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Die Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein enthält, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer dieser DNS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DNS erfolgt. Inbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Insulin-Gen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehören ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält.
Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet :
DNS = Desoxyribonukleinsäure
RNS = Ribonukleinsäure cDNS = komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz) mRNS = messenger-RNS tRNS = transfer-RNS dATP = Deoxyadenosintriphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat . A = Adenin
T = Thymin
G = Guanin C = Cytosin
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2-Amino-2-hydroxyäthyl-1, 3-propandiolATP = Adenosintriphosphat
TTP = Thymidintriphosphat
Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information.
Es ist bekannt, dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt. Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schliesslich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.
Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.
Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.
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Genetischer Code
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<tb>
<tb> Phenylalanin <SEP> (Phe) <SEP> TTK <SEP> Histidin <SEP> (His) <SEP> CAK
<tb> Leucin <SEP> (Leu) <SEP> XTY <SEP> Glutamin <SEP> (Gln) <SEP> CAJ
<tb> Isoleucin <SEP> (Ile) <SEP> ATM <SEP> Asparagin <SEP> (Asn) <SEP> AAK
<tb> Methionin <SEP> (Met) <SEP> ATG <SEP> Lysin <SEP> (Lys) <SEP> AAJ
<tb> Valin <SEP> (Val) <SEP> GTL <SEP> Asparaginsäure <SEP> (Asp) <SEP> GAK
<tb> Serin <SEP> (Ser) <SEP> ORS <SEP> Glutaminsäure <SEP> (Glu) <SEP> CAJ
<tb> Prolin <SEP> (Pro) <SEP> CCL <SEP> Cystein <SEP> (Cys) <SEP> TGK
<tb> Threonin <SEP> (Thr) <SEP> ACL <SEP> Tryptophan <SEP> (Try) <SEP> TGG
<tb> Alanin <SEP> (Ala) <SEP> GCL <SEP> Arginin <SEP> (Arg) <SEP> WGZ
<tb> Tyrosin <SEP> (Tyr) <SEP> TAK <SEP> Glycin <SEP> (Gly) <SEP> GGL
<tb> Terminationssignal <SEP> TAJ
<tb> Terminationssignal <SEP> TGA
<tb>
Schlüssel :
Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden :
A = Adenin
G = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin
X = T oder C, falls Y = A oder G X = C, falls Y = C oder T.
Y = A, G, C oder T, falls X = C Y = A oder G, falls X = T W = C oder A, falls Z = A oder G W = C, falls Z = C oder T
Z = A, G, C oder T, falls W = C Z = A oder G, falls W = A
QR = TC, falls S = A, G, C oder T
QR = AG, falls S = T oder C S = A, G, C oder T, falls QR = TC S = T oder C, falls QR = AG J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G M = A, C oder T
Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription.
In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose an Stelle der Desoxyribose und Uracil an Stelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär.
Diese RNS wird als messenger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle.
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F.,Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden ; vgl.
Aviv, H., und Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972), und Efstratiadis, A., Kafatos, F. C., Maxam, A. F. und Maniais, T., Cell. 7, 279 (1976).
Restriktions-Endonueleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Stranges gespalten wird.
Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt.
Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restriktions-Endonuclease bezeichnet. Restriktions-Endonueleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nucleotidsequenz und die Erkennungsstellen wurden ermittelt. Einige Restriktions-Endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden.
Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit andern, ähnlich erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen ; vgl. Roberts, R. J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Die Erkennungsstellen sind relativ rar, jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restriktions-Endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen. Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segment gekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restriktions-oligo-nucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restriktions-Endo-
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;Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger
DNS oder einsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist ; vgl. Vogt, V. M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).
DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei
DNS-Segmenten mit einem 5'-Phosphat bzw. einem 3'-Hydroxyl bewirkt, die z. B. von zwei
DNS-Fragmenten gebildet werden, die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale
Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppelsträngigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind ; vgl. Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 67, 1468 (1970).
Alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbindungen, einschliesslich der S'-terminalen Phosphatgruppen in DNS, hydrolysiert.
Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments in einen DNS-Vektor, z. B. ein Plasmid. Als Plasmid bezeichnet man jede autonom DNS-replizierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasmid ist mit den Chromosomen der Wirtszelle nicht genetisch verbunden. Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren sind doppelsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Grössenordnung einiger Millionen, obgleich bei einigen das Molekulargewicht grösser als 108 ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS lässt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle auf Grund des grossen Grössenunterschiedes abtrennen.
Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwin-
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digkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflusst werden.
Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg ein DNS-Seg- ment in das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertes Plasmid mit vergrösserter Molekülgrösse entsteht, ohne dass seine Fähigkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können, z. B. Gene der Arzneimittelresistenz.
Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen im einzelnen beschrieben. Das Insulin wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der Sicht der Grundlagen- forschung. Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die
Isolierung von Insulin-Gen aus andern Organismen, einschliesslich Menschen, übertragen werden.
Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert. Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur
Behandlung von Diabetes verwendet. Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von
Rindern und Schweinen als Insulinquelle, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Ausserdem entwickeln einige Diabetiker eine allergi- sche Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsulin. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äussert erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte
Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur Einführung des Insulin-Gens in Bakterien vorlag. Die Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.
Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man z. B. ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer insulin- ähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden.
Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie z. B. ein Bakterium eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder zum Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von erfindungsgemäss verlängerten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur nomalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich z.
B. die Möglichkeit zum Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemässen Mikroorganismen und Menschen mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten, wobei die auf erfindungsgemässe Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetische Information enthaltenden Nucleotidsequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirts-Mikroorganismus.
Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Strukturgens für Ratten-Pre-proinsulin.
Danach kann davon ausgegangen werden, dass die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus, wie z. B. eines Wirbeltieres, auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist. Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschliesslich z. B. der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschliesslich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören. Unter einem Mikroorganismus versteht man jeden mikroskopischen lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und z. B. aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliesslich Hefen, bestehen
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kann.
Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von reverser
Transcriptase unterworfen, wobei dieser Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplemen- tären (cDNS)-Stranges erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphosphate erfolgt. Das Produkt dieser ersten Reaktion mit reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt.
Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur
Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende
Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den
Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultie- rende doppelsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man an beiden Enden eine spezifische
DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungs- bzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist.
Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer
Restriktions-Endonuclease behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbstkomplementäre einsträngige Enden entstehen.
Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-endonuclease wird mit dies'em Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbstkomplementäre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5'-Enden zu erzeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur
Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen geschlossenen Ringes aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird.
Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht.
Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal, wie z. B. Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterien- stämme, die das rekombinierte Plasmid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet, und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend reisoliert. Auf diese Weise können grosse Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, worauf man die spezifische cDNS-Sequenz durch endonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.
Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich dem Menschen, und deren Transfer in einen Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die Insulin codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.
Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden :
1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus
Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert : die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst und eine RNS-Übersetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die U. S. A. vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vgl.
US-Federal Register, Bd. 41, Nr. 131,
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der Isolierung der spezifischen mRNS, die die Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte
Protein codiert. Auf diese Weise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil zie- hen aus der Tatsache, dass in hochdifferenzierten Organismen, wie den Wirbeltieren, die Identifizie- rung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche
Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen.
In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der
Isolierung angewendete Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.
In den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig
Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen : die Absonderung der
Zellen vom Bindegewebe und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen andern im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorgesehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar. So wird z.
B. die Isolierung von
Langerhans'schen Inseln aus Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender mRNS geeignet sind, beschrieben.
Insulin produzierende Zellen können auch aus andern Quellen stammen, z. B. aus der Bauchspeicheldrüse von Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen. Die Isolierung reiner Inselzellen ist in diesen Fällen wesentlich einfacher, insbesondere bei Verwendung reiner Zellkulturen.
In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Inselzellen nicht erforderlich, doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil.
Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann z. B. die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz.
2. Extraktion der mRNS
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS ist ein einsträngiges Polynucleotid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher das gesamte Molekül für den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbreitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien.
Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar. Die überraschende Wirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.
Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewendet werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein.
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Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihrer Verwendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus isolierten Langerhans'schen Inseln aus Ratten-Pankreas beschrieben.
Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässerigen
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sind z. B. das Jodid, Perchlorat, Thiocyanat-, Dijodsalicylation u. dgl. Die Wirksamkeit von
Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist z. B. Lithium-dijodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0, 1 M, ausserdem ist es relativ teuer. Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt im Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und in wässerigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa 5molaren Lösungen.
Thiolverbindungen wie das ss-Mercaptoäthanol spalten bekanntlich intramolekulare Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulfid-Austauschreaktion. Zahlreiche Thiolverbindungen sind in dieser Richtung wirksam, z. B. ss-Mercaptoäthanol, Dithiothreit, Cystein, Propanoldimercaptan u. dgl. Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ss-Mercaptoäthanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt.
Bei der Inhibierung der RNase während der RNS-Extraktion aus Zellen oder Geweben ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemässen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion beruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmass der Denaturierung. Dies erklärt möglicherweise die Überlegenheit des Guanidiniumthiocyanats gegenüber dem Hydrochlorid, trotz der Tatsache, dass das Hydrochlorid als Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird.
Anderseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels
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stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein Vielfaches schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierung und mRNS-Konfiguration während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Erfindung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, dass das bevorzugte Denaturierungsmittel ein solches wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt.
Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdijodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres Denaturierungsmittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugung von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist.
Die Verwendng eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese Weise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhindert, die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidbindungen intakt bleiben. Ferner wird jene im mRNS-Präparat zurückbleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiol.
Disulfidbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jeder Konzentration in gewissem Ausmass wirksam, doch wird im allgemeinen ein grosser Überschuss an Thiolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen bevorzugt, damit die Gleichgewichsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft. Anderseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelrie-
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chend und unangenehm bei hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so dass für die Praxis eine obere Konzentrationsgrenze entsteht. Beim ss-Mercaptoäthanol erwiesen sich Konzentrationen im Bereich von 0, 05 bis 1, 0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0, 2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet.
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abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind.
Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Äthanol, bei dem die RNS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäss die Ausfällstufe umgangen und das Homogenisat direkt auf eine 5, 7molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgt ; vgl. die Beschreibung von Glisin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C., Biochemistry 13,2633 (1974). Diese Methode wird bevorzugt, dass sie stetig eine für RNase ungünstige Umgebung aufrechterhält, so dass man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt.
Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat.
Nur ein Teil dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, dass in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transkription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure. Derartige mRNS mit daran gebundenen Poly-A-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die Oligoäthymidylat gebunden ist, s. Aviv, H., und Leder, P., loc. cit. Die vostehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind. Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig ihres Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher Weise ausgeführt werden.
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RNase-Inhibierung nicht erforderlich ist.
In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNase-Aktivität ausreichen.
3. Bildung der cDNS
Die Zeichung ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werden könnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Stranges auf Grund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist. Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei man die mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosid-triphosphate als Vorläufer des DNS-Stranges einsetzt. Zweckmässig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate in a -Stellung mit 32 P markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, z.
B. durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können ; vgl. Efstratiadis, A., et al., loc. cit. Wie aus der Zeichnung ersichtlich, erhält man als Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase eine doppelsträngige Haarnadelform mit nichtcovalenter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DNS-Strang.
Das Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Zweckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und Ausfällung mit Äthanol.
Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt werden.
Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt. Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch PH-Einstellung leicht gesteuert werden kann.
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Die Synthese einer doppelsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, z. B. mit DNS-Polymerase oder reverser Transcriptase.
Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der
Verwendung eines in a -Stellung mit 32 P markierten Nucleosid-triphosphats. Die reverse Transcrip- tase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, z. B. aus Vogel-Myeloblastosisvirus (das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es gemäss einem
Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).
Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reak- tionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatogra- phieren an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und Ausfällung mit Äthanol zur Reini- gung des DNS-Produktes und Befreiung von verunreinigendem Protein verwenden.
Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppelsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische hydrolytische
Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die
Sl-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart,
Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Äthanol erfolgen wie vorstehend beschrieben.
Die Verwendung von reverser Transcriptase'und Sl-Nuclease bei Synthesen doppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis et al., loc. cit., beschrieben.
Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekülen mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate.
Die Kombination von Exonuclease- und Polymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender 3'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5'-Enden.
Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüp- fungsreaktionen sichergestellt.
Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produktes derart, dass geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-
Endonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-Endonuclease ausgewählt, und diese Wahl basiert wieder auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die cDNS zu rekombinieren ist. Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-Endonuclease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt z. B. eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind III.
Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H. O., und Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51,379 (1970), gereinigt. Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton, J. H., Edgell, M. H., und Hutchinson III, C. A., J. Virol.
10,42 (1972), gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet.
Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelstranges.
Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in der Zeichnung dargestellte Sequenz, vgl.
Heyneker, H. L., et al. und Scheller, R. H., et al., loc. cit. Verschiedene solcher synthetischer Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen.
Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemistry 12,5045 (1973), gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc. cit., beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung
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einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuc1ease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III-Er- kennungssequenz an jedem Ende.
Die Behandlung des Reaktionsprodukts mit Hind III-Endonuclease führt zur Spaltung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komple- mentärer 5'-Enden, s. Zeichnung.
4. Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors
Im Prinzip kann eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene Weise hergestellten cDNS verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen bestehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health.
Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Kommittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vekto-
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dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt.
Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, dass sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von col EI gehören die Plasmide pMB9, die das Gen für Tetracyclinresistenz tragen, und pBR313, pBR315, pBR316, pBR317 und pBR322, die ausser dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Ampicillinresistenz besitzen.
Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col EI verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen eine Hind III-Erkennungsstelle besass.
Wie beim Plasmid kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde. Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind ; vgl. Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol. 30,507 (1976). E. coli RR-1 kann verwendet werden, wenn P3-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, einschliesslich Protisten und anderer Bakterien, z. B. Hefen.
Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher
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dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkulieren.
Die anschliessend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.
Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewendet. Hiebei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5'-terminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis
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ein.
Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt :
Tabelle 1
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<tb>
<tb> Fall <SEP> Reaktionsteilnehmer <SEP> Ligase-Produkt
<tb> I <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3' <SEP> 5'
<tb> OH <SEP> H2O3PO <SEP> O-P-O
<tb> + <SEP> + <SEP> 2 <SEP> H2O
<tb> OPO3 <SEP> H2 <SEP> HO <SEP> O-P-O
<tb> 5' <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3'
<tb> II <SEP> 3'5'3'5'
<tb> OH <SEP> H, <SEP> 0 <SEP> 3PO <SEP> 0-P-O--- <SEP>
<tb> +'"+H. <SEP> O <SEP>
<tb> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> HO <SEP>
<tb> 5' <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3'
<tb> III <SEP> 3'5'
<tb> OH <SEP> HO <SEP>
<tb> + <SEP> keine <SEP> Reaktion
<tb> OH <SEP> HO <SEP>
<tb>
In Tabelle 1 wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wiedergegeben, wobei die 5'- und 3'-Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen.
im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden. Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale S'-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, dass eine einsträngige covalente Bindung erfolgt, während im andern Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nichtcovalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül auf Grund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall III
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reaktion eintreten kann.
Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende
Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5'-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische
Phosphatase katalysierte Hydrolyse.
Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Mole- kül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonsti- tuiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die Ende-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vgl. Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Sci. USA 67,1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli erhaltene Ligase verwenden, vgl. Modrich, P., und
Lehman, I. R., J. Biol. Chem. 245,3626 (1970).
Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen
Unterfragmenten wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falscher Sequenz verhütet. Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Fragments homogener
Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5'-terminalen Phosphatgruppen der cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur
Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphatgruppe können daher nicht covalent gebunden werden.
Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 5'-Phosphatgruppe besitzen.
Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, d. h. hinten-an-vorn statt vorn-an-hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung werden nicht verhindert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.
Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Ratteninsulin codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen gewonnene neukombinierte Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder Hsu I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt, und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, A. M., und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74,560 (1977), ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Proinsulin I und 13 von 23 Aminosäuren der Prepeptid-Sequenz. Eine Zusammenstellung der Nucleotidsequenz dieser Region wird nachstehend dargestellt.
Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten.
Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Ratten-Insulingen in E. coli. In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide charakterisiert, die Teil von Ratten-Insulingen und
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menschlichem Insulingen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen.
Beispiel 1
Zur Herstellung von gereinigten Ratten-Inselzellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit Hank'scher Salzlösung infundiert durch rückläufige Infusion in den Pankreasausgang. Die Hank'sche Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Standardlösung. Dann wird die Bauchspeicheldrüse entfernt, in Hank'scher Lösung von OC zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Inhibitor verdaut. Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4 C, falls nichts anderes angegeben. Die Bedingungen bei der Verdauung sind äusserst kritisch. Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hank'scher Lösung werden in ein 30 ml-Glasrohr gefüllt. Alle Glasteile waren mit Silikon behandelt worden.
Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenase, ein aus Clostridium histolyticum erhaltenes Enzym (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl, I., Mackeman, J. D., und Howes, E. L., J. Clin. Invest. 32,1323 (1943), - Typ CLS IV, Hersteller Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, und 1 mg Sojabohnentrypsin-Inhibitor, Hersteller Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri.
Die Inkubation erfolgte bei 37 C während 25 min unter Schütteln mit 90 Bewegungen pro Minute.
Ständige Beobachtung war erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kollagenase-Verdauung in optimalem Ausmass verlief. Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt, bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung. Nach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 min bei 200 x G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Kuchen wurde mit Hank'scher Lösung gewaschen ; dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde der Kuchen in 15 ml eines synthetischen Polysaccharides mit der Dichte 1, 085 suspendiert. Eine Schicht von 8 ml synthetischem Polysaccharid der Dichte 1, 080 wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml synthetischem Polysaccharid der Dichte 1, 060, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 min bei 500 xG und dann 5 min bei 2000x G zentrifugiert.
Die Acinar-Zellen blieben am Boden, die Inselzellen stiegen im Gradienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten. Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe. Grosse Verunreinigungsfragmente wurden vom Schichtmaterial entfernt. Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikropipette befreit. Das Zellpräparat wurde dann in Hank'scher Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Zellkuchen wurde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.
Die von 200 Ratten zusammengefassten Inselzellen wurden in 4molarer Guanidiniumthiocyanat-
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essigsäure enthielt, überschichtet und 18 h bei 37 Umdr/min im Rotor SW 50, 1 einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 15 C zentrifugiert. Dabei wandert die RNS zum Boden des Zentrifugierröhrchens.
Polyadenylierte RNS wurde durch Chromatographieren des RNS-Gesamtpräparates an Oligo (dT)Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H., und Leder, P., loc. cit., isoliert.
Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhans'schen Inseln von Ratten in cDNS wurde reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (erhalten von Life Science Inc., St. Petersburg, Florida) verwendet. Die Reaktionen wurden in 50 mMol Tris-HCl,
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3,NaCl, 2 mMol EDTA chromatographiert. Die eluierte Nukleinsäure wurde nach Zusatz von Ammoniumacetat (PH 6, 0 bis 0, 25 Mol) mit Äthanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Kuchen wurde in 50 il frisch zubereiteter O. lmolarer Natriumhydroxydlösung gelöst und
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und Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, D. P. Wierlich, W. J. Rutter und C. F.
Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976), S. 471-477] wurde an der Hind III-Erkennungsstelle mit Hsu I-Endonuclease gespalten, dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0, 1 Einheithlg DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 25 mMol Tris-HCl für PH 8 30 min bei 25 C inkubiert, dann erfolgt Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase. Nach der Ausfällung mit Äthanol wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS zu cDNS zugegeben, die zu Hind III kohäsive Enden besass, u. zw. in
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50 Einheiten/ml T4 DNS-Ligase inkubiert.
Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Transformation vorbereitet waren :
Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von etwa 2 x 10 Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, das 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid, 2 mMol NaOH, 100 I1g/ml Diaminopimelinsäure und 40 I1g/ml Thymin enthielt und 37 C zeigte. Die Zellen wurden durch fünfminütiges Zentrifugieren unter 5000xG bei 5 C gesammelt, in 20 ml kalter 10 mmolarer Natriumchloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suspen-
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ten Bedingungen auf Agarplatten übertragen.
Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit 5 I1g/ml Tetracyclin bei Transformation mit dem Hind III-Produkt. Es wurde eine als pAU-1 bezeichnete Neukombination isoliert. Rohe Plasmid-Präparate mit 2 bis 5 lig DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit überschüssiger Hsu I-Endonuclease behandelt. Dann wurden 10 mMol EDTA-Na2 und 10% (Gewicht/Volumen) Rohrzukker zugesetzt und das Gemisch wurde an 8% Polyacrylamid-Gel zerlegt. Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Basenpaare Länge gefunden. In einem ähnlichen Versuch wurde als Transfer-Vektor das Plasmid pBR322 verwendet. Sämtliche Bedingungen blieben wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekombinierten Klone erfolgte auf 20 I1g/ml Ampicillin enthaltenden Platten.
Beispiel 5
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und dem Enzym Polynucelotidkinase unter den von Maxam und Gilbert, loc. cit., beschriebenen Bedingungen. Das Enzym katalysiert die Übertragung einer radioaktiven Phosphatgruppe von y- 32 P-ATP. auf die 5'-Enden der DNS. Das Enzym war aus E. coli nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemistry 12,5045 (1973), erhalten worden. Die so markierte DNS wurde mit Hae IIIEndonuclease nach der Vorschrift von Beispiel 2 gespalten, und zwei markierte Fragmente von etwa 265 bzw. 135 Basenpaaren wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen an einem Polyacrylamid-Gel voneinander getrennt. Die isolierten Fragmente wurden spezifischen Spaltungsreaktionen unterworfen, dann erfolgte die Sequenzanalyse nach der Methode von Maxam und Gilbert, loc. cit.
Die Sequenz der folgenden Tabelle 2 bezieht sich auf eine Zusammenstellung der Ergebnisse dieser Versuchsreihen und ähnlicher Versuchsreihen mit cDNS und Plasmid-Vektoren aus col El, wie pMB9 und pBR322. Am 5'-Ende ist eine Sequenz von schätzungsweise 50 bis 120 Nucleotiden Länge unbestimmt und das Poly-dA-Segment am 3'-Ende ist von verschiedener Länge. Diese Sequenz entspricht dem derzeitigen Wissensstand, wobei selbstverständlich weitere Untersuchungen zusätzliche Details eröffnen oder die Notwendigkeit zu geringfügiger Revision einiger Bereiche mit sich bringen können. Die entsprechende Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I beginnt mit der mit 1 bezeichneten Triplett-Stellung und endet mit der mit 86 bezeichneten Triplett-Stellung.
Einige Ungewissheit verbleibt im Hinblick auf die in gestrichelter Linie unterstrichene Sequenz :
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Tabelle 2
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<tb>
<tb> 1
<tb> [unbestimmt] <SEP> -----GCC <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> GTC <SEP> CTC <SEP> TGG <SEP> GAG <SEP> CCC <SEP> AAG <SEP> CCT <SEP> GCT <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> TTT <SEP> GTC <SEP> AAA <SEP> CAG <SEP> CAC <SEP> CTT <SEP> TGT
<tb> 10 <SEP> 20 <SEP> 30
<tb> GGT <SEP> CCT <SEP> CAC <SEP> CTG <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> GCT <SEP> CTG <SEP> TAC <SEP> CTG <SEP> GTG <SEP> TGT <SEP> CGG <SEP> GAA <SEP> CGT <SEP> GGT <SEP> TTC <SEP> TTC <SEP> TAC <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> AAC <SEP> TCC <SEP> CGT <SEP> CGT
<tb> 40 <SEP> 50
<tb> GAA <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> GAC <SEP> CCG <SEP> CAA <SEP> GTG <SEP> CCA <SEP> CAA <SEP> CTG <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> GCT <SEP> GGA <SEP> GGC <SEP> CCG <SEP> GAG <SEP> CCC <SEP> CCG <SEP> GAT <SEP> CTT
<SEP> CAG <SEP> ACC <SEP> TGG <SEP> GCA
<tb> 60 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb> CTG <SEP> GAG <SEP> GTT <SEP> GCC <SEP> CGG <SEP> CAG <SEP> AAT <SEP> CGT <SEP> GGC <SEP> ATT <SEP> GTG <SEP> GAT <SEP> CAG <SEP> TGC <SEP> TGC <SEP> ACC <SEP> AGC <SEP> ATC <SEP> TGC <SEP> TCC <SEP> CTC <SEP> TAC <SEP> CAA <SEP> CTG <SEP> GAG
<tb> 86
<tb> AAC <SEP> TAC <SEP> TGC <SEP> AAC <SEP> TGA <SEP> GTTCAATCAATTCCCGATCCACCCCTCTGCAATGAATAAAGCCTTTGAATGACC-poly <SEP> A
<tb>
mit gestrichelter Linie unterstrichen = Bereiche vorhandener Unsicherheit
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Beispiel 6
Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis 4 isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das einer geeigneten Quelle entstammt, z.
B. einem gespendeten Pankreas oder einem frischen Leichnam oder einem menschlichen Insulinoma. Ein Mikroorganismus wird im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4 erzeugt, mit einer die A- und B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotisequenz. Die bekannte Aminosäuresequenz der A-Kette lautet :
1 10 20 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
Die Aminosäuresequenz der Kette B lautet :
1 10 Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-
20 30
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vgl. Smith, L. F., Diabetes 21 (Erg. 2), 458 (1972).
PATENTANSPRÜCHE : l. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus mit einer Insulin codierenden Nucleotid- sequenz, bei welchem man aus Bauchspeicheldrüsengewebe Inselzellen isoliert, aus den Inselzellen mRNS isoliert, mit dieser mRNS eine cDNS mit Insulin codierender Nucleotidsequenz synthetisiert, diese cDNS mit einem DNS-Transfer-Vektor umsetzt, und das Reaktionsprodukt von cDNS und DNS mit einem Mikroorganismus vermischt, dadurch gekennzeichnet, dass man die mRNS aus den
Inselzellen durch Homogenisieren der Inselzellen in Anwesenheit eines RNase-Inhibitorpräparats isoliert, womit ein Abbau der mRNS durch RNase verhindert wird, und dass man die cDNS dadurch mit dem DNS-Transfer-Vektor umsetzt, indem a)
ein DNS-Transfer-Vektor mittels einer Restriktions-Endonuclease durch Inkubieren eines diese Restriktions-Endonuclease, vorzugsweise Hind III, Hsu I oder Eco
RI, und den Transfer-Vektor enthaltenden Reaktionsgemisches enzymatisch zu einem DNS-Transfer-Vektor hydrolysiert wird, der miteinander oder mit einer eine Insulin codierende Nucleotidsequenz aufweisenden cDNS verknüpfbare reaktions- fähige Enden besitzt, und indem b) dieser Transfer-Vektor und die die Insulin codierende Nucleotidsequenz aufweisende cDNS durch Inkubieren eines DNS-Ligase, ATP, den Transfer-Vektor und die cDNS enthaltenden Reaktionsgemisches enzymatisch miteinander verknüpft werden, womit ein DNS-Transfer-Vektor mit Insulin codierender Nucleotidsequenz erhalten wird.