DE3102721C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene synthetische Gen. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieser Erfindung. Der Anspruch 4 betrifft einen Plasmidvektor, der ein synthetisches Gen nach Anspruch 1 eingefügt enthält. Der Anspruch 5 betrifft eine Ausgestaltung des Anspruchs 4. Der Anspruch 6 betrifft eine Zelle, die durch Einfügung eines Plasmidvektors nach Anspruch 5 transformiert worden ist. Anspruch 7 betrifft die Verwendung einer Zelle gemäß Anspruch 6.

Die Synthese von Peptiden auf chemischem Wege ist ein umständliches Verfahren, das mit zunehmender Länge des Peptids in zunehmendem Maße weniger wirksam wird. Andererseits ändert sich bei der Herstellung von Peptiden durch Mikroorganismen bei einem Fermentationsverfahren der Wirkungsgrad nicht relativ zur Länge des Peptidprodukts. In den bei Rekombinanten-DNS-Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind kurze Peptide jedoch metabolisch instabil. Es ist beispielsweise bekannt, daß das Peptid Somatostatin, das aus 14 Aminosäuren besteht, nicht stabil ist, wenn es direkt in E. coli gebildet wird. Stabilität wird in diesem Fall erreicht, indem das Peptid an ein normales E. coli-Protein geknüpft und dieses Verschmelzungsprodukt anschließend gespalten wird (K. Itakura et al., Science, 198 [1977], 1056-1063). Aus "Science", Vol. 198, Seiten 1056 bis 1063, 1977, ist ein Plasmidvektor bekannt, der an einer Einfügungsstelle, die einem bakteriellen Promotor benachbart und abwärts von einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle liegt, ein synthetisches Gen so eingefügt enthält, daß das Gen unter bakterielle Promotorkontrolle ist. Bei diesem Plasmidvektor wird ein synthetisches Somatostatin-DNA-Fragment so insertiert, daß es unter der Kontrolle des lac-Promotors, der u. a. auch eine Ribosomenbindungsstelle trägt, exponiert werden kann.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden Stabilität und erhöhte Ausbeute durch Verwendung eines synthetischen Gens erreicht, das vielfache Wiederholungen der Sequenz enthält, die für ein gewünschtes kleines Peptid codiert. Das Produkt ist somit ein großes Molekül, das in E. coli metabolisch stabiler ist als das kleine Peptid. Die anschließende Spaltung des großen Moleküls ergibt das in ihm enthaltene kleinere Peptid in einer molaren Ausbeute, die höher ist als die Ausbeute, die erzielt würde, wenn das kleine Peptid direkt unter Verwendung eines monomeren Gens hergestellt worden wäre, selbst wenn das kleine Peptid metabolisch stabil wäre.

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Gen, das im Codierungsstrang Codons für die Aminosäuren eines gewünschten Peptids in Tandemwiederholung oder -replikation enthält.

Unter dem Ausdruck "Tandemwiederholung" ist in diesem Zusammenhang die Wiederholung der Sequenz von Codons in linearem Verlauf längs des DNS-Moleküls mit der gleichen Polarität und ohne Unterbrechung zu verstehen.

Der komplementäre oder nicht-codierende Strang des synthetischen Gens enthält eine Sequenz, die durch die Sequenz des Codierungsstranges gemäß den anerkannten Regeln der Nucleinsäure-Basenpaaring bestimmt ist.

Das synthetische Gen der Erfindung ist erhältlich nach einem Verfahren, das durch die Selbstzusammenfügung und Ligation einer Vielzahl geeigneter Oligonucleotide gekennzeichnet ist, wobei die Zusammenfügung unter Ausbildung des Wiederholungscharakters durch selbstkomplementäre, sich überlappende Enden an den Endstellen der Gruppe von Oligonucleotiden, die nach der Zusammenfügung die repetitive Einheit des Gens bilden, erreicht wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung einen Plasmidvektor, der an einem Insertionsort, der einem bakteriellen Promotor benachbart und abwärts (downstream) von einem prokaryotischen Ribosomenbindungsort liegt, ein solches synthetisches Gen in einer solchen Weise eingefügt enthält, daß das Gen sich unter der Kontrolle des bakteriellen Promotors befindet.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf eine Zelle gerichtet, die durch Insertion eines solchen Plasmidvektors in die Zelle transformiert worden ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung die Verwendung der Zelle zur Expression eines Peptids.

Wie bereits erwähnt, werden die Stränge des synthetischen Gens aus einer Reihe von kurzen Oligonucleotiden hergestellt, die selbst durch Verbindung der erforderlichen Nucleotide nach bekannten Methoden in einer Reihenfolge, die durch die Codons der Aminosäuren des gewünschten Peptids und die nachstehend ausführlicher dargelegten Regeln bestimmt ist, gebildet werden.

Die Oligonucleotide des Codierungsstranges und der komplementäre Strang des Gens bilden eine sich überlappende Einheit, die der folgenden allgemeinen Struktur entspricht:

Die in dieser Abbildung dargestellte Struktur besteht aus sechs Oligonucleotiden, und zwar je drei in einem Strang. Die Struktur kann jedoch aus einer beliebigen Zahl von Paaren von Oligonucleotiden von einem Paar aufwärts zusammengefügt sein, vorausgesetzt, daß

• 1) die mit a¹ und a², b¹ und b², c¹ und c² . . . bezeichneten Paarregionen Nucleotidbasensequenzen enthalten, die innerhalb eines Paares, aber nicht zu den Sequenzen eines beliebigen anderen Paares komplementär sind,
• 2) jeder dieser Regionen a¹, a², b¹, b², c¹, c² . . . wenigstens vier Nucleotidbasen enthält und
• 3) die Summe der Nucleotidbasen in jedem Strang, der nach der Zusammenfügung schließlich die Replikationslänge des Polymerisats umfaßt, durch drei teilbar ist.

Wenn eine Einheit von Oligonucleotiden dieses Charakters gemischt wird, hybridisieren die komplementären Regionen der Oligonucleotidpaare unter Bildung von Strukturen von hohem Molekulargewicht, in denen die Sequenzen der Oligonucleotide (in der obigen Darstellung a¹-f¹) sich in Tandemform von einigen wenigen Malen bis zu vielen Malen in verschiedenen Molekülen wiederholen. Beim anschließenden Prozeß ist es zweckmäßig, die Zahl der Polymerisate, die die Sequenz a¹ an ihren 5′-Enden aufweisen, zu maximieren. Dies wird erreicht durch Mischen der Oligonucleotide a¹b¹, c¹d¹, e¹f¹, b²c² und d²e² der vorstehenden Darstellung in äquimolaren Mengen und anschließende Zufügung des Oligonucleotids f²a² in weniger als äquimolarer Menge.

Da die Komplemente von a¹ und f¹ in submolaren Mengen vorhanden sind, enden die meisten Polymerisate in a¹ und f¹. Im allgemeinen Fall wird das 5′-endständige Oligonucleotid der komplementären Einheit dem Polymerisationsgemisch in einer Menge zugesetzt, die weniger als äquimolar in bezug auf die Oligonucleotide sind, die sämtlich in äquimolaren Mengen vorhanden sind.

Die "Einschnürungen" in den Ketten, wo benachbarte Oligonucleotide in der Kette nebeneinander verlaufen, können durch Verwendung des Enzyms DNS-Ligase (EC 6.5.1.1) verbunden werden. Dies ist eine bekannte Methode.

Die in dieser Weise hergestellten Moleküle weisen einsträngige Enden auf. Diese können in die Form des sog. "stumpfen Endes" durch Verwendung des Enzyms DNS-Polymerase I (EC 2.7.7.7) nach einer bekannten Methode umgewandelt werden. Die hierbei erhaltenen Moleküle können in kompetenten Zellen von Mikroorganismen, insbesondere E. coli, unter Verwendung eines gewünschten Vektors cloniert werden. Insbesondere wird ein Plasmidvektor, der aus der sog. "pWT-Reihe" (siehe beispielsweise Tacon et al., Molec. Gen. Genet., 177 [1980], 427) ausgewählt ist, verwendet, wobei die Selektion des Vektors so erfolgt, daß das synthetische Gen bei Insertion in der richtigen Orientierung im gewünschten Translations-Leserahmen gelesen wird.

Fig. 1 veranschaulicht ein Schema für die Herstellung eines Rekombinantenplasmids (pWT 121 (Asp-Phe) _n , das das repetitive Gen für (Asp-Phe) _n in der richtigen DNS- Phaseneinstellung für die Expression eines (Asp-Phe) _n -Proteins enthält. Das oben im Schema dargestellte Plasmid DNS wird mit dem Restriktionsenzym Hind III zerschnitten und dann mit E. coli-DNS-Polymerase I repariert, wobei ein stumpfendiges Molekül entsteht. Bei dem unten im Schema dargestellten Polymerisat, das für (Asp-Phe) _n codiert, wird das zunächst hervorragende 5′-Ende in gleicher Weise repariert, wobei ein weiteres stumpfendiges Molekül entsteht. Durch Verbindung dieser beiden stumpfendigen Spezies mit T4-DNS-Ligase entsteht die in der Mitte des Schemas dargestellte Rekombinanten-DNS mit der richtigen DNS-Phaseneinstellung für die Expression von (Asp-Phe) _n .

Das Clonieren dieses Gens, die Selektion von Bakterienkolonien, die Erfassung des Polypeptidprodukts der Expression des Gens und die Extraktion und Reinigung des Polypeptids können sämtlich nach bekannten Verfahren erfolgen.

Dieses Polypeptid kann dann entweder enzymatisch unter Verwendung bestimmter Enzyme oder chemisch beispielsweise unter Verwendung von Cyanbromid gespalten werden, um die Polypeptidketten an den Methioninresten zu spalten.

Es ist für den Fachmann einleuchtend, daß die Erfindung zahlreiche Anwendungen findet. Die Erfindung ist u. a. anwendbar auf die Peptidhormone Oxytocin, Vasopressin und Somatostatin, die Enkephaline (Opiatpentapeptide) und die appetitregelnden Peptide.

Zur Veranschaulichung wird die Erfindung nachstehend ausführlicher im Zusammenhang mit dem Süßstoff "Aspartame" beschrieben. "Aspartame" ist ein kalorienarmer künstlicher Süßstoff, der chemisch als Asparagylphenylalanin-Methylester bezeichnet werden kann. Dieser Methylester wird zur Zeit mit Hilfe einer mehrstufigen chemischen Synthese hergestellt.

Im Hinblick auf seine Verwendung als Süßstoff ist der Gesamtverbrauch des Methylesters von Asparagylphenylalanin (Aspartame) potentiell sehr groß, und es besteht daher ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Herstellungen, bei denen das Material in einfacher Weise und im großen Maßstab erhalten werden kann.

Es wurde gefunden, daß der Methylester von Asparagylphenylalanin nach einem potentiell großtechnischen Verfahren auf der Grundlage von Rekombinanten-DNS-Methoden hergestellt werden kann, wobei ein synthetisches Gen, das für (Asparagyl-phenylalanin) _n codiert, in einen clonierenden Vektor eingefügt wird, der einen regelbaren bakteriellen Promotor aufwärts vom Insertionsort und im wesentlichen benachbart dazu aufweist, und der Vektor für die Transformation von Bakterienzellen verwendet werden kann, aus denen das exprimierte Polypeptid erhältlich ist, und dieses kann dann gespalten werden, wobei Asparagyl-phenylalanin und hieraus "Aspartame" erhalten wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung demgemäß ein synthetisches Gas für die Expression des replizierenden Polypeptids (Asparagyl-phenylalanin) _n , das ein doppelsträngiges DNS-Molekül enthält, das im Codierungsstrang wenigstens zwei Nucleotidtrimere, die für die Expression von Asparaginsäure (Asp) codieren, und alternierend damit wenigstens zwei Nucleotidtrimere, die für die Expression von Phenylalanin (Phe) codieren, und im anderen Strang replizierende und alternierende Nucleotidsequenzen enthält, die komplementär zu den (Phe)- und (Asp)-Codierungssequenzen sind.

Der Codierungsstrang für das synthetische Gen, d. h. das Gen, das für das replizierende Polypeptid (Asp-Phe) _n codiert, kann daher als codierend für die Sequenz

5′ -(Asp-Phe-(Asp-Phe) _n - 3′,

worin n eine ganze Zahl beispielsweise bis zu einigen hundert ist, dargestellt werden.

Es gibt zwei mögliche Codons für Phe, nämlich (T-T-T) und (T-T-C), und zwei mögliche Codons für Asp, nämlich (G-A-T) und (G-A-C), und diese können in beliebiger Permutation mit entsprechenden komplementären Sequenzen im anderen Strang verwendet werden. Beispielsweise kann der Codierungsstrang die Nucleotidsequenz

mit einem komplementären Strang, der die Sequenz

3′ -A-A-A-G-C-T-G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-T-G-A-A- 5′

hat, sein. In diesem Fall dient (T-T-C) als Sequenz, die für Phenylalanin codiert, und beide Codons (G-A-C) und (G-A-T) alternieren für Asparaginsäure.

Die anderen möglichen Permutationen und Kombinationen der Nucleotidsequenz für die codierenden und komplementären Stränge sind dem Fachmann offensichtlich.

Das synthetische Gen gemäß der Erfindung kann man durch Polymerisation eines doppelsträngigen Fragments von DNS, das aus zwei Dodecanucleotidsträngen besteht, von denen einer die Sequenz für die Expression von (Asp-Phe)₂, den Codierungsstrang, hat, und der andere komplementär dazu, der komplementäre Strang, ist, herstellen.

Demgemäß umfaßt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein synthetisches Gen, das dadurch erhältlich ist, daß man eine erste Dodecanucleotidsequenz, die für Asparagyl-phenylalanin codiert, durch Zusammenknüpfen geeigneter Nucleotidmonomerer bildet, eine zweite Dodecanucleotidsequenz, der zur ersten Sequenz komplementär ist, bildet, die beiden Dodecanucleotide unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase phosphoryliert und die erste und die zweite Sequenz unter Bildung einer doppelsträngigen DNS-Struktur mischt.

Die Dodecanucleotidstränge können beide aus den jeweiligen Monomeren, die durch blockierende Gruppen in bekannter Weise geschützt und durch übliche Phosphotriester-Methoden verknüpft sind, synthetisiert werden (siehe beispielsweise Hsiung et al., Nucleic Acids Research, 6 [1979], 1371-1385). Die in dieser Weise erhaltenen Dodecameren werden entblockiert und anschließend gereinigt. Nach der Reinigung und Phosphorylierung mit T₄-Polynucleotidkinase (E.C.2.7.1.78) werden die codierenden und komplementären Stränge zusammengemischt mit dem Ergebnis, daß doppelsträngige Strukturen durch Wasserstoffbindung gebildet werden. Es wurde gefunden, daß durch Verwendung des für (Asp-Phe)₂ codierenden Dodecameren für den Codierungsstrang und eines entsprechenden komplementären Dodecanucleotidstranges sehr stabile doppelsträngige Strukturen erhalten werden, die sich aus der Sechsbasen-Überlappung der Stränge ergeben, die für das vorstehend gegebene Beispiel wie folgt dargestellt wird:

5′ pT-T-T-C-G-A-C-T-T-C-G-A 3′
3′ G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-Tp 5′

Die lineare Polymerisation der vorstehend genannten doppelsträngigen Strukturen wird durch Inkubation mit T₄-DNS- Ligase (EC 6.5.1.1) erreicht, wobei lange Polymerisate von willkürlicher Länge erhalten werden. Nach der Abtrennung von ungebundenem Material wird festgestellt, daß ein Bereich von Polymerisaten, die 2 bis 500 und mehr Replikationen der Grundeinheiten enthalten, erhalten wird.

Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, ein Verfahren zur Expression von (Asparagyl-phenylalanin) _n durchzuführen, wobei man ein solches synthetisches Gen in einen Insertionsort eines Plasmidvektors in der richtigen Phase für das inserierte Gen liest, einfügt, wobei der Einfügungsort einem bakteriellen Promotor benachbart und abwärts von einem prokaryotischen Ribosomenbindungsort liegt, kompetente Mikrobenzellen unter Verwendung des hierbei erhaltenen Plasmidvektors transformiert, die transformierten Zellen kultiviert und das exprimierte Peptid isoliert. Ferner ist das polymere Produkt als neu anzusehen.

Der Methylester von Asparagyl-phenylalanin (Aspartame) ist dadurch erhältlich, daß man das vorstehend genannte synthetische Gen in einen clonierenden Plasmidvektor, z. B. pWT 121, einfügt, der so aufgebaut ist, daß er in der richtigen Phase für die Expression des eingefügten Gens liest und einen bakteriellen Promotor aufwärts vom Einfügungsort und benachbart dazu enthält. Der Plasmidvektor kann verwendet werden, um Zellen von E. coli HB 101 zu transformieren. Das exprimierte (Asp-Phe) _n kann isoliert und der enzymatischen Spaltung unter Verwendung eines Enzyms, das für Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten spezifisch ist, z. B. Subtilisin (E.C. 3.4.4.16), Chymotrypsin (E.C. 3.4.4.5) oder Proteinase K (E.C. 3.4.21.14) unterworfen werden, wobei Asparagyl-phenylalanin erhalten wird, das unter Bildung des Methylesters (Aspartame) methyliert wird. Das verwendete Enzym kann in löslicher Form vorliegen oder ist vorzugsweise auf einem festen Träger immobilisiert. Die Methylierung kann entweder nach üblichen chemischen Methoden oder durch eine Austauschreaktion mit dem Enzym in Gegenwart von Methanol oder durch direkte enzymatische Methanolyse des Polymerisats erfolgen.

Es leuchtet ein, daß angesichts der Triplettnatur des genetischen Codes das Gen in jeder beliebigen von drei Phasen gelesen werden kann und es daher für ein Gen wesentlich ist, einen Plasmidvektor zu verwenden, der Translation im richtigen Leserahmen ergibt.

Es wurde gefunden, daß gemäß der Erfindung ein Plasmid zu bevorzugen ist, das aus der vorstehend erwähnten, sog. "pWT-Reihe" ausgewählt ist. Grundsätzlich enthalten Plasmide der pWT-Reihe einen Hind III (E.C. 3.1.23.21)-Restriktionsort, der einem clonierten E. coli-Tryptophan-Promotor benachbart ist. Durch Hind III-Restriktion und die Insertion von Hind III- "linkers" in der pWT-Reihe ist es möglich, Plasmide zu konstruieren, die zur Translation in allen drei Leserahmen, nämlich pWT 111, pWT 121 und pWT 131, die in der vorstehend genannten Veröffentlichung angegeben sind, fähig sind.

Die Transkription und Translation von inserierter DNS in den Plasmiden der pWT-Reihe steht unter direkter und starker Tryptophankontrolle. In Gegenwart von Tryptophan wird somit das Operon reprimiert, während es in Abwesenheit von Tryptophan de-reprimiert wird.

Plasmide der pWT-Reihe weisen ferner in der Region unmittelbar anschließend an den Hind III-Ort das Gen für Tetracyclinresistenz auf, so daß nach Einfügung der DNS die Transkription und Translation leicht bestätigt werden können, da, wenn sie stattgefunden hat, die Tetracyclinresistenz aufrechterhalten wird.

Das synthetische Gen wird vorzugsweise in das geeignete Plasmid der pWT-Reihe, d. h. das Plasmid mit der Bezeichnung "pWT 121", eingefügt. Dieses Plasmid ist schematisch in Fig. 2 dargestellt und hat die folgenden Charakteristiken:
Eine Moleküllänge von 4837 bp (Basenpaaren); einen Hpa I (E.C. 3.1.23.23)-Ort; einen Hind III-Ort 206 bp vom Hpa I-Ort; einen Bam HI (E.C. 3.1.23.6)-Ort 353 bp vom Hind III-Ort; einen Sal I (E.C. 3.1.23.37)-Ort 275 bp vom Bam HI-Ort; einen Pst I (E.C. 3.1.23.31)-Ort 2958 bp vom Sal I-Ort und 1045 bp vom Hpa I-Ort. Das Gen für Tetracyclinresistenz erstreckt sich von der Region des Hpa I-Orts bis über den Sal I-Ort hinaus; das Gen für Ampicillinresistenz in der Region vom Pst I-Ort und dem clonierten Teil des trp-Operons umfaßt die Region zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen den Hpa I- und Hind III-Orten.

Das erfindungsgemäße synthetische Gen des Methylesters von Asparagyl-phenylalanin (Aspartame) wurde in pWT 121 wie folgt cloniert:
Das Plasmid pWT 121 wurde der Restriktion mit dem Enzym Hind III unterworfen, wobei ein lineares Molekül erhalten wurde, das dann mit DNS-Polymerase und allen vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten behandelt wurde, wobei vollständig basenpaarige "stumpfe Enden" gebildet wurden. Das stumpfendige Molekül wurde dann zur Entfernung der 5′-Phosphate mit bakterieller Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1) behandelt. Das Plasmid ist nunmehr bereit für die Insertion des synthetischen Gens, das zuerst wie folgt behandelt wird:
Das synthetische Gen wird mit DNS-Polymerase von E. coli und allen vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten zur Bildung stumpfer Enden behandelt, und die "reparierten" Gene werden vom Enzym und kleinen Molekülen abgetrennt.

Stumpfendige Vektor-DNS und stumpfendiges Genmaterial werden im Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 2 gemischt und mit hohen Konzentrationen von T₄-DNS-Ligase miteinander verknüpft, wobei eine Reihe von Plasmiden "pWT 121/Asp- Phe) _n " gebildet wird. Die Größen der clonierten Einfügungen, bestimmt durch Digestion mit dem Restriktionsenzym, lagen, wie gefunden wurde, im Bereich von 60 bis 900 bp (d. h. von 5 bis 75 Replikationen der Dodecanucleotideinheit).

Die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Plasmide pWT 121/(Asp-Phe) _n werden zur Transformation von Zellen von E. coli in bekannter Weise verwendet, indem beispielsweise mit Calciumchlorid behandelte Zellen der Einwirkung des Plasmids pWt 121/(Asp-Phe) _n ausgesetzt werden. Transformierte Zellen, die in bekannter Weise in einem Medium kultiviert wurden, das kein Tryptophan und vorzugsweise β-Indolacrylsäure als Auslöser enthielt, exprimierten ein Protein, das im wesentlichen aus (Asp- Phe) _n bestand und nach enzymatischer Spaltung und Methylierung den gewünschten Asparagyl-phenylalanin-Methylester ("Aspartame") bildete.

Wie bereits erwähnt, wird der Asparagyl-phenylalanin-Methylester üblicherweise durch mehrstufige chemische Synthese hergestellt. Ein bei dieser üblichen Synthese verwendetes Zwischenprodukt ist L-Phenylalanin. Bei Herstellung auf chemischem synthetischem Wege wird Phenylalanin als Racemat erhalten, das getrennt werden muß, bevor das L-Isomere erhalten werden kann. Dies erfordert eine zusätzliche und kostspielige Stufe im Verfahren. Bei der Herstellung gemäß der Erfindung wird das Phenylalanin direkt als L-Isomeres gebildet.

Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, L-Phenylalanin nach einem Verfahren herzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Peptid (Asp-Phe) _n , das von einer Kultur von Zellen von E. coli, die das synthetische "Aspartame"-Gen enthaltende Plasmid tragen, isoliert worden ist, mit einem sauren oder enzymatischen Hydrolysierungsmittel behandelt und vom Hydrolysat das gewünschte L-Phenylalanin abtrennt.

Dieses Verfahren führt natürlich außerdem zu L-Asparaginsäure.

Bevorzugt als Mittel zur Hydrolyse werden beispielsweise Salzsäure oder Carboxypeptidase (E. C. 3.4.12.x), Aminopeptidase (E.C. 3.4.11.x) oder nicht-spezifische Endepeptidasen.

Die Trennung der Hydrolysenprodukte kann nach bekannten Methoden erfolgen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 (Asp-Phe) _n Synthese von Dodecanucleotiden

Die beiden Dodecanucleotide TpCpGpApApApTpCpGpApApG und TpTpTpCpGpApCpTpTpCpGpA wurden nach üblichen Triester- Methoden, die beispielsweise von Hsiung (loc. cit.) beschrieben wurden, und gemäß dem in Fig. 3 dargestellten Reaktionsschema, in dem N für G^isobu, T, C^bz oder A^bz steht, hergestellt. Die vollständig geschützten Dodecanucleotide wurden mit 2% (Gew./Vol.) Benzolsulfonsäure und 0,1 M Tetraäthylammoniumfluorid in THF/Pyridin/Wasser (Volumenverhältnis 8 : 1 : 1) und anschließende Behandlung mit Ammoniak entblockiert. Die entblockierten Dodecanucleotide wurden durch HP-Flüssigkeitschromatographie an mikrofeinem Siliciumdioxid, das mit quaternären Ammoniumgruppen derivatisiert worden ist, gereinigt.

Polymerisation von Dodecanucleotiden

Jedes synthetische Dodecanucleotid (2 µg) wurde in 10 µl eines Reaktionsgemisches phosphoryliert, das 10 bis 50 µCi q-^-32P-ATP, 50 mM Tris-Cl pH 7,8, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,25 mM unmarkiertes ATP, 10 mM Mercaptoäthanol und 3 Einheiten T₄-Polynucleotidkinase (E.C. 2.7.1.78) enthielt (eine Einheit ist die Menge, die den Transfer von 1 Nanomol ³²P-Phosphat vom γ ^-32P-ATP- zum 5′-Hydroxylende eines Polynucleotids in 30 Minuten bei 37°C unter Standard- Bestimmungsbedingungen bewirkt; siehe beispielsweise Richardson, Nucleic Acids Research, 2, 815). Nach 60 Minuten bei 37°C wurden die beiden Dodecanucleotide gemischt, und unmarkiertes ATP in einer Menge, um das ATP auf 1 mM zu bringen, wurde zusammen mit 0,1 Einheiten T₄-DNS- Ligase (E.C. 6.5.1.1) zugesetzt (eine Einheit ist die Menge, die 100 Monomol d(A-T)₁₀₀₀ in 30 Minuten bei 30°C unter Standard-Testbedingungen in eine gegen Exonuclease III resistente Form umwandelt; siehe beispielsweise Modrich und Lehman, J. Biol. Chem., 245 (1970), 3626. Das Reaktionsgemisch wurde dann 24 Stunden bei 25°C inkubiert. ATP und ungebundene Nucleotidmonomere wurden entfernt, indem das Gemisch von oben nach unten durch eine Säule (20 cm × 0,8 cm) von feinstteiligem vernetztem modifiziertem Dextranpolymerisat "Sephadex G 50" in 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 0,2% (Gew./ Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) geleitet wurde. Die doppelsträngigen Polymerisate wurden durch Ausfällung mit Äthanol eingeengt. Das Produkt erwies sich nach der Abtrennung als ein Gemisch von Polymerisaten von willkürlicher Länge, die 2 bis mehr als 500 Replikationen oder Wiederholungen der basischen Einheiten enthielten.

Klonieren des synthetischen Gens a) Reparatur des synthetischen Gens am stumpfen Ende

2 µg des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Polymerisats wurden in 40 µl Gemisch mit 50 mM Tris-Cl pH 7,8, 5 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Mercaptoäthanol, je 0,125 mM der vier Desoxynucleotidtriphosphate und 2 Einheiten DNS-Polymerase I von E. coli (E.C. 2.7.7.7) inkubiert (eine Einheit ist die Menge, die den Einbau von 10 Nanomol Nucleotid in eine mit Säure ausfällbare Form in 30 Minuten bei 37°C unter Standard-Testbedingungen unter Verwendung von Poly-d (A-T) als Template bewirkt; siehe beispielsweise Richardson et al., J. Biol. Chem., 239 [1964], 222). Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 10°C inkubiert und ohne weitere Reinigung verwendet.

b) Herstellung des clonierenden Vektors pWT 121

50 µg pWT 121 DNS wurden mit einem zweifachen Überschuß von Hind III (E.C. 3.1.23.21) digeriert. Das Gemisch wurde zweimal mit einer gleichen Phenolmenge extrahiert und mit Äthanol ausgefällt.

Die Reparatur mit DNS-Polymerase von E. coli zur Bildung stumpfer Enden erfolgte in der vorstehend unter (a) beschriebenen Weise.

Die stumpfendige DNS wurde dann mit bakterieller Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1) behandelt, um endständige Phosphate zu entfernen und die Rezirkularisation der DNS während der anschließenden Ligation zu verhindern. Die DNS wurde 30 Minuten bei 37°C in Gegenwart eines zweifachen Überschusses des Enzyms in 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 01% SDS, inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend erschöpfend mit Phenol extrahiert, mehrmals mit Chloroform gewaschen und dann mit Äthanol gefällt.

c) Ligation des stumpfen Endes

Gemäß Abschnitt (a) hergestelltes stumpfendiges Dodecanucleotidpolymerisat und gemäß Abschnitt (b) hergestellte stumpfendige pWT 121-DNS wurden im Gewichtsverhältnis von 1 : 1 gemischt und bei 15°C mit 0,2 Einheiten T₄-DNS-Ligase in 20 µl Gemisch gebunden, das 50 mM Tris-Cl pH 7,8, 5 mM Magnesiumchlorid, 1 mM ATP und 10 mM Mercaptoäthanol enthielt. Nach 24 Stunden waren die Rekombinantenplasmide pWT 121/(Asp-Phe) _n bereit für die Verwendung zur Transformation von Zellen von E. coli.

Transformation und Gen-Expression

Zellen von E. coli K12 HB 101 (Genotyp Gal^-, Lac^-, Ara^-, Pro^-, Arg^-, Str^r, Rec A^-, r_k ^-, M_k ^-; H. W. Boyer und D. Roullard-Dussoix, J. Mol. Biol., 41, 459-472) wurden nach der Methode von Katz et al., J. Bacteriol., 114 (1973), 577- 591, transformiert und auf L-Agarplatten, die mit Ampicillin (100 mg/ml) ergänzt waren, plattiert.

Rekombinantenklone wurden durch "streaking" gereinigt, um Einzelkolonien zu erhalten. Die in dieser Weise isolierten Clone wurden durch Kolonie-Hybridisierung auf Nitrocellulosefiltern (Grunstein und Hogness, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 72 [1975], 3961-3965) unter Verwendung eines mit Kinase markierten synthetischen Dodecanucleotids als Hybridisierungssonde untersucht. Einzelkolonien, die durch Kolonie-Hybridisierung positiv waren, wurden bis zu einem A₆₀₀-Wert von 0,6 in 25 ml M9-Medium, das mit Ampicillin (100 µg/ml) und Tryptophan (40 µg/ml) ergänzt war, gezüchtet (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, New York [1972], S. 433). Eine Probe von 1 ml wurde von dieser reprimierten Kultur genommen und 10 Minuten mit 5 µCi ¹⁴C-Aminosäuren markiert, bevor sie 10 Minuten mit 200 ml 20%igen (Gew.-Vol.) "Casaminosäuren" getrieben wurden. Die Zellen wurden zentrifugiert (pelletisiert) (10 000 × g für 10 Minuten), mehrmals mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 100 µg/ml Gelatine enthielt, gepuffert, um überschüssige Markierung zu entfernen, und das endgültige Pellet wurde in 50 µl eines Puffers (FSB) lysiert, der 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau, 5% (Vol./Vol.) β-Mercaptoäthanol, 3% (Gew./Vol.) SBS und 65 mM Tris-Cl pH 8 enthielt, indem es 2 Minuten auf 90°C erhitzt wurde. Der Rest der ursprünglichen Kultur von 25 ml wurde zentrifugiert (10 000 g für 10 Minuten) und in einem gleichen Volumen des M9-Mediums, das mit Ampicillin (100 µg/ml) und β-Indolacrylsäure (5 µg/ml) ergänzt war, erneut suspendiert. Nach verschiedenen Induktionszeiten wurden Proben von 1 ml genommen und in der vorstehend beschriebenen Weise markiert. Aliquote Teile von 5 bis 10 µl der endgültigen Lysate wurden auf Acrylamidgelen abgetrennt (12,5% Polyacrylamid + 0,1% SDS; siehe beispielsweise Laemmli, Nature, 277 [1970], 680-685). Die Gele wurden getrocknet und autoradiographisch aufgenommen, um die Lagen der markierten Proteine zu ermitteln. Durch Vergleich der Muster von nicht induzierten und induzierten Zellen konnten Proteine, die unter der Kontrolle des Tryptophanpromoters synthetisiert waren, identifiziert werden.

Fig. 4 zeigt ein Autoradiogramm eines 12,5% Acrylamid und 0,1% SDS enthaltenden Gels, auf dem ¹⁴C-markierte Proteine getrennt sind, die in Zellen von E. coli synthetisiert worden sind, die Rekombinantenplasmide pWT 121 (Asp-Phe) _n tragen. Die Spur 1 zeigt Proteine, die mit ¹⁴C-Aminosäuren in Gegenwart von 40 µg/ml L-Tryptophan markiert sind, d. h. etwaige Gene, die am Hind III-Ort eingefügt worden sind, sind reprimiert, und kein Protein dürfte gebildet werden. Die Spur 2 zeigt Proteine, die mit ¹⁴C-Aminosäuren in Abwesenheit von L-Tryptophan und in Gegenwart von 5 µg/ml β-Indolacrylsäure markiert worden sind, d. h. eingefügte Gene sind vollständig induziert und müßten das für die Einfügung codierte Protein exprimieren. (Das Protein, das in der Spur stark erscheint, wurde als replizierendes Polymerisat von (Asp-Phe) nachgewiesen.) Die Spuren 3 und 4 entsprechen den Spuren 1 bzw. 2 mit dem Unterschied, daß die doppelte Proteinmenge verwendet wurde. Die auf der rechten Seite der Darstellung angegebenen Molekulargewichte des Standard-Proteins sind diejenigen eines Standardgemisches von Protein.

Isolierung von markierten Proteinen von Gelen

Bestimmte Banden von Proteinen wurden von den Acrylamidgelen isoliert, indem das Proteinlysat in einer Reihe von parallelen Spuren abgetrennt wurde. Eine dieser Spuren wurde vom Gel mit einem Skalpell ausgeschnitten und Coomassie Brilliant Blue R angefärbt, während der Rest des Gels 20 Minuten in 15%igem (Vol./Vol.) Glycerin getränkt und bei -70°C aufbewahrt wurde. Die angefärbte Gelscheibe wurde getrocknet und 24 bis 48 Stunden autoradiographisch aufgenommen, um die Lage der markierten Banden zu bestimmen. Dies ermöglichte es, den erheblichen Teil des gefrorenen Gels auszuschneiden. Die Gelscheiben wurden zerkleinert, indem sie durch eine wegwerfbare 1-ml-Spritze ohne Nadel gepreßt wurden. Das markierte Protein wurde 24 Stunden mit 10 mM Triäthylammoniumbicarbonat, pH 7,5, eluiert. Gelfragmente wurden durch Zentrifugieren entfernt, und der Überstand wurde gegen 10 mM Triäthylammoniumbicarbonat dialysiert. Auf diese Weise wurden die markierten Proteinbanden in Ausbeuten von 50 bis 75% erhalten.

Enzym-Aufschlußprodukte

Rohe Zell-Lysate oder isolierte Banden von Acrylamidgelen wurden entweder mit proteolytischen Enzymen in Lösung bei Konzentrationen von 1 bis 10 mg/ml oder mit äquivalenten Mengen eines auf einem festen Träger immobilisierten Enzyms für Zeiträume bis zu 72 Stunden digeriert. 10 mM Triäthylammoniumbicarbonat wurden für Aufschlüsse im pH-Bereich von 7 bis 8 verwendet, während 10 mM Glycin/Natriumhydroxid-Puffer bis zu pH 10,5 verwendet wurden.

Dünnschichtchromatographie

Enzym-Aufschlußprodukte von markierten Proteinen wurden auf Kieselgelplatten für die Dünnschichtchromatographie mit Konzentrationszone (20×20 cm) unter Verwendung entweder von n-Butanol : Essigsäure : Wasser (Volumenverhältnis 8 : 2 : 2) oder n-Propa­ nol : konz. Ammoniak (0,880) (Volumenverhältnis 7 : 3) als Lösungsmittel getrennt. Nach der Entwicklung wurden die Platten getrocknet und dann radiographisch unter Verwendung eines Kodak-Röntgenfilms aufgenommen, um die markierten Peptidprodukte festzustellen. Aufschlußprodukte mit Chymotrypsin (E.C. 3.4.4.5) oder Subtilisin (E.C. 3.4.4.16), das auf einem festen Träger immobilisiert war, oder mit Subtilisin oder Proteinase K (E.C. 3.4.21.14) in löslicher Form ergaben sämtlich ein Gemisch von Produkten. Unter diesen befand sich in jedem Fall eine Verbindung, die mit authentischem Asparagyl-phenylalanin cochromatographierte (Fig. 5 zeigt ein Autoradiogramm einer Siliciumdioxid-Dünnschichtchromatographieplatte, auf der die Produkte der enzymatischen Digestion von (Asp-Phe) _n -Protein getrennt sind). ¹⁴C-markiertes (Asp- Phe) _n -Protein, das von einem 12,5% Acrylamid und 0,1% SDS enthaltenden Gel isoliert worden war, wurde 16 Stunden bei 37°C mit Subtilisin digeriert, das auf einem festen Träger immobilisiert war. Die Dünnschichtchromatographieplatte wurde mit n-Propanol : Ammoniak (0,880) (Volumenverhältnis 7 : 3) entwickelt. Die Pfeile deuten die Lagen der Markers von authentischem (Asp-Phe) und (Phe-Asp) an. Wenn diese Verbindung von der Dünnschichtchromatographieplatte isoliert und in Salzsäure hydrolysiert wurde, ergab sie nur Asparaginsäure und Phenylalanin.

Hydrolyse von induziertem Protein zur Bildung von L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin

Von einem Acrylamidgel isoliertes ¹⁴C-markiertes (Asp- Phe) _n -Protein oder ein rohes Zell-Lysat, das hergestellt worden ist durch Lysis von induzierten ¹⁴C-markierten E. coli-Zellen, die pWT 121/(Asp-Phe) _n -Plasmide tragen, in einem Puffer, der 5% (Vol./Vol.) β-Mercaptoäthanol, 3% (Gew./Vol.) SDS und 65 mM Tris-Cl pH 8 enthielt, wurde für die Hydrolyse verwendet. Ein aus 1 ml einer induzierten Zellkultur hergestelltes Lysat oder das isolierte induzierte Protein aus einem gleichen Kulturvolumen wurde in einem Rohr mit 1 ml 6M-Salzsäure zugeschmolzen und 16 Stunden auf 110°C erhitzt. Nach dieser Zeit wurde das Rohr geöffnet und der Inhalt herausgenommen und zur Trockene eingedampft. Die Untersuchung des Hydrolysats durch Dünnschichtchromatographie ergab die Anwesenheit von ¹⁴C-markierter L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin zusammen mit kleineren Mengen anderer Aminosäuren.

Beispiel 2

Ein Polymerisat (Asp-Phe) _n kann mit Hilfe eines Enzyms, z. B. Chymotrypsin oder Subtilisin, das an aromatischen Aminosäuren schneidet, gespalten werden. Als Alternative kann ein Polymerisat (Asp-Phe-Lys-Lys) _n hergestellt werden, das durch Trypsin oder durch ein Enzym von ähnlicher Spezifität oder durch eine Kombination von Enzymen unter Bildung des Dipeptids Asp-Phe spaltbar ist. Beispielsweise findet eine solche Spaltung an gepaarten basischen Aminosäureresten bekanntlich bei dem Verfahren statt, bei dem Hormonvorstufen zu aktiven Spezies, z. B. dem Kortiko­ tropin-β-lipotropin-MSH-enkephalin-System, gespalten werden (Nakanishi et al., Nature, 278 [1979], 423-427).

Ein Gen für ein solches repetitives Tetrapeptid kann durch Verbinden von vier chemisch synthetisierten Dodecanucleotiden hergestellt werden:

• 1) A.A.G.A.T.T.T.C.A.A.A.A
  2) A.G.G.A.C.T.T.T.A.A.G.A
  3) A.G.T.C.C.T.T.T.T.T.G.A
  4) A.A.T.C.T.T.T.C.T.T.A.A

Hierbei wird die folgende repetitive Struktur gebildet:

Dies erfordert die Verwendung von zwei Codons für jede der Aminosäuren: G.A.T und G.A.C für Asp; T.T.T und T.T.C für Phe und A.A.A und A.A.G für Lys. Diese sind sämtlich in E. coli brauchbar. Der einzige Restriktions­ enzym-Erkennungsort innerhalb dieses polymeren Gens ist das für EcoRI′ (A.G.A T.T.T).

Die Reparatur des vorstehend genannten polymeren Gens unter Verwendung von E. coli-DNS-Polymerase I ergibt ein Molekül, das bei Ligation am stumpfen Ende in den Hind III-Ort beispielsweise des Plasmids pWT 111 im richtigen Leserahmen liest.

Das Versuchsverfahren wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt. Das nach der Induktion erhaltene erforderliche Polypeptid kann beispielsweise unter Verwendung von Trypsin gespalten und das Asp-Phe-Dipeptid isoliert werden.

Beispiel 3

Geringe Mengen des Tripeptids Pyro-Glu-His-Gly haben die Fähigkeit, eine appetithemmende Reaktion bei Tieren auszulösen, d. h., es verursacht eine Verminderung der Futteraufnahme und ist daher von Interesse bei der Steuerung des Appetits beim Menschen (O. Trygstad et al., Acta Endocrinol, 89 [1978], 196-208).

Ein Polymerisat der Form (Glu-His-Gly-Lys-Lys) wird gewöhnlich unter Verwendung von beispielsweise Trypsin gespalten, wobei das Tripeptid Glu-His-Gly erhalten wird. Glutaminsäure kann unter der Einwirkung von Wärme in Pyroglutaminsäure umgewandelt werden; siehe beispielsweise US-PS 25 28 267.

Ein solches repetitives Polymerisat ist für ein repetitives Gen codiert, das aus vier chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, zwei Tetradecanucleotiden und zwei Hexadecanucleotiden besteht:

• 1) A.G.G.A.A.C.A.C.G.G.T.A.A.G.
  2) A.A.A.G.A.G.C.A.T.G.G.C.A.A.A.A
  3) C.T.C.T.T.T.C.T.T.A.C.C.G.T.
  4) G.T.T.C.C.T.T.T.T.T.G.C.C.A.T.G

Diese Oligonucleotide können unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren phosphoryliert und durch Ligation verknüpft werden, wobei die folgende Struktur erhalten wird:

Zwei Codons werden für jede Aminosäure verwendet: G.A.A und G.A.G für Glutaminsäure; C.A.C und C.A.T für Histidin; G.G.T und G.G.C für Glycin und A.A.A und A.A.G für Lysin. Alle diese Codons sind in E. coli brauchbar. Restriktions­ enzym-Erkennungsorte sind in diesem Gen nicht vorhanden. Das Versuchsverfahren wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt. Dieses Gen liest im richtigen Leserahmen, wenn es beispielsweise mit dem stumpfen Ende in den Hind III-Ort des Plasmids pWT 111 verknüpft wird.

Beispiel 4

Das Pentapeptid Arg-Lys-Asp-Val-Tyr ist ein Analogon des Hormons Thymopoietin, das Induktion der Differenzierung von Pro-Thymozyten zu Thymozyten bewirkt (Goldstein et al., Science, 204 [1979], 1309-1310). Es findet medizinische Anwendung für die Behandlung von Störungen der Thymusdrüse.

Ein repetitives Gen, das für ein Polymerisat dieses Analogons des Thymushormons codiert, kann aus vier chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, zwei Tetradecanucleotiden und zwei Hexadecanucleotiden, konstruiert werden:

• 1) A.C.C.G.T.A.A.A.G.A.T.G.T.T.T.A
  2) C.C.G.A.A.A.G.G.A.T.G.T.C.T
  3) T.T.T.C.G.G.T.A.A.A.C.A.T.C.T.T.
  4) T.A.C.G.G.T.A.G.A.C.A.T.C.C

Diese Oligonucleotide können phosphoryliert und durch Ligation verknüpft werden, wobei die folgende Struktur erhalten wird:

In dieser Struktur werden Einzelcodons für Tyrosin (T.A.C) und Asparaginsäure (G.A.T) verwendet, während zwei Codons für Arginin (C.G.T und C.G.A), Lysin (A.A.A und A.A.G) und Valin (G.T.T und G.T.C) verwendet werden. Innerhalb des Gens ist ein einzelner Restriktionsenzym-Erkennungsort für das Enzym Acc I (G.T.C.T.A.C) vorhanden. Dieser Ort wiederholt sich alle 30 Basenpaare. Dieses Gen ist so aufgebaut, daß es im richtigen Leserahmen liest, wenn es durch Ligation am stumpfen Ende in den Hind III-Ort beispielsweise des Plasmids pWT 111 eingeführt wird. Das Versuchsverfahren wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt.

Beispiel 5

Die Enkephaline sind natürlich vorkommende Peptide, die im menschlichen Gehirn gefunden werden und eine Rolle als schmerztötende Verbindungen spielen sollen. Sie sind daher von erheblichem pharmazeutischem Interesse. Es gibt zwei bekannte Verbindungen, Met-Enkephalin, das die Sequenz (Try-Gly-Gly-Phe-Met) hat, und Leu-Enkephalin, in dem das endständige Methionin durch Leucin ersetzt ist. Das vorliegende Beispiel ist auf Met-Enkephalin gerichtet, aber ein ähnliches Verfahren ist auf Leu-Enkephalin anwendbar. Ein Polymerisat von (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Lys-Lys) _n kann beispielsweise durch Trypsin gespalten werden, wobei das erforderliche Pentapeptid erhalten wird. Ein solches Polymerisat ist durch ein repetitives Gen bestimmt, das aus sechs chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, zwei Octadecanucleotiden und vier Dodecanucleotiden, konstruiert ist:

• 1) G.T.A.T.G.G.T.G.G.A.T.T.T.A.T.G.A.A.
  2) G.A.A.A.T.A.C.G.G.A.G.G.
  3) C.T.T.T.A.T.G.A.A.A.A.A.
  4) T.A.T.T.T.C.T.T.C.A.T.A.A.A.T.C.C.A.
  5) A.T.A.A.A.G.C.C.T.C.C.G.
  6) C.C.A.T.A.C.T.T.T.T.T.C.

Diese Oligonucleotide können phosphoryliert und durch Ligation nach einer von zwei Methoden verknüpft werden:
Entweder können alle sechs Oligonucleotide gemischt und unter Bildung des gewünschten Polymerisats in einer Stufe verknüpft werden. Als Alternative können die Oligonucleotide 1, 2 und 4 und die Oligonucleotide 3, 5 und 6 getrennt verknüpft werden, wobei Blöcke erhalten werden, die dann gemischt und zur Bildung des gleichen Polymerisats mit der folgenden Struktur verknüpft werden:

In dieser Struktur dient A.T.G zur Codierung für Methionin und T.T.T zur Codierung für Phenylalanin. Eine Vielzahl von Codons wird für die anderen Aminosäuren verwendet: Tyrosin (T.A.T und T.A.C); Glycin (G.G.T, G.G.A und G.G.C) und Lysin (A.A.A und A.A.G). Innerhalb des Gens befinden sich einzelne Erkennungsorte für die Enzyme Mnl I (C.C.T.C), Mbo II (G.A.A.G.A) und EcoRI′ (G.G.A.T.T.T), wie vorstehend dargestellt. Diese Orte wiederholen sich alle 42 Basen. Das Gen ist so aufgebaut, daß es im richtigen Leserahmen liest, wenn es durch Ligation am stumpfen Ende in den Hind III-Ort beispielsweise des Plasmids pWT 121 eingefügt wird.

Claims (7)

1. Synthetisches Gen mit Codons für die Aminosäuren eines gewünschten Peptids im Codierungsstrang, dadurch gekennzeichnet, daß es die Codons in Tandemwiederholung enthält und erhältlich durch Selbstzusammenfügung und Ligation einer Vielzahl geeigneter Oligonucleotide, wobei die Zusammenfügung unter Ausbildung des repetitiven Charakters durch selbstkomplementäre überlappende Enden an den Endstellen der Gruppe von Oligonucleotiden erreicht wird, die nach der Zusammenfügung die repetitive Einheit des Gens darstellt.

2. Synthetisches Gas nach Anspruch 1 für die Expression der repetitiven Polypeptide (Asparagyl-phenylalanin) _n , worin n eine ganze Zahl von wenigstens 2 ist, gekennzeichnet durch ein doppelsträngiges DNS-Molekül, das im Codierungsstrang wenigstens zwei Nucleotidsequenzen, die für die Expression von Asparaginsäure codieren, und alternierend damit wenigstens zwei Nucleotidsequenzen, die für die Expression von Phenylalanin codieren, und im anderen Strang repetitive und alternierende Nucleotidsequenzen enthält, die komplementär zu den für Asparaginsäure und Phenylalanin codierenden Sequenzen sind und dadurch erhältlich, daß man eine erste Dodecanucleotidsequenz, die für Asparagyl-phenylalanin codiert, durch Verknüpfen geeigneter Nucleotidmonomerer bildet, eine zur ersten Sequenz komplementäre zweite Dodecanucleotidsequenz bildet, beide Dodecanucleotide unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase phosphoryliert und die erste und die zweite Sequenz unter Bildung einer doppelsträngigen DNS-Struktur mischt.

3. Synthetisches Gen nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Struktur

4. Plasmidvektor, der an einer Einfügungsstelle, die einem bakteriellen Promotor benachbart und abwärts von einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle liegt, ein synthetisches Gen nach Anspruch 1 so eingefügt enthält, daß das Gen unter bakterieller Promotorkontrolle ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor aus der pWT-Reihe ausgewählt ist.

5. Plasmidvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er der Plasmidvektor pWT 121 ist, an dessen Hind- III-Stelle ein synthetisches Gen nach Anspruch 2 eingefügt ist.

6. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine E. coli HB 101-Zelle ist, die durch Einfügung eines Plasmidvektors nach Anspruch 5 transformiert worden ist.

7. Verwendung einer Zelle gemäß Anspruch 6 zur Expression eines Peptids.