DE3102721C2 - - Google Patents
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- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene synthetische Gen.
Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieser Erfindung.
Der Anspruch 4 betrifft einen Plasmidvektor, der ein synthetisches Gen
nach Anspruch 1 eingefügt enthält. Der Anspruch 5 betrifft eine Ausgestaltung
des Anspruchs 4. Der Anspruch 6 betrifft eine Zelle, die durch Einfügung
eines Plasmidvektors nach Anspruch 5 transformiert worden ist. Anspruch 7
betrifft die Verwendung einer Zelle gemäß Anspruch 6.
Die Synthese von Peptiden auf chemischem Wege ist ein
umständliches Verfahren, das mit zunehmender Länge des
Peptids in zunehmendem Maße weniger wirksam wird.
Andererseits ändert sich bei der Herstellung von Peptiden
durch Mikroorganismen bei einem Fermentationsverfahren
der Wirkungsgrad nicht relativ zur Länge des
Peptidprodukts. In den bei Rekombinanten-DNS-Verfahren
verwendeten Mikroorganismen sind kurze Peptide jedoch
metabolisch instabil. Es ist beispielsweise bekannt,
daß das Peptid Somatostatin, das aus 14 Aminosäuren
besteht, nicht stabil ist, wenn es direkt in E. coli
gebildet wird. Stabilität wird in diesem Fall erreicht,
indem das Peptid an ein normales E. coli-Protein geknüpft
und dieses Verschmelzungsprodukt anschließend gespalten
wird (K. Itakura et al., Science, 198 [1977], 1056-1063).
Aus "Science", Vol. 198, Seiten 1056 bis 1063, 1977,
ist ein Plasmidvektor bekannt, der an einer Einfügungsstelle,
die einem bakteriellen Promotor benachbart
und abwärts von einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle
liegt, ein synthetisches Gen so eingefügt
enthält, daß das Gen unter bakterielle Promotorkontrolle
ist. Bei diesem Plasmidvektor wird ein synthetisches
Somatostatin-DNA-Fragment so insertiert,
daß es unter der Kontrolle des lac-Promotors, der u. a.
auch eine Ribosomenbindungsstelle trägt, exponiert
werden kann.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden Stabilität und
erhöhte Ausbeute durch Verwendung eines synthetischen
Gens erreicht, das vielfache Wiederholungen der
Sequenz enthält, die für ein gewünschtes kleines Peptid
codiert. Das Produkt ist somit ein großes Molekül, das
in E. coli metabolisch stabiler ist als das kleine Peptid.
Die anschließende Spaltung des großen Moleküls ergibt das
in ihm enthaltene kleinere Peptid in einer molaren Ausbeute,
die höher ist als die Ausbeute, die erzielt würde, wenn das
kleine Peptid direkt unter Verwendung eines monomeren Gens
hergestellt worden wäre, selbst wenn das kleine Peptid
metabolisch stabil wäre.
Die Erfindung betrifft ein
synthetisches Gen, das im Codierungsstrang
Codons für die Aminosäuren eines gewünschten Peptids in
Tandemwiederholung oder -replikation enthält.
Unter dem Ausdruck "Tandemwiederholung" ist in diesem
Zusammenhang die Wiederholung der Sequenz von Codons in
linearem Verlauf längs des DNS-Moleküls mit der gleichen
Polarität und ohne Unterbrechung zu verstehen.
Der komplementäre oder nicht-codierende Strang des synthetischen
Gens enthält eine Sequenz, die durch die Sequenz
des Codierungsstranges gemäß den anerkannten Regeln
der Nucleinsäure-Basenpaaring bestimmt ist.
Das synthetische Gen der Erfindung ist erhältlich nach
einem Verfahren, das durch die Selbstzusammenfügung und
Ligation einer Vielzahl
geeigneter Oligonucleotide gekennzeichnet ist, wobei die
Zusammenfügung unter Ausbildung des Wiederholungscharakters
durch selbstkomplementäre, sich überlappende Enden
an den Endstellen der Gruppe von Oligonucleotiden, die
nach der Zusammenfügung die repetitive Einheit des Gens
bilden, erreicht wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung
einen Plasmidvektor, der an einem Insertionsort, der
einem bakteriellen Promotor benachbart und abwärts
(downstream) von einem prokaryotischen Ribosomenbindungsort
liegt, ein solches synthetisches Gen in einer solchen
Weise eingefügt enthält, daß das Gen sich unter der
Kontrolle des bakteriellen Promotors befindet.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf
eine Zelle gerichtet, die durch Insertion eines solchen
Plasmidvektors in die Zelle transformiert worden ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung
die Verwendung der Zelle zur Expression eines Peptids.
Wie bereits erwähnt, werden die Stränge des synthetischen
Gens aus einer Reihe von kurzen Oligonucleotiden hergestellt,
die selbst durch Verbindung der erforderlichen
Nucleotide nach bekannten Methoden in einer Reihenfolge,
die durch die Codons der Aminosäuren des gewünschten
Peptids und die nachstehend ausführlicher dargelegten
Regeln bestimmt ist, gebildet werden.
Die Oligonucleotide des Codierungsstranges und der komplementäre
Strang des Gens bilden eine sich überlappende
Einheit, die der folgenden allgemeinen Struktur
entspricht:
Die in dieser Abbildung dargestellte Struktur besteht aus
sechs Oligonucleotiden, und zwar je drei in einem Strang.
Die Struktur kann jedoch aus einer beliebigen Zahl von
Paaren von Oligonucleotiden von einem Paar aufwärts
zusammengefügt sein, vorausgesetzt, daß
- 1) die mit a¹ und a², b¹ und b², c¹ und c² . . . bezeichneten Paarregionen Nucleotidbasensequenzen enthalten, die innerhalb eines Paares, aber nicht zu den Sequenzen eines beliebigen anderen Paares komplementär sind,
- 2) jeder dieser Regionen a¹, a², b¹, b², c¹, c² . . . wenigstens vier Nucleotidbasen enthält und
- 3) die Summe der Nucleotidbasen in jedem Strang, der nach der Zusammenfügung schließlich die Replikationslänge des Polymerisats umfaßt, durch drei teilbar ist.
Wenn eine Einheit von Oligonucleotiden dieses Charakters
gemischt wird, hybridisieren die komplementären Regionen
der Oligonucleotidpaare unter Bildung von Strukturen von
hohem Molekulargewicht, in denen die Sequenzen der Oligonucleotide
(in der obigen Darstellung a¹-f¹) sich in
Tandemform von einigen wenigen Malen bis zu vielen Malen
in verschiedenen Molekülen wiederholen. Beim anschließenden
Prozeß ist es zweckmäßig, die Zahl der Polymerisate, die
die Sequenz a¹ an ihren 5′-Enden aufweisen, zu maximieren.
Dies wird erreicht durch Mischen der Oligonucleotide a¹b¹,
c¹d¹, e¹f¹, b²c² und d²e² der vorstehenden Darstellung
in äquimolaren Mengen und anschließende Zufügung des
Oligonucleotids f²a² in weniger als äquimolarer Menge.
Da die Komplemente von a¹ und f¹ in submolaren Mengen vorhanden
sind, enden die meisten Polymerisate in a¹ und f¹.
Im allgemeinen Fall wird das 5′-endständige Oligonucleotid
der komplementären Einheit dem Polymerisationsgemisch in
einer Menge zugesetzt, die weniger als äquimolar in bezug
auf die Oligonucleotide sind, die sämtlich in äquimolaren
Mengen vorhanden sind.
Die "Einschnürungen" in den Ketten, wo benachbarte
Oligonucleotide in der Kette nebeneinander verlaufen,
können durch Verwendung des Enzyms DNS-Ligase (EC 6.5.1.1)
verbunden werden. Dies ist eine bekannte Methode.
Die in dieser Weise hergestellten Moleküle weisen einsträngige
Enden auf. Diese können in die Form des sog. "stumpfen
Endes" durch Verwendung des Enzyms DNS-Polymerase I
(EC 2.7.7.7) nach einer bekannten Methode umgewandelt werden.
Die hierbei erhaltenen Moleküle können in kompetenten
Zellen von Mikroorganismen, insbesondere E. coli, unter
Verwendung eines gewünschten Vektors cloniert werden.
Insbesondere wird ein Plasmidvektor, der aus der sog.
"pWT-Reihe" (siehe beispielsweise Tacon et al., Molec.
Gen. Genet., 177 [1980], 427) ausgewählt ist, verwendet,
wobei die Selektion des Vektors so erfolgt, daß das
synthetische Gen bei Insertion in der richtigen Orientierung
im gewünschten Translations-Leserahmen gelesen
wird.
Fig. 1 veranschaulicht ein Schema für die Herstellung
eines Rekombinantenplasmids (pWT 121 (Asp-Phe) n , das das
repetitive Gen für (Asp-Phe) n in der richtigen DNS-
Phaseneinstellung für die Expression eines
(Asp-Phe) n -Proteins enthält. Das oben im Schema dargestellte
Plasmid DNS wird mit dem Restriktionsenzym Hind III zerschnitten
und dann mit E. coli-DNS-Polymerase I repariert,
wobei ein stumpfendiges Molekül entsteht. Bei dem unten
im Schema dargestellten Polymerisat, das für (Asp-Phe) n
codiert, wird das zunächst hervorragende 5′-Ende in gleicher
Weise repariert, wobei ein weiteres stumpfendiges
Molekül entsteht. Durch Verbindung dieser beiden stumpfendigen
Spezies mit T4-DNS-Ligase entsteht die in der
Mitte des Schemas dargestellte Rekombinanten-DNS mit der
richtigen DNS-Phaseneinstellung für die Expression
von (Asp-Phe) n .
Das Clonieren dieses Gens, die Selektion von Bakterienkolonien,
die Erfassung des Polypeptidprodukts der
Expression des Gens und die Extraktion und Reinigung des
Polypeptids können sämtlich nach bekannten Verfahren
erfolgen.
Dieses Polypeptid kann dann entweder enzymatisch unter
Verwendung bestimmter Enzyme oder chemisch beispielsweise
unter Verwendung von Cyanbromid gespalten werden, um die
Polypeptidketten an den Methioninresten zu spalten.
Es ist für den Fachmann einleuchtend, daß die Erfindung
zahlreiche Anwendungen findet. Die Erfindung ist u. a.
anwendbar auf die Peptidhormone Oxytocin, Vasopressin und
Somatostatin, die Enkephaline (Opiatpentapeptide) und die
appetitregelnden Peptide.
Zur Veranschaulichung wird
die Erfindung nachstehend ausführlicher im Zusammenhang
mit dem Süßstoff "Aspartame" beschrieben. "Aspartame" ist
ein kalorienarmer künstlicher Süßstoff, der chemisch als
Asparagylphenylalanin-Methylester bezeichnet werden kann.
Dieser Methylester wird zur Zeit mit Hilfe einer mehrstufigen
chemischen Synthese hergestellt.
Im Hinblick auf seine Verwendung als Süßstoff ist der
Gesamtverbrauch des Methylesters von Asparagylphenylalanin
(Aspartame) potentiell sehr groß, und es besteht daher
ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Herstellungen,
bei denen das Material in einfacher Weise und im
großen Maßstab erhalten werden kann.
Es wurde gefunden, daß der Methylester von Asparagylphenylalanin
nach einem potentiell großtechnischen Verfahren
auf der Grundlage von Rekombinanten-DNS-Methoden
hergestellt werden kann, wobei ein synthetisches Gen, das
für (Asparagyl-phenylalanin) n codiert, in einen clonierenden
Vektor eingefügt wird, der einen regelbaren bakteriellen
Promotor aufwärts vom Insertionsort und im wesentlichen
benachbart dazu aufweist, und der Vektor für die
Transformation von Bakterienzellen verwendet werden kann,
aus denen das exprimierte Polypeptid erhältlich ist, und
dieses kann dann gespalten werden, wobei Asparagyl-phenylalanin
und hieraus "Aspartame" erhalten wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung
demgemäß ein synthetisches Gas für die Expression des
replizierenden Polypeptids (Asparagyl-phenylalanin) n , das
ein doppelsträngiges DNS-Molekül enthält, das im Codierungsstrang
wenigstens zwei Nucleotidtrimere, die für die
Expression von Asparaginsäure (Asp) codieren, und alternierend
damit wenigstens zwei Nucleotidtrimere, die für
die Expression von Phenylalanin (Phe) codieren, und im
anderen Strang replizierende und alternierende Nucleotidsequenzen
enthält, die komplementär zu den (Phe)- und
(Asp)-Codierungssequenzen sind.
Der Codierungsstrang für das synthetische Gen, d. h. das
Gen, das für das replizierende Polypeptid (Asp-Phe) n
codiert, kann daher als codierend für die Sequenz
5′ -(Asp-Phe-(Asp-Phe) n - 3′,
worin n eine ganze Zahl beispielsweise bis zu einigen
hundert ist, dargestellt werden.
Es gibt zwei mögliche Codons für Phe, nämlich (T-T-T) und
(T-T-C), und zwei mögliche Codons für Asp, nämlich (G-A-T)
und (G-A-C), und diese können in beliebiger Permutation
mit entsprechenden komplementären Sequenzen im anderen
Strang verwendet werden. Beispielsweise kann der Codierungsstrang
die Nucleotidsequenz
mit einem komplementären Strang, der die Sequenz
3′ -A-A-A-G-C-T-G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-T-G-A-A- 5′
hat, sein. In diesem Fall dient (T-T-C) als Sequenz, die
für Phenylalanin codiert, und beide Codons (G-A-C) und
(G-A-T) alternieren für Asparaginsäure.
Die anderen möglichen Permutationen und Kombinationen der
Nucleotidsequenz für die codierenden und komplementären
Stränge sind dem Fachmann offensichtlich.
Das synthetische Gen gemäß der Erfindung kann
man durch Polymerisation eines doppelsträngigen Fragments
von DNS, das aus zwei Dodecanucleotidsträngen besteht, von
denen einer die Sequenz für die Expression von (Asp-Phe)₂,
den Codierungsstrang, hat, und der andere komplementär
dazu, der komplementäre Strang, ist, herstellen.
Demgemäß umfaßt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein
synthetisches Gen, das dadurch erhältlich ist, daß man eine erste Dodecanucleotidsequenz, die für Asparagyl-phenylalanin codiert,
durch Zusammenknüpfen geeigneter Nucleotidmonomerer
bildet, eine zweite Dodecanucleotidsequenz, der zur
ersten Sequenz komplementär ist, bildet, die beiden
Dodecanucleotide unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase
phosphoryliert und die erste und die zweite Sequenz
unter Bildung einer doppelsträngigen DNS-Struktur mischt.
Die Dodecanucleotidstränge können beide aus den jeweiligen
Monomeren, die durch blockierende Gruppen in bekannter
Weise geschützt und durch übliche Phosphotriester-Methoden
verknüpft sind, synthetisiert werden (siehe beispielsweise
Hsiung et al., Nucleic Acids Research, 6 [1979], 1371-1385).
Die in dieser Weise erhaltenen Dodecameren werden entblockiert
und anschließend gereinigt. Nach der Reinigung
und Phosphorylierung mit T₄-Polynucleotidkinase (E.C.2.7.1.78)
werden die codierenden und komplementären Stränge
zusammengemischt mit dem Ergebnis, daß doppelsträngige
Strukturen durch Wasserstoffbindung gebildet werden. Es
wurde gefunden, daß durch Verwendung des für (Asp-Phe)₂
codierenden Dodecameren für den Codierungsstrang und eines
entsprechenden komplementären Dodecanucleotidstranges
sehr stabile doppelsträngige Strukturen erhalten werden,
die sich aus der Sechsbasen-Überlappung der Stränge ergeben,
die für das vorstehend gegebene Beispiel wie folgt
dargestellt wird:
5′ pT-T-T-C-G-A-C-T-T-C-G-A 3′
3′ G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-Tp 5′
3′ G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-Tp 5′
Die lineare Polymerisation der vorstehend genannten doppelsträngigen
Strukturen wird durch Inkubation mit T₄-DNS-
Ligase (EC 6.5.1.1) erreicht, wobei lange Polymerisate
von willkürlicher Länge erhalten werden. Nach der Abtrennung
von ungebundenem Material wird festgestellt, daß ein
Bereich von Polymerisaten, die 2 bis 500 und mehr Replikationen
der Grundeinheiten enthalten, erhalten wird.
Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, ein Verfahren zur Expression
von (Asparagyl-phenylalanin) n durchzuführen,
wobei man ein solches synthetisches Gen in einen
Insertionsort eines Plasmidvektors in der richtigen Phase
für das inserierte Gen liest, einfügt, wobei der Einfügungsort
einem bakteriellen Promotor benachbart und abwärts von
einem prokaryotischen Ribosomenbindungsort liegt, kompetente
Mikrobenzellen unter Verwendung des hierbei erhaltenen
Plasmidvektors transformiert, die transformierten Zellen
kultiviert und das exprimierte Peptid isoliert. Ferner ist
das polymere Produkt als neu anzusehen.
Der Methylester von Asparagyl-phenylalanin (Aspartame) ist
dadurch erhältlich, daß man das
vorstehend genannte synthetische Gen in einen clonierenden
Plasmidvektor, z. B. pWT 121, einfügt, der so aufgebaut ist,
daß er in der richtigen Phase für die Expression des eingefügten
Gens liest und einen bakteriellen Promotor aufwärts
vom Einfügungsort und benachbart dazu enthält. Der
Plasmidvektor kann verwendet werden, um Zellen von E. coli
HB 101 zu transformieren. Das exprimierte (Asp-Phe) n kann
isoliert und der enzymatischen Spaltung unter Verwendung
eines Enzyms, das für Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten
spezifisch ist, z. B. Subtilisin (E.C. 3.4.4.16),
Chymotrypsin (E.C. 3.4.4.5) oder Proteinase K (E.C. 3.4.21.14)
unterworfen werden, wobei Asparagyl-phenylalanin erhalten
wird, das unter Bildung des Methylesters (Aspartame)
methyliert wird. Das verwendete Enzym kann in löslicher
Form vorliegen oder ist vorzugsweise auf einem festen Träger
immobilisiert. Die Methylierung kann entweder nach üblichen
chemischen Methoden oder durch eine Austauschreaktion mit
dem Enzym in Gegenwart von Methanol oder durch direkte
enzymatische Methanolyse des Polymerisats erfolgen.
Es leuchtet ein, daß angesichts der Triplettnatur des
genetischen Codes das Gen in jeder beliebigen von drei
Phasen gelesen werden kann und es daher für ein Gen
wesentlich ist, einen Plasmidvektor zu verwenden, der
Translation im richtigen Leserahmen ergibt.
Es wurde gefunden, daß
gemäß der Erfindung ein Plasmid zu bevorzugen ist, das aus
der vorstehend erwähnten, sog. "pWT-Reihe" ausgewählt ist.
Grundsätzlich enthalten Plasmide der pWT-Reihe einen
Hind III (E.C. 3.1.23.21)-Restriktionsort, der einem
clonierten E. coli-Tryptophan-Promotor benachbart ist. Durch
Hind III-Restriktion und die Insertion von Hind III-
"linkers" in der pWT-Reihe ist es möglich, Plasmide zu
konstruieren, die zur Translation in allen drei Leserahmen,
nämlich pWT 111, pWT 121 und pWT 131, die in der vorstehend
genannten Veröffentlichung angegeben sind, fähig sind.
Die Transkription und Translation von inserierter DNS
in den Plasmiden der pWT-Reihe steht unter direkter und
starker Tryptophankontrolle. In Gegenwart von Tryptophan
wird somit das Operon reprimiert, während es in Abwesenheit
von Tryptophan de-reprimiert wird.
Plasmide der pWT-Reihe weisen ferner in der Region unmittelbar
anschließend an den Hind III-Ort das Gen für
Tetracyclinresistenz auf, so daß nach Einfügung der DNS
die Transkription und Translation leicht bestätigt werden
können, da, wenn sie stattgefunden hat, die Tetracyclinresistenz
aufrechterhalten wird.
Das synthetische Gen wird vorzugsweise in das geeignete
Plasmid der pWT-Reihe, d. h. das Plasmid mit der
Bezeichnung "pWT 121", eingefügt. Dieses Plasmid ist
schematisch in Fig. 2 dargestellt und hat die folgenden
Charakteristiken:
Eine Moleküllänge von 4837 bp (Basenpaaren); einen Hpa I (E.C. 3.1.23.23)-Ort; einen Hind III-Ort 206 bp vom Hpa I-Ort; einen Bam HI (E.C. 3.1.23.6)-Ort 353 bp vom Hind III-Ort; einen Sal I (E.C. 3.1.23.37)-Ort 275 bp vom Bam HI-Ort; einen Pst I (E.C. 3.1.23.31)-Ort 2958 bp vom Sal I-Ort und 1045 bp vom Hpa I-Ort. Das Gen für Tetracyclinresistenz erstreckt sich von der Region des Hpa I-Orts bis über den Sal I-Ort hinaus; das Gen für Ampicillinresistenz in der Region vom Pst I-Ort und dem clonierten Teil des trp-Operons umfaßt die Region zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen den Hpa I- und Hind III-Orten.
Eine Moleküllänge von 4837 bp (Basenpaaren); einen Hpa I (E.C. 3.1.23.23)-Ort; einen Hind III-Ort 206 bp vom Hpa I-Ort; einen Bam HI (E.C. 3.1.23.6)-Ort 353 bp vom Hind III-Ort; einen Sal I (E.C. 3.1.23.37)-Ort 275 bp vom Bam HI-Ort; einen Pst I (E.C. 3.1.23.31)-Ort 2958 bp vom Sal I-Ort und 1045 bp vom Hpa I-Ort. Das Gen für Tetracyclinresistenz erstreckt sich von der Region des Hpa I-Orts bis über den Sal I-Ort hinaus; das Gen für Ampicillinresistenz in der Region vom Pst I-Ort und dem clonierten Teil des trp-Operons umfaßt die Region zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen den Hpa I- und Hind III-Orten.
Das erfindungsgemäße synthetische Gen des Methylesters von
Asparagyl-phenylalanin (Aspartame) wurde in pWT 121 wie
folgt cloniert:
Das Plasmid pWT 121 wurde der Restriktion mit dem Enzym Hind III unterworfen, wobei ein lineares Molekül erhalten wurde, das dann mit DNS-Polymerase und allen vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten behandelt wurde, wobei vollständig basenpaarige "stumpfe Enden" gebildet wurden. Das stumpfendige Molekül wurde dann zur Entfernung der 5′-Phosphate mit bakterieller Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1) behandelt. Das Plasmid ist nunmehr bereit für die Insertion des synthetischen Gens, das zuerst wie folgt behandelt wird:
Das synthetische Gen wird mit DNS-Polymerase von E. coli und allen vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten zur Bildung stumpfer Enden behandelt, und die "reparierten" Gene werden vom Enzym und kleinen Molekülen abgetrennt.
Das Plasmid pWT 121 wurde der Restriktion mit dem Enzym Hind III unterworfen, wobei ein lineares Molekül erhalten wurde, das dann mit DNS-Polymerase und allen vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten behandelt wurde, wobei vollständig basenpaarige "stumpfe Enden" gebildet wurden. Das stumpfendige Molekül wurde dann zur Entfernung der 5′-Phosphate mit bakterieller Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1) behandelt. Das Plasmid ist nunmehr bereit für die Insertion des synthetischen Gens, das zuerst wie folgt behandelt wird:
Das synthetische Gen wird mit DNS-Polymerase von E. coli und allen vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten zur Bildung stumpfer Enden behandelt, und die "reparierten" Gene werden vom Enzym und kleinen Molekülen abgetrennt.
Stumpfendige Vektor-DNS und stumpfendiges Genmaterial
werden im Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 2 gemischt und mit
hohen Konzentrationen von T₄-DNS-Ligase miteinander
verknüpft, wobei eine Reihe von Plasmiden "pWT 121/Asp-
Phe) n " gebildet wird. Die Größen der clonierten Einfügungen,
bestimmt durch Digestion mit dem Restriktionsenzym,
lagen, wie gefunden wurde, im Bereich von 60 bis 900 bp
(d. h. von 5 bis 75 Replikationen der Dodecanucleotideinheit).
Die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten
Plasmide pWT 121/(Asp-Phe) n werden zur Transformation von
Zellen von E. coli in bekannter Weise verwendet, indem
beispielsweise mit Calciumchlorid behandelte Zellen der
Einwirkung des Plasmids pWt 121/(Asp-Phe) n ausgesetzt werden.
Transformierte Zellen, die in bekannter Weise in einem
Medium kultiviert wurden, das kein Tryptophan und vorzugsweise
β-Indolacrylsäure als Auslöser enthielt,
exprimierten ein Protein, das im wesentlichen aus (Asp-
Phe) n bestand und nach enzymatischer Spaltung und Methylierung
den gewünschten Asparagyl-phenylalanin-Methylester
("Aspartame") bildete.
Wie bereits erwähnt, wird der Asparagyl-phenylalanin-Methylester
üblicherweise durch mehrstufige chemische Synthese
hergestellt. Ein bei dieser üblichen Synthese verwendetes
Zwischenprodukt ist L-Phenylalanin.
Bei Herstellung auf
chemischem synthetischem Wege wird Phenylalanin als Racemat
erhalten, das getrennt werden muß, bevor das L-Isomere
erhalten werden kann. Dies erfordert eine zusätzliche und
kostspielige Stufe im Verfahren. Bei der Herstellung gemäß
der Erfindung wird das Phenylalanin
direkt als L-Isomeres gebildet.
Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, L-Phenylalanin nach
einem Verfahren herzustellen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man das Peptid (Asp-Phe) n , das von einer
Kultur von Zellen von E. coli, die das synthetische
"Aspartame"-Gen enthaltende Plasmid tragen, isoliert worden
ist, mit einem sauren oder enzymatischen Hydrolysierungsmittel
behandelt und vom Hydrolysat das gewünschte
L-Phenylalanin abtrennt.
Dieses Verfahren führt natürlich außerdem zu L-Asparaginsäure.
Bevorzugt als Mittel zur Hydrolyse werden beispielsweise
Salzsäure oder Carboxypeptidase (E. C. 3.4.12.x), Aminopeptidase
(E.C. 3.4.11.x) oder nicht-spezifische Endepeptidasen.
Die Trennung der Hydrolysenprodukte kann nach bekannten
Methoden erfolgen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert.
Die beiden Dodecanucleotide TpCpGpApApApTpCpGpApApG und
TpTpTpCpGpApCpTpTpCpGpA wurden nach üblichen Triester-
Methoden, die beispielsweise von Hsiung (loc. cit.) beschrieben
wurden, und gemäß dem in Fig. 3 dargestellten
Reaktionsschema, in dem N für Gisobu, T, Cbz oder Abz
steht, hergestellt. Die vollständig geschützten Dodecanucleotide
wurden mit 2% (Gew./Vol.) Benzolsulfonsäure
und 0,1 M Tetraäthylammoniumfluorid in THF/Pyridin/Wasser
(Volumenverhältnis 8 : 1 : 1) und anschließende Behandlung mit
Ammoniak entblockiert. Die entblockierten Dodecanucleotide
wurden durch HP-Flüssigkeitschromatographie an mikrofeinem
Siliciumdioxid, das mit quaternären
Ammoniumgruppen derivatisiert worden ist,
gereinigt.
Jedes synthetische Dodecanucleotid (2 µg) wurde in 10 µl
eines Reaktionsgemisches phosphoryliert, das 10 bis 50 µCi
q--32P-ATP, 50 mM Tris-Cl pH 7,8, 5 mM Magnesiumchlorid,
0,25 mM unmarkiertes ATP, 10 mM Mercaptoäthanol und 3 Einheiten
T₄-Polynucleotidkinase (E.C. 2.7.1.78) enthielt
(eine Einheit ist die Menge, die den Transfer von 1 Nanomol
³²P-Phosphat vom γ -32P-ATP- zum 5′-Hydroxylende eines
Polynucleotids in 30 Minuten bei 37°C unter Standard-
Bestimmungsbedingungen bewirkt; siehe beispielsweise
Richardson, Nucleic Acids Research, 2, 815). Nach 60 Minuten
bei 37°C wurden die beiden Dodecanucleotide gemischt,
und unmarkiertes ATP in einer Menge, um das ATP auf 1 mM
zu bringen, wurde zusammen mit 0,1 Einheiten T₄-DNS-
Ligase (E.C. 6.5.1.1) zugesetzt (eine Einheit ist die
Menge, die 100 Monomol d(A-T)₁₀₀₀ in 30 Minuten bei 30°C
unter Standard-Testbedingungen in eine gegen Exonuclease
III resistente Form umwandelt; siehe beispielsweise
Modrich und Lehman, J. Biol. Chem., 245 (1970), 3626. Das
Reaktionsgemisch wurde dann 24 Stunden bei 25°C inkubiert.
ATP und ungebundene Nucleotidmonomere wurden entfernt,
indem das Gemisch von oben nach unten durch eine Säule
(20 cm × 0,8 cm) von feinstteiligem vernetztem modifiziertem
Dextranpolymerisat "Sephadex G 50" in
50 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 0,2% (Gew./
Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) geleitet wurde. Die
doppelsträngigen Polymerisate wurden durch Ausfällung mit
Äthanol eingeengt. Das Produkt erwies sich nach der Abtrennung
als ein Gemisch von Polymerisaten von willkürlicher
Länge, die 2 bis mehr als 500 Replikationen oder
Wiederholungen der basischen Einheiten enthielten.
2 µg des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten
Polymerisats wurden in 40 µl Gemisch mit 50 mM
Tris-Cl pH 7,8, 5 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Mercaptoäthanol,
je 0,125 mM der vier Desoxynucleotidtriphosphate und
2 Einheiten DNS-Polymerase I von E. coli (E.C. 2.7.7.7)
inkubiert (eine Einheit ist die Menge, die den Einbau von
10 Nanomol Nucleotid in eine mit Säure ausfällbare Form
in 30 Minuten bei 37°C unter Standard-Testbedingungen
unter Verwendung von Poly-d (A-T) als Template bewirkt;
siehe beispielsweise Richardson et al., J. Biol. Chem.,
239 [1964], 222). Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 10°C
inkubiert und ohne weitere Reinigung verwendet.
50 µg pWT 121 DNS wurden mit einem zweifachen Überschuß
von Hind III (E.C. 3.1.23.21) digeriert. Das Gemisch
wurde zweimal mit einer gleichen Phenolmenge extrahiert
und mit Äthanol ausgefällt.
Die Reparatur mit DNS-Polymerase von E. coli zur Bildung
stumpfer Enden erfolgte in der vorstehend unter (a)
beschriebenen Weise.
Die stumpfendige DNS wurde dann mit bakterieller Alkaliphosphatase
(E.C. 3.1.3.1) behandelt, um endständige
Phosphate zu entfernen und die Rezirkularisation der DNS
während der anschließenden Ligation zu verhindern. Die DNS
wurde 30 Minuten bei 37°C in Gegenwart eines zweifachen
Überschusses des Enzyms in 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 01% SDS,
inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend erschöpfend mit
Phenol extrahiert, mehrmals mit Chloroform gewaschen und
dann mit Äthanol gefällt.
Gemäß Abschnitt (a) hergestelltes stumpfendiges Dodecanucleotidpolymerisat
und gemäß Abschnitt (b) hergestellte
stumpfendige pWT 121-DNS wurden im Gewichtsverhältnis von
1 : 1 gemischt und bei 15°C mit 0,2 Einheiten T₄-DNS-Ligase
in 20 µl Gemisch gebunden, das 50 mM Tris-Cl
pH 7,8, 5 mM Magnesiumchlorid, 1 mM ATP und 10 mM Mercaptoäthanol
enthielt. Nach 24 Stunden waren die Rekombinantenplasmide
pWT 121/(Asp-Phe) n bereit für die Verwendung zur
Transformation von Zellen von E. coli.
Zellen von E. coli K12 HB 101 (Genotyp Gal-, Lac-, Ara-,
Pro-, Arg-, Strr, Rec A-, rk -, Mk -; H. W. Boyer und
D. Roullard-Dussoix, J. Mol. Biol., 41, 459-472) wurden nach
der Methode von Katz et al., J. Bacteriol., 114 (1973), 577-
591, transformiert und auf L-Agarplatten, die mit Ampicillin
(100 mg/ml) ergänzt waren, plattiert.
Rekombinantenklone wurden durch "streaking" gereinigt, um
Einzelkolonien zu erhalten. Die in dieser Weise isolierten
Clone wurden durch Kolonie-Hybridisierung auf Nitrocellulosefiltern
(Grunstein und Hogness, Proc. Nat. Acad. Sci.,
USA, 72 [1975], 3961-3965) unter Verwendung eines mit
Kinase markierten synthetischen Dodecanucleotids als
Hybridisierungssonde untersucht.
Einzelkolonien, die durch Kolonie-Hybridisierung positiv
waren, wurden bis zu einem A₆₀₀-Wert von 0,6 in 25 ml
M9-Medium, das mit Ampicillin (100 µg/ml) und Tryptophan
(40 µg/ml) ergänzt war, gezüchtet (Miller, Experiments
in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory,
New York [1972], S. 433). Eine Probe von 1 ml wurde von
dieser reprimierten Kultur genommen und 10 Minuten mit
5 µCi ¹⁴C-Aminosäuren markiert, bevor sie 10 Minuten mit
200 ml 20%igen (Gew.-Vol.) "Casaminosäuren" getrieben
wurden. Die Zellen wurden zentrifugiert
(pelletisiert) (10 000 × g für 10 Minuten), mehrmals mit
phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 100 µg/ml Gelatine
enthielt, gepuffert, um überschüssige Markierung zu entfernen,
und das endgültige Pellet wurde in 50 µl eines
Puffers (FSB) lysiert, der 10% (Vol./Vol.) Glycerin,
0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau, 5% (Vol./Vol.) β-Mercaptoäthanol,
3% (Gew./Vol.) SBS und 65 mM Tris-Cl pH 8 enthielt,
indem es 2 Minuten auf 90°C erhitzt wurde. Der Rest der
ursprünglichen Kultur von 25 ml wurde zentrifugiert
(10 000 g für 10 Minuten) und in einem gleichen Volumen
des M9-Mediums, das mit Ampicillin (100 µg/ml) und β-Indolacrylsäure
(5 µg/ml) ergänzt war, erneut suspendiert. Nach
verschiedenen Induktionszeiten wurden Proben von 1 ml
genommen und in der vorstehend beschriebenen Weise markiert.
Aliquote Teile von 5 bis 10 µl der endgültigen
Lysate wurden auf Acrylamidgelen abgetrennt (12,5% Polyacrylamid
+ 0,1% SDS; siehe beispielsweise Laemmli,
Nature, 277 [1970], 680-685). Die Gele wurden getrocknet und
autoradiographisch aufgenommen, um die Lagen der markierten
Proteine zu ermitteln. Durch Vergleich der Muster von
nicht induzierten und induzierten Zellen konnten Proteine,
die unter der Kontrolle des Tryptophanpromoters synthetisiert
waren, identifiziert werden.
Fig. 4 zeigt ein Autoradiogramm eines 12,5% Acrylamid und
0,1% SDS enthaltenden Gels, auf dem ¹⁴C-markierte Proteine
getrennt sind, die in Zellen von E. coli synthetisiert
worden sind, die Rekombinantenplasmide pWT 121 (Asp-Phe) n
tragen. Die Spur 1 zeigt Proteine, die mit ¹⁴C-Aminosäuren
in Gegenwart von 40 µg/ml L-Tryptophan markiert sind, d. h.
etwaige Gene, die am Hind III-Ort eingefügt worden sind,
sind reprimiert, und kein Protein dürfte gebildet werden.
Die Spur 2 zeigt Proteine, die mit ¹⁴C-Aminosäuren in
Abwesenheit von L-Tryptophan und in Gegenwart von 5 µg/ml
β-Indolacrylsäure markiert worden sind, d. h. eingefügte
Gene sind vollständig induziert und müßten das für die
Einfügung codierte Protein exprimieren. (Das Protein, das
in der Spur stark erscheint, wurde als replizierendes
Polymerisat von (Asp-Phe) nachgewiesen.) Die Spuren 3 und
4 entsprechen den Spuren 1 bzw. 2 mit dem Unterschied,
daß die doppelte Proteinmenge verwendet wurde. Die auf
der rechten Seite der Darstellung angegebenen Molekulargewichte
des Standard-Proteins sind diejenigen eines
Standardgemisches von Protein.
Bestimmte Banden von Proteinen wurden von den Acrylamidgelen
isoliert, indem das Proteinlysat in einer Reihe von
parallelen Spuren abgetrennt wurde. Eine dieser Spuren
wurde vom Gel mit einem Skalpell ausgeschnitten und
Coomassie Brilliant Blue R
angefärbt, während der Rest des Gels 20 Minuten in 15%igem
(Vol./Vol.) Glycerin getränkt und bei -70°C aufbewahrt wurde.
Die angefärbte Gelscheibe wurde getrocknet und 24 bis 48
Stunden autoradiographisch aufgenommen, um die Lage der
markierten Banden zu bestimmen. Dies ermöglichte es, den
erheblichen Teil des gefrorenen Gels auszuschneiden. Die
Gelscheiben wurden zerkleinert, indem sie durch eine
wegwerfbare 1-ml-Spritze ohne Nadel gepreßt wurden. Das
markierte Protein wurde 24 Stunden mit 10 mM Triäthylammoniumbicarbonat,
pH 7,5, eluiert. Gelfragmente wurden
durch Zentrifugieren entfernt, und der Überstand wurde
gegen 10 mM Triäthylammoniumbicarbonat dialysiert. Auf
diese Weise wurden die markierten Proteinbanden in Ausbeuten
von 50 bis 75% erhalten.
Rohe Zell-Lysate oder
isolierte Banden von Acrylamidgelen wurden entweder mit
proteolytischen Enzymen in Lösung bei Konzentrationen von
1 bis 10 mg/ml oder mit äquivalenten Mengen eines auf einem
festen Träger immobilisierten Enzyms für Zeiträume bis zu
72 Stunden digeriert. 10 mM Triäthylammoniumbicarbonat
wurden für Aufschlüsse im pH-Bereich von 7 bis 8 verwendet,
während 10 mM Glycin/Natriumhydroxid-Puffer bis zu pH 10,5
verwendet wurden.
Enzym-Aufschlußprodukte von
markierten Proteinen wurden auf Kieselgelplatten
für die Dünnschichtchromatographie mit Konzentrationszone
(20×20 cm) unter Verwendung entweder von n-Butanol :
Essigsäure : Wasser (Volumenverhältnis 8 : 2 : 2) oder n-Propa
nol : konz. Ammoniak (0,880) (Volumenverhältnis 7 : 3) als
Lösungsmittel getrennt. Nach der Entwicklung wurden die
Platten getrocknet und dann radiographisch unter Verwendung
eines Kodak-Röntgenfilms aufgenommen, um
die markierten Peptidprodukte festzustellen. Aufschlußprodukte
mit Chymotrypsin (E.C. 3.4.4.5) oder Subtilisin
(E.C. 3.4.4.16), das auf einem festen Träger immobilisiert
war, oder mit Subtilisin oder Proteinase K (E.C. 3.4.21.14)
in löslicher Form ergaben sämtlich ein Gemisch von Produkten.
Unter diesen befand sich in jedem Fall eine Verbindung,
die mit authentischem Asparagyl-phenylalanin cochromatographierte
(Fig. 5 zeigt ein Autoradiogramm
einer Siliciumdioxid-Dünnschichtchromatographieplatte,
auf der die Produkte der enzymatischen Digestion von
(Asp-Phe) n -Protein getrennt sind). ¹⁴C-markiertes (Asp-
Phe) n -Protein, das von einem 12,5% Acrylamid und 0,1%
SDS enthaltenden Gel isoliert worden war, wurde 16 Stunden
bei 37°C mit Subtilisin digeriert, das auf einem festen
Träger immobilisiert war. Die Dünnschichtchromatographieplatte
wurde mit n-Propanol : Ammoniak (0,880) (Volumenverhältnis
7 : 3) entwickelt. Die Pfeile deuten die Lagen
der Markers von authentischem (Asp-Phe) und (Phe-Asp) an.
Wenn diese Verbindung von der Dünnschichtchromatographieplatte
isoliert und in Salzsäure hydrolysiert wurde, ergab
sie nur Asparaginsäure und Phenylalanin.
Von einem Acrylamidgel isoliertes ¹⁴C-markiertes (Asp-
Phe) n -Protein oder ein rohes Zell-Lysat, das hergestellt
worden ist durch Lysis von induzierten ¹⁴C-markierten
E. coli-Zellen, die pWT 121/(Asp-Phe) n -Plasmide tragen,
in einem Puffer, der 5% (Vol./Vol.) β-Mercaptoäthanol,
3% (Gew./Vol.) SDS und 65 mM Tris-Cl pH 8 enthielt, wurde
für die Hydrolyse verwendet. Ein aus 1 ml einer induzierten
Zellkultur hergestelltes Lysat oder das isolierte
induzierte Protein aus einem gleichen Kulturvolumen wurde
in einem Rohr mit 1 ml 6M-Salzsäure zugeschmolzen und
16 Stunden auf 110°C erhitzt. Nach dieser Zeit wurde das
Rohr geöffnet und der Inhalt herausgenommen und zur
Trockene eingedampft. Die Untersuchung des Hydrolysats
durch Dünnschichtchromatographie ergab die Anwesenheit von
¹⁴C-markierter L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin zusammen
mit kleineren Mengen anderer Aminosäuren.
Ein Polymerisat (Asp-Phe) n kann mit Hilfe eines Enzyms,
z. B. Chymotrypsin oder Subtilisin, das an aromatischen
Aminosäuren schneidet, gespalten werden. Als Alternative
kann ein Polymerisat (Asp-Phe-Lys-Lys) n hergestellt werden,
das durch Trypsin oder durch ein Enzym von ähnlicher
Spezifität oder durch eine Kombination von Enzymen unter
Bildung des Dipeptids Asp-Phe spaltbar ist. Beispielsweise
findet eine solche Spaltung an gepaarten basischen Aminosäureresten
bekanntlich bei dem Verfahren statt, bei dem
Hormonvorstufen zu aktiven Spezies, z. B. dem Kortiko
tropin-β-lipotropin-MSH-enkephalin-System, gespalten
werden (Nakanishi et al., Nature, 278 [1979], 423-427).
Ein Gen für ein solches repetitives Tetrapeptid kann durch
Verbinden von vier chemisch synthetisierten Dodecanucleotiden
hergestellt werden:
- 1) A.A.G.A.T.T.T.C.A.A.A.A
2) A.G.G.A.C.T.T.T.A.A.G.A
3) A.G.T.C.C.T.T.T.T.T.G.A
4) A.A.T.C.T.T.T.C.T.T.A.A
Hierbei wird die folgende repetitive Struktur gebildet:
Dies erfordert die Verwendung von zwei Codons für jede
der Aminosäuren: G.A.T und G.A.C für Asp; T.T.T und
T.T.C für Phe und A.A.A und A.A.G für Lys. Diese sind
sämtlich in E. coli brauchbar. Der einzige Restriktions
enzym-Erkennungsort innerhalb dieses polymeren Gens ist
das für EcoRI′ (A.G.A T.T.T).
Die Reparatur des vorstehend genannten polymeren Gens
unter Verwendung von E. coli-DNS-Polymerase I ergibt ein
Molekül, das bei Ligation am stumpfen Ende in den Hind
III-Ort beispielsweise des Plasmids pWT 111 im richtigen
Leserahmen liest.
Das Versuchsverfahren wird auf die in Beispiel 1 beschriebene
Weise durchgeführt. Das nach der Induktion erhaltene
erforderliche Polypeptid kann beispielsweise unter Verwendung
von Trypsin gespalten und das Asp-Phe-Dipeptid
isoliert werden.
Geringe Mengen des Tripeptids Pyro-Glu-His-Gly haben die
Fähigkeit, eine appetithemmende Reaktion bei Tieren auszulösen,
d. h., es verursacht eine Verminderung der Futteraufnahme
und ist daher von Interesse bei der Steuerung
des Appetits beim Menschen (O. Trygstad et al., Acta
Endocrinol, 89 [1978], 196-208).
Ein Polymerisat der Form (Glu-His-Gly-Lys-Lys) wird
gewöhnlich unter Verwendung von beispielsweise Trypsin
gespalten, wobei das Tripeptid Glu-His-Gly erhalten wird.
Glutaminsäure kann unter der Einwirkung von Wärme in
Pyroglutaminsäure umgewandelt werden; siehe beispielsweise
US-PS 25 28 267.
Ein solches repetitives Polymerisat ist für ein repetitives
Gen codiert, das aus vier chemisch synthetisierten
Oligonucleotiden, zwei Tetradecanucleotiden und zwei
Hexadecanucleotiden besteht:
- 1) A.G.G.A.A.C.A.C.G.G.T.A.A.G.
2) A.A.A.G.A.G.C.A.T.G.G.C.A.A.A.A
3) C.T.C.T.T.T.C.T.T.A.C.C.G.T.
4) G.T.T.C.C.T.T.T.T.T.G.C.C.A.T.G
Diese Oligonucleotide können unter Anwendung der vorstehend
beschriebenen Verfahren phosphoryliert und durch
Ligation verknüpft werden, wobei die folgende Struktur
erhalten wird:
Zwei Codons werden für jede Aminosäure verwendet: G.A.A
und G.A.G für Glutaminsäure; C.A.C und C.A.T für Histidin;
G.G.T und G.G.C für Glycin und A.A.A und A.A.G für Lysin.
Alle diese Codons sind in E. coli brauchbar. Restriktions
enzym-Erkennungsorte sind in diesem Gen nicht vorhanden.
Das Versuchsverfahren wird auf die in Beispiel 1 beschriebene
Weise durchgeführt. Dieses Gen liest im richtigen
Leserahmen, wenn es beispielsweise mit dem
stumpfen Ende in den Hind III-Ort des Plasmids pWT 111
verknüpft wird.
Das Pentapeptid Arg-Lys-Asp-Val-Tyr ist ein Analogon des
Hormons Thymopoietin, das Induktion der Differenzierung
von Pro-Thymozyten zu Thymozyten bewirkt (Goldstein et
al., Science, 204 [1979], 1309-1310). Es findet medizinische
Anwendung für die Behandlung von Störungen der Thymusdrüse.
Ein repetitives Gen, das für ein Polymerisat dieses
Analogons des Thymushormons codiert, kann aus vier chemisch
synthetisierten Oligonucleotiden, zwei Tetradecanucleotiden
und zwei Hexadecanucleotiden, konstruiert werden:
- 1) A.C.C.G.T.A.A.A.G.A.T.G.T.T.T.A
2) C.C.G.A.A.A.G.G.A.T.G.T.C.T
3) T.T.T.C.G.G.T.A.A.A.C.A.T.C.T.T.
4) T.A.C.G.G.T.A.G.A.C.A.T.C.C
Diese Oligonucleotide können phosphoryliert und durch
Ligation verknüpft werden, wobei die folgende Struktur
erhalten wird:
In dieser Struktur werden Einzelcodons für Tyrosin (T.A.C)
und Asparaginsäure (G.A.T) verwendet, während zwei Codons
für Arginin (C.G.T und C.G.A), Lysin (A.A.A und A.A.G)
und Valin (G.T.T und G.T.C) verwendet werden. Innerhalb
des Gens ist ein einzelner Restriktionsenzym-Erkennungsort
für das Enzym Acc I (G.T.C.T.A.C) vorhanden. Dieser
Ort wiederholt sich alle 30 Basenpaare. Dieses Gen ist
so aufgebaut, daß es im richtigen Leserahmen liest, wenn
es durch Ligation am stumpfen Ende in den Hind III-Ort
beispielsweise des Plasmids pWT 111 eingeführt wird. Das
Versuchsverfahren wird auf die in Beispiel 1 beschriebene
Weise durchgeführt.
Die Enkephaline sind natürlich vorkommende Peptide, die
im menschlichen Gehirn gefunden werden und eine Rolle
als schmerztötende Verbindungen spielen sollen. Sie sind
daher von erheblichem pharmazeutischem Interesse. Es gibt
zwei bekannte Verbindungen, Met-Enkephalin, das die Sequenz
(Try-Gly-Gly-Phe-Met) hat, und Leu-Enkephalin, in dem das
endständige Methionin durch Leucin ersetzt ist. Das vorliegende
Beispiel ist auf Met-Enkephalin gerichtet, aber
ein ähnliches Verfahren ist auf Leu-Enkephalin anwendbar.
Ein Polymerisat von (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-Lys) n kann
beispielsweise durch Trypsin gespalten werden, wobei das
erforderliche Pentapeptid erhalten wird. Ein solches
Polymerisat ist durch ein repetitives Gen bestimmt, das
aus sechs chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, zwei
Octadecanucleotiden und vier Dodecanucleotiden, konstruiert
ist:
- 1) G.T.A.T.G.G.T.G.G.A.T.T.T.A.T.G.A.A.
2) G.A.A.A.T.A.C.G.G.A.G.G.
3) C.T.T.T.A.T.G.A.A.A.A.A.
4) T.A.T.T.T.C.T.T.C.A.T.A.A.A.T.C.C.A.
5) A.T.A.A.A.G.C.C.T.C.C.G.
6) C.C.A.T.A.C.T.T.T.T.T.C.
Diese Oligonucleotide können phosphoryliert und durch
Ligation nach einer von zwei Methoden verknüpft werden:
Entweder können alle sechs Oligonucleotide gemischt und unter Bildung des gewünschten Polymerisats in einer Stufe verknüpft werden. Als Alternative können die Oligonucleotide 1, 2 und 4 und die Oligonucleotide 3, 5 und 6 getrennt verknüpft werden, wobei Blöcke erhalten werden, die dann gemischt und zur Bildung des gleichen Polymerisats mit der folgenden Struktur verknüpft werden:
Entweder können alle sechs Oligonucleotide gemischt und unter Bildung des gewünschten Polymerisats in einer Stufe verknüpft werden. Als Alternative können die Oligonucleotide 1, 2 und 4 und die Oligonucleotide 3, 5 und 6 getrennt verknüpft werden, wobei Blöcke erhalten werden, die dann gemischt und zur Bildung des gleichen Polymerisats mit der folgenden Struktur verknüpft werden:
In dieser Struktur dient A.T.G zur Codierung für Methionin
und T.T.T zur Codierung für Phenylalanin. Eine Vielzahl
von Codons wird für die anderen Aminosäuren verwendet:
Tyrosin (T.A.T und T.A.C); Glycin (G.G.T, G.G.A und G.G.C)
und Lysin (A.A.A und A.A.G). Innerhalb des Gens befinden
sich einzelne Erkennungsorte für die Enzyme Mnl I
(C.C.T.C), Mbo II (G.A.A.G.A) und EcoRI′ (G.G.A.T.T.T),
wie vorstehend dargestellt. Diese Orte wiederholen sich
alle 42 Basen. Das Gen ist so aufgebaut, daß es im
richtigen Leserahmen liest, wenn es durch Ligation am
stumpfen Ende in den Hind III-Ort beispielsweise des
Plasmids pWT 121 eingefügt wird.
Claims (7)
1. Synthetisches Gen mit Codons für die Aminosäuren eines gewünschten
Peptids im Codierungsstrang, dadurch gekennzeichnet,
daß es die Codons in Tandemwiederholung enthält
und erhältlich durch Selbstzusammenfügung und Ligation
einer Vielzahl geeigneter Oligonucleotide, wobei die
Zusammenfügung unter Ausbildung des repetitiven Charakters
durch selbstkomplementäre überlappende Enden an
den Endstellen der Gruppe von Oligonucleotiden erreicht
wird, die nach der Zusammenfügung die repetitive Einheit
des Gens darstellt.
2. Synthetisches Gas nach Anspruch 1 für die Expression
der repetitiven Polypeptide (Asparagyl-phenylalanin) n ,
worin n eine ganze Zahl von wenigstens 2 ist, gekennzeichnet
durch ein doppelsträngiges DNS-Molekül, das im
Codierungsstrang wenigstens zwei Nucleotidsequenzen, die
für die Expression von Asparaginsäure codieren, und
alternierend damit wenigstens zwei Nucleotidsequenzen,
die für die Expression von Phenylalanin codieren, und
im anderen Strang repetitive und alternierende Nucleotidsequenzen
enthält, die komplementär zu den für Asparaginsäure
und Phenylalanin codierenden Sequenzen sind und
dadurch erhältlich,
daß man eine erste Dodecanucleotidsequenz, die für
Asparagyl-phenylalanin codiert, durch Verknüpfen
geeigneter Nucleotidmonomerer bildet, eine zur ersten
Sequenz komplementäre zweite Dodecanucleotidsequenz
bildet, beide Dodecanucleotide unter Verwendung von
T₄-Polynucleotidkinase phosphoryliert und die erste und
die zweite Sequenz unter Bildung einer doppelsträngigen
DNS-Struktur mischt.
3. Synthetisches Gen nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch
die Struktur
4. Plasmidvektor, der an einer
Einfügungsstelle, die einem bakteriellen Promotor benachbart
und abwärts von einer prokaryotischen
Ribosomenbindungsstelle liegt, ein synthetisches
Gen nach Anspruch 1 so eingefügt enthält, daß das Gen
unter bakterieller Promotorkontrolle ist, dadurch gekennzeichnet,
daß der Plasmidvektor aus der pWT-Reihe ausgewählt
ist.
5. Plasmidvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß er der Plasmidvektor pWT 121 ist, an dessen Hind-
III-Stelle ein synthetisches Gen nach Anspruch 2 eingefügt
ist.
6. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie
eine E. coli HB 101-Zelle ist, die durch Einfügung eines
Plasmidvektors nach Anspruch 5 transformiert worden ist.
7. Verwendung einer Zelle gemäß Anspruch 6 zur Expression
eines Peptids.
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