SE451595B - Plasmidvektor innehallande en syntetisk gen for expression av de repetitiva polypeptiderna(aspartyl-fenylalanin)n, der n er ett heltal av minst 2 samt e.coli transformerad med vektorn - Google Patents

Description

451 595 dessa minst tvâ nukleotidsekvenser vilka kodar för expression av fenylalanin, dels i den andra strängen innehåller sådana repetítiva och alternerande nukleotídsekvenser som är komple- mentära till de för asparaginsyra respektive fenylalanin kodande sekvenserna.

Den komplementära eller icke-kodande strängen av den syntetiska genen innehåller en av kodningssträngsekvensen bestämd sekvens i enlighet med de etablerade reglerna för basparbildning hos nukleínsyror.

Uppfinningen avser även en E coli-cell, som trans- formerats genom att en dylik plasmidvektor insatts i densamma.

Den syntetiska genens strängar framställes utgående från en serie korta oligonukleotider, vilka i sin tur fram- ställes genom att de erforderliga nukleotiderna hopfogas enligt kända metoder i en ordníngsföljd, som föreskrives av kodonerna för den önskade peptidens aminosyror och av de regler, som närmare anges nedan.

Oligonukleotiderna av genens kodningssträng och komple- mentära sträng bildar en överlappningsstruktur, som är uppbyggd pà generellt följande sätt: 5' al: Cl el 3' 3l Denna struktur är sammansatt av sex oligonukleotider, tre i vardera strängen. Men i själva verket kan strukturen hop- sättas av ett vilket som helst antal olígonukleotídpar, således av ett eller flera (hur många som helst) par, förutsatt att (1) de med ai och az, bï och bz, c] och c2 ... beteck- nade basparregionerna innehåller nukleotidbassekvenser som är komplementära inom paret i fråga men icke komplementära till sekvenserna av något annat par; (2) var och en av dessa regioner ai, az, b1, bz, c1, AN* 451 595 c ..... innehåller minst fyra nukleotidbassekvenser; och (3) summan av nukleotidbaserna i varje sträng, som efter att ha satts ihop kommer att omfatta polymerens repeti- tiva sekvens, är delbar med 3.

När en grupp oligonukleotider av denna art samman- blandas, hybridiserar oligonukleotidparens komplementära regio- ner till varandra till bildning av högmolekylära strukturer, i 1 i det ovan vilka sekvenserna av oligonukleotiderna (a1 - f uppritade schemat) är tandemupprepade, och detta i ett varie- rande antal gånger i olika molekyler, från nägra få gånger till många gånger. Vid det efterföljande förfarandet är det önsk- värt att maximera antalet av de polymerer, hos vilka sekvensen a1 finns vid 5'-ändarna. Detta uppnås genom att de ovan angivna 1 bl' cl 1 1 2 2 olígonukleotiderna a d1, e f , b c och d2 e2 blandas i ekvimolära mängder och därefter oligonukleotiden f2 a 2 tili- sättes i en mängd, som är ndndre än den ekvimolära. Eftersom komplementen till al och fï finns närvarande i submolära 1 och f1 vid ändarna. Generellt brukar den komplementära uppsättningens mängder, kommer de flesta polymerer att ha a 5'-terminalolígonukleotid tillsättas polymerisationsblandningen i en mängd, som är mindre än den ekvimolära i förhållande till de andra oligonukleotiderna, vilka alla finns närvarande i ekvimolära mängder.

Gapen (nicke) i kedjorna, nämligen vid skarvarna mellan intill varandra belägna oligonukleotider i kedjan, kan utfyllas genom hopskarvning med enzymet DNA-ligas (EC.6.5.1.1), vilket är ett känt förfarande.

De sålunda framställda molekylerna har ensträngsändar.

Dessa kan omvandlas till ändar med jäms liggande strängar med användning av enzymet DNA-polymeras I (EC.2.7.7.7) i enlighet med ett känt förfarande.

De så erhållna molekylerna kan klonas i celler av E coli med användning av en önskad vektor. Speciellt kan man använda en plasmidvektor vald ur den s k “pWT-serien", se t ex Tacon et al, Molec Gen Genet 177, 427 (1980); man väljer vek- torn så, att den syntetiska genen när den insatts i korrekt orientering avläses i den önskade läsramen för översättningen (translation). 451 595 Fig 1 visar ett schema för framställning av en rekom- binantplasmid (pWT 121 (Asp-Phe)n), som innehåller den repe- titiva genen för (Asp-Phe)n i korrekt DNA-fas för expression av ett (Asp-Phe)n-protein. Plasmidens DNA, som visas överst pá fig 1, skäres upp med restriktionsenzymet Hind III och repa- reras sedan med E coli DNA polymeras I till bildning av en molekyl med jäms liggande strängändar. Hos den för (Asp-Phe)n kodande polymeren, som visas nederst i fig 1, repareras den frán början ensträngiga 5'-änden pá liknande sätt, så att man även här erhåller en molekyl där änden uppvisar jäms liggande strängändar. När dessa tvâ molekyltyper med jäms liggande strängändar sammanbindes medelst T4 DNA-ligas, erhåller man den mitt i fig 1 visade rekombinant-DNA, som har den korrekta DNA-läsramsfasen för expression av (Asp-Phe)n.

Kloning av denna gen, selektion av bakteriekolonier, detektering av den genom genens expression erhållna polypeptid- produkten samt polypeptidens extrahering och rening är pro- cedurer, som alla kan utföras enligt kända metoder.

Denna polypeptid kan sedan spjälkas, antingen enzyma- tiskt med användning av specifika enzymer eller ocksá kemiskt, exempelvis genom användning av cyanogenbromid i och för spjälk- ning av polypeptidkedjor vid metioninrester.

I äskådliggörande syfte kommer nedan en speciell ut- föringsform av uppfinningen att beskrivas i större detalj, närmare bestämt tillämpningen på sötningsmedlet "Aspartam".

Aspartam är ett syntetiskt làgkalorisötningsmedel, som kemiskt kan sägas vara aspartyl-fenylalanin-metylester. Aspartam till- verkas för närvarande i enlighet med ett i flera steg utfört kemiskt syntesförfarande.

Eftersom Aspartam användes som sötningsmedel kan den totala konsumtionen av Aspartam bli potentiellt mycket stor.

Fördenskull har man ett stort intresse av att utveckla för- faranden, medelst vilka materialet i fråga kan erhållas på ett bekvämt sätt och i stor skala.

Man har funnit att Aspartam kan framställas medelst ett potentiellt storskaligt förfarande baserat på rekombinant- -DNA teknik, i det att en syntetisk gen, som kodar för (aspar- tyl~fenylalanin)n, insättes i en kloningsvektor som har en un] 451 595 kontrollerbar bakteriell promotor uppströms om och i huvudsak intill insättningsstället, och vektorn kan användas för trans- formeríng av bakterieceller, ur vilka den genom expression bildade polypeptiden kan erhållas, varpå polypeptiden kan spjälkas för erhållande av aspartyl-fenylalanin och sålunda även Aspartam.

Den syntetiska genen för expression av den repetitiva polypeptiden (aspartyl-fenylalanin)n omfattar en dubbel- strängig DNA~molekyl, som i sin kodningssträng innehåller dels minst två nukleotidtrimerer vilka kodar för expressíon av asparaginsyra (Asp) och dels, alternerande med nämnda trimerer, minst tvà nukleotidtrimerer vilka kodar för expression av fenylalanin (Phe), varvid den andra strängen innehåller repe- terande och alternerande nukleotidsekvenser som är komplemen- tära till (Phe)- och (Asp)-kodningssekvenserna.

Kodningssträngen av den syntetiska genen, dvs den sträng som kodar för den repetitiva polypeptiden (Asp-Phe)n, kan således anges såsom kodande enligt följande: 5' - (Asp-Phe-Asp-Phe)n - 3' där n betecknar ett heltal av exempelvis upp till flera hundra.

Det finns två möjliga kodoner för Phe, nämligen (T-T-T) och (T-T-C), och två möjliga kodoner för Asp, nämligen (G-A-T) och (G-A-C), och dessa alternativa varianter kan använ- das helt urskiljníngslöst i stället för varandra, med mot- svarande komplementära sekvenser i den andra strängen. Exempel- vis kan kodningssträngen vara en nukleotidsekvens Phe Asp Phe Asp Phe Asp y 1 | n u , f f f l 5' -T~T-T-C-G-A-C-T~T-C-G-A-T-T-T-C-G-A-C-T-T- 3' med en komplementär sträng vars sekvens är 3' -A-A-A-G-c-T-G-A-A-G-c-T-A-A-A-G-c-T-G-A-A- 5' I detta fall användes (T-T-C) som fenylalaninens kod- níngssekvens och användes båda kodonerna (G-A-C) och (G-A-T) alternerande för asparaginsyra. 451 595 För fackmannen torde det stå klart, vilka övriga permutatíoner och kombinationer kan komma i fråga för de kodande nnkleotidsekvenserna och vilka strukturer de komple- mentära strängarna då kommer att uppvisa.

Den syntetiska "Aspartam-genen" enligt föreliggande uppfinning kan framställas genom polymerisation av ett dubbelsträngigt fragment av DNA, bestående av två dodeka- nukleotidsträngar, den ena med sekvensen för expression av (Asp-Phe)2 = kodningssträngen, och den andra, dvs den komple- mentära strängen, uppvisande komplementära baser till kodnings- strängens baser.

Enligt föreliggande uppfinning kan man åstadkomma en första, för aspartyl-fenylalanin kodande dodekanukleotidsekvens genom hoplänkning av tillämpliga nukleotidmonomerer, åstadkomma en andra dodekanukleotidsekvens, som är komplementär till den första sekvensen, fosforylera båda dodekanukleotider med an- vändning av T4-polynukleotidkinas, och sammanblanda de första och andra sekvenserna för bildning av en tvàsträngig DNA- -struktur. var och en av dodekanukleotidsträngarna kan synteti- seras ur respektive monomerer, som skyddas med blockerings- grupper pà känt sätt och sammanlänkas medelst konventionell fosfotriestermetodik [se t ex Hsiung et al, Nucleic Acids Research 6, 1371-1385 (1979)]; från de sålunda erhållna dode- kamererna avlägsnar man blockeringsgrupperna, varpå dodeka- mererna renas. Efter reningen och fosforylering med T4-poly- nukleotidkinas (EC.2.7.1.78) sammanblandas de kodande och komp- lementära strängarna. Detta har till följd att dubbelsträngiga produkter bildas på grund av vätebindningar. Man har funnit att man genom användning av den för (Asp-Phe)2 kodande dodekameren som kodningssträng och en motsvarande dodekanukleotid som komp- lementär sträng erhåller mycket stabila dubbelsträngsstruktu- rer, vilka bildas till följd av strängarnas 6-basöverlappning.

För ovan anförda exempel kan denna skrivas 5' pT-T-T-C~G-A-C-T~T-C-G-A 3' 3' G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C~Tp 5' 451 595 Linjär polymerisering av ovan angivna dubbelsträngsstrukturer 4 DNA-ligas (EC.6.5.1.1) till bildning av långa polymerer (längderna är slumpvisa). Efter frånskiljande av icke-ligerat material finner man att man erhålles genom inkubation med T erhållit en kollektion polymerer innehållande från 2 till 500 och ännu fler upprepningar av grundenheterna.

Expression av (aspartyl-fenylalanin)n åstadkommes genom att en sådan syntetisk gen insättes i ett insättningsställe hos en plasmidvektor med läsram i den korrekta fasen för den insatta genen, varvid insättningsstället befinner sig intill en bakteriell promotor och nedströms om ett prokaryotribosom- bindningsställe, att man med användning av den sålunda erhållna plasmidvektorn transformerar kompetenta mikrobiella celler, att de transformerade cellerna odlas och att den bildade peptiden tíllvaratas.

Vid framställning av Aspartam (metylestern av aspartyl- -fenylalanin) insättes ovannämnda syntetiska gen i en för kloning avsedd plasmidvektor, t ex pWT 121, som är konstruerad med läsram i den korrekta fasen för expression'av den insatta genen och som har en bakteriell promotor uppströms om och intill insättningsstället. Plasmidvektorn kan användas för transformering av E coli HB 101 celler, och den bildade (Asp-Phe)n kan tillvaratas och underkastas enzymatisk spjälk- ning med användning av ett enzym, som är specifikt för amino- syror med aromatiska sidokedjor,såsom subtilisin (EC.3.4.4.16), kymotrypsin (EC.3.4.4.5) eller proteinas K (EC.3.4.21.14), i och för erhållande av aspartyl-fenylalanin som metyleras för bildning av Aspartam. Det använda enzymet kan föreligga i en löslig form eller kan - företrädesvis - vara immobiliserat på ett fast underlag. Metyleringen kan utföras antingen på kon- ventionellt kemiskt sätt eller genom en utbytesreaktion med enzymet i närvaro av metanol, eller genom direkt enzymatisk metanolys av polymeren.

Eftersom den genetiska koden är baserad på tripletter kan genen i princip läsas i tre olika faser. Det är därför viktigt för genen att den inlägges i en sådan plasmidvektor som ger en översättning (translation) i den korrekta läsramen. 451 595 Det har visat sig att en föredragen plasmidvektor för användning i samband med föreliggande förfarande är en vektor ur ovannämnda "pWT-serie".

Ett utmärkande grunddrag hos plasmider tillhörande pWT-serien är att de har ett Hind III (EC.3.1.23.21) restrik- tionsställe intill en klonad E coli tryptofanpromotor. Genom restriktion med Hind III och insättning av Hind III påkopp- lingslänkar är det i pWT~serien möjligt att konstruera plas- mider, som kan översätta i samtliga tre läsramar. Dessa plasmider är pWT 111, pWT 121 och pWT 131 som beskrives i ovan anförda litteraturställe.

Transkription och översättning av insatt DNA i plasmider till- hörande pWT-serien förgiggår under direkt och stark tryptofankon- troll; operonet är sålunda undertryckt i närvaro av tryptofan, me- dan undertryckandet upphäves tofan. i frånvaro av tryp- I regionen omedelbart efter Hin d III stället uppvisar plas- miderna i pWT-serien även genenför tetracyklinresistens; därför kan efter DNA-insättningen transkriptionen och översättningen lätt bekräftas: Om transkription och översättning har ägt rum får man en bibehållen tetracyklinresistens.

Enligt en föredragen utföringsform av förfarandet skall där- för den syntetiska genen insättas i den passande plasmiden ur pWT- -serien, d.v.s. plasmiden "pWT 121". Denna plasmid visas schema- tiskt i fig. 2. Den har följande karakteristika: Molekyllängd U837 bp; ett Hpa I (E.C. 3.l.23.23) ställe; ett Hin d III ställe 206 bp från Hpa I stället; ett Bam HI (E.C. 3.l.23.6) ställe 355 bp från Hin d III stället; ett Sal I (E.C. 3.l.25.57) ställe 275 bp frän Bam HI stället; ett Pst I (E.C. 5.1. 23.31) ställe 2958 bp från Sal I stället och lOU5 bp från Hpa I stället; genen för tetracfidinresistens sträcker sig från Hpa I ställets region till ett ställe bortom Sal I stället; genen för ampicillinresistens i Pst I ställets region och den klonade delen av trp-operonet omfattar regionen mellan promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I och Hin d III ställena.

Den syntetiska Aspartamgenen enligt föreliggande uppfinning klonades in i pWT 121 på följande sätt: Plasmiden pWT 121 underkastades restriktion med enzymet Hin d III till bildning av en linjär molekyl, som sedan behand- rr 451 595 lades med DNA-polymeras och alla fyra deoxíribonukleosidtrifos- faterna till bildning av fullständigt basparade ändpartier, med strängändarna liggande "jäms". Denna molekyl med jäms liggande strängändar behandlades sedan med bakteriellt alkaliskt fosfatas (E.C. 3.l.3.l) för avlägsnande av 5'-fosfaterna. Efter denna behandling är plasmiden förberedd för insättning av den synte- tiska genen, som först behandlas enligt följande: Den syntetiska genen behandlas med E. coli DNA-polymeras och alla fyra deoxiribonukleosidtrifosfaterna till bildning av jäms liggande strängändar, och de "reparerade" generna avskiljes från enzymet och små molekyler.

Vektor-DNA med jäms liggande strängändar och genmate- rial med jäms liggande strängändar blandas i ett förhållande från 1:1 till 1:2 och ligeras ihop med höga koncentrationer av T4 DNA-ligas till bildning av plasmidserien "pWT 121/(Asp- -Phe)n". De klonade insatsernas storlekar bestämdes genom omsättning med restriktionsenzym och befanns uppgå till 60-900 bp (dvs 5-75 upprepningar av dodekanukleotidenheten).

De pà ovan beskrivet sätt framställda pWT 121/(Asp- -Phe)n plasmiderna användes för transformering av E coli-celler på känt sätt, t ex genom att med kalciumklorid behandlade celler exponerades för pWT 121/(Asp-Phe)n plasmiden. Då trans- formerade celler på känt sätt odlades i tryptofanfritt medium, som företrädesvis innehöll B-indolakrylsyra, bildade cellerna ett protein som i huvudsak bestod av (Asp-Phe)n, vilket efter enzymatisk spjälkning och metylering gav den önskade aspartyl- -fenylalaninmetylestern, Aspartam.

Såsom ovan omnämnts erhålles produkten Aspartam kon- ventíonellt medelst en kemisk syntes, som utföres i ett flertal steg. En vid denna konventionella syntes använd mellanprodukt är L-fenylalanín. Om fenylalanín framställes medelst kemiska syntesförfaranden erhålles denna förening i form av ett race- mat, som måste underkastas upplösning i sina isomerer så att L-isomeren kan erhållas. Detta betingar ett ytterligare, dyrt förfaringssteg. När däremot fenylalanín framställes enligt en utföríngsform av föreliggande uppfinning, erhålles den direkt i form av L-isomeren. (Asp-Phe)n~peptiden, isolerad från en kul- tur av E coli-celler innehållande plasmider med den syntetiska 451 595 10 Aspartam-genen, behandlas härvid med ett surt eller enzymatiskt hydrolyseringsmedel, varpå den önskade L-fenylalaninen avskil- jes från hydrolysatet. Vid detta förfarande erhålles givetvis även L-asparaginsyra.

Föredragna hydrolyseringsmedel är bl a klorvätesyra eller kerbexipeptiaae (Ec.3.4.12.x), aminepeptiaae (Ec.3.4.11.- x) eller ospecifika endopeptidaser.

Hydrolysprodukternas avskiljande kan åstadkommas i enlighet med kända metoder.

Uppfinningen àskâdliggöres ytterligare i nedanstående exempel.

Exemgel 1 (Asp-Phe)n Syntes av dodekanukleotíder De båda dodekanukleotiderna TpCpGpApApApTpCpGpApApG och TpTpTpCpGp ApCpTpTpCpGpA syntetiserades medelst konventionella triestermetoder såsom beskrivits hos exempelvis Hsiung, loc. cit. och i enlighet med det i fig. 3 visade reaktionsschemat. Med N betecknas i fig. 3 . Från de fullständigt skyddade dodekanuk- GiS°b“, T, cbz eller Abz leotiderna avlägsnades blockeringsgrupperna med 2%-ig (vikt/volym) bensensulfonsyra, 0,1 M tetraetylammoniumfluorid i THF/pyridin/vat- ten (volymförhållande 8:l:l), med efterföljande behandling med ammoniak. De från blockeringsgrupperna befriade dodekanukleotiderna renades medelst HPLC på "Partisil 10 Sax" (mikropartikelformig ki- seldioxid, som derivatiserats med kvaternära ammoniumgrupper (whatmanb.

Polymerisation av dodekanukleotider Varje syntetisk dodekanukleotid (2 pg) fosforylerades i ett 10 149 reaktionsmedium, innehållande 10-50 ;1Cíy 32P-ATP, 50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 5 mM magnesiumklorid, 0,25 mM omärkt (unlabelled) ATP, 10 mM merkaptoetanol och 3 enheter T4-poly- nukleotidkinas (EC.2.7.1.78). (1 enhet är den mängd, som under standardbetingelser åstadkommer överförande av 1 nanomol 32P-feefet från y(32P)-ATP till 5'-hyarexiänden av en poly- nukleotid inom 30 min vid 37°C, se exempelvis Richardson, -Nucleic Acids Research, 2, 815). Efter 60 min vid 37°C blanda- des de båda dodekanukleotiderna, omärkt ATP tillsattes för att öka ATP~halten till 1 mM, tillsammans med 0,1 enhet (som strax n 451 595 11 kommer att definieras) T4-DNA~ligas (EC.6.5.1.1), och reak- tionsblandningen inkuberades 24 h vid 25OC. (1 enhet i detta sammanhang är den mängd, som omvandlar 100 monomol d(A-T)1 000 till en mot exonukleas III resistent form inom 30 min vid 30°C under standardbetingelser, se t ex Modrich och Lehman, J Biol Chem, 245, 3626 (1970).) ATP och icke-ligerade nukleotidmono- merer avlägsnades genom passage nedåt på en kolonn av "Sephadex G-50" (20 cm x 0,8 cm) i 50 mM natriumklorid, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 0,2% (vikt/volym) natriumdodecylsulfat (SDS).

"Sephadex" är ett varumärke; "Sephadex G-50" är en superfin partikelformig modifierad dextranpolymer med tvärbindningar, Pharmacia. De dubbelsträngíga polymererna koncentrerades genom utfällning med etanol. Efter separation befanns produkten vara en blandning av polymerer med slumpvisa längder, innehållande från- 2 till mer än 500 upprepningar av grundenheterna.

Kloning av den syntetiska genen (a) Reparation av den syntetiska genen till bildning av jäms liggande strängändar Zlug polymer, som framställts på ovan beskrivet sätt, inku- berades i UO,ul blandning med 50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 5 mM mag- nesiumklorid, 1 mM merkaptoetanol, 0,125 mM av vart och ett av de fyra deoxinukleosidtrifosfaterna och 2 enheter E. coli DNA polymeras I (E.C. 2.7.7.7). I detta sammanhang avses med l enhet den mängd, som åstadkommer inkorporering av 10 nanomol nukleotid i en medelst syra utfällbar form inon=30 minuter vid 3700 under standardbetingelser och med användning av poly d (A-T) som mall; se t. ex. Richardson, et al. J. Biol. Chem., ëâg, 222,(l96fl).

Blandningen inkuberades 20 minuter vid 1000, och den så erhållna blandningen användes utan ytterligare rening. (b) Framställning av kloningvektorn pWT l2l 50/ug pWT 121 DNA omsattes med ett dubbelt överskott av Hin d Ill (E.C. 3.l.23.2l). Blandningen extraheradefi två gånger med samma volym fenol och underkastades utfällning med etanol.

Reparation med E. coli DNA polymeras för bildning av jäms liggande strängändar utfördes på det ovan under (a) beskrivna sättet.

Den erhållna DNA, som hade jäms liggande strängändar, behand- lades med bakteriellt alkaliskt fosfatas (E.C. 3.l.5.l.) för av- lägsnande av de i ändställning befintliga fosfaterna och för för- hindrande av aüzdaum mwxåter skulle övergå till ringform under den 451 595 12 efterföljande ligeringen. Den sålunda behandlade DNA inkuberades 30 minuter vid 3700 i närvaro av ett 2-faldigt överskott av enzym i 10 NM TTíS'Cl, PH 7,5, 0,l% SDS. Blandningen extraherades där- efter fullständigtmed fenol, tvättades flera gånger med kloroform och utfälldes sedan med etanol. (0) Ligering stumt ände mot ände I ett lzl viktförhållande blandades dodekanukleotidpolymer med jäms liggande strängändar, erhållen enligt (a) ovan, och pWT 121 DNA med jämsligfimde strängändar, erhållen enligt (b) ovan, och man ligerade vid 1500 med 0,2 enheter Tu DNA ligas i en 20/ul blandning, innehållande 50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 5mM magnesiumklo- rid, -lmM ATP och 10 mM merkaptoetanol. Efter 2ü timmar var pWT 121/ (ASP-Phenfrekombinantplasmiderna färdiga för användning i och för transformering av E.oo1i celler.

Transformation och genexpression E coli K12 HB 101 celler (genotyp gal_, lac_, ara-, pro-, arg-, strå, recA_, rk_, Mk_; Boyer, H W och Roullard- -Dussoix, D, J Mol Biol, 41, 459-472) transformerades i enlig- ß het med det förfarande, som beskrivits av Katz et al (1973), J Bacteriol, 114, 577-591, och avsattes på L-agarplattor, vilka kompletterats med 100 pg/ml ampícillin.

Rekombinantklonerna renades genom utstrykning för er- hållande av enskilda kolonier. Sålunda isolerade kloner under- söktes genom kolonihybrídisering på nitrocellulosafilter, (Grunstein och Hogness (1975), Proc Nat Acad Sci, USA 72, 3961-3965) med användning av en medelst kinas-märkt syntetisk dodekanukleotid som hybridiseringsmedel. Enskilda kloner, som vid kolonihybridisering befunnits vara positiva, odlades till ett A600-värde uppgående till 0,6 i 25 ml medium M9 (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, s 433), vilket medium försattes med ampicillin (100 ug/ml) och tryptofan (40 ng/ml). Ett 1 ml prov togs ut från denna undertryckta kultur och märktes genom 10 min behandling med 5 uCi 14C-aminosyror innan det behandlades i 10 min med 200 pl 20% (vikt/volym) “kasaminosyror" (Dífco).

Cellerna centrifugerades (10 000 x g, 10 min), tvättades flera gånger med fosfatbuffrad saltlösning, innehållande 100 lig/ml gelatin, för avlägsnande av överskott av som lnärkningsämnen ifl 451 595 13 ]4C-föreningar, och den slutligen erhållna centri- använda fugeringsåterstoden underkastades lys i 50 ul av en buffert (FSB) innehållande 10% (volym/volym) glycerol, 0,01% (vikt/ volym) bromfenolblått, 5% (volym/volym) B-merkaptoetanol, 3% (vikt/volym) SDS och 65 mM Tris-Cl, pH 8; lyseringen åstadkoms genom 2 min upphettning till 90°C. Återstoden av den ursprung- liga 25 ml kulturen centrifugerades (10 000 x g, 10 min) och återsuspenderades i samma volym av medium M9, som försatts med 100 pg/ml ampicillin och 5 pg/ml B-indolakrylsyra. Efter olika induktionstider uttogs 1 ml prov och isotopmärktes på ovan beskrivet sätt. 5-10 ul portioner av de slutliga lysaten sepa- rerades på akrylamidgeler (12,5% polyakrylamid + 0,1% SDS, se t ex Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970). Gelerna torkades och autoradiograferades för fastställande av de isotopmärkta proteinernas lägen. Genom jämförelse av mönstren från oindu- cerade celler och inducerade celler kunde man identifiera de proteiner, som syntetiserats under kontrollen av tryptofan- promotorn.

Hig. H visar ett autoradiogram av en gel av 12,5% akrylamid; O,l% SDS. På denna visas separerade luC-märkta proteiner, synteti- Sefade i E- 00li celler, vilka innehåller rekombinantplasmider PWT 12l(ASP-Phe)n. Bana l visar proteiner, som märkts med luC-ami- HOSYPOP i närvaro av 40,ug/ml L-tryptofan, d.v.s. alla eventuella gener, som insatts vid Hin d III stället, är i detta fall under- Üfyßktä, Så att in%ñt protein bör produceras. Bana 2 visar pro- teiner märkta med C-aminosyror i frånvaro av L-tryptofan och i näPVaP0 av 5¿ug/ml B-indolakrylsyra, d.v.s. i detta fall kommer de insatta generna att vara fulltut inducerade, så att de bör bilda det protein, som anges av insatsens kod. [Det protein, som starkt framträder i bana 2, har visats vara en repetitiv polymer aV(ASD-Phe). ]Bana 3 resp. bana 4 svarar mot bana l resp. bana 2, med undantag av att den dubbla mängden protein har använts. De till höger angivna standardproteinmolekylvikterna är de hos en standardblandning av protein, som erhållits från Radiochemical Centre, Amersham, Buckinghamshire, England.

Isolering av isotopmärkta proteiner ur geler Särskilda band av proteiner isolerades från akrylamidgeler genom att proteinlysatet underkastades separering i en serie av parallella ~ -:-n 451 595 14 banor. En av dessa banor skars ut från gelen med skalpell OCH fär* gades med Coomassie Brillant Blue R (Gurr, Searle Diagnostics), medan resten av gelen indränktes 20 minuter i 15% (volym/volym) glycerol och lagrade: vid -7000. Den infärgade gelskivan torkades och autoradiograferades under en tid av 24-H8 timmar för att de- finiera läget för de isotopmärkta banden. På så sätt blir det möj- ligt att skära ut den intresserande delen av den frysta gelen.

Gelskivorna bröts sönder genom att pressas genom en l ml spruta av engängstyp utan nål, och det isotopmärkta proteinet elue- rades 24 timmar med 10 mm trietylammoniumbikarbonat, pH 7,5.

Gelfragment avlägsnades genom centrifugering, och den överstående vätskan dialyserades mot 10 mM trietylammoniumbikarbonat. Man erhöll på detta sätt 50-75% "utbyten" av isotopmärkta proteinband.

Omsättningar med enzymer ' Ûrena celldymuzeller isolerade band från akrylamidgeler omsattes antingen med proteolytíska enzymer i lösning, vid koncentratíoner av l-l0 mg/ml, eller med ekvivalenta mängder enzym, som immobíliserats på ett fast underlag; omsättningarna utfördes under tider av upp till 72 timmar. 10 mM trietylammoniumbikarbonat användes för omsättningar i pH-området 7-8, medan 10 mM glycin/natriumhydroxId-buffertaran- vändes vid upp till pH 10,5.

Tunnskiktskromatografi Enzymomsättningsprodukter av isotopmärkta proteiner separerades på för TLC avsedda Merck-silikagelplattor med koncentrationszon(20 x 20 cm), med användning av antingen en 8:2:2 (volym) blandning av n~_büt&n0l:ättíksyra:vatten eller en 7:3 (volym) blandning av n-pro~ panolzkoncentrerad (0,880) ammoniak som lösningsmedel. Efter fram- kallning torkades plattorna och autoradiograferades med användning av Kodak "Kodirex"-röntgenfilm för detektering av de isotopmärkta peptidprodukterna . Omsättningen med kymotrypsin(E.C. 3.ü.U.5) eller subtilisin (E.C. 3.P.ä.l6) som immobiliserats på ett fast under- lag, eller med subtilisin eller proteinas K (E.C. 3.4.2l.lH) i löslig form gav alltid en blandning av produkter. Bland dessa fanns i varje enskilt fall en förening, som vid kromatograferíng rörde sig tillsammans med autentiskt aspartyl-fenylalanin. (Fig. 5 visar ett autoradiogram av en TLC-silikaplatta på vilken produkterna från enzyma- tisk omsättning av (Aqoime )n-protein är separerade. Med luC märkt (Afldrhe )n-protein, som isolerats från en l2,5% æuylamid:0,l% SDS gel,omsattes 16 timmar vid 3700 med subtilisin, som immobiliserats u) 451 595 15 på ett fast underlag. TLC-plattan framkallades med n-propanol:0,880 ammoniak (7:3 volym/volvm). Pilarna visar lägena för som markörer använda, autentiska ( Amrrhe) och (Phe4mp ).) När den ovannämnda före~ ningen togs tillvara från TLC-plaüan och hydrolyserades i klorväte- syra, gav den enbart asparaginsyra och fenylalanin.

Hydrolys av inducerat protein för framställning av L-asparagin- syra och L-fenylalanin lnC-märkt (Asp-Phe )n-protein, som isolerats från en akrylamidgel, eller ett orent cell-lysat, som framställts genom lysering av inducerade luC-märkta E.coli celler, innehållande pWT 121/ (Asp-Phe)n plasmider, i en buffert innehållande 5% (volyml volym) p-merkaptoetanol, 3% (vikt/volym) SDS och 65 mM Tris-Cl, pH 8. Ett lysat berett av l ml inducerad cellkultur, eller det iso- lerade inducerade proteinet från en liknande kulturvolym förseglades i ett rör med l ml 6 M klorvätesyra och upphettades l6 timmar till llO°C. Efter denna tid öppnades röret och innehållet avlägsnades där- För hydrolysen användes ur och indunstades till torrt tillstànd. Dà hydrolysatet under- _ . . 1 ~ söktes genom tunnskiktskromatografi, visade denna att 4C-markt Lfasparaginsyra och L-fenylalanin fanns närvarande, tíllsannans med mindre mäng- der andra aminosyror.

Exempel 2 En polymer (Asp-Phe)n kan spjälkas medelst ett enzym såsom kymo- trypsin eller subtilisin, som skär in vid aromatiska aminosyror.

Alternativt kan en polymer (Asp-Phe-Lys-Lys)n bildas, som kan spjäl- kas medelst trypsin eller medelst ett enzym med liknande specifici- tet eller medelst en kombination av enzymer till bildning av dipep- tiden asp-phe. Man vet exempelvis att sådan spjälkning vid parade basiska aminosyrarester försiggår i samband med den process, vid vilken hormonprekursorer spjälkas till aktiva ämnen, t. ex. kortiko- tropín - B-lipotropin-MSH-enkefalin”systemet.(Nakanishi, et al., Nature, (1979), g1§, u25-h27).

En gen för en sådan repetitiv tetrapeptid kan framställas ge- nom att man hopsätter fyra kemiskt syntetiserade dodekanukleotider: (1) A.A.G.A.T.T.T.c.A.A.A.A (2) A.c.G.A.c.T.T.T.A.A.G.A (3) A.G.T.C.C.T.T.T.T.T.G.A (4) A.A.T.C.T.T.T.C.T.T.A.A 451. 595 16 till bildning av en repetitiv struktur: asp phe lys lys asp phe lys lys asp phe -raf-fif-“Wf-'fir-àr-'fif-xr-*fif-fl 5' A.A.G.A.T.T.T.C.A.A.A.A.A.G.G.A.c.tv.fr.T.A.Z\.G.A.A.A.G.A.T.T.T.T ' IL» n m' n I n n ~ (2) (1) EcoRI' 3' T.T.C.T.A.A.A.G.T.T.T.T.T.C.C.T.G.A.A.A.T.T.C.T.T.T.C.T.A.A.A.A.5' U) /l-è m <4) <3» <4) (a) Detta innebär användning av två kodoner för var och en av amino- syrorna, nämligen G.A.T och G.A.C för asp; T.T.T och T.T.C för phe; A.A.A och A.A.G för lys. Alla dessa kodoner är acceptabla i E. coli. Det enda igenkänningsstället för ett restriktionsenzym i denna polymera gen är stället för EcoRI' (A.G.A T.T.T).

Vid reparation av ovannämnda polymera gen med användning av E.colí DNA polymeras I erhålles en molekyl som ger en läsning i den korrekta läsramsfasen vid ligering stumt ände mot ände in i Hin d III stället av t. ex. plasmiden pwT 111.

Själva förfarandet utföres på samma sätt som beskrivits i exempel 1. Den erforderliga polypeptiden, som erhållits vid induktion, kan spjälkas med användning av t ex trypsin, och Asp-Phe-dipeptiden kan isoleras.

V)

Claims (4)

451 595 17 P a t e n t k r a v

1. Plasmidvektor, k ä n n e't e c k n a d a v att en syn- tetisk gen är insatt däri vid ett insättningsställe intill en bakteriell promotor och nedströms om ett prokaryotribosombind- ningsställe på sådant sätt att genen ligger under kontroll av den bakteriella promotorn, varvid denna gen är en gen för ex- pression av de repetitiva polypeptiderna (aspartyl-fenylalanin)n där n är ett heltal uppgående till minst 2, omfattande en dub- belsträngig DNA-molekyl, som dels i kodningssträngen innehål- ler minst tvâ nukleotidsekvenser vilka kodar för expressíon av asparaginsyra och alternerande med dessa minst två nukleotid- sekvenser vilka kodar för expression av fenylalanin, dels i den andra strängen innehåller sådana repetitiva och alternerande nukleotidsekvenser som är komplementära till de för asparagin- syra resp fenylalanin kodande sekvenserna.

2. Plasmidvektor enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att genen har följande struktur: :Vi 5 ' pT-T-T-c-G-A-c-T-T-c-G-A 3 ' 3 ' G-A-A-G-c-T-A-A-A-G-c-Tp 5 ' där n är ett heltal uppgående till minst 2.

3. Plasmidvektor enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a d a v att den är pWT 121, och att genen är insatt vid Hin d III-stället.

4. E. coli transformerad med en plasmidvektor enligt något av kraven 1-3.