DD154023A5 - Verfahren zur herstellung eines dns-transfer-vektors - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die den genetischen Code fuer ein spezifisches Protein enthaelt, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer dieser DNS in einem Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehoeren ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem hoeheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem hoeheren Organismus enthaelt.

Description

Die vorliegende Erfindung"betrifft die Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz«,

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet %

DN-S ~ Desoxyribonukleinsäure

RNS =3 Ribonukleinsäure .

cDNS = komplementäre ONS

(enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz)

'KiRNS =' messenger-RNS

tRNS - transfer-RNS "

dATP w Dooxyadenosintriphosphat

dGTP- ™ Deoxygüanosintriphosphat

dCTP = Deoxycytiüintriphosphat

A ~ Adenin

T ~ Thyrain

G κ Guanin

C a' Cytosin ' . .

T r 1 s - 2- Ära i si ο - 2, - h yd r ο χ y» e t h y I ·» 1. Z4 - ρ r ο ρ a η d i ο 1

EDTA ~ Ethylendiamintetraessigsäure.

ATP S= Adenosintriphosohet

TTP - Thymidintripho£?phat

Oie biologische Bedeutung der Basensequens; aar DNS ist die

29* 8« 80

7 · AP C 07 D/205 5S8

' GZ 57 941 18

eines Speichers der genetischen Information« Es ist bekannt, daß die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der di© Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmte Außerdem dienen Teile dor Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins« Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt* Schließlich dient die Basensequenz in jeden» S-trang als Matrize bei, der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet«

Die Art und Weise, in welcher die Information der-Sasensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist«

Es konnte bewiesen werden, daß jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder meh.„ rerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird«. Dedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett« Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht«, Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle %

Genetischer Code

Phenylalanin (Phe) TTK Histidin (His) CAK

Leucin (Leu) XTY Glutamin (ein) CAD

Isoleucin (lie) ATM Asparagin (Asri) AAK

Methionin (Met) ATG Lysin (Lys) . AAO

Valin (VaI) ' ' GTL Asparaginsäure (ASp) GAK

Serin (Ser) ORS Glutaminsäure (GIu) CAD

Prolin (Pro) CCL Cystein (Cys) TGK

29« 8_β 80 GZ 57 941

Threonin (Thr) ACL Tryptophan (Try) TGG

Alanin (Ala) GCL Arginin (Arg) VVGZ'

Tyrosin.(Tyr) TAK Glycin (GIy) GGL

Terminationssignal TAD.

Terminationssignal TGA

Schlüssels Oedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts«» Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrim.idinbasen, die die Nucleoticisequenz bilden σ

A - Adenin

G = Guanin

. C = Cytosin

T = Thymin

X=T oder C, falls Y=A oder G

X a'C, falls Y = C oder T

Y s A, G_f C oder T, falls X=C 'Υ » A oder G, falls X « T

WaC oder A, falls Z = A oder G

W-C, falls ZsC oder T

Z = A, G₁ C oder T, falls W = C

Z a A oder G₁ falls W=A QR a TC_f falls S ~ A, G, C oder T QR a AG, falls S-T oder C

S ~ A₁-G, C oder T, falls QR » TC

S- β τ oder C, falls QR = AG

D ~ A oder G

K s T oder -C

L ~. A_s T_e C oder G

M -- A, C oder T .

.29* 8. 80 f% A 0/CP ' · GZ 57 941 18

Im biologischen Vorgang der Obersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription_ö In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragene Die RNS ist ein der DWS ahn- liches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der Desoxyribose und Uracil anstelle von Thymin 8teh©n_e Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS« Die durch Transcription einer DNS-Wucleotidsequenz: entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementäre Diese RNS wird als messenger*»RNS (mRMS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dsm genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle«

In der Zelle dient die mRNS als Matrize in einem komplexen Vorgang, an öem zahlreiche Enzyme und Organellen innerhalb der Zeil© beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer Aminosäuresequenzen führt«, Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnete

Häufig gibt es weitere Stufen_t die dazu dienen_f aus aer bei der Translation entstandenen Aminosäuresequenz ein funk-= tionales Protein zu erzeugen« Ein Beispiel ist die Herstellung des Insulins«. - .

Der direkte Vorläufer des Insulins -ist ein Polypeptid_f das · Prüinsulinj das die beiden Insulinketten A und B über ein weiteres Peptid C gebunden enthält, vergleiche Steiner» D_e Fe- .Cunningham, D_if Spigelman, L_s und Αΐβη,,-Β** Science 3.57, 597 (iQ67)_# Kürzlich wurde berichtet, d&ß das erste Trans-

29« 8_Θ 80 GZ 57 941 18

lationsprodükt von Xnsulin-mRNS nicht Proinsulin selbst, sondern ein Pre-proinsulin ist, das mehr als 20 weitere Aminosäuren am Amino-Ende.des Proinsulins enthält, vergleiche Gähn, S* D_e( Keim, P₆ und Steiner, D₀ F_c, Proc* Natl· Aead« Sei» USA 73, 1964 (3.976), und Lomedico, P_e T_e und Saunders, Ge F* _f Nucl« Acids Res* 3, 381 (197δ)_β Die Struktur des Pre-proinsulinmoleküls kann schematisch wie folgt wiedergegeben V'ierden* NH₂-(Pre-peptid)-B-Kette~(C-Peptid)-A-Kett©-> COOH_e

Zahlreiche Proteine von Bedeutung fur Medizin odsr Forschung werden in den Zellen höherer Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt© Hierzu gehören zum Beispiel das Hormon Insulin, andere Peptidhonnone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke_e Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem * Organismus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen mensch·« liehen Ursprungs« Es besteht daher ein Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen außerhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden* In manchen Fällen ist es möglich _£, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten«, Das Wachstum von Zellen in.Gewebckultursn ist jedoch langsam, das Medium ist teuer» die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden, und die Ausbeuter; sind niedrig« Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten*

Itu Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten Medien gezüchtet wer»

29* 8* 80 0Σ 57 941 IS

den* Die Fermentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar. Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch j und hohe Ausbeuten sind möglich« Außerdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen·

Reverse Transoriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrise, ©ines Qligo-DeoxynuGleotid~Priroers und der vier Deoxynucleoeid-Triphosphate dATP., dGTP„ dCtP und TTP, Die Reaktion wird eingeleitet durch .die nicht-covalente Bindung des Oligo-Deoxynucleotid-Ppioiers an das 3'-Ende dor mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Doxynucleotide, ent» sprechend der Basenpaarungsregel, an das 3'-Ende der wachsenden Kette« Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS=Einzelstrang* Die Reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Eirizelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H_f und Leder, P₆ , Proc« Nati» Acad. Sei«* USA 69, .1408 (1972) und Ef stratiadis, A., Kafatos, F* C₅₅ Maxam, A« F₀. und Mania·» tis, T_eCell« 7, 279 (1976).

Restrictions-Endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelstrangiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Strangs gespalten wird* Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so

29* 8_β 80 ' GZ 57 941 18

wird dies© in lineare Form überführt« Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, daß die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt« Diese Sequenz Wird sls Erkennungsstelle (Spaltsteile) der Restrictions-Endonuclease .bezeichnet» Restrictions-Endonueleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert, und ihre Nucleotidsequenz und die Erkennungsstellen wurden ermittelte Einige Restrictions-Endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle» so daß stumpfe Bindungen_t die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen* Dieso einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysis?"« te DNS erneut zu binden* Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muß, wenden die gleichen kohäsiven Enden produ~ zierts so daß es möglich wird,- heterologo DNS-Sequenzen mit anderen, ähnlich erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R* D._Sf Cr.it* Rev_e Biochenu 4„ 123 (1976)«, Die Erkennungssteilen sind relativ rar, jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restrictions-Endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngi- ger Oligo-Nucleotide mit den Sequenzen der Erksnnungsstel« len* Somit kann praktisch jedes ONS-Segraent an ein anderes Segment gekoppelt werden _t indem man einfach das entsprechen·» de Restrictions-Oligu-Nuclöotid an diß Molekülenden anhängt .und das Produkt der hydrolytischen Wirkung' dor entsprechenden Restrictiono-Endonuclease unterwirft, wobei man die er=» forderlichem kohäsiven Enden erhält; vergleiche Heynecker, Shine j Η_β L_e , Goodman, CJ« , Boyer, Η« Μ« _e Rosenberg _s li® W₀, De₁ Dickereon,- Π«· £» _e Narang_£ S_ffi A*, rtakura, K₀, Lin* S₄

29« 8« 80 GZ 57 941 If

und Riggs* A₉ D* , Nature 263_f 748 (1976), und Scheller. R. Κ_β# Oicksrson, R* Ε«', Boyer« H₀ W₆, Riggs. A. D_e und •Itakura, K_0f Science'196, -177 (1977).

Sl-Endonuclease ist ein Enzym, des zur Hydrolyse der Phos« phodiesterhindungen einsträngiger DNS oder einsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelst rängiger DNS befähigt ist; vergleiche Vogt, V_c, M*, £ur_c 3« Biochenu 33, 192 (1973) ·

DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5'~ Phosphat bzw, einem 3'-Hydroxyl bewirkt* die zum Beispiel von zwei ONS-Fragmenten gebildet werden, die durch kohäsi» ve Enden zusammengehalten werden«, Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppelsträngigen DNS-Molekül zu verbinden« Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren _f wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind; vergleiche Sgaramella, V_e , Van de Sande, 0« H₀ und Khorana, H_e 6«,, Proc. Natl* Acad₆ Sei«, USA 67, 1468 (1970)«

Alkalische Phosphatase ist ein Enzym _t das Phosphatesterbindungen _{ einschließlich der 5'-terminalen Phosphatgruppen in DNS hydrolysiert«

Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments in einen DNS-Vektor, zum Beispiel ein Plasmid» Als Plasmid bezeichnet man jede autonom DNS«replizierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann«, Ein Plasmid ist mit den Chromosomen der Wirtezelle nicht genetisch verbunden_f Plasmid-Desoxyribonuklein-

29* 8« 80 4 &-Ö / GZ 57 941 18

säuren sind doppelst rängige Ringmoleküle_f im allgemeinen ..mit Molekulargewichten von der Größenordnung einiger Millionen, obgleich bei einigen das Molekulargewicht 'größer als 10 ist« Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar* Die Piasmid-DNS läßt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle auf Grund des großen Grö&enunterschiedes abtrennen* Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit aer Teilung aer Wirtszelle replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflußt werden. Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstliche« Weg ein DNS-Segment in das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertes Plasmid mit vergrößerter Molekülgrößo entsteht, ohne daS seine Fähigkeit zur Repli« kation oder Expression beliebiger Gene dos Plasraids wesentlich beeinträchtigt würde, Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur übertragung eines.DNS-Seqmönts in eine neue Wirtszelle,, Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektio.nsgründen brauchbar sein können, zum Beispiel Gene dor Arzneimittel resistenζ«

Zur Illus'trierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen im einzelnen beschrieben* -Das .Insulin,wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus d&r Sicht der klinischen Medizin und aus der Sicht' der Grundlagenforschung« Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von-Insulin-Gen aus anderen Orgelnj.sruen-, einschließlich Menschen«. übertra-

29· 8* 80

GZ 57 941 18

- 10 gen werden«

Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert« Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur Behandlung von Diabetes verwendete Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen als Insulinquelle,, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltive.it ansteigt« Außerdem entwickeln einige Diabetiker eine allergische Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsuiin«· Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den .weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre äußerst erwünscht* Dio Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte» Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde je» doch bisher dadurch vereitelt, daß keine Technik zur Einführung des Insulin-Gens in B_akterien vorlag« Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Technik bereit«

Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den'genetischen Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleo-'tidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, aaB auch das schließlich erzeugte Protein modifiziert wird« Auf diese Weise könnte man zura Beispiel ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist« Die genetische-Fähigkeit zur Herstellung einer insulinähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden« Ähnliche Betrachtungen gölten für den Fall der Wachstumshormone.

29* 8_e SO

2*% & O Ä *f ^{GZ 57 941 1Q}

- 11 -

Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie zum Beispiel ein ßakte-rium, eröffnet: neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine,, Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder zu dem Ersatz solcher Protein© durch Proteine, welche von erfindungsgemäß veränderten Mikroorganismen erzeugt wurden .dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus -zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich zum Baispiel die Möglichkeit zum Aufbau von.Symbiosen zwischen erfindungsgemäaGii Mikroorganismen und Menschan mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten., wobei die auf erfindungsgemäße Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden_f um den pathologischen Stoffwechsel fehler auszugleichen«,

Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer einss Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise-das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen;, Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungsn vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten wordene Es ist auch jnöglich, daß die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten P_roteina durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten* Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer aor Gen-Sequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröff-

29* 8« 80

2 24 2.67 GZ 57 941 18

- 12 -*

net außerdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird. Ferner können isolierte Gene verändert werden, so daß sie Proteinvarianten mit anderen therapeutischen oder funktioneilen Eigenschaften codieren«. .

Die vorliegende Erfindung betrifft Maßnahmen, um diegenannten Ziele zu erreichen«. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschließlich enzyra-katalysierter Reaktionen urafaßt« Vorstehend wurden die bisherigen Kenntnisse über die Natur dieser Enzymreaktionen skizzierte

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetischen Information enthaltende Nucleotidsequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirts-Mikroorganismus C

Di© Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzerif die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Strukturgens für Ratten Pro-proinsulxn, des Gens für Ratten-Wachstumshormon und des Gens für menschliches tö/achstumhormoru Danach kann davon ausgegangen werden, daß die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus? wie zum Beispiel eines Wirbeltieres, auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist, Ein höherer Organismus wird hier definiert'als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschließlich zum Seispiel dar Insekten, Mollusken, Pflan-

29« 8* 80

GZ 57 941 18

- - 13 -

zen, Wirbeltiers, einschließlich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine» Primaten und Menschen gehören« Unter einem Mikroorganismus versteht man jeden mikroskopischen lebenden Organismus» der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontiseh oder eucaryontisch sein und zum Bei« spiel aus einem Bakterium, P_rotozon, Algen und Pilzen, einschließlich Hefen, bestehen kann« Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isolierte Aus den Zellen wird intakte inRNS nach einem Verfahren extrahiert, bsi dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird«, Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von Reverser Transcriptase unter^· worfen, wobei diese Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Strangs erforderlichen vier Deoxynucleosid-Triphosphate erfolgte Das Produkt dieser ersten Reaktion mit Reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt«, Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit Reverser Transcriptase odor DNS-Pclymerase in Gegenwart der vier Oeoxynucleosid-Triphosphate inkubiert« Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind« Dieses Produkt Wird dann mit für den Einzölstrang spezifischer Nuc~ lease behandelt, die die einst rängige Schleife abspaltet» Die resultierende doppelsträngige -cDMS wird sodann verlängert» indem man an beiden Enden eine spezifisches DNS addiert, die die Sequenz alner Erkennungs- bzw_s Spaltstelle eines Restriktionsanzyms aufweist„ Die Addition wird durch sine ONS-LigasQ katalysiert» Die verlängerte cDMS wird dann mit

29« 8_S SO ' Ο O A 9A7 GZ 57 941 18

einer Rsstriktiono-Endonuclease behandelt, wobei an den 5'~ Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige 'Enden entstehen«

Eine Plasraid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-Ertdunuclease wird mit diesem Enzym behandelt _f urn den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-kompleraentare einst rängige Nuckleotidsequenzen an den 5'-Enden zu erzeugen« Die 5^c-terminaleri Phosphatgruppen an den einsträr,-gigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, daß das Piasroid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet« Die wie vorstehend beschrieben_f vorbereitete oDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert« Unter den beschriebenen Resktionsbedingungen kann die Eüldung eines lebsn^fähigen, geschlossenen Rings aus Plasmid~DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird» Das die cDNS»Sequenz enthaltende Plasßiid ivird denn in ©ine geeignete WirtszelXe verbracht» Zellen _f die ein lebensf ähiges^ Plasmid aufgenommen haben_f erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal wie zum Beispiel Arzneimittel-Resistenz« Rein© Bakterienetämmei. die das rekombinierte .Plasmid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet _t und das neukombinierte Plasmid wird einschließend reisolierte Auf diese Weise können große Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden? woraus man die spezifische cDNS«Sequenz durch endonucieolytische Spaltung fait. dem entsprechenden RestrUctionaenzym wieder isolieren kann« ...

Das erfindungsgemäße Grundverfahren ist suf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Orqanis««

29« 8* 80

9&7 - GZ 57 941 18

mus, einschließlich dem Menschen, und deren Transfer in einen Mikroorganismus als Wirt anwendbare Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine« Zur Veranschoulichung der Erfindung wurde die Insulin codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert» in Bakterien transferiert und dort replizierte Auf gleiche Welse wurde die für Ratten-Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz isoliert, transferiert und in Bakterien repliziert» Die Methode ist auf den Transfer einer aus menschlichem Zellraaterial isolierten Nucleotidsequenz _t zum Beispiel für'menschliches Insulin und Wachstumshormon oder andere Polypeptid'norrnone anwendbar*

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Isolierung eines DNS'-Moieküis mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz aar DNS nach aer Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindete

Die das erfindungegemsße Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden?

I,, Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus

Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert t. die DNS dee zugrunde liegenden Organismus selbst und eine RNS-Übersetzung aer DNS₀ Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institu-

. 29« 8« 80 9® A 267' GZ 57 941 18

- 16 -

tes of Health wird für die USA vorgeschrieben, daß menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschließend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders auegestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vergleiche US-Federal Register, BcU 41_f Nr_e 131, 7_e 7_e 1967, S* 27S02 » 27943β 3ed.8s Verfahren mit tatsächlicher Brauchbarkeit zur Herstellung von menschlichem Protein, wie zum Beispiel das vorliegende Verfahren, arbeitet daher vorzugsweisemit der Isolierung der spezifischen mRNS, die pine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codierte Auf dies© Weise genießt man den weiteren Vorteil, daß die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden· kann» Insbesondere kann man. auch Vorteil ziehen aus der Tatsache, daß in hochdifferenzierten Organismen, wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht« Eine solche Fa~ pulation kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegeru In derartigen Zellpopulationen besitzt ein großer Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz» Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewandte Verfahren können ira Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein*

In den meisten Gewoben, Drüsen und Organen, werden die Zellen von einem ira allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten.', das hauptsächlich aus Kollagen bssteht, das 'jedoch je nachdem auch andere Strukturprot&ine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann*

29« 8ο 80 GZ 57. 941 18

ί

- 17 -

Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert -zwangsläufig Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix«, Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfaßt daher zwei Hauptstufens die Absonderung der Zellen vom Bindegewebe und die Abtrennung der -gewünschten Zellen von allen anderen im Gewebe vorliegenden Zellarten,; Die erf indungsgeinäB vorgesehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen -aus verschiedenen Geweben anwendbar« So wird zum Beispiel die Isolierung von Langerhansschen Inseln aus den Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender raRNS geeignet sind_{ beschrieben«

Insulin produzierende Zellen können auch aus anderen Quellen stammen, zum Beispiel aus der Bauchspeicheldrüse von. Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen_e Die Isolierung reiner Inselzellen ist in diesen Fällen wesentlich einfacher» insbesondere bei Verwendung reiner'Zellkulturen« In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Inselzellen nicht erforderlich» doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil«

Häufig kann der Anteil an gewünschter raRNS erhöht werden _t wenn man die Zsllrosktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt* So kann zum'Beispiel die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen» Weiiere Verfahren, sind das Züchten bei-einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährniediums oder einer sonstigen chemischen Substanz,.. Bei der Isolierung von iVachstumshormon-rüRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysozollen mit Thyroid--

. 29.· 8_β 80

GZ 57 941 18

- 18

hormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon« raRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöhte

2« Fxtraktion der tnRNS

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung aer RNase-Aktivität im Zellextrakt« Die zu extrahierende mRNS 1st ein einsträngiges Polynucleotide ungepaart mit einem komplementären Strang* Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phos« phodiesterbindung in der Se.quenz würde daher das gesamt© Molekül für den Zweck aer Transferierung einer intakten ge= netischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen» Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbreitet, aktiv und außergewöhnlich stabile Es findet sich auf aer Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien« Die Schwierigkeiten sind besondersakut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist_e Das Problem aer Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, una das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar« Die überraschende Wirksamkeit der Methode wird am Beispiel eier erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten In- _seizollen der Bauchspeicheldrüse beschriebene

Beim Auf reißen.der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen_t die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewandt 'werden, setzt man erfindungsgemäS eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation

29* 8* 80 GZ 57 941 18

- 19 - .

und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein«, Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihrer'Vervvendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus isolierten Langorhansechen Inseln aus Ratten-Pankreasbeschriehen* ·

Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wäßrigen Medien und ihrer Verfügbarkeit« Geeignete chaotrope Kationen sind zum Beispiel das Guanidinium-* Carbaraoylguanidinium=·, Guanylguanidinium-, Lithiurnion und dergleichen* Geeignete chaotrope Anionen sind zum Beispiel das Dodid, Perchlorat,Thiocyanate, Diiodsalicylation und dergleichen,« Die Wirksamkeit von Salzen, die durch Kombine™-tion derartiger Kationen und Anionen gebildet sind hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab« So ist zum Beispiel Lithium-Diiodsalicyla.t ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumtiiiocyanat, jcidoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0,1 M, außerdem ist es relativ teuer* Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt ins Guanidiniumthiooyanat vor_# da dieses Salz leicht zugänglich und in wäßrigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa Smolaren Lösungen _e

Thiölverbinduncion wie das ß-Merkaptoethanol spalten bekanntlich intramolekular6 Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulf id-Aue-tauscn reaktion,» Zahl reiche Thiolverbindungen sind in dieser Richtung wirksam, zum Beispiel ß-'Merkeptoethanolf Dithiothrsit ,-· Cyst ein , Propanoldimerkap» tan und dergleichen» Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in großem Überschuß über die intramolekularen Disulfide vorliegen muß_ä vm die Austauschreaktion zu Ende -zu -führen« ß-Merkaptoetha» nol wird -wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen

_: 29* S₉ 80

4 £&} GZ 57 941 13

. ~ 20 -

Preises bevorzugt« .

Bei der Inhibierung der RNas'e während aer RNS-Extraktion aus Zellen oder Geweben ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner konzentration abhängige Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration· Der Erfolg des'erfindungsgeraäßen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion· beruht vermutlich auf aer raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmaß der Deriaturierung» Dies erklärt möglicherweise die Überlegenheit des Guanidiniumthioncyanats gegenüber dem Hydrochloride trotz der Tatsache,. daß das Hydrochlorid als Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist«. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird« Andererseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von aer Konzentration des Denaturierungsmittels in bezug auf die Schwellenkonzentration _t erhöht von der fünften zur zehn« ten Potenz; vergleiche Tanford* C₀ Ä_{c t} AdV₁₅ Prot* Chenu 23, 12i (1968)_e Diese Beziehung ergibt qualitativ, daß ein nur schwach stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniutnhydro« chlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein Vielfaches schneller denaturieren kann« Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierung und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen.war zum 2_eitpunkt der Erfindung offenbar noch nicht erkannt« Die obigen Erwägungen führen dahin, daß das bevorzugte Denaturierungsrnittel ein solches .wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt« Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiunidiiodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein

2.9* 8* 80 GZ 57 941 18

stärkeres Denaturierungsraittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist, und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubte Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugung von Guanidiniurnthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochloride da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsraittel ist«

Die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsraittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese Weise das RNase-Moiekül vollständig entfaltet wird« Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozeoses,. indem sie eine schnelle Renaturierunq verhindert, die eintreten kann _t falls die intramolekularen Disulfidbindungen intakt bleiben^ .Femer wird jede, im mRNS-Präparat zurückbleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiolf. Disulf idbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jedor Konsantration in gewissem AusmaS wirksam, doch.wird im allgemeinen ein großer Überschuß.an Thiolgruppen gegenüber den'intramolekularen Disulfidbindungen bevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Oisulfidspaltuno abläuft« Andererseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so daß für die Praxis eine obere Konzentrationsgrenze entsteht·«. Beim E-Horkaptoethsnol er-"wiesen sich Konzentrationen im Bereich von 0,05 M bis 1,0 M als wirksam,, und Konzentrationen von 0,2 M werden, bei öer Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Ratienpankreas als optimal betrachtet«.

29* 8_β 80 GZ 57 941 18

Der pH-Wert des Mediums während der mRNS-Extraktion aus den Zellen kann im Bereich von pH 5_f0 bis 8,0 liegen«,

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die RNS aus der Masse aus Zellprotein und DNS abgesonderte Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die'sämtlich geeignet sind* Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Ethanol, bei dem die RNS selektiv ausfällte Bevorzugt wird erfinciungsgemäß die Ausfällstufe umgangen und das Homogenisat direkt auf eine 5_f7molare Casiuinchloridlösüng, die sich in einem Z_en~ trifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf. Zentrifugierung erfolgt; vergleiche die Beschreibung von Glisin, V„ , Crkvenjakov, R« , und Byus, C_e -, Biochemistry 13, 2633 (1974) _c Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine fur RNsse ungünstige Umgebung aufrecht erhält, so daS man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt«

Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS" aus dem Zellhomogenisat« Nur ein Teil dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS« Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, daß in den Zellen höherer Organismen ntRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure_e Derartige mRNS mit daran gebundenen Poly-Ä-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die öligo-thymidylat gebunden ist, siehe Aviv, H* und Leder, P₉ Iocs cit₀ Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichenreine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind*'Die·Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS. unabhängig ihres Herkunftsorganismus_t in praktisch gleicher Weise ausqeführt werden»

• 29* 8« 80

2 0 i 9&*f GZ 57 941 18

- 23 -

Unter bestimmten Bedingungen_t zum Beispiel bei der Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, daß obige Stufe a&r RNase-lnhibierung nicht erforderlich ist_e In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNasQ-Aktivität ausreichen«

Figur ,1 ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen dos Verfahrens,? Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS "komplementär iste Als Enzym wählt man für diese Reaktion Reverse Trense riptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werden könnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Strangs auf Grund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist* Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen auegeführt worden» wobei man die mRNS als Matrize und ein Gemisch UBV vier üeoxynucleosidtriphosphste als Vorläufer des DNS-Strangs einsetzt«, Zweckmäßig wird.eines der Deoxynucleoeid-TriphosphatG in «^-Stellung mit 32_p markiert, um den .Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung t zum Beispiel durch Chromatograpnieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu könnenί vergleiche Efetratisdie_f A* et« ale, loc₀ cit₀ Wie aus eier Zeichnung ersichtlich, erhält rnan als Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptsse eine doppelst'rangj.go Haarr.adölfonn mit nicht·*·covalenter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dein DNS-Strang«

Pas -Produkt der Reaktion mit der Reversen Trenocriotase

29» 8_β 80 GZ 57 941 18

wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgernisch gewonnene Zweckmäßig verwendet- man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephades G-LOO" (Hersteller Pharmacia Inc_ö Uppsala, Schweden) und Ausfällung mit Ethanol^

Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt Werden® Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt* Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch pH-Einstellung leicht 'gesteuert werden kanne

Nach der alkalischen Hydrolyse und anschließenden Neutralisierung kann die mit 32_p markierte cDNS durch Ausfällung mit Ethanol konzentriert werden/ falls dies erwünscht ist»

Die Synthese einer doppelsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms_t zum Beispiel mit DNS-Polymerase oder Reverser Transcriptase«,

Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschließlich der Verwendung eines in ec-Stellung mit 32p markierten Nucleosid-Triphosphats«, Die Reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, zum Beispiel aus Vogel-Hyeloblastosisvirus (das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated» St» Petersburg* Florida,, die es gemäß einem Vertrag mit den. National Institutes of Health produziert) «

Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert

29. 8_O 80

GZ 57 941 18

pc „

sein_f die DMS aus dem Resktlonsgemisch rein zu gewinnen* Auch hier kann man zweckmäßig Phenolextraktion_e Chromatographieren an "Sephatex G-IOO" und Ausfällung mit Ethanol zur Reinigung des DNS-Produkts und Befreiung von verunreinigendem Protein verwenden«

Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppolsträngige DNS überführt werden_£ indem man die einst rangige Schleife _t die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt« Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfugung, die eine spezifische hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS'-Bereiche bewirken« Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die Sl-Nuclesse aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana_f bezogen Vs?erden)e Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Si-» Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülan mit ba~ sengepaarten Enden«. Extraktion _s Chromatographieren und'Ausfällung mit Ethanol erfolgen wie vorstehend beschrieben«. Die Verwendung von Reverser Transcriptase und Sl-Nuclease bei Synthesen doppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS würde von Efstratiadis, et_e al«, loc« cit_e beschrieben»

Gegebenenfalls kann man dan Anteil an cDNS-Molekülen mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E_s coli-DNS-Polymeras© I in Gegenwart o&r vier öeoxynucleosid-Triphosphate« Di© Kombination von Exonuclease- und Polymerase-Aktivität dos Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehe η d β r 3' ·* E η d e η u η d zum Au f f ü 11 e η s ämtlicher h θ r ν ο rstehender 5'-Enderic Auf diese lV₈ise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Molekule an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellte-

29* 8_β 80 GZ 57 941 IS

Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Bohandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, daß geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Rest riktions-Endonuclease aufweisen_β Die Wahl dss an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmäßigkeitsgründen in der Handhabung, Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-Endonuclease ausgewählt, und diese Wahl basiert wiederum auf aer Wahl des DNS-Vektors, mit dem die cDNS zu rekorabinieren ist» Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktiols-Endonuclease anspricht* Das Plasmid pMB9 besitzt zum Beispiel eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind IH₆ Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H« 0 und Wilcox, l<« IV., D* Mol« Biol* 51, 379 (1970) gereinigt« Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton, D_e H,,' Edgell, M* H_e und Hutchinson- III, C. A* D_e Viroi« 10, 42 (1972). gereinigt« Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind HI₆ Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet«

Zweckmäßig verwendet man ein chemisch synthetisiertes dop™ pelsträngiges Deoanucleotid mit dor Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des oDNS~Popp-3lstrangs_e .Das doppelsträngige Decanueleotid besitzt die in Figur 1 dargestellte Sequenz, vergleiche Heyneker, H_e L* st al« und Scheller, R'_e H«' et al« , loc« cit« Verschiedene solcher synthetischen Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so daß man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, daß sie suf di© Einwirkung einer der zahlrei« chen Restriktions-Endonucleasen ansprechen,

29_β 8_β 80 GZ 57 943, 18

Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem Weg erfolgen« Das Verfahren.der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert.wird, die nach der Methode von Panet, A* et al«_t Biochemistry 12, 5045 (1973) gereinigt worden war» Die Reaktion öer Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V₆ et al« _t loc* cite beschriebene Das Produkt aer Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem großen molaren Überschuß eines doppelsträngigen Qecanucleotids mit einer Hind-III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III»Erkennungssequenz an jedem Ende« Die Behandlung des Reaktionsprodukts mit Hind-III-Endonuclease führt zur Spaltung an der Erkennungssteile und Bildung einsträngiger Selbst-komplementärer 5^f-Enden, siehe Fig_t 1*

4* Erfindungsgemäße Bildung eines rekombinierten DNS»Trans~

Im Prinzip können eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene Weise hergestellten cONS verwendet werden« Die Grundvoraussetzungen bestehen darin; de& der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muß, seine Replikation in der tVirts^elle erfolgt und daß er außerdem eine genetische BeötirnmungegröSs besitzt; die es ermöglicht, diejenigen Wirtszsllsn, die ä&n Vektor, aufgenommen haben, aus-'zusondern«, Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Ausvvahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transför-Vektorsrten, die für jeweiligoi versuche geeignet er» scheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien

^2S* ^{8β 80}

der National Institutes of Health* Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert« da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Komitee der National institutes of Health anerkannt wurden_e Erfindungsgemäß ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Piasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschließlich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht« Geeignete Transfer-Vektoren _t deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von Bakteriophagen y^ (vglο zum Beispiel Blattner, F* R_e , Williams, B₀ G* , Blechl, A« E* , Denniston-Thompspn, !<<=, Faber_s Η_β Ε«, Furlong, Le A*, Grundwald, D₉ D_e, Kiefer, D„ 0_e, Moore,'D» O_e , Schumm, O* W₀ , Sheldon, Ec L« und Smithies, So, Science 196, 161 (1977)) und Derivate des Plasmids col El (vgl_c zum Beispiel Rodriguez, R_c L* , Bolivar, S,, Goodman, H* M₀, Boyer, H_e W. und Betlach* M. N. , ICN-UcIa Symposium on Molecular Mechnisrous In The Control of Gene Expression, D«, P_e Nierlich, W_e D_{e t} Kutter, Ο« F_e, Fox, Eds» (Academic Press, NY, 1975) S* 471 . 4-77) β Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen .Molekulargewichte in der Größenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, daß die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Nornialbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die. Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelte Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der VVirtszelle erlaubt es unter bestimmten Urnständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirts« zelle zu veranlassen, daß sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden_β Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäß der Erfindung* Zu den geeigneten Derivaten von col El gehören die Plasmide pMB-9, die das Gen für Tetracyclinresi-

29. 8* 80 GZ 57 941 18

stenz tragen, und pBR-313, pBR-315, pBR-316', pBR-317 und pBR-322, die außer dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Ampicillinresistenz besitzen,. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmäßige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw«, keine Kolonien bilden*· 3"n den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen eine Hind-III-Erkennungsstelle besaß* '

Wie beim Plasmid kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde«. Ein E« coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind ι vergleiche Curtiss, 111, R« _; Ann« Rev« Microbiol*, 30, 507 (1976)* E₆ coli RR-I kann verwendet werden, wenn PS-Einrichtungen vorhanden sind_o Wie im Fall der Plaomide sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur. Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, einschließlich Protisten und anderer Bakterien, zum Beispiel Hefenβ

Rekombinierts Plasmide werden erhalten, indem man mit Restrilctions-'EnddnucIease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten,. Um die Möglichkeit, daß cD.NS-Seomente Kombinationen

29* 9, 80 224 26/ · GZ 57 941· 18

miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuß über die cDNS eingesetzt* Diese Arbeitsweise 'hat bisher, dazu'geführt, daß die Hauptmenge der Plasraide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkulierte Die •anschließend transformierten Zellen' enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide« Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Se~ lektionsvorgang_a Gemäß dem Stand aer Technik wurde dieses Problem gelöst_t indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens, derart _t daß die Insertion der cDNS das Gen teilt» wodurch Verlust UBr vom Gen codierten Funktion eintritt«

Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung.der Kolonienzahl* die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewandte Hierbei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym)« Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5'~terminalen Phosphatgruppen von den mit aer Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DHS wird verhinderte Die Ringbildung und Transformation hän«< gen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'~ phosphorylierte Enden aufweist« Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis 10*" herab« .

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Tatsache, daß die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer S'-Phosphat-'DNS-Endgruppe und einer S'-Hyüroxyl-DNS-Endgruppe^ Wird die terminale 5'~Phosphatgruppe ent"

29« 8« 80 GZ 57 941 3,8

ferrit, so tritt keine Bindungsreaktion ein« Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so .sind zwei Situationen möglich, in Tabelle 1 gezeigt?

Tabelle 1

Fall

III

Reaktionsteilnehmer 3·

OH ^H2°3^P0

·——»OPO_H„

3¹

-OH.

5^! 3'

OH

5^s

OH

HO-

Ο-ίΛωΓΪ

Ligase-Produkt

-P-d-

5"

3'

-0-P»0-

5¹

OH HO

I CC

5' 3'

keine Reaktion

-^+H2°

Xn iabolle Ϊ wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wiedergegeben, wobei die 5'- und 3'~ .Endgruppen 'je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufvvei-' ssn₅ Im Fail I liegen S'-Pnosphargruppen an beiden reaktions fähigen Endgruppen vor, mit deta Ergebnis, daß beide Stränge covalent gebunden werdsru Im Fell Il besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eines terminale 5⁶~Phcsphatgruppe mit dem Ergebnis* daß 'eine einsirängige covalente Bindung

29« 8* 80 GZ 57 941 18

erfolgt, während im anderen Strang eine Diskontinuität vorliegt« Der nicht-covalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül auf Grund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbundene Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5'-P^csphatgruppe, so daß keine Bindungsreaktion eintreten kann«

Unerwünscht© Bindungsreaktionen können daher verhindert worden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung oer 5*-Phosphatgruppen_e Man kann jede Methode, zur Entfernung von 5'«Phosphatgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigte Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse,»

Das vorstehend beschriebene Verfahren ist such dann brauchbar* wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typisohenveise mit einer Restr'iktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist« Die Unterfragmente können gesondert gereinigt, und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unter-•Fragmente rekonstituiert werden«, Das Enzym DNS-Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vergleiche Sgara™ meila, V«, _f Van de Sande, 0« H_e und Khorana, H_e G«, Proc» Nfäti, ,-Sei« USA 67, 1468 (1970)· Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E₆ coli erhaltene Ligase verwenden* vergleiche Modrich, P« und Lehman,, I* R₆* CJ₀ Biol, ehern« 245, 3626 (1970)«

Die Rekonetituierung der Originalsequenz aus durch Rescrik-

29« 9« 80 GZ 57 941 13

iions-Endonuciease erhaltenen Unterfragmenton wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falsche Sequenz verhütet« Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Fragments homogener Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5'-'terminalen Phosphatgruppen der cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease© Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphataoe_£ Die S'-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur Rekonstituierung der gespaltenen. Unterfragmente verwendet wird« Enden ohne 5'-'terminale Phosphatgruppe können daher nicht covalent gebunden werden«. Die DNS-Unterf ragmente können nur ©a solchen Enden gebunden werden, die eine 5-'Phosphatgruppe besitzen«

Dieses Verfahren verhindert.die wichtigste unerwünschte Bindungare&ktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten ' mit umgekehrter Ssquens, das heißthinten»an-vorn_f statt vorn· an«»hinten* Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisie« ru.ng und Cyclisierung werden nicht verhindert« da diese in einer Reaktion vora Typ II gemäß Tabelle I erfolgen» Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig _s da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierberen Produkten führen» was bei der Naukumbination in falscher Richtung nicht der . Fsii lsi«

Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Ratteninsulin, codierende cDNS isoliert und mit einem Plsomid rekombinierte Die DNS-Molekülo wurden zur Transformation von E₈ coli X-1776 verwendete Die-Selektion der zu -transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem

β OAf- . 29. 9* 80

GZ 57 941 18

. - 34

tetracyclinhaltigen Medium«.Eine aus transformierten Zellen gewonnene neukombinierte Plasmid»DNS enthielt ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge_o Weitere Neukorabinationen_f die auf gleiche Weise isoliert worden Waren, wurden ebenfalls analysierte Die inserierten Fragmente wurden mit Hind-lli- oder HSU-I-Endonuciease aus dem Plas« Biid freigesetzt,, und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, Ae M₆ und Gilbert, W₄, Proc_e Nati* Acad· Sei USA, 74, 560 (1977) ermittelt« Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten, die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Proinsulin Ϊ und 13 von 23 Aminosäuren der Prepeptid-Sequenz« Eine Zusammenstellung dor Nucleotidsequenz dieser Region Wird nachstehend dargestellte ...

Auf ähnliche. Weise wurde Wachstumshormon von Ratten codierende cDNS isoliert, mit einem Plasmid rekombiniert und in Eecoli transferiert« Nach ausgiebiger Replikation in E₀ coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 nucleotiden Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorlauferpeptids und einen Teil der 5'-untranslatierten Region enthielten₉

Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschließlich menschlicher Gene_e dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismuse Auch neue rekombinierte Plasmide., die das gesamte oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschriebene Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil' ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthaltene Die folgenden

^{29β 8}* ^so

GZ 57 941 18

- 35

Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung _sauf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Retten-Insulingon in E_c col:'u In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide charakterisiert, die Teile von Ratten~Xnsulingen, Ratten-iVachstumshormongen , menschlichem Insulingen und menschlichem Wächstumshormongen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen e .

Beispiel 1

Zur Hsr'stoliung von gereinigten Ratten-Inselzellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit Hankscher Salzlösung infundiert durch, rückläufige Infusion in den Pankreasgang-, Die Hanksche Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Si'sndardlösung« Dann wird die Bauch·= Speicheldrüse entfernt, in Hankscher Lösung von O C zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Inhibitor verdaut« Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4 C, falls nichts anderes angegeben« Die Bedingungen bei der Verdauung sind äußerst kritisch* Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hankscher Lösung werden in ein 30-ml-Glasrohr gefüllt« Alle Glasteile waren mit Silikon (Handelsbezeichnung Silicladj Hersteller Clay-Adama Division, Becton-Dickinson rnc«_t Parsippsny* New Dergey) behandelt wordene Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenese ein aus Clostridium-histolyticum erhaltenes Enzym (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl_f ~X₍, , Maakeaan* α* D_e und .Howes. E₀ L* _t CJ_e ClIn-T. η vest* 32₁ 132.3 (1943) ~ Typ CLS IV, Hersteller· Worthing ton Biochemical Corporation, Freehold, New Oersey) und i mg Sojabohnen„ trypsin-Inhibi-

: 29« 8_β 80

'# . GZ 57 941

36 -

tor, Hersteller Sigma Chemical Company, St₄, Louis, Missouri« Die Inkubation erfolgte bei.37 ⁰C während 25 Hin« unter Schütteln von 90 Bewegungen pro Minute« Ständige Beobachtung war erforderlich, um sicherzustellen, daß die Kollagenase-Verdauung in optimalem Ausmaß verlief_β Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt, bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung,* Nach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 Min« bei 200 χ G zentrifugiert« Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert, und der Kuchen wurde mit Hankscher Lösung gewaschen, dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt* Nach dem letzten Zentrifugieren wurde der Kuchen in 15 rnl des Hsnüolsprodukts Ficoll (Hersteller Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Schweden) mit der Dichte 1,085 suspendierte Eine Schicht von 8 ml Ficoll der Dichte 1,080 wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml Ficoll der Dichte 1,060, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 Min« bei 500 χ G und dann 5 Min_e bei 2000 χ G zentrifugierte Die Acinar-Zellen blieben am Boden, die Inselzellen stiegen im Gradienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten* Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe« Große Verunreinigungsfragmente wurden vorn Schichtmaterial entfernte Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikriopipette befreit« Das Zellpräparat wurde dann in Hankscher Lösung verdünnt und zentrifugiert© Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert, und der Zellkuchen wurde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert«,

Die von 200 Ratten zusamniengefai3ten Inselzellen wurden in 4-molarer Guanidiniumthiocyanatlösung (Handelsbezeichnung

29έ 8_β 80

£ 4 Ä..Ö / . . GZ 57 941 18

· - 37 -

Tridom, Hersteller? Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs) die Imolar an ß-Merkaptoethanol und auf pH 5,0 gepuffert war, bei 4 ⁰C homogenisierte Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7molare Cäsiumchloridlösung, die 100 mMol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, überschichtet und 18 Std» bei 37 Umdrehungen/Hinute im Rotor SW 50,1 einer Beckman-Ultra zentrifuge bei 15 ⁰C zentrifugierte zum Boden des Zentrifugierröhrchens*

zentrifuge bei 15 ⁰C zentrifugierte Dabei wandert die RNS

Polysdenylierte RNS wurde durch Chromatographieren des RNS-Gesamtpräparates an Oligo(dT)-Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H*, und Leder, P« loc» cit* isolierte

Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhansschen Inseln von Ratten in cDNS wurde Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (erhalten von Life Science Inc_c , St₀ Petersburg, Florida) verwendet«, Die Reaktionen wurden in 50 mM Tris-HGl, pH 8,3, mit 9 mM MgGIp, 30 mM NaGI, 20 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM von jeweils 3 nicht-radioaktiven Deoxyribonucleosid-Triphosphaten, 250 ,uM des vierten, in cg -Stellung mit 32_p markierten Deoxynucleosid-Triphoephatj spezifische Aktivität 50 bis 200 Curie/Mol _f 20 ug/mi Gligo=dT.,,_,_,. ρ (Hersteller Collaborative Research, S-VaItham, Massachusetts) , 100 ug/rnl polyadenylierter RNS und 200 Einheiien/ml Reverser Transcriptase ausgeführt* Das Gsmisch wurde 15 Min* bei 45 ⁰C inkubiert_ö Nach Zusatz von EDTA-NA₀ bie 25 mil .wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen mit Wasser gesattigtom Phenol extrahiert, dann wurde die wäßrige Phaso an einer mit Sepbadex-G-IOO gofülltsn Säule von 0,3 crn Durchmesser und 10 cui Höhe in iO-mM Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl₉.2 mM EDTA .chromatographiert* Die eluier.te Nukleinsäure wurde nach Zusatz von Änimoniumacetat (pH 6_f0 bis 0_e25 M) mit Ethanol ausgefällt«,

29, 8_β 80 GZ 57 941 18

Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Kuchen wurde in 50 /Ul frisch zubereiteter 0,!molarer Natriumhydroxidlösung gelöst und 20 Min« bei 70 °C inkubiert, um die RNS zu hydrolysieren_e Das Gemisch wurde mit !molarer Natriumacetatlösung, pH 4,5, neutralisiert, und das 32p^cDNS-Produkt Wurde mit Ethanol ausgefällt und erneut in Wasser gelöst«, Proben ein» strängiger cDNS wurden auf nativem Polyacrylamid-Gel nach der Methode von Dingman_s C₈ W_e und Peacock, Α» C_t , Biochemistry 7, 659 (1958) analysiert«, Die Gele wurden getrocknet, und die 32_p-DNS wurde durch Autoradiographie unter Verwendung eines i<odak-i\!o-Screen~NS-2T-Film8 (Hersteller? Eastman Kodak Corp« , Rochester. New York) ermittelt» Die cDNS war heterodispers, wie aus der Elektrophorese ersichtlich» Sie enthielt mindestens eine Haupt-cDNS von etwa 450 Nucleotiden (Vergleich mit bekannten Standards)*

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene einst rängige cDNS wurde mit Reverser Transcriptase behandelt,- um den komplementären Strang herzustellen* Das- Reaktionsgemisch enthielt 50 mM TrIe-HCl, pH .8,3, 9 mM MgCl₂, !0 mM Dithiothreit, 50 mM von jeweils drei nicht-markierten Deoxyribonucleosid-Triphosphaten* i-mM eines in ^-Stellung mit 32_p markierte Nucleosid-Triphosphats mit der spezifischen V^irkung 1 bis 10 Curie/Mi 1 lira öl , 50 /Ug/ml cDNS und 220 Einheiten/ml Reverse Transcriptase_e Das Reaktionsgemisch wurde „120 Min« bei 45 ⁰C inkubiert» Die Reaktion wurde durch Zusatz von EOTA-Nap bis 25 mM abgestoppt, dann wurde mit Phenol extrahiert, an Sephadex G-IOO chromatographiert und mit Ethanol ausgefällte Eine Probe des Reaktionsprodukts von 500 bis 1000 oprn wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel i beschrieben,

vL £L *4 £. & ä

GZ 57 941 18

analysiert» Es wurde eine heterodisperse Bands'mit Zentrum um 450 Nucleotide Länge beobachtet, beim Vergleich mit Standardproberu Pr.ob'en der DNS-Reaktionsprodukte der Beispiele i und 2 wurden gesondert mit überschüssiger Restriktions-Endonuclease Hae III behandelt und durch Gel-Elektrophorese analysiert* Beide Produkte wurden durch die Endonuclease gespalten, so daß zwei Banden der Radioaktivität bei der Gel-Elektrophorese beobachtet wurden» Die aus der Spaltung der doppelsträngigen cDNS resultierenden Binden repräsentierten Spaltungsprodukte von im wesentlichen gleicher Kettenlänge wie bei der Spaltung der einsträngigen cDNSo

Das doppelet rängige Reaktionsprodukt von Beispiel 2 wurde in einer Konzentration von 2-5 ,ug/rnl mit 30 Einheiten Sl-Nuclease mit einer Aktivität von 1200 Einheiten/ml (Her~ steller j Milec Laboratories, Elkhart, Indiana) in 0,05 M Natriümacetat, pH 4.6, 0_f3 H Natriumchlorid, 4,5 mM ZnCl_? 30 Min_e bei 22 ⁰C inkubiert und weitere 15 Min„ bei 10 C_e Mit dem Zusatz von Trie-base bis 0,1 M Endkonzentration, EDTA bis .25 mM und E* coli-tRNS (hergestellt nach der Methode von Ehrsnstein, G», Methods in Enzymology, Herausg« Colowicki S_s P„ und Kaplan, N₄ O_ef BcU izk, S_e 588 (1957)) bis 40 ^ug/ml'wurde die Verdauung gestoppt» Nach der Extraktion dos ReaktionsQQmioclieü m-if Phenol und Chrcmatographieren an Sephadex G-IOO wurde die· eluierte 32.~,-cDNS mit Ethanol e.usgefälltO Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute en cDNS-Molekülen mit basengopasrtcn Enden, die zur Verknüpfung öer stumpfen Enden an chemisch synthetisierte Decanucleotide erforderlich waren« Hind-llX-Decamere

29» S. 80 GZ 57 941 18

wurden nach dem Verfahren von Scheller, R_e H„, Dickerson, R* E*, Boyer, H».W«, Rigge, A» D* und Itakura, !<« Science 196, 177 (1977) hergestellt« Die Verknüpfung der Hind-III-Decsmere mit der cDNS erfolgte durch Inkubieren bei 14 C in 66 mM Tris-HCl, pH 7,6_f- 6,6 mM MgCl«, 1 mM ATP₄ 10 mM

5 Dithiothreit, mit 3 mM Hind-III-Decamere mit 10 cpm/pMol und T4-DNS-Ligase, etwa 500 Einheiten/Milliliter, während 1 Stunde* Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Min«, auf 65 C erwärmt j um die Ligase zu inaktivieren« Dann wurden KCl bis 50 mti. Endkonzontration, ß-Merkaptoethanol bis 1 mM Endkonzentration und EDTA bis 0,1 inM Endkonzentration vor der Verdauung mit 150 Einheiten/ml zugeben, die während 2 Std» bei 37 ⁰C ausgeführt wurde« Hind-III- und Hae~III~Endonuc-' lease sind handelsübliche Präparate, erhältlich bei New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts* Das Reaktionsprodukt wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert« Dabei wurde ein Peak beobachtet, der einer Sequenz von etwa 450 Nucleotiden entsprach, außerdem wurden Fragmente der abgespaltenen Hind-III-Deca» mere beobachtet« . ^_-

Beispiel 4

Plasmid pM3-9~DNS (Herstellung s_e Rodrigues, R«.L_e, BoIiver, F₀, Goodman, H* M« , Boyer, H« Vt/_β und Betlach, M₀, ICN-UCLA Symposium on Molecular und Cellular Biology, Wiarlich, D_e.P»,. Rutter, W« 0_s , und Fox, C_s F_{e t} Eds« ,'(Academic Press, New York 1976) S_c 471 - 477) wurde an der Hind-III-Erkennungsstelle mit Hsu-l-iHndonuclease .gespalten, dann mit alkalischer Phosphatass (Typ BAPF_f V/orthington Biochemical Corp·« , Freehold, New Dersey) behandelt* Das

29* 8_e 80

GZ 57 941 18

~ 41

Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0,1 Einheit/Mikrogramm DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 25 mM Tris-HCl für pH 8 30 Min« bei 25 ⁰C inkubiert_{ dann erfolgte Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase« Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde die mit Phosphatse behandalte Plasmid-DNS zu cDNS zugegeben» die zu Hind III kohäsive Enden besaß, und zwar in einem Molverhältnis von 3 Mol Plasmid zu 1 Hol. cDNS_e Das Gemisch wurde in 66 mM Tris, pH 7,6, 6_f6 mM MgCl₂, .10 mM Dithiothreit und 1 roM ATP X Std« bei 14 °C : Liqase inkubiert«

X Std« bei .14 C in Gegenwart von 50 Einheiten/ml T4 DNS

Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von Ee coli-X··· 1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Trensformation vorbereitet waren: Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte vonetwa 2 χ 10. Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, dos 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/i Natriumchlorid» 2 mM NaOH, 100 ,ug/ml Diaminopimelinsäure" und 40 ,ug/mi Thymin enthielt und 37 C zeigt©,, Die Zellen wurden durch rühfminütiges Zentrifugieren unter 5 000 χ G bei 5 C gesammol,t_e in 20 ml kalter lOraillirnolarer Natrium« 'chloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suspendiert, der 75 mM CaCl₂, 140 mM NaCl und 10 jnN Tris pH 7,5 enthielt, und 5 Min_e -in Eis stehengelasnöiu Dann wurden die Zellen zentrifugiert und erneut in 0,5 roll Transformationspuffer suspendierte Di© Transformation erfolgt«"durch Vermischen von iOO yul der Zellsuspension mit 50 ,ul rekombinierter DNS (.1 yug/ml)'* Dos Gemisch wurde 15 Miru bei 0 ⁰C inkubiert _? dann 4 Min* bei 25 ⁰C und 30 Min« boi 0 ⁰C behandelt. Sodann wurden die Zellen zum Wachstum unter ausgewählten Bedingungen auf Agar-Platten übertragen*

'9 9 3 947 · ' ^{29ί 8}· ⁸⁰

Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit δ Mikrogramm/ml Tetracyclin bei Transformation mit dem Hind» IU-Produkt« Es wurde eine- als pAU-1 bezeichnete Neukombip.ation isolierte Rohe Plasmid-Präparate mit 2 ,ug bis 5 ,.ug DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit Überschüssigor Hsu-I Endonuclease behandelte Dann wurden 10 mM EDTA-Na₂ und 10 % (Gewicht/Volumen) Rohrzucker zugesetzt» und das Gemisch wurde an 8 % Polyacrylamid-'Gel zerlegt« Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Easenpaare Länge gefunden« In einem ähnlichen Versuch wurde als Transfer-Vektor das' Plasmid pBR-322 verwendete Sämtliche Bedingungen blieben wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekotnbinierten Klone erfolgte auf 20 ,ug/ml Ampicillin enthaltenden Platten,

Nach der Eluierung aus dem Gel wurde DNS markiert durch Inkubation mit Ί - .P-ATP und dem Enzym Polynucleotidkinase unter den von Maxam und Gilbert loc_e cito beschriebenen Bedingungen« Das Enzym katalysiert die Übertragung einer ra« dioaktiven Phosphotgruppe von ι -⁴^P-ATP auf die 5¹-Enden der DNSi Das Enzym war aus E* coli nach der Methode von Panet, A, et al. Biochemistry 12,5045 (1973) erhalten worden«, Die so markierte DNS wurde mit Hae-III-Endonucleass nach der Vorschrift von Beispiel 2 gespalten, und zwei markierte Fragmente von etwa 265 bzw* 135 Basenpaaren wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen an einem Polyacrylaraid-Gel voneinander getrennt* Die isolierten Fragmente wurden spezifischen Spaltungsreaktionen unterworfen, dann erfolgte die Sequenzanalyse nach der Methode von Haxam Gilbert, loc« cit* Die Sequenz der folgenden Tabelle 2

am und

29« 8» 80 GZ 57 941 18

- 43

zieht sich auf eine Zusammenstellung der Ergebnisse dieser Versuchsreihen und ähnlicher Versuchsreihen mit cDNS und . Plasmid-Vektoren aus ccd El wie pMß-9 und pBR~322_e Am 5'-Ende ist eine Sequenz von schätzungsweise 50 bie 120 Nucleotiden Länge unbestimmt, und das Poly-dA-Segment am 3*-Ende ist von verschiedener Länge* Diese Sequenz,entspricht dem derzeitigen Wissensstand, wobei selbstverständlich weitere Untersuchungen zusätzliche Details eröffnen oder die'Notwendigkeit zu geringfügiger Revision einiger Bereiche mit sich bringen können* Die entsprechende Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin beginnt mit der mit 1 bezeichneten Triplett--Stellung und endet aiii der mit 86 bezeichneten Triplett-Stellung,. Einige Ungewissheit verbleibt im Hinblick auf die in gestrichelter Linie unterstrichene Sequenz*

⁸⁰

041 18

- 44

Tabelle 2

/unbestimmt/ ——GCC CTG CTC CTC CTC TGG GAG CCC AAG CCT'

20

GGT CCT CAC CTG GTG GAC GCT CTG TAG CtG GTG TGT CCG

40 GAA GTG GAG GAC CCG CAA GTG CCA CAA CTG GAG CTC GCT

60 . 70

CTG GAG GTT GCC CGG CAG AAG CGT CGC ATT GTG GAT CAC

86 AAC TAC TGC AAC TGA GTTCAATCAATTCCCGATCCACCCCTCTGCA

ii: gestrichelter Linie unterstrichen ~ Bereiche vorhandener

Unsicherheit

.29« 8« GZ 57 941

(Fortsetzung)

1 CCT CAG CCT TTT GTC AAA CAC CAC CTT TGT

30

GAA CGT GGT TTC TTC TAC AGA CCC AAG- TCC CGT CGT

50 CGAGGC CCG CAG GCC GCG CAG CTT CAG ACC TGG CCA

80 TGC TGC ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAG CAA CTG GAG

TGAATAAACCCTTTGAATGACG-poly A

29* Se 80 GZ 57 941 18

Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis 4 isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man. von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das einer geeigneten Quelle entstammt j zum Beispiel einem gespendeten Pankreas oder einem frischen Leichnam oder einem menschlichen Insulinoma» Ein Mikroorganismus wird im 'wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4 erzeugt, mit einer die A- und B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenz» Die bekannte Aminosäuresequenz der Α-Kette lautett

1 10

Giy^Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-

20 ;Leu«Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

Die Aminosäuresequenz der Kette B lautet?

1 Io

Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala^Leu-

20 30

Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-'Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr .

Die Arainossuresequenzen werden ausgehend vorn Ende mit freier Arninogruppe beziffert, vergleiche Smith, L₈F^, Diabetes 21, (Erg_e Z)₁ 458 (1972)*

Be-ispiel 7

Bei Genen nicht-menschlichen Ursprungs erfordern die US-Sich-srhe-itsbestirnraungen nicht die Isolierung einer cDNS go hoher Reinheit wie bei menschlicher cDNS, Es iet daher niöglich, die das gesamte Ratten-Wschstumshormon-Strukturgen

. 29· 8« 80 .#/ GZ 57 941 18·

Sas «β* Ii

- 47 -

enthaltende cDNS zu isolieren, indem man elektrophoretisch abgetrennte DNS der erwarteten Länge von etwa 800 Basenpaaren (entsprechend der bekannten Aminosäurelänge dos Wachstumshormons) isolierte. Als Quelle für Ratten-Wachstumshormon-mRNS wurden gezüchtete Hypophysezellen von Ratten (sub-Klon des Zellstamms GH-I, zu beziehen bei der American Type Culture Collection) verwendet, vergleiche Tashjian, A₉ H» et* al₉, Endochrinology 82, 342 (1968). Werden diese Zellen unter normalen Bedingungen gezüchtet, so macht die Wachstumshormon-mRNS nur 1 bis 3 % der gesamten Poly-Ä-enthaltenden RNS aus» Die Menge an Wachstumshormon-mRNS wurde jedoch über die Menge anderer mRliS in der Zelle erhöht durch die synergistische Einwirkung von Thyroidhormoneri und Gluco« corticoiden»_ Die RNS wurde aus 5 χ 10 -Zellen gewonnen, die in einer Suspensionskultur gezüchtet und zur Produktion von Wachstumshormon disponiert wurden durch Zusatz von 1 niM Dexamethason und 1OmM L-Triiodthyronin zum Medium 4 Tage vor dem Sammeln der Zeilen« Die polyadenylierte RNS wurde aus der cytoplasmischen Mernbranf raktion der gezüchteten Zellen isoliert, siehe dazu Martial, 3* Α., Baxter, 3« D«, ,Goodman, H* Ho und Seeburg, P₄ H,, Proc» Nat« Acad«, Sei« USA 74, 1816 (1977), und Bancroft, F_e C» , Wu₅,, G* und Zubay, G₀, Proc_s Nat* Acade Sei«, USA 70, 3646 (:1973)_e Die rnRNS wurden dann im wesentlichen nach der Vorschrift der Beispiele 1, 2 und 3 weiter gereinigt und in doppelsträngige cDNS transcribierte Nach der Fraktionierung der Gel-Elektrophorese wurde eine schwache, aber deutliche Bande entsprechend einer DNS. mit etwa 800 Basenpaaren Länge beobachtete

Die Behandlung der gesamten, durch Transcription aus der kRMS der gezüchteten Hypophysenzellen erhaltene cDMS mit .Hhal-Endonuclea.se ergab zwei DMS-Hauptf ragmen te (nach elsk-

29* 8« 80 GZ 57 941 18

- 43 -

trophoretischer Trennung) entsprechend etwa 320 Nucleotiden (Fragment A) und 240 Nucleotiden (Fragment B). Die Nucleotidsequenzanalysa der Fragmente A und B gemäß der Vorschrift von Beispiel 5 ergab, daß diese Fragmente tatsächlich Portionen der codierenden Region für Ratten-Wachstumshormon waren, und zwar auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz für Ratten-Wachstumshormon und durch Vergleich mit anderen bekannten IVachsturnshormonsequenzen ι vergleiche Wallis, Mp und Davies,' R_e V» N*, Growt Hormone And Related Peptides (Hrsg· Copecile, A_e und Muller» E_e E₃), S« 1 - 14 (Elsevier, New York, 1976), und Dayhoff, M. 0_e, Atlas of Protein Sequence and Strukture, 5, Erg* 2, S, 120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D« C, 1976)* Wird die doppelsträngige cONS mit 800 Basenpaaren nach der vorstehend beschriebenen elektrophoretischen Isolierung analog mit Hhal-Endonuclease behandelt, so erhält man unter den Hauptspaltprodukten zwei Fragmente, die in der Länge den Fragmenten A und B entsprechen*

Da die Ratten-Waehstumshorrnon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren nicht unter Rückgriff auf· die Behandlung mit Restriktions- Endonuclease gereinigt wurde, mußte die DNS zwecks Entfernung ungepaarter einsträngiger Enden behandelt vverden_e In der Praxis -entfernt man diese ungepaarten Enden vor aer elektrophoretischen Trennung in 25 ,ul 60 mlA Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl₉, 10 mH ß-Merkeptoothanol, 1 mM ATP und 200 ,uM von jedem der Nucleotide dATP, dTTP, dGTP und dCTP_e Das Gemisch wurde mit einer Einheit C_rt ccli DNS-Polymerase I bei 10 C 10 Min« inkubiert, um alle hervortretenden 3¹-Enden zu entfernen und alle hervortretenden 5^!-Enden aufzu~ füllen« DNS-Polymarase I-ist ein handelsübliches Produkt (ßpehringer-Mannheim Bicchamicals, Indianapolis, Indiana)».

β,

29» 8* 80 GZ 57 941 18

- 49 -

An die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren wurden chemisch synthetisierte Hind-IIl-Bindeglieder nach der Vorschrift von Beispiel 3 addierte Das Plasmid pBR-322 mit einem Ampicillin-Resistenzgen und einer einzigen Hind-III-Stelle im Tetracyclin-Resistenzgen wurde mit Hind-III-Endonuclease und alkalischer Phosphatase nach der Vorschrift von Beispiel 4 vorbehandelt« Das so behandelte Plasmid wurde mit oer Ratten-Wachstunishormon-cDNS mit den 800 Basen» paaren in einer DNS-Ligase-Reaktion gemäß Beispiel 3 kombiniert* Das Gemisch zur Ligase-Reaktion wurde zur Transfermierung einer Suspension von E_e~coli~X~:L776-Zellen, die gemäß Beispiel 3 behandelt worden waren, verwendet« Die re~ kombinierten Kolonien wurden auf Grund ihres Wachstums auf Ampicillin enthaltende Nährplatten und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 ,ug/ml Tetracyclin ausgesondert» 10 derartiger Kolonien wurden erhalten, die das Plasmid mit einer Insertion von 800 Basenpaaren enthielten« Die Freisetzung erfolgte durch Hind-III-Spaltung«

Die Ratten-Wachstumshormon-DNS (RGH-DNS) mit 800 Basenpaaren wurde in präparativen Mengen aus dem rekombinierten Klon 'pRGH-1 isoliert, und die Nucleotidsequenz wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, ermittelt«, Die Nucleotidsequenz umfaßte Teile der 5'°untranslatierten Region des Ratten-Wachstumshormons und eine Sequenz von 26 Aminosäuren, die im Proteinvorläufer des Wachstumshormons vor der Sekretion gefunden wird» Die aus der Gen-Sequenz gefolgerte mRN3-Se~. quenz zeigt folgende Tabelle 3_e Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt gut überein (mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8) mit aer Teilsequenz des Ratten-Wachstumshormons gemäß Wallis und.Daviss_s loc_e cit_t/ die die Reste 1 - 43,

ta

29# 8_β 80 GZ 57 941 18

65 - 69, 108 - 113, 133 - 143 und 150 - 190 aufweist, Tabelle 3

DNS-Nucleotidsequenz eines Stranges, der die gesamte Ratten-Wachstumshormon codierende Sequenz enthalte Die entsprechenden Aminosäuren werden, zusammen mit ihrer Stellungsnummer in bezug auf das Amino-Ende aufgeführte Negativ bezifferte Aminosäuren entsprechen der Sequenz von Pro-Wachstumshormon· Die entsprechende mRNS-Sequenz ist die gleiche, lediglich wird in der mRNS T durch LJ ersetzt;

29* 8_β 80 GZ 57 941 18

Tabelle 3

• . Met Ala Ala

5·—GTGGACAGATCACTGAGTGGCG ATG CCT CCA

Trp Pro Gin GIu Ala GIy Ala Leu Pro Ala Met Pro Leu Ser TGG CCT CM GAG CCT GGT GCT TTA CCT GCC ATG CCC TTC TCC

Ala Ala Asp Thr Tyr.Lye GIu Phe Glu Arg Ala, Tyr lie Pro CCT CCT CAC AGC TAC AAA GAG TTC GAG CGT CCC TAG ATT CCC

60 Ser Glu Thr He Pro Ala Pro Thr Gly Lys Glu Glu Ala Gin

TCA GAG ACC ATC CCA GCC CCC ACC GGC AAG GAG GAG CCC CAG

Ser Trp Leu Gly Pro VaI Gin Phe Leu Ser Arg He Phe Thr TCA TGG CTG CGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGG ATC TTT ACC

120 AsP Leu Glu Glu Gly He Gin AIa Leu Met Gin Glu Leu Glu'

GAC CTG GAA CAC GCC ATC CAG CCT CTG ATG CAG GAG CTG GAA

Phe Asp Ala Asn Met Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn TTT GAC CCC AAC ATG CCC AGC GAT GAC GCT CTG CTC AAA AAC

ISO Tyr Leu Arg VaI Met Lys Cys Arg Arg Phe AIa Glu Ser Ser

TAG CTG CGG CTC ATG AAC TGT CGC CGC TTT CCG GAA ACC ACC CTGCCAACTGCCACCCCTACACTTTGTCCTAATAAAATTAATGATGCATCATATC

29* 8. 80 GZ 57 941 13

(Fortsetzung)

Asp Ser CIn Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu Cys CAC TCT CAG ACT CCC TGG CTC CTG ACC TTC AGC CTG CTC TCC

'20

eer Leu Phe AIa Asn Ala VaI Leu Arg Ala Gin His Leu His ACT CUG TTT CCC AAT GCT GTG CTC CCA CCC CAG CAC CTG CAC

40 .

GIu GIy Gin Arg Tyr Ser lie Gin Asn Ala Gin Ala Ala Phe CAG GGA CAC CGC TAT TCC ATT CAG AAT GCC CAG GCT GCT TTC

8o GIn Arg Thr Asp Met Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu CaG AgA ACT GAC ATG GAA TTG CTT CGC TTC TCG CTC CTG CTC

100 Ash Ser Leu Met Phe GIy Thr Ser Asp Arg VaI Tyr Glu Lye AAC AGC CTG ATG TTT GGT ACC TCG GAC CGC GTC TAT GAG AAA

140 Asp GIy Ser Pro Arg JIe 'GIy Gin He Leu Lys GIn Thr Tyr GAC GGCAGC CCC CGT ATT GGG CAG ATC GTC AAG CAA ACC TAT

160 Tyr GIy Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu Hie Lys AIa TAT GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC AAG CCA

Cyβ Ala Phe

TGT GCT TTC TAG GCACAGAGTGGTGTCTCTGCGGCACTCCCCCGTTACCGC

poly(A) — 3'

Leu Leu CTG CTG

GIn Leu GAG CTG

Cys Phe TCC TTC

He GIn ATC CAG

Leu Lys CTG AAG

Asp Lys GAC AAG

GIu Thr GAG ACC

29» 8,

GZ 57 941

- 53 -

(Fortsetzung)

CTGTACT

29» 8, 80 GZ 57 941 18

Die Isolierung von menschlicher Wacheturnshormon-mRNS erfolgt im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 7, lediglich ist das biologische Ausgangsmaterial menschliches Hypo·» physentumorgewebe«, Fünf benigne Hypophysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren, und von denen jeder-0,4 bis 1,5 g wog'* wurden in 4molarer Gunidiniumthiocyanat-Lösung die an Merkaptoethanol Imolar und auf pH 5,0 gepuffert worden war, bei 4 ⁰C aufgetaut und homogenisiert* Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7molare Cäsiumchloridlösung, die 100 mmöl Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschieh» tet und 18 Std« bei 37 000 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beckraann-Ultrazentrifuge bei 15 C zentrifugiert» Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenrohres* Die weitere Reinigung mit einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose-Gradientensedimentation erfolgte wie in den Beispielen 1, 2 und 3r Etwa 10 % ö.er so isolierten RNS codierten Wachstumshormon, wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers in Niederschlags- material aus Antiwachsturnshorraon in einem zellfreien Translationssystein aus Weizönkeimen; vergleiche Roberts, B* E. und Patterson, B_e H, , Proc« N-at_e Äcad* Sei« USA /Ό, 2330 (1973)«. Die Herstellung der cDM8"von menschlichem. Wachstumshormon erfolgt im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben« Die cDNS wird durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, und das zu einer etwa SOO Nucleotiden Lange entsprechenden Stellung wandernde Material wird zur Klarierung ausgewählt* Diese Fraktion wird mit DNS-Polyraerase 1, wie in Beispiel 6 beschrieben, behandelt,' dann erfolgt End-Addition der Hind-

29* S* 80 GZ 57 941 18

ΣΙΪ-Bindeglieder« Die cDNS wird dann mit dem mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasrnid pBR-322 und DNS-Ligase rekombinierte Mit der rekombiriierten DNS wird E₀ coli.X-1776 transformiert, und ein die Wachstumshormon-DNS enthaltender Stamm wird ausgewählt» Dieser Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet, die DNS wird daraus isoliert, und ihre Nucleotidseque'nz wird bestimmt _e Die klonierte Sn/achstumshormon~DNS enthält die die gesamte Aminosäuresequenz den menschlichen Wachstumshormons codierenden Nucleotide* Die ersten 23 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons sind

Io HpN-P^e-Pr o~Thr-lie-Pro-Leu» Se r-Arg-Leu-Ph e» Asp-Asn-Ala-Met-

20 Leu~Arg-Ala~His-Arg-Leu-His~Gln-Leu-_e

Die restliche Sequenz zeigt die Tabelle 4%

Tabelle 4 ' " .

Nucleotidsequenz eines Stranges von menschlicher Wachstumshormon-DNS« Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons, beginnend am Am'ino~Ende* Die DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für menschliches Wachstumshormon, lediglich ersetzt in der fliRNS- U das T» '

29c S₃ 80 GZ 57 941 18

Tabelle 4

24 34

Ala Phe Asp Thr Tyr Gin GIu Phe GIu GIu Ala Tyr

G. GCC TTT GAC ACC TAG CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT

60 Thr Ser Leu Cys Phe Ser GIu Ser He Pro Thr pro Ser ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCG TCC

80 Arg lie Ser Leu Leu Leu lie Gin Ser Trp Leu GIu Pro CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC

GIy Ala Ser Asp Ser Asn VaI Tyr Asp Leu Leu Lys Asp GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC. CTA AAG GAC

140 GIy Ser· Pro Arg Thr GIy Gin He Phe Lys Gin Thr Tyr CCC AGC CCC CCG ACT GGG GAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC

160 Lys Asn Tyr GIy Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Ar>p Met CAAG AAC TAC CCG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG CAC ATG

191 Vai GIu GIy Ser Cys GIy Phe

CTG CAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTCCCCGGGTGGCATCCCT

I I?

29, 8, 80 GZ 57 941 18

- 57 -

Tabello 4 (Fortsetzung)

He Pro Lys GIu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin ATC CCA AAG CAA CAG MG TAT TCA TTC CTG CAG AÄC CCC CAG

Asn Asg GLu Glu Thr Gin GIn Lys Ser Asn Leu GIu Leu Leu AAC AGG GAG CM ACA CAA CAG ΑΛΑ TCC AAC CTA. GAG CTG CTC

100

VaI Gin Phe Leu Arg Ser VaI Phe AIa Asn Asn Leu VaI ιyr GTG CAG TTC CTC AGG AGT CTC TTC GCC AAC AAC CTG CTG TAC

120 Leu GIu GIu Gly He Gin Thr Leu Met GIy Arg Leu Glu Asp CTA GAG CAA GCC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAC

Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn His Asp Ala Leu Leu AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC CAT CAC TCA CTA CTC

180 Asp Lys VaI Glu Thr Phe Leu Arg He VaI Gin Cys Arg Ser GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TCC CGC TCT

TGACCCCTCCCCACTGCCTCTCCTGGCC --·

3'

. £ £ 4 &<& έ , _{GZ 57 941 18}

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es erstmalig möglich, eine für ein spezifisches reguiatorisches Protein eines höheren Organismus,·wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, codierende Nucleotidsequenz zu isolieren, ferner kann der Transfer der darin enthaltenen genetischen Information in einem Mikroorganismus ausgeführt werden in welchem die unbegrenzte Replikation möglich ist* Das offenbarte Verfahren kann auf die Isolierung und Reinigung des menschlichen Insulingens und seinen Transfer in einen Mikroorganismus angewandt werden« Ebenso kann menschliches Wachstumshormongen und können andere Proteingene isoliert., transferiert und in einem Mikroorganismus repliziert werden« Offenbart werden einige neue rekombinierte Plasmide, die in ihrer Nucleotideequcnz eine Struktur aufweisen, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus erhalten wurde« Offenbart werden neue Mikroorganismen, die abgewandelt sind, so daß sie eine Nucleotidsequenz enthalten, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist« Die Beispiele illustrieren die Erfindung am Transfer von Ratten-Gen für Proinsulin I in einen Stamm von Escherichia coli und am Transfer von Ratten-Gen für Wachstumshormon an einem Stamm von E_f coli» Die Sequenz des Hauptstücks des transferierten Gens wurde in jedem Fall ermittelt, wobei festgestellt wurde, da& sie die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I bzw«. Ratten-Wachstumshormon codiert*

Der hier beschriebene Mikroorganismus wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 3.1392 hinterlegte Weiterhin wurde dos Piasmid enthaltende Ratten-Insulingen, das unabhängig auf andere Mikroorganismen-Stämme übertrogen werden kann, unter der Hinterlegungsnummer 40003 bei der ATCC hinterlegte

Claims (1)

1. _Λ - « ^{29e 8β 80}

   2k4 Z6?. . · GZ 57 941 18

   . - 59 -

   le Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz, gekennzeichnet dadurch, daß man

   (a) Hypophysenzellen, die-Wachstumshormon codierende nRNS enthalten, isoliert,

   (b) die mRNS aus den Hypophysenzellen extrahiert in Gegenwart eines RNase-Inhibitors, wodurch der RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,

   (c) die von Protein, DNS und anderer RNS irn wesentlichen freie mRNS isoliert,

   (d) eine doppelsträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz besitzt., wobei man eine cDNS mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz erhält,

   (e) einen DNS-Transfer-Vektor bereitstellt, der zur Bindung miteinander oder mit doppelsträngiger cDNS befähigte reaktionsfähige Enden besitzt, und

   (f) den DNS-Transfer-Vektor mit der doppelst rängigen cDNS mit einer Wachstumshormon codierenden Nucleotidsequenz verbindet«,

   2_e Verfahren nach Punkt l_f gekennzeichnet dadurch, daß man einen RNase-Inhibitor verwendet, der ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält».

   29ο 8« 80 GZ 57 941 13

   3« Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als chaotropes Kation Guanidiniumion und als chaotropes Anion Thiocyanation verwendet»

   '4* Verfahren nach Punkt 2_f gekennzeichnet dadurch, daß man eis Diaulfidbindungen spaltendes Mittel ß-Merkaptoethanol verwendet«.

   Os Verfahren nach Punkt 1₍ gekennzeichnet dadurch, daß man als RNase-Inhibitor 4-molares Guanidiniumthiocyanat und 0,2-molares ß-Merkaptoethanol verwendete

   6« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die reaktionsfähigen Enden besitzenden DNS-Moleküle- in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Ver-. .knüpfung miteinander gehindert wird_t wobei das Verfahren darin besteht, daß man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5'~terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und die DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehan™ delten reaktionsfähigen Enden'zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine Verbindung zwischen den Enden herstellende Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten Enden f die in der Ligase-katalysier-ten Reaktion nicht miteinander verbunden werden,

   7« Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch» daß man .zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische. Phosphatase verwendet« . . '

   29« 8. 80 GZ. 57 941 18

   8« Vorfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die zu verbindenden DNS-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktions-iHndonuclease behandelter PlasmId-DNS und nicht-plasmider linearer DNS bestehen und der zur Behandlung bestimmte Teil die Plasmid-DN3 enthält, so daß die End-sn-Ende-Verknüpfung der DNS ohne Neukombinatxon mit der nicht-plasmdden DNS verhindert wird«