszcza w 50 pi swiezo przygotowanego 0,1 m NaOH i inkubuje sie w 70°C przez 20 minut w celu zhydrolizowania RNA. Mieszanine zobojet¬ nia sie dodajac 1 m octanu sodu, pH 4,5 a otrzy¬ many 32p^cDNA wytraca sie etanolem i ponownie rozpuszcza w wodzie. Próbki jednoniciowego cDNA poddaje sie analizie na natywnych zelach poliakryloamidowych metoda opisana przez C. W.Dingmana i A. C. Peacocka w Biochemistry, 7, 659 (1968). Zele suszy sie i wykrywa sie *®P DNA autoradiograficznie na blonie Kodak No-Screen NS-2T5). cDNA jest heterodyspersyjny, jak to mozna sadzic na podstawie elektroforezy. Zawie¬ ra on co najmniej jeden glówny rodzaj cDNA skladajacy sie z okolo 450 nukleotydów, jak moz¬ na sadzic po porównaniu ze znanymi standardami.Przyklad II. Powtarzano sposób postepowa¬ nia podany w poprzednim przykladzie, zmienia¬ jac stezenia P-merkatoetanolu zacji komórek wysepek. Stosowano stezenia P-rneTjlLaijto^anolu r$wne< OJfr m, Q& m, 0,6 m i 9,8 m* Pr^y Wfizyslfcteli stosowanych wartosciach stezen fMnericapteetanolu osiagnieto ten sana wy- 5) Znafc ochronny, Eastman Rochester, New York.Kodak Corporation,140 200 27 28 nik -^- zapobiezenie degradacji mRNA powodo¬ wanej przez RNAaize. ?.Przyklad HI. Powtarzano aposób postepo¬ wania podany w przykladach I i II, zmieniajac wartosc pH roztworu tiocyjsiiianu guanidyniowe- * go i P-imerkaptotetanolu w etapie homogenizacji komórek wysepek. Stosowano wartosci pH 6,0, 7,0 i 8,0. Przy wszystkich stosowanych wartosciach pH osiagnieto ten sam wynik — zapobiezenie de¬ gradacji mRNA powodowanej przez RNAaze. 10 Przyklad IV. Opisano synteze i charaktery¬ styke dwuniciowego cDNA zawierajacego sekwen¬ cje insuliny szczurzej. Otrzymany w sposób jak wyzej opisano w przykladzie I jednoniciowy cDNA poddaje sie dzialania odwrotnej transkryptazy w celu syntezy komplementarnej nici. Mieszani¬ na reakcyjna zawiera: 50 mmoli Tris-HCl, pH 8,3, 9 mimoli MgCl2, 10 mmoli dwutiotreitolu, po 50 jumoli kazdgo z trzech nieznakowanych dezoksy- rybonukleozydotrójfosforanów, 1 mmol nukleozy- dotrójfosforanu' znakowanego 32P w pozycji a o aktywnosci wlasciwej 3,7X1010—37X10loBq na milimol, 50 ^ug/rnl cDNA i 220 jednostek/ml od¬ wrotnej transkryptazy. Mieszanine reakcyjna in- kubuje sie w 45°C przez 120 minut. Reakcje za¬ trzymuje sie przez dodanie EDTA-Na2 do steze¬ nia 25 mmoli, mieszanine ekstrahuje sie fenolem i poddaje chromatografii na kolumnie Sephadex G-100, a nastepnie wytraca sie etanolem. Próbki otrzymanego produktu o aktywnosci 500—1000 im¬ pulsów/min poddaje sie analizie metoda elektro¬ forezy na zelu w sposób jak wyzej opisano w przykladzie I. Stwierdza sie obecnosc heterodys- persyjnego pasma o dlugosci okolo 450 nukleoty- dów, przez porównanie z próbkami standardowy¬ mi Próbki DNA otrzymanego w sposób jak wyzej opisano w przykladzie i i IV poddaje sie oddziel¬ nie trawieniu z udzialem uzytej w nadmiarze en- donukleazy restrykcyjnej Hae III i podobnie ana¬ lizuje metoda elektroforezy na zelu. Obydwa pro¬ dukty zostaja rozszczepione przez endonukleaze tak, ze w elektroforezie na zelu stwierdza sie dwa pasma radioaktywnosci. Pasma tworzace sie w wyniku rozszczepienia dwuniciowego cDNA sta¬ nowia produkty rozszczepienia o zasadniczo tej samej dlugosci co produkty otrzymane w wyniku rozszczepienia jednoniciowego cDNA.Przyklad V. Opisano laczenie dekanukleo- tydu bedacego miejscem rozszczepienia Hind III, z wolnym koncem dwuniciowego cDNA, otrzyma¬ nego w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IV. Dwuniciowy produkt reakcji, otrzymany w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IV, w stezeniu 2—5 fig/mol, poddaje sie dzialaniu 30 j nukleazy SI o aktywnosci 1200 j/ml produk¬ cji Miles Laboratories-, Elkhart, Indiana, w srodo¬ wisku zawierajacym 0,03 m octanu sodu, pH 4,6, 0,3 m chlorku sodu i 4^5 mmoli ZnCk przez 30 minut, w temperaturze 22?C, a nastepnie przez. 15 minut w temperaturze 10°C. Trawienie zatrzymuje sie przez dodanie Tris-zasady do koncowego steze¬ nia 0,1 m EDTA do 25 mmoli i tRNA z E. coli, otrzymanego metoda podana przez G. von Ehren- steina w Methods in Enzymology, wyd. S. P. Có- lowick i N. O. Kaplan, tom 12 A, str. 588 (1967), «* 20 25 30 65 40 45 50 55 60 do stezenia 40 ^g/ml. Po ekstrakcji fenolem mie¬ szanine rekreacyjna poddaje sie chromatografii na kolumnie Sephadex G-100, po czym 32P-cDNA wy_ eluowany w objetosci martwej wytraca sie eta¬ nolem. W wyniku tego postepowania otrzymuje sie z duza wydajnoscia czasteczki cDNA o wol¬ nych koncach ze sparowanymi zasadami, co jest niezbedne do przylaczenia dowolnego konca che- miecznie zsyntetyzowanych dekanukleotydów. De- kamery Hind III otrzymuje sie metoda opisana przez R. H. Schellera, R. R Dickersona:, H. W.Boyera, A. D. Riggsa i K. Itakure w Science 196, 177 (1977). Przylaczenie dekamerów Hind III do cDNA przeprowadza sie przez inkubacje w 14°C przez 1 godzine w srodowisku zawierajacym: 66 mmoli Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mmoli MgCl2-, 1 mmol ATP, 10 mmoli dwutiotreitolu, 3 mmole dekamerów Hind III o aktywnosci 105 impul- sów/pmol i ligaze T4 DNA, okolo 500 j/ml. Na¬ stepnie mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do 65°C przez 5 minut w celu inaktywacji ligazy. Dodaje sie KC1 do koncowego stezenia 50 mmoli, p-mer- kaptoetanolu do koncowego stezenia 1 mmol, EDTA do koncowego stezenia 0,1 mmol i trawi endonukleaza Hsu I lub Hind III o» stezeniu 150 j/ml, przez 2 godziny w 37°C. Endonukleazy Hind III i Hae III sa handlowo dostepne z New En- gland Bio-Labs, Beverly, Massachusetts, Produkt analizuje sie metoda elektroforezy na zelu w spo¬ sób opisany powyzej w przykladzie I i obserwuje sie pik odpowiadajacy sekwencji okolo 450 nukle- otydów, a dodatkowo fragmenty rozszczepionych dekamerów Hind III.Przyklad VI. Sposobem podanym w przy¬ kladzie V laczy sie dekanukleotydy stanowiace miejsca rozszczepienia Eco RI z wolnym koncem cDNA z przykladu IV. Dekamery Eco RI otrzy¬ muje sie sposobem podanym przez Schnellera i wsp., j. w. Maja one nastepujaca sekwencje: 5'-CCGAATTCGC-3'. Po polaczeniu z wolnym koncem produkt poddaje sie trawieniu endonukle¬ aza Eco RI, w warunkach reakcji takich samych jakie podano dla Hsu I lub Hind III. Eco RI jest dostepna, wytwarza ja New England, Biolabs.Produkt reakcji analizowano metoda elektrofo¬ rezy na zelu, jak opisano w przykladzie I, obser¬ wujac pik odpowiadajacy sekwencji okolo 450 nu- kleotydów, a ponadto fragmenty rozszczepionych dekamerów Eco RI.Przyklad VII. Opisano przygotowanie zre- kombinowanego plazmidu i jego charakterystyke po replikacji. Plazmid pMB9 DNA, przygotowuje sie jak opisali R. L. Rodriguez, F. Bolivar, H. M.Goodman, H.W. Boyer i M. Batlach w ICN-UCLA Symposium on Molecudar and Cellular Biology, wyd. D. P. Wierlich, W. J. Rutter i C. F. Fox (Academic Press, New York 1976 strony 471—477) i rozszczepia w miejscu rozpoznawania Hind III en¬ donukleaza Hsu I, nastepnie dziala sie fosfataza alkaliczna typ BAPF, Worthington, Biochemicai Corporation, Freehold, New Jersey. Enzym jest obecny w mieszaninie reakcyjnej w stezeniu 0,1 j/mikrogram DNA. Mieszanine te inkubuje sie w obecnosci 25 mmoli Tris-HCl, pH 8,0 przez 30 minut w 65°C, nastepnie ekstrahuje fenolema mm w celu usuniecia fosfatazy. Po wytraceniu etano¬ lem, wprow&dza Sie DNA plazrritóu traktowanego fosfataza do cDNA zawierajacego „lepkie" konce Hind III w stosunku molowym; 3 moie plazmsttu na 1 mol cDNA. Mieszanine reakcyjna zawieraja¬ ca 66 mmoli Tris, pH Ifi, 0,6 mmoli tógCb, 10 mmoli dwutiotreitolu i 1 himoli ATP inkbttuje sie przez 1 godzine w 14°C w obiechosci Hgazy T4 DNA w stezeniu 50 j/rhl.Mieszanine te dodaje Sie nastepnie bezposrednio do zawiesiny komórek E. coli X-1776 przygotowa¬ nych do transformacji w nastepujacy sposób: ko¬ mórki hoduje sie W 37°C do otrzymania okolo 2X108 komórek/ml, w 50 ml podloza zawieraja¬ cego: Tryptone 10 g/l, ekstrakt drozdzowy 5 s/l, NaCl 10 g/l, NaOtt 2 mmole, kwas dwuarhinopi- melinowy 100 ^wg/rnl i tymine 40 fig/ml. Komórki oddziela sie przez wirowanie w 5°C przez 5 mi¬ nut przy 5 0000 x g, zawiesia W %& mi zimnego 10 mmoli NaCl, wiruje jak poprzednio i ponownie zawiesza w 20 mil buforu do transformacji, który zawiera: 75 mmoli CaCla, 140 rnfnoli NaCl i 10 mmoli Tris, pH 7,5, pozostawiajac je przetf 5 mi¬ nut w lodzie. Komórki nastejpnie odwirowuje sie i zawiesza w 0,5 mi buforu do transformacji, któ¬ ry to proces zachodzi po zmieszaniu 100 fil ubl- wiesiny komórek z 50 ^il zrekomfeinoWanego DNA (1 ^g/ml). Mieszanine inkulbuje sie. w temperatu¬ rze 0ÓC przez 15 minut, przenosi do 25°C na 4 minuty, a nastepnie inkubuje Sie W 0°C przez 30 minut. Nastepnie przenosi sie komórki na plytki z podlozem agarowym w celu prowadzenia wzro¬ stu w warunkach selekcyjnych.Screening zrekombinowanych plazmidów prowa¬ dzi sie w obecnosci tetracykliny w stezeniu 5 mi- krogramów/ml w celu wykrycia transformacji w miejscu rozpoznawania Hind III. Wyodrebnia sie wybrany, zrekombinowany plazmid, oznaczo¬ ny jako pAU-1. Surowe preparaty plazmidów, wy¬ odrebnione z pAU-1 zawierajace 2—5 /zg DiNA, trawi sie endonukleaze Hsu I uzyta w nadmiarze.Dodaje sie EDTA-Na2 10 mmoli (stezenie konco¬ we) oraz sacharoze 10% (waga/objetosc) (stezenie koncowe) i mieszanine rozdziela sie na 8% zelu poliakryloamidowyim. Obecnosc DNA stwierdza sie w miejscu odpowiadajacym DNA o dlugosci oko¬ lo 410 par zasad. W podobnym eksperymencie plazmid pBR322 stosuje sie jako czynnik przeno¬ szacy. Wszystkie warunki sa takie sanie1 jak opi¬ sano, z wyjatkiem tego, ze koncowa selekcje zre- 16 l* 20 kóimbinowanych klonów prowadzi sie na plyt¬ kach zawierajacych ampicyline, w stezeniu 20 F*g/mi.Przyklad VIII. a) (Powtarza sie sposób po¬ stepowania z przykladu VII, stosujac zamiast plazmidu pMB9 DNA plazmid pBJR322, otrzy¬ many sposobem podanym przez Bolivara i wap., Gene 2, 95 (1977). Utrzymuje sie te same warunki, z wyjajfckiem tego, ze koncowy rozdzial zrekom¬ binowanych klonów przeprowadza sie droga ich hodowli na plytkach zawierajacych 20 pg/ml te¬ tracykliny. Wlaczony fragment usuwa sie jak wyzej, otrzymujac DNA o dlugosci okolo 410 par zasad i o sekwencji przedstawionej w tablicy 2. b) Powtarza sie sposób postecwwania z przykla¬ du VII, stosujac plaEmid pBR313 DNA otrzymany Sposobem podanym przez Bollvara i wsp., Gene 2, 75 (1977) w miejsce plazmidu pMB9 DNA.Wszystkie warunki sa te same, z tym, ze konco¬ wa selekcje zrekombinowanych klonów przepro¬ wadza sie jak wyzej podano, otrzymujac DNA o dlugosci okolo 410 par zasad i o sekwencji przedstawionej w tablicy 2. c) Powtarza sie sfrosófe postepowania z przykla¬ du VII, stosujac plazmid pSCIOl DNA otrzymany sposobem podanym przez Cohena i wsjp., Proc.Nat. Acad. Scie. USA, 70, 1293 (1973) w miejsce plazmidu pMB9 DNA. Wszystkie warunki, wraz z warunkiem selekcji zrekombinowanych klonów sa takie same. Wlaczony DNA usuwa sie wyzej podanym sposobem, otrzymujac DNA b dlugosci okolo 410 par zasad i o sekwencji podanej w ta¬ blicy2. ¦ Przyklad IX. Powtarza sie sposób postepo¬ wania z przykladów VII i VIII, stosujac szczepy E. coli RRI i E. coli HB10 w miejsce E. coli X-1776, utrzymujac te same warunki i otrzymu¬ jac te same wyniki.Przyklad X. a) Jako wektor przenoszacy stosuje sie fag Charon 16A DNA, otrzymany spo¬ sobem podanym przez. Blattnera i wsp., j. w.Lepkie konce usuwa sie poprzez inkubacje, w ciagu 60 minut, w temperaturze 42ÓC w 0,1 m Tris-HCl, pH = 8,0 i 10 mmoli MgCl2. Wektor rozszczepia sie w miejscu rozpoznawania Eco RI i poddaje dzialaniu fosfatazy alkalicznej, jak po¬ dano w przykladzie VII. Po wytraceniu etanolem wektor cDNA poddany dzialaniu fosfatazy dodaje sie do cDNA zawierajacego lepkie zakonczenia Tablica 2 30 40 ¦ 1 [nieokreslona]-GCC CTG CTG GTC CTG TGG GAG CCC AAG CCT GCT CAG CCT TTT GTC AAA CAG GAA CGT 10 L» 1 CAC CTT TOT GGT CCT CAC CTG GTG GAG GCT CTG TAC CTG GTG TGT GGG 30 GGT TTC TTC TAC ACA; CCC AAC TCC CGt CGT GAA GTG GAG GAC CCG CAA 40 50 1 GTG CCA CAA CTG GAG CTG GCT CGA GOC CCG GAG GCC GCG GAt ClT CAG ACC TGG GCA CTG ATC TGC GAG GTT GCC CGG CAG AAG CGT CG^AAT GTG GAT CAG TGC TOC ACC AGC TCC CtC TAC CAA CTG GAG AAC TAC TGC AAC fGA GttCAAtCAATTSCCGA- TCCACCCCTCTGCAATGAATAAAGCCTTTGAATGAGC-poliA I ''-• ¦- * ¦- •¦¦ •¦¦• ¦¦'-¦¦ -"^ w viii!,*—ni nrm IUi i ii rtftflrffiri-it w ¦" ^-p--.¦«¦-¦ w- . ¦¦. *..i.... ¦ ^r-« c-r^-*! -.»,Vf.J Podkreslony fragment ;** Obsza* o aleealkdWicic pytanej sektffmrtji140 200 SI 32 w miejscu Eco HI, w stosunku molowym 2 mole wektora na 1 mol cDNA. Mieszanina, poddaje sie lizie ligaza T4 DNA, jak w przykladzie VII. Tak otrzymana mieszanine dodaje sie bezposrednio do zawiesiny komórek E. óofi X-1776, przygotowanych do transformacji tak, jak podano w przykladzie VII i przeprowadza sie transformacje tak, jak po¬ dano w przykladzie VII. Zrekomibinowane fagi od¬ dziela sie i posiewa na bakterii Lac-, na plytkach zawierajacych 5-chloro-4Hbromo-3-indolilo-p-D- -galaktozyd (X6) (80 \ig/m\. i selekcjonuje sie zre¬ komibinowane fagi zawierajace cDNA wbudowany w miejscu Ecoi RI Charona 16A, wytwarzajace bezbarwne plytki. Wyselekcjonowane rekombinanty izoluje sie, poddaje trawieniu nadmiarem endonu- kleazy Eco RI i analizuje sie otrzymany produkt tak, jak opisano w przykladach VII i IX. Uzys¬ kuje sie DNA o< dlugosci okolo 410 par zasad i o sekwencji przedstawionej w tablicy 2. Ewen¬ tualnie mieszanine otrzymana po przeprowadzeniu lizy stosuje sie do< otrzymania zrekomlbinowanych fagów in vitro, sposobem podanym przez N. Steinberga i wsp., Gene 1, 255 ((il977). Screening zrekombinowanych fagów mozna równiez przepro¬ wadzic poprzez hybrydyzacje bakterii in situ sposo¬ bem podanym przez W. D. Bentona i R. W. Da- visa, Science 196, 180 (1977). b) Jako wektor przenoszacy stosuje sie fag Charon 3A DNA otrzymany sposobem podanym przez Blattera i wsp., w miejsce Charona 16A DNA opisanego powyzej. Stosuije sie te same wa¬ runki co dla Charona 16A DNA. Selekcje zre¬ kombinowanych fagów przeprowadza sie: a) umie¬ szczajac fagi na bakterii Lac+, na plytkach za¬ wierajacych X6 i wydzielajac bezbarwne powloki, a nastepnie b) przez hybrydyzacje w odpowiednim stopniu lub trawienie endonukleaza restrykcyjna, sposobem podanym przez Blattnera wsp. Wbudo¬ wany fragment usuwa sie tak, jak opisano powy¬ zej, otrzymujac DNA o< dlugosci okolo 410 par zasad i o sekwencji zamieszczonej w tablicy 2. c) Fag X gtWES. X BDNA otrzymany sposobem podanym przez Tiemeiera i wsp., stosujac sie jako wektor przenoszacy w miejsce Charona 16A w warunkach takich, jak opisano dla Charona 16A. Selekcje zrekombinowanych fagów przepro¬ wadza sie metoda hybrydyzacji podana przez Ben¬ tona i Davisa. Wlaczony fragment usuwa sie jak opisano powyzej, otrzymujac DNA o dlugosci oko¬ lo 410 par zasad i sekwencji zamieszczonej w ta¬ blicy 2.Przyklad XI. Powtarza sie tok postepowa¬ nia z przykladu X, zastepujac szczep E. coli X-1776 szczepami E. coli RRI, E. coli HB101, E. coli DP50 i E. coli DP50 SupF, stosujac te sa¬ me warunki. Otrzymuje sie te same wyniki.Przyklad XII. DNA z pAU-1, otrzymany w sposób' jak wyzej opisano w przykladzie VII, poddaje sie dalszemu oczyszczaniu metoda elek¬ troforezy na 6% zelu poliakryloamidowym. Po elucji z zelu, DNA znakuje sie przez inkubacje z ,2P-ATP znakowanym w pozycji y oraz enzy¬ mem kinaza polinukleoitydowa w warunkach spisanych przez Maxama i Geliberta, j. w.Enzym katalizuje przeniesienie radioaktywnej grupy fosforanowej z 32p_ATP znakowanego w pozycji y n& koniec 5' DNA. Enzym ten otrzy¬ muje .sie z E. coli metoda opisana przez A. Pa- 5 neta i wsp., Biochemistry 12, 5045 (1973). Tak znakowany DNA rozszczepia sie endonukleaza Hae III, jak to wyzej opisano w przykladzie IV, a dwa znakowane fragmenty zawierajace, odpo¬ wiednio okolo 265 i 135 par zasad, rozdziela sie io na zelu poliakryloamidowym w warunkach wy¬ zej opisanych w przykladzie I. Wyodrebnione fragmenty poddaje sie specyficznej reakcji roz¬ szczepienia i analizuje sekwencje metoda opisana przez Maxama i Gilberta, j. w. Na sekwencje, 15 która przedstawia tablica 2i skladaja sie wyniki otrzymane w opisanej tutaj serii eksperymentów oraz podobnych serii badan cDNA, do których uzyto jako czynnika przenoszacego DNA plaz¬ midu pochodzacego z cal El, takiego jak pMB9 20 i pBR322. Przy koncu 5', sekwencja o dlugosci odpowiadajacej 50—120 nukleotydów jest nieozna¬ czona, a odcinek poli dA na koncu 3' moze miec rózna dlugosc.Przedstawiona sekwencja reprezentuje najlepsza, 25 dostepna obecnie informacje, przy czym rozumie sie, ze postepujace naprzód badania moga ujaw¬ nic dodatkowe szczególy lub moga wykazac po¬ trzebe niewielkich zmian w niektórych obszarach.Odpowiadajaca sekwencja aminokwasów szczurzej 30 pro insuliny I zaczyna sie w pozycji, trypletu oznaczonej jako 1 i konczy sie w pozycji tryple¬ tu oznaczonej jako 86. Sekwencja nukleotydów podkreslonych linia przerywana jest niezupelnie pewna. Przerywana linia poczatkowa oznacza ob- 135 szary w chwili obecnej nieokreslone.Przyklad XIII. Opisano tu sposób izolowa¬ nia i oczyszczania DNA zawierajacego polinukle- otyd o sekwencji kodujacej insuline ludzka, synteze wektora przenoszacego zawierajacego ten DNA i otrzymywanie szczepu mikroorganizmu zawiera¬ jacego ten DNA jako czesc swego kodu gene¬ tycznego. Ludzkie komórki wysepkowe oddziela sie od tkanki trzustki ludzkiej sposobem podanym w przykladzie I. Zródlem tkanki trzustki moze byc zapisana w darze trzustka, swieze zwloki lub ludzki nowotwór wysepek. Komórki wysepkowe wydzielone z kilku trzustek poddaje sie homoge¬ nizacji w 4 m roztworze tiocyjanianu guanidynio- wego zawierajacego 0,2 m p-merkaptoetanohi, o pH = 5, jak opisano w przykladzie I. Poliade- nylowany RNA wydziela sie chromatograficznie sposobem podanym przez Aviva i Ledera, j. w.Jednoniciowy DNA otrzymuje sie stosujac odwrot¬ na transkryptaze i mRNA hydrolizowany sposo¬ bem podanym w przykladzie I. Dwuniciowy cDNA otrzymuje sie stosujac odwrotna transkryptaze jak opisano w przykladzie IV i trawiac nukleaza SI, jak podano w przykladzie V. Do dwuniciowe- go cDNA insuliny ludzkiej dodaje sie fragmenty zawierajace miejsca rozszczepienia Hind III jak podano w przykladzie V. Produkt trawi sie endo¬ nukleaza Hind III lulb Hsoi I i analizuje sposo¬ bem podanym w -przykladzie V. Obserwuje sie pik odpowiadajacy sekwencji okolo 450 nukleotydów, a ponadto fragmenty rozszczepionych dekamerów 40 50 15 60140 3* Hind III. cDNA insuliny ludzkiej zawierajacy lep¬ kie konce w miejscu Hind III wbudowuje sie do plazmidu pMB9 sposobem opisanym w przykla¬ dzie VII. E. coli X-1776 poddaje sie transformacji i przeprowadza sie sereening zrekombinowanyeh plazmidów sposobem podanym w przykladzie VII.Wlaczony fragment usuwa sie stosujac Hsu I i analizuje sposobem podanym w przykladzie VII.Odzyskuje sie DNA zawierajacy okolo 450 nukle- otydów. Stwierdza sie,, ze sklonowana insulina ludzka zawiera nukleotydy kodujace calkowita sekwencje aminokwasów insuliny ludzkiej. Znana sekwencja aminokwasowa lancucha A insuliny ludzkiej przedstawia sie nastepujaco1 1 Gly-Ile-Val-Glu^Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- 20 -Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn.Znana sekwencja aminokwasowa lancucha B in¬ suliny ludzkiej przedstawia sie nastepujaco: 1 10 Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu- -Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg- 30 Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr.Numerowanie sekwencji amisokwasowej rozpo¬ czyna sie od konca z wolna grupa aminowa.Przyklad XIV. a) Powtarza sie tok poste¬ powania z przykladu XIII stosujac plazmid pBR322 w miejsce plazmidu pMB9 DNA. Wszy¬ stkie warunki i sposób selekcji, zrekombinowanyeh plazmidów sa takie same jak opisano w przykla¬ dzie VIIIa. Wlaczony fragment usuwa sie jak wyzej podano, otrzymujac DNA zawierajacy 450 nukleotydów, o sekwencji podanej w przykladzie XIII. b) Powtarza sie tok postepowania z przykladu XIII, stosujac plazmid pBR3il3 DNA w miejsce plazmidu pMB9 DNA. Wszystkie warunki i sposób se¬ lekcji zrekombinowanyeh plazmidów sa takie same, jak podano w przykladzie VIII(b). Wlaczony fragment usuwa sie jak wyzej podano, otrzymu¬ jac DNA zawierajacy okolo 450 nukleotydów i o sekwencji podanej w przykladzie XIII. c) Powtarza sie tok postepowania z przykladu XIII, stosujac plazmid pSCIOl DNA w miejsce plaz¬ midu pMB9 DNA. Wszystkie warunki i sposób selekcji zrekombinowanyeh klonów sa takie same jak opisano w przykladzie VIIIi(c). Wlaczony frag¬ ment usuwa sie,, otrzymujac DNA zawierajacy okolo- 450 nukleotydów i o sekwencji podanej w przykladzie XIII.Przyklad XV. Powtarza sie tok postepowa¬ nia- z przykladów XIII i XIV, stosujac szczepy E. coli RR1 i E. coli HB101 w miejsce E. coli X-1776. Wszystkie warunki stosuje sie takie sa¬ me i otrzymuje sie takie same wyniki.Przyklad XVI. cDNA insuliny ludzkiej otrzy¬ many jak w przykladzie Xliii poddaje sie dziala¬ niu syntetycznie otrzymanych fragmentów zawie¬ rajacych miejsca rozszczepienia Eco RI, jak podano w przykladzie VI. a) cDNA insuliny ludzkiej poddany dzialaniu Eco RI wlacza sie w miejsce Eco RI Charona 16A sposobem opisanym w przykladzie X(b). Zrekom- 200 U binowane fagi wydziela sie i poddaje screeningo- wi, a wlaczony fragment usuwa sie sposobem po¬ danym w przykladzie X(a). Otrzymuje sie DNA zawierajacy okolo 450 nukleotydów o sekwencji 5 podanej w przykladzie XIII. b) cDNA insuliny ludzkiej zawierajacy lepkie konce w miejscu Eco RI wlacza sie do wektora Charona 3A, jak podano w przykladzie X(b). Zre- komibinowane fagi selekcjonuje sie i analizuje 10 sposobami podanymi w przykladzie X(b), otrzymu¬ jac DNA zawierajacy okolo 450 nukleotydów, o sekwencji podanej w przykladzie XIII. c) \ gt WES X B stosuje sie jako wektor prze¬ noszacy dla cDNA insuliny ludzkiej poddanego 5 dzialaniu Eco RI, jak opisano w przykladzie X(c).Zrekombinowane fagi wydziela sie i poddaje screeningowi, jak opisano w powyzszym przykla¬ dzie. Wlaczony fragment usuwa sie, otrzymujac DNA zawierajacy okolo 450 nukleotydów, o sek¬ wencji podanej w przykladzie XIII.Przyklad XVII. Powtarza sie tok postepo¬ wania z prbykladu XVI, stosujac szczepy E. coli RRil, E. coli HB101, E. coli DIF50 i E. coli DP50 25 SupF w miejsce E. coli X-1776. Stosuje sie takie same warunki i otrzymuje sie takie same wyniki.Prowadzenie procesu sposobem wedlug wynalaz¬ ku umozliwia w pierwszym rzedzie izolowanie polinukleotydu o sekwencji kodujacej specyficzne bialka regulatorowe wyzszych organizmów takich jak kregowce i przeniesienie informacji genetycz¬ nej dotyczacej tych bialek do mikroorganizmów, w których moze ona byc replikowana bez ogra¬ niczen.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania zrekombinowanego plaz- miotu bakteryjnego, zawierajacego- polinukleotyd o sekwencji kodujacej insuline, przez ekstrakcje mRNA kodujacego insuline z komórek izolowa¬ nych z organizmu wytwarzajacego insuline, wy¬ dzielenie mRNA, synteze pierwszej nici cDNA zawierajacego sekwencje nukleotydowa kodujaca insuline na matrycy mRNA, synteze druga nici cDNA na pierwszej nici jako matrycy i poddanie wytworzonego dwuniciowego DNA reakcji z plaz¬ midem bakteryjnym, znamienny tym, ze a) homogenizuje sie komórki wyizolowane z orga¬ nizmu wytwarzajacego insuline w obecnosci kom¬ pozycji inhibitujacej RNaze, zawierajacej anion chaotropowy, kation , chaotropowy i srodek prze¬ rywajacy wiazanie dwusiarczkowe i ekstrahuje sie mRNA z komórek, b) oddziela sie w sposób znany poliadenylowany mRNA od innych sklad¬ ników zhomogenizowanych komórek, c) inkubuje sie wydzielony mRNA z odwrotna transkryptaza w obecnosci dATP, dCTP, dGTP i dTTP, d) po¬ wstaly jednoniciowy cDNA kodujacy insuline in- kufougei sie z odwrotna transkryptaza luib polime- 60 raza DNA w obecnosci dAITP, dCTP, dGTP i dTTP e) do konców wytworzonego dwuniciowego DNA przylacza sie w sposób znany, laczaca sek¬ wencje DNA komplementarna do konców pozosta¬ lych po rozszczepieniu przez endonukleaze re- •» strykcyjna, wybrana do rozszczepienia bakteryj-35 140 200 3* nego plazmidu E. coli, do którego ma byc przyla¬ czony dwuniciowy DNA, f) rozszczepia sie plaz¬ mid bakteryjny wybrana endonukleaza restryk¬ cyjna i poddaje sie go dzialaniu alkalicznej fos¬ fatazy, po czym g) inkubuje sie dwuniciowy DNA, zawierajacy wiazace sekwencje i plazmid bakte¬ ryjny poddany dzialaniu alkalicznej fosfatazy w obecnosci ligazy DNA i ATP z wytworzeniem plazmidu majacego sekwencje nukleotydowa ko¬ dujaca, insuline. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze komórki wysepkowe zawierajace mRNA wzboga¬ cone w polinukleotyd o sekwencji kodujacej in¬ suline izoluje sie, poddaje^tkanke trzustki zawie¬ rajaca komórki wysepkowe i inne komórki dzia¬ laniu enzymu hydrolitycznego i inhibitora trypsy- ny, frakcjonuje sie hydrolizowana tkanke do uzyskania wysepek zasadniczo wolnych od innych komórek i komórkowego debris oraz izoluje sie mRNA z wysepek. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako enzym hydrolityczny stosuje sie empirycznie wyselekcjonowany preparat kolagenazy. 4. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze reakcje z udzialem enzymu hydrolitycznego pro¬ wadzi sie w naczyniu szklanym silikonowanym. 10 20 23 5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze reakcje z udzialem enzymu hydrolitycznego pro¬ wadzi sie w naczyniu z tworzywa sztucznego. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako kation chaotropowy stosuje sie kation guani- dyniowy, a jako anion chaotropowy anion tiocyja- nianowy. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako czynnik rozrywajacy wiazanie dwusiarczko- we stosuje sie p-merkapitoetanol. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako uklad hamujacy aktywnosc RNAazy stosuj sie uklad zawierajacy 4 m tiocyjanian guanidynio- wy i 0,2 m P-merkaptoetanol. 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze plazmid bakteryjny E. coli rozszczepia sie endo¬ nukleaza restrykcyjna Hind III, Hsu I lub EcoRI, przy wartosci pH 7,6 w temperaturze 37°C. 10. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 9, znamienny tym, ze z rozszczepionego plazmidu bakteryjnego E. coli usuwa sie koncowe grupy 5'-fosforanowe dzialaniem fosfatazy alkalicznej. 11. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 9, znamienny tym, ze jako plazmid bakteryjny E. coli stosuje sie plazmid pBR322. 12. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 9, znamienny tym, ze jako plazmid. bakteryjny F. coli stosuje sie plazmid pMB9. 5' (A) 3' '_(A)3 C (T)5 c: r ;a) 3 v (T)5' , iS! , 5 (A) 3 3' (T) 5 T4DNA ' 5'CCAAGCTTGG 3' ^ +3'GGTTCGAACC b' 5' CCAAGCTTGG (A) CCAAGCTTGG 3' 3'GGTTCGAACC (TJ GGTTCGAACC 5' FIGI _ AAGCTTGG (A) CCAAGCn _ -TTCGAACC (T) GGTTCGAA - cDNA Zakl. Graf. Radom — 493/88 80 egz. A4 Cena 220 zl PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.
PL1978207176A 1977-05-27 1978-05-27 Method of obtaining recombined bacterial plasmide containing polynucleotide of insuline coding sequence PL140200B1 (en)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80134377A 1977-05-27 1977-05-27
US80502377A 1977-06-09 1977-06-09
US89770978A 1978-04-19 1978-04-19
US05897710 US4363877B1 (en) 1977-09-23 1978-04-19 Recombinant dna transfer vectors
US05/898,887 US4264731A (en) 1977-05-27 1978-04-21 DNA Joining method
US89900278A 1978-04-26 1978-04-26
US89900378A 1978-04-26 1978-04-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL207176A1 PL207176A1 (pl) 1979-03-26
PL140200B1 true PL140200B1 (en) 1987-04-30

Family

ID=27569921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1978207176A PL140200B1 (en) 1977-05-27 1978-05-27 Method of obtaining recombined bacterial plasmide containing polynucleotide of insuline coding sequence

Country Status (21)

Country Link
JP (1) JPH0659218B2 (pl)
AR (1) AR225404A1 (pl)
AU (1) AU521903B2 (pl)
BE (1) BE867424A (pl)
BG (1) BG40319A3 (pl)
CH (1) CH642680A5 (pl)
DD (1) DD145927A5 (pl)
DE (2) DE2822568A1 (pl)
DK (2) DK233278A (pl)
FI (1) FI64640C (pl)
FR (1) FR2392033B1 (pl)
GB (1) GB1565190A (pl)
GR (1) GR73552B (pl)
IL (1) IL54790A (pl)
IT (1) IT1094934B (pl)
LU (1) LU79714A1 (pl)
NL (1) NL7805591A (pl)
NZ (1) NZ187300A (pl)
PL (1) PL140200B1 (pl)
PT (1) PT68082B (pl)
SE (4) SE451461B (pl)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU527165B2 (en) * 1977-02-08 1983-02-17 Genentech Inc. Method and means for microbial polypeptide expression; synthetic DNA and process therefor
ZA782933B (en) * 1977-09-23 1979-05-30 Univ California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
IE48385B1 (en) * 1978-08-11 1984-12-26 Univ California Synthesis of a eucaryotic protein by a microorganism
US6268122B1 (en) 1978-12-22 2001-07-31 Biogen, Inc. Recombinant DNA molecules and their method of production
JPS55150883A (en) * 1979-05-11 1980-11-25 Nakano Vinegar Co Ltd Method of storing "mozuku"
GR68404B (pl) * 1979-06-01 1981-12-29 Univ California
FR2458584A1 (fr) * 1979-06-08 1981-01-02 Pasteur Institut Vecteurs pour le transfert et l'expression de materiel genetique dans une cellule eucaryote et procede pour la production d'une proteine determinee dans des cellules eucaryotes
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
GR70279B (pl) * 1979-09-12 1982-09-03 Univ California
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
DE3001928A1 (de) * 1980-01-19 1981-08-06 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
US4350764A (en) * 1980-03-10 1982-09-21 The Regents Of The University Of California Microbiological synthesis of beta endorphin
CA1202581A (en) * 1980-03-27 1986-04-01 Saran A. Narang Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
DE3177281T2 (de) * 1980-12-12 1992-12-10 Unilever Nv Strukturgene, die fuer die verschiedenen allelischen und reifungsformen von praeprothaumatin und deren mutanten kodieren, diese strukturgene enthaltende klonierungsvektoren und deren expression in mikrobiellen wirtzellen.
CA1192151A (en) * 1980-12-12 1985-08-20 Cornelis T. Verrips Dna sequences encoding the various allelic forms of mature thaumatin, and cloning vehicles comprising said dna's and their use in transformed microorganisms
US4695543A (en) * 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US4748233A (en) * 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
CA1224432A (en) * 1982-08-17 1987-07-21 Gary N. Buell Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield
US5474980A (en) * 1984-10-04 1995-12-12 Monsanto Company Prolonged release of biologically active somatotropins
US5411951A (en) * 1984-10-04 1995-05-02 Monsanto Company Prolonged release of biologically active somatotropin
DK257988D0 (da) * 1988-05-11 1988-05-11 Novo Industri As Nye peptider
DE4034702A1 (de) * 1990-10-31 1992-05-07 Siemens Ag Verfahren und vorrichtung zur pruefung der aktiven werkzeuge von gesenkbiegemaschinen, insbesondere von biegestempeln

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment

Also Published As

Publication number Publication date
IL54790A0 (en) 1978-07-31
IT7823930A0 (it) 1978-05-29
DE2822568C2 (pl) 1989-08-31
FI781675A7 (fi) 1978-11-28
FR2392033A1 (fr) 1978-12-22
SE455794B (sv) 1988-08-08
GB1565190A (en) 1980-04-16
IT1094934B (it) 1985-08-10
JPS5449387A (en) 1979-04-18
DK233278A (da) 1978-11-28
SE8305328D0 (sv) 1983-09-29
FR2392033B1 (fr) 1985-09-13
DK791A (da) 1991-01-04
BE867424A (fr) 1978-09-18
CH642680A5 (en) 1984-04-30
IL54790A (en) 1983-07-31
SE8305327D0 (sv) 1983-09-29
DE2822568A1 (de) 1978-12-14
FI64640B (fi) 1983-08-31
LU79714A1 (fr) 1978-11-06
PT68082B (en) 1980-02-20
FI64640C (fi) 1983-12-12
DK791D0 (da) 1991-01-04
PL207176A1 (pl) 1979-03-26
DE2858357C2 (pl) 1990-03-15
JPH0659218B2 (ja) 1994-08-10
BG40319A3 (bg) 1986-11-14
AU521903B2 (en) 1982-05-06
SE8305329D0 (sv) 1983-09-29
AR225404A1 (es) 1982-03-31
DD145927A5 (de) 1981-01-14
NL7805591A (nl) 1978-11-29
SE7806086L (sv) 1978-11-28
SE8305328L (sv) 1983-09-29
NZ187300A (en) 1982-08-17
SE8305327L (sv) 1983-09-29
GR73552B (pl) 1984-03-14
PT68082A (en) 1978-06-01
SE8305329L (sv) 1983-09-29
AU3648878A (en) 1979-11-29
SE451461B (sv) 1987-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL140200B1 (en) Method of obtaining recombined bacterial plasmide containing polynucleotide of insuline coding sequence
US4440859A (en) Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
Amann et al. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli
Baecker et al. Biosynthesis of bacterial glycogen. Primary structure of Escherichia coli 1, 4-alpha-D-glucan: 1, 4-alpha-D-glucan 6-alpha-D-(1, 4-alpha-D-glucano)-transferase as deduced from the nucleotide sequence of the glg B gene.
EP0187519B1 (en) Recombinant dna vectors capable of expressing apoaequorin, apoaequorin peptides and their production, and microorganisms including said vectors
US4652525A (en) Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
EP0080848A2 (en) Stabilizing &amp; selecting cells
PL149278B1 (en) Method of constructing a replicating vector for cloning
JPH068317B2 (ja) 新規ポリペプチド
JPS61275223A (ja) ヒト血清アルブミンの微生物学的調製法
JPS59501343A (ja) 遺伝子工学等
CA2076320C (en) Process for producing peptide
Taljanidisz et al. Messenger ribonucleic acid for the lipoprotein of the Escherichia coli outer membrane is polyadenylated
KR940003653B1 (ko) 인체 췌장 엘라스타제의 제조방법
EP0133321A1 (en) DNA gene, process for production thereof and plasmid containing the same
FI65446C (fi) Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer insulin kodande nukleotidsekvens
JP2591713B2 (ja) アシネトバクター・カルコアセチカスからの酵素ムタロターゼの製造のためのｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子および方法
PL142369B1 (en) Process for manufacturing recombinated bacterial plasmid,containing nucleotides sequence coding the growth hormone
CA1156166A (en) Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
FI65447C (fi) Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer tillvaexthormon kodande nukleotidsekvens
FI75185C (fi) Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en foer insulin kodande nukleotidsekvens.
KR840001441B1 (ko) 고등생물의 특정 단백질에 대한 뉴클레오티드 배열을 함유하는 dna전달 매개체의 제조방법
KR970009082B1 (ko) 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법
FI74732C (fi) Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en nukleotidsekvens som kodar foer tillvaexthormon.
JPS6115699A (ja) 魚類の成長ホルモン遺伝子