DD145927A5 - Verfahren zur herstellung eines dn -transfer-vektors - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die den genetischen Code fuer ein spezifisches Protein enthaelt, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer dieser DNS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Insulin-Gen und Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschlieszende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehoeren ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem hoeherem Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem hoeherem Organismus enthaelt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen JNucieotidsequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein enthält, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen föucleotidsequenz und den Transfer dieser DKS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DKS erfolgt« Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Insulin-Gen und Wachstumshormon-Genen,-deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschließende Charakterisierung» Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt« Zu diesen gehören ein Plasmidj in welches eine spezifische ITucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische ITucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält» ·

Charakteristik _ider bekann ten te chnls.chen Lösungeη

Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet:

DNS .= Desoxyribonukleinsäure . .

FINS » Ribonukleinsäure . '

cDNS ;= komplementäre DNS · ' ·

(enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz)

raRNS = messenger-RNS .

tRNS = transfer~RNS .

dATP = Deoxyadenosintrlphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat

A = Adenin · '

T = Thymin ' . ·

G s= Guanin . . ...

G = Cytosin : ' . ·

Tris S= 2~Amino-2-hydroxy-ethyl-l_J3-propandiol EDTA - Ethylendiamin-tetraessigsäure ATP ~ Adenosintriphosphat · TTP = Thymidintriphosphat

Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information, Es ist bekanntj dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird., der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt» Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken^- zur Steuerung von Kerstellungszeitpunkt und Menge 'jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannte Schliesslich dient die •Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.

Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequem; der DNS auf die Aminosäuresequenz' von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist. . . . . '

Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder raehrer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.

Genetischer Code

Phenylalanin (Phe)	TTK
Leucin (Leu)	XTY
Isoleucin (lie)	ATM ·
Methionin (Met)	ATG
Valin (VaI)	GTL
Serin (Ser)	ORS
Prolin (Pro)	CCL
Threonin (Thr)	ACL
Alanin (AIa)	GCL
Tyrosin (Tyr)	ΤΑΚ
Terminationssignal	ΤΑJ
Terminationssignal	TGA

Histidin (His) CAK. Glutamin (Gin) . CAJ

Asparagin (Asn) AAK

Lysin (Lys) AAJ

Asparaginsäure (Asp) GAK

Glutaminsäure (GIu) CAJ

Cystein (Cys) . TGK

Tryptophan (Try) TGG

Arginin (Arg) V/GZ

Glycin (GIy) . GGL

Schlüssel: Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Tri nucleotid d'er-DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pjrijnidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden i

A - Adenin G = Guanin C = Cytosin T = Thymin

- Ij- -

.X=T oder C, falls Y=A oder G

X=C, falls Y=C oder T ' - Y=A, G, C oder T, falls X=C

Y=A oder G, falls X=T '

W= C oder A, falls Z= A oder G .

W = C, falls Z = C oder T Z = A, G, C oder T, falls W=C

Z=A oder G₅ falls W=A V QR = TC, falls S = A, G, : C oder T .

QR = AG, falls S=T oder C ' S = A, G, C oder T* falls QR = TC .S=T oder G₉ falls QR = AG.

J «= A oder G .

K-T oder C "

L= A, T, C oder G « M = A, ' C oder T- '

Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz In eine .Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription« In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen, Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotide in dem jedoch Ribose anstelle der Desoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen» Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS« Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger-RNS (niRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle,, ·. .

In der Zelle dient die mRNS als Matrize" in einem komplexen Vorgangj an dem zahlreiche Enzyme und Organellen innerhalb

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der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer AminosäureSequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.

Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des Insulins. .

Der direkte Vorläufer des Insulins ist ein Polypeptide das Proinsulin, das die beiden Insulinketten A und B über ein weiteres Peptid C gebunden enthält, vergleiche Steiner, D. P. Cunningham, D., Spigelman, L» und At.en, B., Science 157, 697 (1967). Kürzlich wurde berichtet, dass das erste Translationsprodukt von Insulin-mRNS nicht Proinsulin selbst, sondern ein Pre~proinsulin ist, das mehr als 20 weitere Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins enthält, vergleiche Calin, S.J. Keim, P. und Steiner, D.F.-, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73^ 1964 (197.6), und Lomedico, P.T« und Saunders, G.P- Nucl.Acids Res. JjS₂. >8l (1976). Die Struktur des Pre-pr oinsul inmoleJdils kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden: MHp-(Pre-peptid)-B~Kette~(C"Peptid)-A-Kette~COOH.

Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in.den Zellen höherer Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hierzu gehören zum Beispiel das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon,· an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für 'technische, medizinische oder Forschungszwecke. Häufig'ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organismus su gewinnen, insbesondere, bei Proteinen menschlichen

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Ursprungs* Es besteht daher ein Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen außerhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden» In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhaltene Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, · die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig« Häufig ist es auch schwierig» einen gezüchteten Zellstarnro mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften' zu erhalten»

Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten Medien gezüchtet werden· Die Permentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar« Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Außerdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen*

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Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RlS-SIatrize komplementären DITS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligp-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCtP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-covalente Bindung des Oligodeoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Doxynucleotide» entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3^f-Bnde der wachsenden Kette« Das ala Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadeiförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RUS und einen komplementären DNS-Einzelstrang# Die Reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DI\FS~Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS~ Einzelstrangs durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H» und Leder ₉ P», Proc« Uatl* Acade Sei» ^USA .iä» ¹⁴⁰⁸ (1972) und Efstratiadis_s A.₅Kafatos, F.C. Maxam, A.Fc und Kaniatis, Tc Gell* χ, 279 (1976).

Restrictions-endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodies^erbindungen in doppeistrangiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des JÖks-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt.: Das Hauptmerkmal . eines Enzyms dieser- Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz v/ird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restrictions-endonuclease bezeichnet. Restrictions-endonucleasen wurden aus. verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nueleotidsequenz und die Erkermungsstellen wurden ermittelt. Einige Restrictions-endonucleasen hydro-.lysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydro lysierte' DNS erneut zu binden» Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit anderen, ähnlich-erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen;' vergleiche Roberts, R.J_vCrit.Rev. Biochem. Hj_ 123 (I976). .Die Erkennüngssteilen sind relativ rar,'jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restrictions-endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen. Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segmentgekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restrictions-oligo-nucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restrictions-endonuclease unterwirft, wobei man die erforderlichen

kohäsiven Enden erhält; vergleiche Heynecker, H.L,Shine,

J. Goodman, H=M. Boyer, H.W. Rosenberg, J., Dickerson, R.E* Narang, S.A., Itakur a, K., Lin, S und Riggs, A.D.^ Nature 26?, 748 (I976J,und'Scheller. R.H. Dickerson, R.E. Boyer,

H.W. Riggs, A.D. und ^akura, K.,Science I96, 177 (1977).

Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger DNS oder einsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist; vergleiche Vogt, V.M._;Eur.J.Biochem. 53^.192 (1975). .

DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5'-Phosphat bzw. einem J '-Hydroxyl be.'wirkt, ... die zum Beispiel von zwei DNS-Fragmenten gebildet -werden,¹ die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppeIsträh.gigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind; vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H., und Khorana, H.G., Proc. Natl.Acad.Sci.,-USA 67i 3Λ68 (1970).

Alkalische. Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbindungen, einschliesslich der 5' -terminalen Phosphat.- in DNS hydrolysiert.

'Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments In einen DNS-Vektor, zum Beispiel ein Plasmid.-Als Plasniid bezeichnet man jede autonom DNS-replisierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasrnid ist mit den Chromosomen' der Wirtszelle nicht genetisct

verbunden. Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren sind doppelsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Grössenordnung einiger Millionen., obgleich

bei einigen des Molekulargewicht grosser als 10 ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS lässt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle aufgrund des grössen Grössenunterschiedes abtrennen» Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle.replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der . Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflusst werden. Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg ein DNS-Segment in.das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertesplasmid mit vergrösserter Molekülgrösse entsteht, ohne dass seine Fälligkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle«. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können., zum Beispiel Gene der Arzneimittelresistenz.

Zur Illustr«ierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen im einzelnen beschrieben« Das Insulin wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der Sicht der Grundlagenforschung, Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Insulin-Gen aus anderen Organismen, einschliesslich Menschen, übertragen werden. · ' ' ' .

Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert. Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur Behandlung von Diabetes verwendet. Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen als Insulinquelle, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Ausserdem ent- . wickeln einige Diabetiker eine allergische Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsulin. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht« Die Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur- Einführung des Insulin-Gens in Bakterien vorlag. Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Technik bereit. ·

Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen Code für ein'spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nueleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man zum Beispiel ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer insulinähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden. Ähnliche· Betrachtungen gelten für den Fall der Wachstumshormone.

Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie zum Beispiel ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten

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zur Herstellung derartiger Proteine.. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder dem Ersatz solcher Proteine durch Proteine_? welche· von erfindungsgemäß ver~ änderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich zum Beispiel die Möglichkeit zum.Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemäßen Mikroorganismen und Menschen mit chronic sehen oder akuten Mange Ikranlchei ten, wobei die auf erfindungsgemäße Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen©

Es wäre daher sehr erwünscht_s, den Transfer eine3 Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus y der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen· Auf diese Weise könnte das Protein unt-er gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten wer'den. Es ist auch möglich, daß die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten« Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz„ die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genaix bekannter genetischer Struktur eröffnet außerdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit zu untersuchen wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird. Ferner können isolierte Gene verändert 'werden, so daß sie Pröteinvarianten mit anderen therapeutischen oder funktioneilen Eigenschaften codieren*

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Darlegung des V/es ens der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Maßnahmen, um die genannten Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschließlich Enzym-katalysierter Reaktionen umfaßte Vorstehend wurden die bisherigen Kenntnisse über die Katür dieser Enzymreaktionen skizziert*

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetischen Information enthaltende Nucleotide sequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Kucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirts-Mikroorganismus *.

-Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Strukturgens für Ratten Pre-proinsulin, des Gens für Ratten-Wachstumshormon und des Gens für menschliches Wachstumshormon« Danach kann davon ausgegangen werden, daß die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus wie zum Beispiel eines Wirbeltiers auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist β Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschließlich zum Beispiel der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschließlich Säugetiere, wobei zu letzteren 'Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören«. Unter einem

Mikroorganismus versteht man jeden mikrokopischen lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und zum Beispiel aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliess~ lieh Hefen, bestehen kann. Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die' intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von Reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegnwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Strangs erforderlichen vier DeoxynucIeosid-triphosphate erfolgt. Das Produkt dieser ersten Reaktion mit Reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz/ die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit Reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eine

. doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultierende doppeltsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man , an beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungsbzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-endonuclease

•behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.

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Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um. den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplemen-· täre einsträngige Nucleotidsequenzen.an den 5¹-Enden zu er« zeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirts zelle fähige Ringstruktur' bildet. Die,wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase .zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Eildung eines lebensfähigen, geschlossenen Rings aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird. Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal wie zum Beispiel Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterienstämme, die das rekombinierte Plasraid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend rdsoliert. Auf diese Weise können grosse Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch £ndonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann« .·'.-. . '

Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich dem Menschen,und deren Transfer in : einen Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Viert.und zur mikrobiologischen Synthese solcher' ; Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die

Insulin codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert» Auf gleiche Weise wurde die für Ratten-Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz isoliert, transferiert und in Bakterien repliziert. Die Methode ist auf den Transfer einer aus menschlichem ZeIlmaterial isolierten Nucleotidsequenz, zum Beispiel für menschliches ·Insulin und Wachstumshormon oder andere Polypeptidhormone anwendbar. .

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.

Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden;

1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus

Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert: die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst, und eine RNS-ÜberSetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die USA vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfä3.tig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vergleiche US-Federal Register, Bd. hl, Nr. 131, 7.7.I967, S, 27902-27943. Jedes Verfahren mit tatsächlicher Brauchbarkeit zur Herstellung von menschlichem Protein, wie zum Beispiel das vorliegende

Verfahren, arbeitet daher vorzugsweise mit der Isolierung der spezifischen mHNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese V/eise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die rnRNS leichter als aus- Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tat-.sache dass in hochdirferenzierten Organismen wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Punktion hauptsächlich injier Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungssträfe des Organismus vorliegen. In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mPiNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewandte Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.

Ih den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen: die. Absonderung der Zellen vom Bindegewebe, und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen anderen im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorgesehenen ,Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar. So wird zum. Beispiel die Isolierung von Langerhans'sehen Inseln

aus Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender mRNS geeignet sind, beschrieben.

JQisulin produzierende Zellen können auch aus anderen Quellen stammen, zum Beispiel aus der Bauchspeicheldrüse von Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen. Die Isolierung reiner Inselzellen ist in diesen Fällen wesentlichfeinfacher, insbesondere bei Verwendung reiner Zellkulturen. In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Inselzellen nicht erforderlich, doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil. ^: .

Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn .man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann zum Beispiel die Behandlung, mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer -sonstigen chemischen Substanz. Bei der Isolierung von Wachs tumshorrnon-mRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysenzellen mit Thyroidhormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon-niRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöht.

2. '· Extraktion der mRNS · " '

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS' ist ein einsträngiges Polynucleötid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher da.s gesamte Molekül für

tr©

den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbeeitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien. Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für."Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar.. Die überraschendejwirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.

Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien 'RNS angewandt werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein. Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihx^er Verwendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus. isolierten Langerhans¹sehen Inseln aus Ratten-Pankreas beschrieben.

Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässrigen. Medien und ihrer Verfügbarkeit. Geeignete chaotrope Kationen sind zum Beispiel das Guanidiniun Carbamoylguanidinium-, Guanylguanidinium-, Lithiumion und dergleichen. Geeignete chaotrope Anionen sind zum Beispiel das Jodid, Perchlorate Thiocyanate Diiodsalicylation und

dergleichen. Die Wirksamkeit von Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist zum Beispiel ,Lithium-diiodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0,1 M, ausserdem ist es relativ teuer» Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt, im · Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und .in wässrigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa ^- Lösungen. . . ' ' .

Thiolverbindungen wie das ß-Merkaptoethanol spalten bekanntlich intramolekulare Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulfid-Austauschreaktion. Zahlreiche Thiolverbindungen sind in -dieser Richtung wirksam, zum Beispiel ß-Merkaptoethanol, Dithiothreit, Cystein, Propanoldimerkapt?"ⁿund dergleichen. Eine wesentliche.Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ß-Merkaptoethanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt»

Bei ^C&iibierung der RNase während der RiJS-Extraktion aus Zellen oder Gewebeji ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemässen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion beruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmass der De-

he.it naturierung. Dies erklärt möglicherweise die. überlegen- aes Guanidiniumthioncyanats gegenüber dem. Hydrochlorid, trätz der Tatsache, dass das Hydrochlorid als' Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur

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- 2Θ-

vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird. Andererseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels in Bezug auf die Schwellenkonzentration, erhöht von der fünften zur zehnten Potenz; vergleiche "Tanford, CA. Adv.Prot.Chem. £3^ 121 (1968). Diese Be-

; Ziehung ergibt qualitativ, dass ein nur schwach stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidlniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein' Vielfaches • schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierüng und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Er-. findung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, dass das bevorzugte Denaturierungsmittel ein solches Wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt. Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdiiodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres

. Denaturierungsmittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugun von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist; ,

. Die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese V/eise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhinderte die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidblndungen intakt bleiben., Ferner wird jede, im mRNS-Präparat zurück-

1%

bleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiol. Disulfidbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jeder Konzentration in gewissem Ausmass wirksam, doch wird im allgemeinen ein grosser Überschuss an Tniolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen teevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft. Andererseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei ,hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so dass für die Praxis eine . obere K'onzentrationsgrenze entsteht. Beim ß-Merkaptoethanol erwiesen sich Konzentration im Bereich von 0,05 M bis 1,0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0,2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet« ' .

Der pH-Wert des Mediums während der mRNS-Exträktion aus den .Zellen kann im Bereich von pH 5,0 bis 8,0 liegen« '

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die RNS aus der Masse aus Zellprotein und DNS abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind. Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Ethanol, bei dem die RI-JS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäss die·Ausfällstufe umgangen und das HomogenaC direkt auf eine 5*7-molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgt; vergleiche die Beschreibung von Glisin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C, Biochemistry I^ 26^ (197²O. · Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine für Rl¹JaSe ungünstige Umgebung aufrecht erhält, so dass man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt. '

Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat. Nur ein Teil .dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, dass in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure. Derartige mRNS mit daran gebundenen Poly-A-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, siehe Aviv,. H. und Leder, P. loccit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind. Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig ihres Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher V/eise ausgeführt werden. '

Unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel bei der Ver- . Wendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, dass obige Stufe der RNase-= Inhibierung nicht erforderlich ist« In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung-der RNase-Aktivität ausreichen.

2. ' Bildung der cDNS

Figur 1 ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufer des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion Reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werdenjkönnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Strangs aufgrund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist«, Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei' man die

mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Strangs einsetzt. Zweckraässig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate in ^- Stellung mit ;52_p markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum geispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können; vergleiche Efstratiadis, A. -et..al.., loccit. Wie aus der Zeichnung 'ersichtlich., erhält man als Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase eine doppe1strängige Haarnadelform mit nicht-coval'enter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DHS-Strang....,·.

Das Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Z'weckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephadex G-LOO" (Hersteller Pharmacia Inc. Uppsala, Schweden) und Ausfällung mit Ethanol. -

Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die ENS-Matrize entfernt werden. Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt« Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch pH-Einstellung leicht gesteuert werden kann. '

Nach der alkalischen Hydrolyse und anschliessenden Neutralisierung kann die mit ;32 markierte cDNS durch Ausfällung mit Ethanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.

Die Synthese einer doppeIsträngigen haarnadelförniigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, zum Beispiel mit DNS-Polymerase oder Reverser Transcriptase.

Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der Verwendung eines in^{ -Stellung mit 52p markierten Nucleosid-tripbosphats. Die Reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, zum Beispiel aus Vogel-Myeloblastosisvirus(das Virus ist erhältlich von der Life.Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es geraäss einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).

Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephatex G-IOO" und Ausfällung mit Ethanol zur Reinigung des DNS-Produkts und Befreiung von Verunreinigendem Protein verwenden.

Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppeIsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die' Enden komplementärer Stränge verbindet₉ entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische Hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die S 1-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit Basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Ethanol erfolgen wie vorstehend beschrieben. Die Verwendung von Re\rerser Transcriptase und .' Sl-Nuclease bei Synthesebdoppelsträngiger cDNS-Ubertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis., et.al., loc.cit. beschrieben*

Gegebenenfalls kann man den Anteil an"cDNS-Molekülen mit stupfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate« Die Kombination von Exonuclease- und Iblymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender J)'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervor-" stehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellt. . · ·.

Die nächste Verfahrens stufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, dass geeignete Sequenzen . an Jedem Ende stehen^ die eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-endonuciease aufweisen. Die V/ahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgrünele in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-endonuciease ausgewählt, und diese V/ahl basiert wiederum auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die öDNS zur rekombinieren'ist« Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-endonuciease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt zum Beispiel eine Erkennungssteile für das Enzym Hind III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, K.O. und Wilcox, K.V/., J.MoleBiol.51^ 579 (1970) gereinigt. Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middle ton, J.H., Edgell, MoH. und Hutchinson III> CA. .J, Virol·. 10^ h2 (1972) gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird* katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet«

Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes -> doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelsti'angs. Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in Figur 1 dargestellte Senquenz, vergleicheHeyneker, H.L., et al. und Scheller, R.H., et al«, loc,eit. Verschiedene solcher synthetischen Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfugung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen. ' ·· · .'· . .

Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDWS kann auf bekanntem Weg erfolgen. Das Verfahren der · Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet* A.,et al,, Biochemistry 12 , 5045 (1973) gereinigt worden V7ar. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc.cit. beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer . cDKS rait stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind I] Erkennungssequenz an jedem Ende. Die Behandlung des Reaktionsprodukte mit Hind III-Endonuclease führt zur Spalung an der Erkemrongsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5'-Enden, siehe Figur 1. .

.4· Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors

Im Prinzip können eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS, ζην Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene.

/hergestellten Weise' cDNS verwendet werden. Die. Grundvoraussetzungen be-

• stehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen

" Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der Öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health. Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Kommittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss 1st selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, ein-

<> schliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht.

Geeignete Transfer-Vektoren, deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von BakteriophagenX(vgl. zum Beispiel Blattner, F.R./ Williams, B.G., Blechl, A.E.. Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.Α., Grunwald, D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J₀V/., Sheldon, E.L. und Smithies, 0., Science 196, l6l (1977))und Derivate des Plasmids col El (Vgl. zum Beispiel Rodriguez, R.L., Bolivar, · S., Goodman, H.M., Boyer, H.V/. und Betlach. M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D, P. Nierlich, V/. J., Rutter, CF., Fox. Eds. (Academic Press, NY, 1976) S. 471-477). Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der

Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators., die V/irtszelle zu veranlassen, dass sie' hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von gol Elgehören die Plasmide pMB-9* die das Gen für Tetracyclin· resistenz tragen, und pBR-313, pBR-^15, pBR-Jlö, pBR-317 und pBR-j522, die ausser dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Amp .icillinresistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genai stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur.Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vorn Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart-der'Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El Verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen, eine Hlnd III-Erkennungsstelle besass.

Wie beim Plasmid, kann auch die 'Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng •begrenzt wurde. Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind; vergleiche Curtiss, III, R., Ann.Rev.Microbiol., >0^ 507 (1976). E. coli RR-I kann verwendet werden, wenn PJ-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide, sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, ein-schliesslich Protisten und anderer Bakterien, zum Beispiel Hefen,

Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird · die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkulieren. Die anschliessend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukorabinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss Stand.der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endenuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt. . .

Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewandt. Hierbei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5^:-feerminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis 10 herab. , .

on - 3Ö

Das eirfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte·Reaktion.stattfindet· zwischen einer 5^f-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer 5'-Hydroxyl-DNS-Endgruppe. Wird die terminale .5'-Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein. ' Ist aoppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt:

·..;.".· Tabelle 1 .

Fall

Reaktionsteilnehmer

III

-OK" H 0 PO-

-OPO₃H₂ ^{+ ί 3}HO-

-OH -OH

OK

-OH

5^f

H₂O ?-

-⁵OH

HOHO-

Ligase-Produkt

3' 5*

0-P-O-

O-P-Q

-0-P-O- -OH HO-

4-2

+H

keine Reaktion

In Tabelle 1 wird'die doppelsträngige DNS schernatisch durch zv/ei parallele Linien xviedergegeben, v/obei die 5'~ und 5' ~ Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen. Im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden beaktionsfähigen Endgruppen vor., mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden^ Im Fall II' besitzt n'ur einer der zu verbindenden Stränge eine terniinale 5' -Phosphat-.· gruppe mit dem Ergebnis, dass eine, einsträngige covalente

Bindung erfolgt, während im anderen Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nicht-co\eLent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5^r~ Phosphatgruppe, so dass keine Bindungsreaktion eintreten kann. · ; . .

Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5^f-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS- nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse. ... ·

Das vorstehend beschriebene ,Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstitu-* ieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS- ' ' Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. und Khorana, H.G.., Proc. Natl.,Sci USA 6J^ 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coIi erhaltene Ligase verwenden, vergleiche Modrich, P. und Lehman, I.R., J.Biol.Chem. 245, 3626 (1970).

Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen Unterfrägmente wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falscher Sequenz verhütet. Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Fragments homogener Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5¹-terminalen Piiosphatgruppen der e'DNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die f>*-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS~Ligase, die zur Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphatgruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eijge 5'-Phosphatgruppe besitzen.

Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, das heisst hinten~an-vorn, statt vorn-an-hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung v/erden nicht verhindert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalis abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.=

Zur ,Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Ratteninsulin codierende cDNS isoliert und mit einem Pl<asmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen •gewonnene Meukombinierte Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes

DNS~Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurderr mit Hind III- oder HSU I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode.von Maxam, A.M. und Gilbert, W., Proc. Natl.Acad.Sci USA, Jk^ 56O (1977) ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte .Codierungsreaktion für Ratten-Proinsulin I und 1> von 2J> Aminosäuren der Prepeptid-Sequenz. Eine Zusammenstellung der Nucleotidsequenz dieser Region wird nachstehend dargestellt.

.Auf ähnliche VJeise wurde Wachstumshormon von Ratten codierende cDNS isoliert, mit einem Plasmid rekombiniert und in E. coli transferiert. Nach ausgiebiger Replikation in E. coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 Nucleotiden Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorlauferpeptids und .einen Teil der 5-V-untranslatierten Region enthielten.

Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte, oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben,die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten. Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Ratten-Insulingen in E. coil. In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide . charakterisiert, die Teile von Ra-tten-Insulingen, Ratten-Wachtumshorrnongen, menschlichem Insulingen und' menschlichem

^ or·

2 03 5 81S -34- ' ' -17.1.1979

53 547/12

Wachstumshormongen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen» .

Aiisf'ührungshelgpiele

Zur Herstellung von gereinigten Ratten-Inseli-ellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit Hank*scher Salzlösung infundiert durch rückläufige Infusion in den Pankreasgango Die Hank'sehe Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Standardlösung« Dann wird die Bauchspeicheldrüse entfernt, in Hank'scher Lösung von O C zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Inhibitor verdaut« Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4 ⁰C, falls nichts anderes angegeben» Die Bedingungen bei der Verdauung sind äußerst kritisch» Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hank'scher Lösung werden in ein 30 ml-Glasrohr gefüllt. Alle Glasteile waren mit Silikon (Handelsbezeichnung Siliclad, Hersteller Clay-Adams Division, Beeton-Dickinson Inc., .Parsippany, New Jersey) behandelt wordene Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenase, ein aus Clostridium histolyticum erhaltenes Enzym (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl, I«, Mackeman, JeD* und Howes, -E.L··, J.Clin-Invest· 32_S 1323 (1943) - Typ CLS IV, Hersteller Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey) und 1 mg Sojabohnen, trypsin-Inhibitor, Hersteller Sigma Chemical Company, St» Louis, Missouri* Die Inkubation erfolgte bei 37°C während 25 Min« unter Schütteln mit 90 Bewegungen pro Minute« Ständige* Beobachtung war erforderlich, um. sicherzustellen, daß die Kollagenase-Verdauung in optimalem-Ausmaß verliefe Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt, bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung» lach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 Min* bei 200 χ G zentrifugiert« Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert

und der Kuchen wurde mit Hank¹scher Lösung gewaschen, . dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde der Kuchen in 15 ml des Handelsprodukts Ficoll (Hersteller Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Schweden) mit der Dichte 1,O85 suspendiert. Eine Schicht von 8 ml Ficoll der Dichte l,080 wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml" Ficoll der Dichte Ι,.ΟβΟ, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 Min. bei 500 χ G und dann 5 Min. bei 2000 χ G zentrifugiert. Die Aeinar-Zellen blieben am Boden, die Inselzeilen stiegen imGiadienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten. Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe. Grosse Verunreinigungsfragmente wurden vom Schichtmaterial entfernt. Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikropipette befreit. Das Zellpräparat wurde dann in Hank'scher Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die über-

ab-

stehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Zellkuchen

• . vnirde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.

Die von 200 Ratten zusammengefassten Inselzellen wurden in 4-molarer Guanidinlumthiocyanatlösung (Handelsbezeichnung Tridom, Hersteller: Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs) die 1-molar an ß-Merkaptoethanol und auf pH 5.» 0 gepuffert war,- bei 4 C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5»7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 m MbI Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, überschichtet und l8 Std..

bei j>7 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beekman-Ultrazentrifuge beil5 c zentrifugiert. Dabei wandert die RNS zum Boden des Zentrlfugierröhrchens. ..

Polyadenylierte RNS wurde durch Chromatographieren des RNS-Gesamtpräparates an Oligo(dT)-Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H., und Leder, P. loc.cit. isoliert.

Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhans'sehen Inseln von Ratten in cDNS wurde Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (erhalten von Life Science Inc., St. Petersburg, Florida) verwendet. Die Reaktionen wurden in 50 DiM Tris-KCl, pH 8,5jait

9 mM-MgCl₂, 50 mM NaCl, 20 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM von jeweils 3 nicht-radioaktiven Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 250 p.M des vierten, in ot-Stellung mit 3>2_p markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 50-200 Curie/Mol, 20 pg/ml 01igo-dT,p__-, ο (Hersteller Collaborative Research, Waltham, Massachusetts), 100 ug/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml Reverser Transcriptase ausgeführt. Das Gemisch wurde I5 Min. bei 4-5 C inkubiert. Nach Zusatz von EDTA-NAp bis 25 mM wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, dann wurde die wässrige Phase an einer mit Sephadex G-1Ö0 gefüllten Säule von'0,5 cm Durchmesser und 10 cm Höhe in

10 mM Tris-HCl_s pH 9*0, 100 mM NaCi, 2 mM EDTA chromatographiert. Die eluierte Nukleinsäure vaarde nach Zusatz von Ammoniumacetat(pH 6,0 bis O₅25 M) mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Kuchen wurde in 50 ul frisch zubereiteter 0,1-molarer Nätriumhydroxidlösung gelöst und 20 Min. bei 70 °C inkubiert, um die RNS zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde mit 1-molarer •Natriumace tat lösung, pH K, 5, neutralisiert und das 3>2p~cDNS-Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt und erneut in Wasser gelöst. Proben einsträngiger cDNS wurden auf nativem Poly·- acrylamid-Gel nach der Methode von Dingman, CV/., und Peacock, A.C., Biochemistry T^ 659 (1968) analysiert«, Die Gele wurden getrocknet'.und die J2 -DNS wurde durch

Autoradiographie unter Verwendung eines Kodak No-Screen NS-2T-Films (Hersteller: Eastman Kodak Corp., Rochester, New York) ermittelt. Die eDNS war heterodispers, wie aus der Elektrophorese ersichtlich. Sie enthielt mindestens eine Haupt-cDNS von etwa 450 Nucleotiden (Vergleich mit bekannten Standards).

Beispiel 2 ' · · ' . ·

Die gemäss Beispiel 1 erhaltene einsträngige cDNS wurde mit Reverser Transcriptase behandelt, um den komplementären Strang herzustellen. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 9 inM MgCL₂, 1OmM Dithiothreit, 50 mM von jeweils drei nicht-markierten Deoxyribonucleosid-triphosphateri, 1 IaM eines in c^-Stelluiig mit ;52_p markierten Nucleosidtriphosphats mit der spezifischen Wirkung 1-10 Curie/Millimol., 50 jag/ml cDNS und 220 Einheiten/ml Reverse Transcriptase«, Das Reaktionsgemisch wurde 120 Min. bei 45 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EI)TA-Na₂ bis 25 mM abgestoppt, dann wurde mit Phenol extrahiert, an Sephadex G-100 chromatographiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine Probe des Reaktionsprodukts von 500 bis 1000 cprn wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Es wurde eineheterodisperse. Bande mit Zentrum vm %50 Nucleotide Länge beobachtet, beim Vergleich mit Standardproben« Proben der DNS-Reaktionsprodukte' der Beispiele 1 und 2 wurden gesondert mit überschüssiger Restriktions-Endonuclease Hae III behandelt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Beide Produkte wurden durch die Endonuclease gespalten, so dass zwei Banden der Radioaktivität bei der Gel-Elektrophorese beobachtet wurden. Die aus der* Spaltung der doppelsträngigen cDNS resultierenden Banden •repräsentierten Spaltungsprodukte von im wesentlichen.gleicher

2Ä

Kettenlänge wie bei der Spaltung der einsträngigen cDNS.

Beispiel j? .' '

Das doppelsträngige Reaktionsprodukt von Beispiel 2 wurde in einer Konzentration von2-5 »g/ml mit ^O Einheiten SIr Nuclease mit einer Aktivität von 1200 Einheiten/ml (Hersteller: Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in 0, OJ M Natriumacetat, pH 4,6, .0,3 M Natriumchlorid, 4,5 mM ZnCl,. 30 Min. bei 22 °C inkubiert und weitere 15 Min. bei 10 ⁰C. .Mit dem Zusatz von Tris-base bis 0,1 M Endkonzentration, EDTA bis 25 mM und E. coli-tRNS (hergestellt nach der Methode von Ehrenstein. G., Methods in Enzymology, Herausg. ' S.P. .Colowick und N.O. Kaplan, Bd. 12A, S." 588 (1967))bis 40 ug/ml vmrde die Verdauung gestoppt. Nach der Extraktion des Reaktionsgemisch mit Phenol und Chromatographieren· an · Sephadex G-100 vairde die eluierte 52_p-cDNS mit Ethanol ausgefällt. Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden, die zur Verknüpfung der stumpfen Enden an chemisch 'synthetisierte Decanucleotide erforderlich waren. Hind III~Decamere wurden nach dem Verfahren von Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. und Itakura, K. Science

(1977) hergestellt. Die Verknüpfung der Hind III-Decamere mit der cDNS erfolgte durch Inkubieren bei 14 °C in 66 mM Tr is-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl₀, 1 mM ATP, 1Ό mM Dithiothr'eit, 3 mM Hind III-Decamere mit 10^ cpm/pMol und Τ4 DNS-Ligase, etwa 500 Einheiten/Milliliter, während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Min. auf 65 C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren. Dann wurden KCl bis 50 mM Endkonzentration, ß-Merkaptoethanol bis 1 mM Endkonzentration und EDTA .bis 0,1 mM Endkonzentration vor der Verdauung mit 150 Einheiten/ml zugegeben, die während 2'Std.. bei 57 C

HO

ausgeführt wurde. Hind III- und Hae III-Endonuclease sind handelsübliche Präparate, erhältlich bei New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. Das Reaktionsprodmkt wurde durch Gel-Elektrophorese,wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Dabei wurde ein Peak beobachtet, der einer Sequenz von etwa' 450 Nucleotiden entsprach, ausserdem wurden Fragmente der abgespaltenen Hind III-Decamere beobachtet.

Beispiel 4 . ''"'..'..

Plasmid pMB-9-DNS (Herstellung :SRodrigues, R.L., Boiler, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W. und Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular und Cellular Biology, D.P. Wierlich, V/.J. Kutter* und CF. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976) S. 471-477) wurde/an der Hind III-Erkennungsteile mit Hsu I-Endonuclease gespalten, dann mit alkalischer Phosphatase (Typ BAPF, Worthington Biochemical Corp., .Freehold, New Jersey) behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0,1 Einheit/Mikrogramm DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 2.5 mM Tris-HCl für pH 8 ^O Min. bei 25 ⁰C inkubiert, dann erfolgt Phenol-Extraktion zur Entfernung.der Phosphatase. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde die mit Phosphatase behandelte Plasraid-DNS zu cDNS zugegeben, die zu Hind III kohäsive Enden besass, und zwar in einem Molverhältnis von ;5 Mol Plasmid zu 1 Mol cDNS. Das Gemisch, wurde in 66 mM Tris, pH 7,6, 6,6 mM

10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP 1 Std. bei 14 °C in Gegenwart von 50 Einheiten/ml Τ4 DNS-Ligase inkubiert»

Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von E. coil X-1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Transformation vorbereitet waren: die ,Zellen wurden bis zu einer

Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, das 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l

' Natriumchlorid, 2 mM NaÖH, 100 ug/ml Diaminopimelinsäure

und 40 ug/ml Thymin enthielt und 27 C zeigte. Die Zellen ; vmrden durch fünfminütiges Zentrifugieren unter 5 000 χ G bei 5 ⁰C gesammelt, in 20 ml kalter 10-millimolarer Natriumchloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suppendiert, der 75 mM CaCIp,

l40 mM NaCl und 10 mM Tris pH 7,5 enthielt, und 5 Min. . in Eis stehengelassen. Dann wurden die Zellen zentrifugiert V :.. und erneut in 0,5 ml Transformationspuffer suspendiert. • ; Die Transformation erfolgte durch Vermischen von 100 ul

der Zellsuspension mit 50 ul rekombinierter DNS (1 ug/ml). ;· . Das Gemisch viurde 15 Min. bei 0 C inkubiert, dann 4 Min. .·. ' bei 25 ⁰C und ^O Min. bei 0 ⁰C behandelt. Sodann wurden die Zellen zum Wachstum unter ausgewählten Bedingungen auf Agar-Platten übertragen.

Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit .5 Mikrogramm/ml Tetracyclin bei Transformation.¹ dem Hind IH-. Produkt «. Es wurde eine als pAU-1 bezeichnete Neukornbination Isoliert. Rohe Plasmid-Präparate mit 2 ug - 5 J^S DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit überschüssiger Hsu I-Endonuclease behandelt. Dann wurden 10 mM EDTA-Na₂ und 10 % (Gewicht/Volumen) Rohrzucker zugesetzt Und das Gemisch wurde an 8 % Polyacrylamid-Gel zerlegt. Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Basenpaare Länge gefunden. In einem ähnlichen Versuch wurde als Transfer-Vektor das Plasmid pBR-;522 verwendet. Sämtliche Bedingungen blieben, wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekombinierten Klone erfolgte auf 20 ;ug/ml Ampicillin enthaltenden Platten. ·. . . .

Be!spiel 5

Nach der Eluierung aus dem Gel wurde DNS markiert durch Inkubation miff- P-ATP und dem Enzym Polynucleotidkinase unter den von Maxam und Gilbert loc.cit. beschriebenen Bedingunge] Das Enzym katalysiert die Übertragung einer radioaktiven .Phosphatgruppe von I ~^J P-ATP auf die 5'-Enden der DNS. Das Enzym war aus E. coli nach der Methode von Panet, A., et al, Biochemistry 12, fjO²^ (1973) erhalten worden. Die so markierte DKS wurde mit Hae III-Endonuclease nach der Vorschrift von. Beispiel 2 gespalten, und zwei markierte Fragmente von etwa 265 bzw. Γ25 Basenpaaren wurden unter den in Beispiel 1 beschrieben Bedingungen a.n einem Polyacrylamid-Gel voneinander getrennt. Die isolierten Fragmente wurden spezifischen Spaltungsreaktionen unterworfen, dann erfolgte die Sequenzanalyse nach der Methode von Maxam und Gilbert, loc.cit«, Die Sequenz der folgenden Tabelle 2 bezieht sich auf eine Zusammenstellung der Ergebnisse dieser Versuchsreihen und ähnlicher Versuchsreihen mit cDNS und Plasmid-Vektoren aus col El wie pMB-9 und pBR-222. Am 5'-Ende ist eine Sequenz von schätzungsweise 50 bis 120 Nucleotiden Länge unbestimmt und das PoIy-dA-Segment am J^s-Ende ist von verschiedener Länge«, Diese Sequenz entspricht dem derzeitigen Y/issensstand, wobei selbstverständlich weitere Untersuchungen zusätzliche Details eröffnen oder die Notwendigkeit zu gerlngfügiger Revision einiger Bereiche mit sich bringen können. Die entsprechende Aminosäuresequenz von Ratten-

miifc Proinsulin I beginnt der mit 1 bezeichneten Triplett-Stellung und endet milk der mit 86 bezeichneten Triplett-Stellung. Einige Ungewissheit verbleibt im Hinblick auf die in gestrichelter Linie unterstrichene Sequenzί

Tabelle 2

^/unbestimmt/ „„__{GCG CTG} g_{TC GTG CTC TGG GAG ccc MG CCT GGT CAG}. _{GCT Tn}. _{GTGMA CA0 CAC}· _{CTT TGT}

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mit gestrichelter Linie unterstrichen =· Bereiche vorhandener Unsicherheit

- TS--

Belspiel 6

Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis K isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das. einer geeigneten Quelle entstammt, zuih Beispiel einem gespendeten Pankreas oder einem frischen Leichnam oder einem menschlichen · Ihsulinoma. Ein Mikroorganismus wird im wesentlichen nach Vorschrift von Beispiel k- erzeugt, mit einer die A-B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenz. Die bekannte Aminosäuresequenz der Α-Kette lautet:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-i-.sn-

20

Tyr-Cys-Asn Die Aminosäuresequenz; der Kette B lautet:

1 "i ίο .

j Phe-Val-Asn-Glu-Kis-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-L&u-Tyr-Leu-Val-I 20 30

.Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

Die Aminosäuresequenzen werden, ausgehend vom Ende, mit freier Aminogruppe beziffert, vergleiche Smith, L.F«, Diabetes 21, (Erg.2), 458 (1972). '

Beispiel 7«

Bei Genen nicht-menschlichen'Ursprungs erfordern die US-Sicherheitsbestimmungen nicht die Isolierung einer cDNS

oei · so hoher Reinheit wie menschlicher cDNS„ Es ist daher möglich, die das gesamte 'Ratten-Wachstumshorraon-Strukturgen enthaltende cDNS zu Isolieren, indem man elektrophoretisch abgetrennte DNS der erwarteten Länge von etwa 800 Basen-, paaren (entsprechend der bekannten Aminosäurelänge des Wachstumshormons) isoliert. Als. Quelle für Ra tten-V/achs turnshormon-mRNS wurden gezüchtete Hypophysenzellen von Ratten'

(sub-Klon des Zellstamms GH-I, zu beziehen bei der American Type Culture Collection) verwendet, vergleiche .Tashjian, A.H,, et. al., Endoehrinology 82,- jK2 ζΐ9β8). V/erden diese Zellen unter normalen Bedingungen gezüchtet, so macht die Wachstumshormon-mRNS nur 1 bis 3 % der gesamten Poly-A-enthaltenden RNS aus. Die Menge an Wachtumshormon-mRNS wurde jedoch über die Menge anderer mRNS in der Zelle erhöht durch die synergistische Einwirkung von Thyroidhormonen und Glucocorticoiderj. Die RNS wurde aus 5 χ 10 -Zellen gewonnen,, die in einer Suspensionskultur gezüchtet und zur Produktion von Wachstumshormon disponiert wurden durch Zusatz von 1 mM Dexamethason un 10 mM L-Triiodthyronin zum Medium 4 Tage vor dem Sammeln der Zellen. Die polyadenylierte RNS wurde aus der eytoplasmischen Membranfraktion der gezüchteten Zellen isoliert, siehe dazu Martial, J.Α., Baxter, J.D., Goodman, H.M. und Seeburg, P.H., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 7^ l8l6(1977)* und Bancroft, P.C., Wu., G. und Zubay, G., Proc.Nat.Acad.ßcI. USA 7O₂. 56k6 (1975). Die mRNS wurden, dann im wesentlichen nach der Vorschrift der Beispiele 1, . 2 und J> weiter gereinigt und in doppeisträngige cDNS transcribiert. Nach der Fraktionierung der Gel-Elektrophorese wurde eine schwache aber deutliche Bande entsprechend einer DNS mit etwa 800 Basenpaaren Länge beobachtet.

Die Behandlung der gesamten, durch Transcription aus der mRNS der gezüchteten Hypophysenzellen erhaltene cDNS mit . 'Hhal-Endonuclease ergab zwei DNS-Hauptfragmente (nach elektrophoretischer Trennung) entsprechend etwa 3>20 Nucleotiden (Fragment A) und 2kO Nucleotiden (Fragment B). Die Nuieotidsequenzanalyse der Fragmente A und B gernäss der Vorschrift von Beispiel 5 ·. ergab, dass diese Fragmente tatsächlich Portionen der codierenden Region für Ratten-Wachstumshormon waren, und zwar auf der Basis der bekannten

Aminosäuresequenz für Ratten-Wachstumshormon und durch Vergleich mit anderen bekannten Wachstumshormonsequenzen j vergleiche Wallis, M. und Davies, R.V.N., Growt Hormone And Related Peptides (Herausg. Copecile, A. und Muller, E.E. ), S. 1-14 (Elsevier, New Yoek, 1976), und Dayhoff, M.O., •Atlas of Protein Sequence and Structure, 5^ Erg. 2, S.120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C, 1976)· Wird die doppeisträngige cDNS mit 8OO.Basenpaaren nach der vorstehend beschriebenen elektrophoretischen Isolierung analog mit; Hhal-Endonuclease behandelt, so erhält man unter den Hauptspaltprodukten zwei Fragmente, die in der Länge den Fragmenten A und B entsprechen.

Da die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren nicht unter Rückgriff auf die Behandlung mit Restriktions-Endonuclease gereinigt wurde, musste die DNS zwecks Entfernung ungepaarter einsträngiger Enden behandelt werden. In der Praxis entfernt man diese ungepaarten Enden vor der elektrophoretischen Trennung in 25 Ul βθ mM Tris-HCl, pH 7,5* 8 mM MgClgj10 mM ß-Merkaptoethanol,. 1 mM ATP und 200 JiM von Jedem der Nucleotide dATP, dTTP, dGTP und dCTP. Das Gemisch wurde mit einer Einheit E.coil DN5-Polymerase I bei 10 ⁰C 10 Min. inkubiert, um alle hervortretenden J>^x -Enden zu entfernen und alle hervortretenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist ein handelsübliches Produkt (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana).

An die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaareri . ' wurden chemisch synthetisierte Hind III-Bindeglieder nach der Vorschrift von Beispiel 5 addiert. Das Plasmid pBR-j522 mit einem Ampicillin-Resistenzgen und einer einzigen-Hind III-Stelle im Tetracyclin-Resistenzgen wurde mit Hind III-Endonuclease und alkalischer Phosphatase nach der Vorschrift ..,.·· von Beispiel K vorbehandelt. Das so behandelte Plasmid vmrde

mit der Raiten-Wachstumshormoh-cDNS mit den 800 Basenpaaren in einer DNS-Ligase-Reaktion gemäss Beispiel 3 kombiniert. Das Gemisch zur Ligase-Reaktion wurde zur TraräOrmierung einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen, die gemäss Beispiel 3 behandelt worden waren, verwendet. Die rekombinierten Kolonien wurden aufgrund ihres Wachsturns auf Ampicillin enthaltende Nährplatten und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 pg/ml Tetracyclin ausgesondert. 10 derartiger Kolonien wurden erhalten, die das Plasmid mit einer Insertion von etwa 800 Basenpaaren enthielten. Die Freisetzung erfolgte durch Kind HI-Spaltung. ...

'.-.. ' .· ' (EGH-DNS) Die Ratten-WachstUmshormon-DNf/mit 800 Basenpaaren wurde in präparativen Mengen aus dem rekombinierten Klon pRGH~l isoliert und die Nucleotidsequenz wurde., wie in Beispiel 5 beschrieben, ermittelt. Die Nucleotidsequenz umfasste Teile der 5'-untranslatierten Region des Ratten-Wachstumshormons und eine Sequenz von 26-Aminosäuren, die im Proteinvorläufer des Wachs tums^/$r°&ibr Sekretion gefunden wird. Die aus der Gen-Sequenz gefolgerte mRNS-Sequenz zeigt folgende Tabelle 3« Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt gut überein (mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8) mit der Teilsequenz des Ratten-Wachstumshormons gemäss Wallis und Davies, loc.cit,, die die Reste 1-42, 65-69, IO8-II3, 132-145 und 150-190 aufweist.

Tabelle 3

DNS-Nucleotidsequenz eines Stranges, der die gesamte Ratten-Wachstumshormon codierende Sequenz enthält«. Die entsprechenden Aminosäuren werden,, zusammen mit ihrer Stellungsnummer in Bezug auf das Amino_rHnde aufgeführt. Negativ bezifferte Aminosäuren entsprechen der Sequenz von Pro-Wachstumshormon_o Die entsprechende mRNS-Sequens ist die gleiche, lediglich wird : in der mRNS T durch U ersetzt: ·

Tabelle

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Beispiel 8 . . ··' · "

Die Isolierung von menschlicher Wachstumshormon-mRNS erfolgt im !wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 7, lediglich ist das biologische Ausgangsmaterial menschliches Hypophysentumorgewebe. Fünf benigne Hypophysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren, und von denen jeder 0,4 bis 1,5 g wog, wurden in 4-molarer Gunidiniumthiocyanat-Lösung, die an Merkaptoethanol 1-molar und auf pH 5*0 gepuffert worden war, bei 4 ⁰C aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5*7~m°lare Cäsiumchloridlösung, die 100 mmol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und l8 Std. bei yj 000 Umdrehungen/Minute im Rotor SiV 50,1 einer Beckmann-Ultrazentrifuge bei 15 °C zentrifugiert» Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenrohres. Die weitere Reinigung mit einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose^- Gradientensedimentation erfolgte wie in den Beispielen 1, 2 und 5· Etwa 10 % der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon,wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers in Niederschlagsmaterial aus Ant!Wachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimen j vergleiche Roberts, B-E. und Patterson, B.M., Prac.Nat.Acad.'Sci. USA 70, 2330 (1973)·

der · "

Die Hersteilung/cDNS von menschlichem Wachstumshormon erfolgt im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben. Die cDNS wird durch. -Gel—Elektrophorese fraktioniert, und das zu einer

/entsprechenden Stellung etwa oOO Nucleotiden Länge/wandernde Material wird"^ zur Klonierimg ausgewählt« Diese Fraktion wird mit DNS-Polymerase wie in Beispiel 6 beschrieben, behandelt, dann erfolgt End-'Addition der Kind III-Bindeglieder. Die cDNS wird dann mit dem mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pBR-^22 und DNS-Ligase rekombiniert. Mit der rekombiriierten DNS X-transformiert und ein die Wachstumshormon-DNS

enthaltender Stamm wird ausgewählt. Dieser Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet> die DNS wird daraus isoliert und ihre Nucleotidsequenz wird bestimmt. Die klonierte

die

Wachstumshormon-DNS enthält die gesamte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codierende?! Nucleotide,, Die ersten 2j5 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons

^Sind . .; · /Η,Ν-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-

- ^:Λ '"". " 10 I' 20

Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leü-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-

Die restliche Sequenz zeigt die Tabelle 4: .

Tabelle 4 · . ·.' .'".·.

Nucleotidsequenz eines Stranges von menschlicher Wachstumshormon-DNS. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz des menschlichen'Wachsturashormons, beginnend am Amino-Ende. Die DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für menschliches Wachstumshormon, lediglich ersetzt in der mJRNS TJ das T. ' '

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Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird es erstmalig möglich, eine für ein spezifisches regulatorisches Protein eines höheren Organismus, wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, codierende Nucleotidsequenz zu isolieren, ferner kann der Transfer der darin enthaltenen genetischen Information in einesn Mikroorganismus ausgeführt werden, in welchem die unbegrenzte Heplikation möglich ist. Das offenbarte Verfahren kann auf die Isolierung und Reinigung des menschlichen Insulingens und seinen Transfer in einen Mikroorganismus angewandt werden« Ebenso kann menschliches Wachsturashormongen und können andere Proteingene isoliert, transferiert und in einem Mikroorganismus repliziert werden. Offenbart werden einige neue rekombinierte Plasmide, die in ihrer Nucleotidsequenz eine Struktur aufweisen, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus erhalten wurde. Offenbart werden neue Mikroorganismen, die abgewandelt sind,, so dass' sie eine Nuce^ofcidsequenz enthalten, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist. Die Beispiele illustrieren die Erfindung am Transfer von Ratten-Gen für Proinsulin I in'einen Stamm von Escherichia coil und am Transfer von Ratten-Gen für Wachstumshormon an einem Stamm von E. coli. Die Sequenz des RauptStücks des transferierten Gens wurde in federn Fall ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass sie die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I bzw» Ratten-Wachstumshormon codiert«

Der hier beschriebene Mikroorganismus wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31392 hinterlegt. Weiterhin wurde das Plasmid enthaltende Ratten-Insulingen, das unabhängig auf andere Mikroorganismen-Stämme übertragen werden kann, unter der Hinterlegungsnummer *10003 bei der ATCC hinterlegt.

Claims (6)

1«, Verfahren zur Herstellung eines DN5-~Transfer~Vektors mit einer Insulin codierenden Ifucleotidsequenz, gekennzeichnet dadurch, daß man

a) aus der'Bauchspeicheldrüse eines Insulin produzierenden .Organismus Inselzellen isoliert, welche Insulin codierende mRNS enthalten,

b) aus den Inselzellen die niEITS in Gegenwart von R-Nase-Inliibitor extrahiert, so daß der RNase-Äbbau der reRNS verhindert wird,

c) dio von Protein^ DITS und anderer RlTS im wesentlichen - freie rnliNS isoliert,

d) eine do.ppelnträngige oD?IS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRWD komplementäro Nucleotidsequens aufweist, wobei man eine oDITS mit Insulin codierender Hucleotidsequenz erhält _s

e) einen DITS-Transfer-Yektor mit reaktionsfähigen Enden die miteinander odor mit doppelsträngiger cDNS verbunden werden können, .bereitstellt, und

f) den DETS-Transfer-Vcktor und die doppelsträngige cDHS mit der Insulin codierenden Nucleotidsequenz miteinander verbindet,

2_S Verfahre ίο. nach Punkt 1_? gekonnte lohnet dadurch, daß der HWase-Inhibitor ein chaotropes Kation, ein cha^ptropes Aiiiori und ein lÜBulfidbinöung spaltonaes Mittel enthalte

SH

AP C 07 D /205 588 53 547 18

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als chaotropes Kation Guanidiniumion und als chaotropes Anion Thioeyanation verwendet. .

4. Verfahren nach Punkt 2_? gekennzeichnet dadurch, daß man

als Mittel zum Spalten von Disulfidbindungen ß-Merkaptoethanol.verwendet·

5. Verfahren nach Punkt I₃ gekennzeichnet dadurch, daß man als RNase-Inhibitor 4—molares Guanidinxmthiocyanat .und 0,2-molares ß-Merkaptoethanol verwendet·

6. Verfahren nach Punkt I₃ gekennzeichnet dadurch, daß die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, daß man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit- einem Reagens vorbehandelt, das zur Entfernung der 5'—terminalen Phosphatgruppe befähigt ist, und DNS-MoIeküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die' eine Verbindung zwischen den reaktionsfähigen Enden herstellende .Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten reaktionsfähigen Enden, die in dar Ligsse-katalysierten Reaktion nichtmit-einander verbunden werden«

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Ph ο ξ pha t a se ve rwe η3 e t „

AP C 07 D /205 588

GJi — 3 —

8. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch _} daß dae zu verbindenden MB-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktionn-Endenuclease "behandelter Plasmid™ I)NS und nicht plasmider linearer DiTS bestehen und der zur Vorbehandlung be .stimmte Teil die Plasmid-ONS enthält j so daß die End-an-Ende-Verknüpfung der. Plasmid-DNS ohne Heukombination mit der nicht-plasmiden verhindert wird. .

Hierzu 1 Seife