NL8100437A

NL8100437A - Recombinant dna-technieken; synthetisch gen; werkwijze voor de bereiding daarvan; plasmidevector; werkwijze voor de bereiding daarvan; cel; werkwijze voor het transformeren van een cel; werkwijze voor het expirimenteren van een peptide; aldus verkregen peptide; (aspartyl-fenylalanine)n; werkwijze voor het bereiden van aspartyl-fenylalaninemethylester; aldus verkregen aspartyl-fenylalaninemethylester; werkwijze voor het bereiden van l-fenylalanine of l-aspartinezuur.

Info

Publication number: NL8100437A
Application number: NL8100437A
Authority: NL
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1980-01-30
Filing date: 1981-01-29
Publication date: 1981-09-01
Also published as: SE8100238L; IT1170653B; IL61952A; FR2479259A1; ES8203965A1; CH662821A5; ES498948A0; AU545908B2; AU6650781A; SE451595B; IT8147639A0; DK17881A; FR2479259B1; JPS579795A; IE810071L; IL61952A0; BE887290A; IE50833B1; CA1189466A; DE3102721C2

Description

m t κ VO 1545

Recombinant DNA-technieken; synthetisch gen; werkwijze voor de bereiding daarvan; plasmidevector; werkwijze voor de bereiding daarvan; cel; werkwijze voor het transformeren van een cel; werkwijze voor het exprimeren van een peptide; aldus verkregen peptide; (aspartyl-fenylalanine]n; werkwijze voor het bereiden van aspar-tyl-fenylalaninemethylester; aldus verkregen aspartyl-fenylalanine-methylester; werkwijze voor het bereiden van L-fenylalanine of L-aspartinezuur.

De uitvinding heeft betrekking ap recombinant DNA-technie- ken.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding in zijn breedste aspect betrekking op een werkwijze voor de bereiding van oligo-5 peptiden of polypeptiden door recombinant DNA-technieken, waarbij een synthetisch gen wordt gebruikt, dat codeert voor een repeterend polymeer van het gewenste oligopeptide of polypeptide.

De uitvinding heeft tevens betrekking cp een dergelijk synthetisch gen en op de bereiding daarvan.

10 De synthese van peptiden langs chemische weg is een bewerke lijk proces, dat met toenemende lengte van het peptide steeds minder efficiënt wordt. Anderzijds treedt bij de bereiding van peptiden door microorganismen in een fermentatieproces geen variatie in efficiëntierelatie tot de lengte van het peptideprodukt op. In 15 de in recombinant ÜNA-procsssen toegepaste organismen zijn echter korte peptiden metabolisch instabiel. Het is b.v. bekend dat net peptide scmatcstatine, dat uit 14 aminozuren bestaat, niet stabiel is wanneer het direct in E_. coli wordt bereid. In dat geval wordt stabiliteit verkregen door het peptide te koppelen aan een nor-2Q maal Ei. coli proteïne en vervolgens dit fusieprcdukt te splijten

Cltakura, k., e.a., Science 198, 105B - 1063, 1977).

Volgens de onderhavige werkwijze werden stabiliteit en verhoogde opbrengst gerealiseerd onder toepassing van een synthetisch 81 00 43 7 - 2 - β· * gen dat een veelvoudige herhaling van de volgorde, die voor een gewenst klein peptide codeert, bevat. Het produkt is derhalve een groot molecuul, dat metabolisch stabieler in E_. coli is dan het kleine peptide. De daaropvolgende splijting van het grote molecuul 5 geeft het kleinere peptide dat daarin aanwezig is en wel in een hogere molaire opbrengst dan verkregen zou worden wanneer het kleine peptide direct onder toepassing van een monomeer gen was bereid, zelfs wanneer het kleine peptide metabolisch stabiel zou zijn.

10 In een uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op een synthetisch gen, dat in de coderingsstreng codons bevat voor de aminozuren van een gewenst peptide in tandemherhaling.

Met de term "tandemherhaling" wordt hier de herhaling van de volgorde van codons bedoeld, in een lineaire voortgang langs het 15 DNA-molecuul met dezelfde polariteit en zonder onderbreking.

•o

De complementaire of niet-coderende streng van het synthetische gen bevat een volgorde, die bepaald wordt door de volgorde van de coderingsstreng overeenkomstig de aanvaarde regels van nu-cleïnezuurbasepaarvorming.

20 In een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrek king op een werkwijze voor de bereiding van een dergelijk synthetisch gen, welke de 2elfopbouw en ligatie en desgewenst reparatie van een veelheid van geschikte oligonucleotiden omvat, waarbij de opbouw voor het verkrijgen van het repeterende karakter gereali-25 seerd wordt door zelfcomplementaire overlappende einden aan de eindpunten van de groep der oligonucleotiden, welke na de opbouw de repeterende eenheid van het gen omvat,

In een verdere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op een plasmidevector die op een naast een bacteriële promo-30 tor er stroomafwaarts van een prokaryotische ribosoom bindings- plaats gelegen inbrengplaats een daarin gebracht zodanig synthetisch gen omvat, dat het gen onder bacteriële promotoroontrole staat.

In weer een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding be-35 trekking op een cel, die getransformeerd is doordat daarin een der- > 8100437 6 ·» - 3 - gelijke plasmidevector is ingebracht.

In een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het exprimeren van een peptide, waarbij een dergelijke cel wordt gekweekt.

5 Zoals bovenstaand aangegeven worden de strengen van het synthetische gen bereid uit een reeks korte oligonucleotiden die zelf bereid worden door de vereiste nucleotiden volgens bekende methoden samen te voegen in een volgorde, die bepaald wordt door de codons van de aminozuren van het gewenste peptide en de onder-1G staand meer gedetailleerd uiteengezette regels.

De oligonucleotiden van de coderingsstreng en de complementaire streng van het gen vormen een overlappende set welke overeenkomt met de volgende algemene structuur: ci 1 i .1 i 1 i ,1 i 1 i -1 5’ a ibicidieif i 3' " 1 I- I 1- I — f - — — |

* I I t I I I

15 I_I_I I_ I _I C, 3 ~~2 i ΤΊ ~2 ! T ! ~~3. 1 2 1 2 3 4 b i c i d i e i f i a

Ge hier weergegeven structuur is samengesteld uit zes oli-gonucleotiden, drie in elke streng. De structuur kan echter uit elk aantal paren oligonucleotiden van één paar opwaarts worden op-20 gebouwd, mits: 1 2 1 2 1

Cl] de gepaarde gebieden, aangeduid met a en a , b en b , c en 8100437 2 c .... nucleotide basevolgorden bevatten, die complementair zijn binnen het paar, maar niet aan de volgorden van elk ander paar,· 12 12 12 25 C2] elk van deze gebieden a,a,b,b,c,c .... tenminste 3 vier nucleotide basen bevatten; en 4 (3] de som van de nucleotide basen in elke streng, die na opbouw uiteindelijk de herhalingslengte van het polymeer omvat, deelbaar is door drie.

30 Wanneer een set oligonucleotiden van dit karakter wordt ge mengd, hybridiceren de complementaire gebieden van de oligonucleotide paren onder vorming van structuren met hoog molecuulgewicht, waarin de volgorden van de oligonucleotiden Ca* - f^ in het bovenstaande plaatje] in tandem worden herhaald van enkele keren tot 35 vele karen, in verschillende moleculen. In de daaropvolgende werk- * ff - 4 - wijze is het gewenst om het aantal polymeren die in de volgorde a^ op het 5'-eindpunt daarvan hebben, zo groot magelijk te maken.

Dit wordt gerealiseerd door de oligonucleotiden a1 b^, c* d^, 1 1 2 2 2 2 e f , b c en d e van het bovenstaande plaatje in equimolaire 2 2 5 hoeveelheden te mengen en vervolgens het oligonucleotide f a in een minder dan equimolaire hoeveelheid toe te voegen. Aangezien de complementen van a1 en f1 in submolaire hoeveelheden aanwezig zijn, zullen de meeste polymeren eindigen in a"*- en f*. In het algemene geval wordt het 5' terminale oligonucleotide van de comple-10 mentaire set aan het polymerisatiemengsel toegevoegd in een hoe veelheid, die minder is dan equimolair ten opzichte van de andere oligonucleotiden, die alle in equimolaire hoeveelheden aanwezig zijn.

De "inkepingen” in de ketens kunnen, waar naburige oligo-15 nucleotiden in de keten naast elkaar liggen, worden samengevoegd onder toepassing van de enzym ÜNA-verbinding CEC 6.5.1.1), een bekende procedure.

De aldus bereide moleculen zullen enkelvoudige strengeinden hebben. Deze kunnen worden omgezet in de zogenaamde "stompeinde”-20 vorm door toepassing van de enzym DNA-polymerase I CEC 2.7.7.7) volgens een bekende procedure.

De verkregen moleculen kunnen in competente microbecellen, in het bijzonder EE. coliworden gecloned onder toepassing van een gewenste vector. In het bijzonder kan een plasmidevector, gekozen 25 uit de zogenaamde ”pWT reeks", zie b.v. Tacon, e.a., Molec. Gen.

Genet., 177, 427 (1980) worden toegepast, waarbij de vector zodanig wordt gekozen dat het synthetische gen, wanneer dat ingébracht is in de correcte oriëntatie, gelezen wordt in het leesraam van de gewenste vertaling.

30 Van de tekening toont fig.1 een schema voor de bereiding van een recombinant plasmide (pWT 121 (asp-phe)n) dat het repeterende gen voor (asp-phe)n bevat in de correcte DNA-fasering voor het exprimeren van een (asp-phe^-proteïne. Het plasmide DNA, getoond aan de bovenzijde van het diagram, wordt geknipt met het 35 restrictie-enzym Hind III en vervolgens gerepareerd met E_. coli 8100437 - 5 - DNA polymerase I teneinde een molecuul met stomp einde te verkrijgen. Het voor Casp-phe)n coderende polymeer, getoond aan de onderzijde van het diagram, heeft zijn aanvankelijk uitstekende 5’-einde op gelijke wijze gerepareerd teneinde een ander molecuul met 5 stomp einde te verkrijgen. De samenvoeging van deze twee species met stomp einde met T4 DNA-ligase geeft het recombinant DNA, getoond in het midden van het diagram, met de correcte DNA-fasering voor het exprimeren van (asp-phe]n.

Het clonen van dit gen, de keuze van bacteriekolonies, de 10 detectie van het polypeptideprodukt van de gen-expressie en de ex tractie en zuivering van het polypeptide, kunnen alle volgens bekende procedures worden uitgevaerd.

Dit polypeptide kan vervolgens worden gespleten hetzij enzymatisch onder toepassing van specifieke enzymen, hetzij chemisch 15 b.v. docr gebruik van cyaanbromide, om polypeptideketens bij methi- onineresten te splijten.

Zoals de deskundige duidelijk zal zijn, kan de uitvinding op vele wijzen worden toegepast. De uitvinding kan b.v. worden gebruikt voor de peptidehormonen oyytocine, vasopressine en somato-20 statine, de enkefalinen (opiaat pentapeptiden) en de eetlust rege lende peptiden.

Ter illustratie zal thans één bepaalde uitvoeringsvorm van de uitvinding meer in detail worden beschreven voor de zoetstof "Aspartame”.

25 Aspartame is een kunstmatige zoetstof met lage calorische waarde die chemisch als aspartyl-fenylalaninemethylester kan worden beschreven. Aspartame wordt doorgaans bereid door een uit vele trappen bestaande chemische synthese.

Vanwege zijn toepassing als zoetstof, is het -totale ver-3G bruik van aspartame potentieel zeer groot en daarom bestaat grote belangstelling voor de ontwikkeling van bereidingen, waarbij het materiaal op geschikte wijze en op grote schaal kan worden verkregen.

Het is gevonden dat aspartame kan worden bereid door een 25 potentieel grootschalig proces, gebaseerd op recombinant DNA-tsch- 81 0 0 43 7 Λ Λ - 6 - nieken waarbij een synthetisch gen, dat codeert voor (aspartyl-fenylalanine)n wordt ingébracht in een cloonvector met een regelbare bacteriële promotor stroomopwaarts van en nagenoeg naast de inbrengingsplaats gelegen, en waarbij de vector gebruikt kan wor-5 den voor het transformeren van de bacteriecellen waaruit het ge- exprimeerde polypeptide kan worden verkregen en dit vervolgens kan worden gespleten om aspartyl-fenylalanine en derhalve aspartame te verkrijgen.

Derhalve heeft de uitvinding in een verdere uitvoerings-10 vorm betrekking op een synthetisch gen voor het exprimeren van het repeterende polypeptide (aspartyl-fenylalanine) , dat een DNA-molecuul met dubbele streng omvat dat in de coderingsstreng tenminste twee nucleotide trimeren bevat die coderen voor het exprimeren van aspartinezuur (Asp) en alternerend daarmee tenminste 15 twee nucleotide trimeren, die coderen voor het exprimeren van fe- nylalanine (Phe) en in de andere streng repeterende en alternerende nucleotide opvolgingen complementair aan de (Phe) en (Asp) coderende opvolgingen.

De coderingsstreng van het synthetische gen, d.w.z. de 20 streng die codeert voor het repeterende polypeptide (Asp-Phe)n, kan derhalve worden weergegeven als coderend: 5’ - (Asp - Phe - Asp - Phe)n - 3’ waarin n een geheel getal, b.v. tot verschillende honderden, voorstelt.

25 Er bestaan twee mogelijke codons voor Phe, nl. (T-T-T) en (T-T-C), en twee mogelijke codons voor Asp, nl. (G-A-T) en (G-A-C), en deze kunnen in elke permutatie met corresponderende complementaire opvolgingen in de andere streng worden toegepast. De coderingsstreng kan b.v. de volgende nucleotidevolgorde bezitten: 30 Phe Asp Phe Asp Phe Asp i-i ï-n-)<-->ï-1 5’ -T-T-T-C-G-A-C-T-T-C-G-A-T-T-T-C-G-A-C-T-T- 3’ met een complementaire streng met de volgorde: 3’ -A-A-A-G-C-T-G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-T-G-A-A- 5’

In dit geval wordt (T-T-C) als de volgordecodering voor fenylala-35 nine gebruikt en worden beide codons (G-A-C) en (G-A-T) alterne- 8100437 - 7 - • ft.

rend voor aspartinezuur gebruikt.

De andere mogelijke permutaties en combinaties van nucleo-tidevalgorde voor de coderings- en complementaire strengen, zullen de deskundigen duidelijk zijn.

5 Het synthetische "Aspartame gen” volgens de uitvinding kan worden bereid door de polymerisatie van een dubbel strengfrag-ment van DNA, bestaande uit twee dodecanucleotidestrengen, één met de volgorde voor het exprimeren van (Asp-Phe^* de coderingsstreng en waarbij de ander daaraan complementair.is, de complementaire 10 streng.

Derhalve heeft de uitvinding in een verdere uitvoeringsvorm betrekking op een dergelijke werkwijze, waarbij een eerste dodeca-nucleotidevolgorde wordt verschaft die codeert voor aspartyl-fenyl-alanine door geschikte nucleotidemonomeren aan elkaar te koppelen, 15 een tweede dodecanucleotidevolgorde wordt verschaft die complemen tair is aan de eerste volgorde, beide dodecanucleotiden worden ge-fosforyleerd onder toepassing van polynucleotidekinase en de eerste en tweede opeenvolgende samen worden gemengd onder vorming van een DNA-structuur met dubbele streng.

20 Oe dodecanucleotidestrengen kunnen elk worden gesyntheti seerd uit de desbetreffende monameren die op bekende wijze door blokkerende groepen worden beschermd en volgens een conventionele fosfotriëstermethodolagie worden gekoppeld Czie b.v. Hsiung e.a.. Nucleic Acids Research, _6, 1371 - 1385 C1979)], waarbij de aldus 25 verkregen dodecameren van blokkerende groepen worden ontdaan en vervolgens worden gezuiverd. Na zuivering en fosforylering met ΤΔ polynucleotidekinase (E.C. 2.7.1.78), worden de coderings- en complementaire strengen met elkaar gemengd met als gevolg dat dub-belstrengstructuren door waterstofbinding worden gevormd. Gevonden 30 is dat door toepassing van het dodecameer, dat codeert voor CAsp-

Phe)2 voor de coderingsstreng en een corresponderende dodecanucleo-tide complementairs streng, zeer stabiele dubbelstrengstructuren worden verkregen als gevolg van de overlapping van zes basen van de streng, die VGar het gegeven voorbeeld als volgt kan worden 35 weergegeven: 8100437 - a - 5’ pT-T-T-C-G-A-C-T:TrC-G-A^ 3' 3’ · G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-Tp 5’

Lineaire polymerisatie van de bovenstaande dubbelstrengstructuren wordt verkregen door incubatie met t4-dna- ligase (EC 6,5,KI) 5 waarbij lange polymeren met willekeurige lengte worden verkregen.

Na scheiding van niet geligateerd materiaal wordt gevonden, dat een gebied van polymeren wordt verkregen die 2 - 500 en meer herhalingen van de basiseenheden bevatten.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor 10 het exprimeren van (aspartyl-fenylalanine) , waarbij een dergelijk synthetisch gen wordt ingébracht in een inbrengingsplaats van een plasmidevector die in de correcte fase voor het ingebrachte gen leest, waarbij de inbrengingsplaats gelegen is naast een bacteri-ele promotor en stroomafwaarts van een prokaryotische ribosoom 15 bindingsplaats, competente microbecellen worden getransformeerd onder toepassing van de verkregen plasmidevector, de getransformeerde cellen worden gekweekt en het geëxprimeerde peptide wordt verzameld. Het polymere produkt wordt bovendien nieuw geacht,

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor 20 het bereiden van aspartame (de methylester van aspartyl-fenylala- nine), waarbij het bovenvermelde synthetische gen wordt ingébracht in een plasmidecloonvector, b.v. pWT 121, ontworpen om te lezen in de correcte fase voor expressie van het ingebrachte gen en met een bacteriële promotor, gelegen stroomopwaarts van en 25 naast de inbrengingsplaats. De plasmidevector kan worden gebruikt om _E. coli HB 101 cellen te transformeren, waarbij het geëxprimeerde (Asp-Phe)n wordt verzameld en wordt onderworpen aan enzymatische splijting onder toepassing van een voor aminozuren met aromatische zijketens specifiek enzym, b.v. subtilisine (E.C.3.4.4.16) 30 chymotrypsine (E.C. 3.4.4.5) of proteinase K (E.C. 3.4.21.14), waarbij aspartyl-fenylalanine wordt verkregen dat gemethyleerd wordt om aspartame te bereiden. Het toegepaste enzym kan in oplosbare vorm of bij -voorkeur onbeweeglijk gemaakt op een vaste drager worden toegepast. Nethylering kan met gebruikelijke chemische 35 middelen of door middel van een uitwisselingsreactie met het enzym 8100437 - 9 - bij aanwezigheid van methanol of door directe enzymatische metha-nolyse van het polymeer, worden uitgevoerd.

Gegeven de triplet-aard van de genetische code, sal het duidelijk zijn dat het gen in elk van de drie fasen kan worden 5 gelezen en het is derhalve essentieel voor een gen dat als piasmi- devector een vector wordt gebruikt, die voor vertaling in het correcte leesraam zorgdraagt.

Gevonden is dat een plasmidevector die bij voorkeur in de onderhavige werkwijze wordt toegepast, een vector is, gekozen uit 10 de bovenstaand vermelde zogenaamde "pWT-reeks".

In de basis omvatten de plasmiden van de pWT-reeks een Hin dill (E.C. 3.1.23.21) restrictieplaats naast een gecloonde E.coli tryptofaanpromotor. Door Hin d III restrictie en het inbrengen van Hin d III koppelaars is het mogelijk in de pWT-reeks om 15 plasmiden te construeren die in staat zijn tot vertalen in alle drie de leesramen, welke volgens de beschrijving in~de bovengenoemde literatuurplaats pWT 111, pWT 121 en pWT 131 zijn.

Overschrijving en vertaling van ingébracht DNA in de plasmiden van de pWT-reeks staat onder directe en sterke controle 20 van tryptofaan; het aperon wordt derhalve bij aanwezigheid van tryptofaan onderdrukt terwijl bij afwezigheid van tryptofaan het de-onderdrukt wordt.

Plasmiden van de pWT-reeks bezitten ook in het gebied dat onmiddellijk volgt op de Hin d III-plaats, het gen voor tetracy-25 clineweerstand, zodat na inbrengen van het DNA, overschrijving en vertaling gemakkalijk kunnen worden bevestigd omdat wanneer dit heeft plaats gevonden, tetracyclineweerstand is behouden.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige werkwijze wordt daarom het synthetische gen in het geschikte plasmide 30 van de pWT-reeks gebracht, d.w.z. het plasmide aangeduid als "pWT 121”. Dit plasmide wordt schematisch in fig.2 getoond en heeft de volgende eigenschappen:

een mclscuuilsngte van dB37 bc; een Hpa I (E.C. 3.1.23.233plaats; een Hin d III plaats 206 bp van de Hpa I plaats; een Bam Hl 35 (E.C. 3.1.23.5) plaats 353 bp van de Hin ο III plaats; een Sal I

8100437 - 10 - CE.C. 3,1,23.37) plaats 275 bp van de Bam Hl plaats; een Pst I CE.C. 3.1.23.31) pteats 2958 bp van de Sal I plaats en 1045 bp van de Hpa I plaats; het gen voor tetracyclineweerstand strekt zich uit van het gebied van de Hpa I plaats tot voorbij de Sal I plaats;

5 het gen voor de ampicillineweerstand in het gebied van de Pst I

plaats en het gecloonde gedeelte van het trp operon omvat het gebied tussen de promotor en het eerste gedeelte van het E gen tussen de Hpa I en de Hin d III plaatsen.

Het synthetische aspartame gen volgens de uitvinding werd 10 tot pWT 121 gecloond op de volgende wijze:

Het plasmide pWT 121 werd aan restrictie met het enzym Hin d III onderworpen om een lineair molecuul te verkrijgen dat vervolgens behandeld werd met DNA-polymerase en alle vier de de-oxyribonucleoside trifosfaten om volledig basegepaarde "stompe 15 einden" te verkrijgen. Het molecuul mefcstomp einde werd vervolgens behandeld met bacteriële basische fosfatase CE.C. 3.1.3.1) om de 5’-fosfaten te verwijderen. Het plasmide wordt nu in gereedheid gebracht voor inbrengen van het synthetische gen dat eerst als volgt wordt behandeld: 20 het synthetische gen wordt behandeld met Ei. coli DNA-polyme rase en alle vier de deoxyribonucleosidetrifosfaten om stompe einden te verkrijgen en de "gerepareerde" genen worden van het enzym en kleine moleculen afgescheiden.

Vector DNA met stomp einde en gen-materiaal met stomp einde 25 wordt gemengd in een verhouding van 1 : 1 tot 1 : 2 en samen geli- gateerd met hoge concentraties DNA-ligase om de reeks van plas-miden "pWT 121/(asp-phe)n” te verkrijgen. De afmetingen van de gecloonde invoegingen, bepaald door restrictie enzymontsluiting. bleken te variëren van 60 tot 900 bp Cd.w.z. van 5-75 herhalingen 30 van de dodecanucleotide-eenheid).

De zoals boven beschreven pWT 121/Casp-phe) plasmiden worden gebruikt om op een bekende wijze E_. coli cellen te transformeren, b.v. door blootstelling van met calciumchloride behandelde cellen aan het pWT 121/Casp-phe)^ plasmide. Getransformeerde csl-35 len, die op bekende wijze gekweekt waren in een medium dat geen 8100437 - 11 - tryptofaan bevatte en bij voorkeur be inleider /3-indolearcylzuur bevatte, leidde tot expressie van een proteïne dat in hoofdzaak uit Casp-phe)n bestond, dat na enzymatische splijting en methyle-ring de gewenste aspartyl-fenylalaninemethylester, aspartame gaf.

5 Zoals bovenstaand is vermeld, wordt het produkt aspartame conventioneel verkregen door een uit vele trappen bestaande chemische synthese. Een in deze conventionele synthese gebruikt tussen-produkt is L-fenylalanine. De uitvinding heeft tevens betrekking op de bereiding van L-fenylalanine dat in deze conventionele syn-10 these bruikbaar is. Wanneer fenylalaninecbor chemische synthese wordt bereid, wordt het verkregen als een racemaat dat gesplitst moet worden voordat het L-isomeer kan worden verkregen en dit vereist een extra en kostbare trap in het proces. Wanneer fenylalani-ne verkregen wordt volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding, 15 wordt het direct als het L-isomeer verkregen.

Derhalve heeft de uitvinding verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van L-fenylalanine, waarbij het [asp-phe]^ peptide wordt behandeld,dat geïsoleerd is van een cultuur van E. coli cellen die plasmiden dragen waarin het synthetische aspar-20 tame-gen is opgenomen, met een zuur of enzymatisch hydrolysemiddel en het gewenste L-fenylalanine van het hydrolysaat wordt afge scheiden.

Deze werkwijze geeft vanzelfsprekend ook L-aspartinezuur en de uitvinding heeft derhalve ook betrekking op een dergelijke 25 werkwijze.

Geprefereerde hydrolysemiddelen omvatten zoutzuur of carbo-xypeptidase CE.C. 3.4.12.x], aminopeptidase CE.C. 3.4.11.x] of niet specifieke endcpeptidasen.

De scheiding van de hydrolyseprodukten kan volgens bekende 30 methoden worden gerealiseerd.

De uitvinding wordt aan de hand van de voorbeelden nader toegslicht.

Voorbeeld I Casp-pheJ^

Synthese van dodecanucleotiden 35 2ε twee dodecanucleotiden TpCpGpApApApTpCpGpApA.pG en 8100437 - 12 - «

TpTpTpCpGpApCpTpTpCpGpA, werden bereid volgens een conventionele triëstermethodologie zoals b.v. beschreven door Hsiung, l.c., en overeenkomstig het in fig.3 weergegeven reactieschema, waarin N gisobu^ ^ j-.bz voorstelt. De volledig beschermde dodecanu-

5 cleotiden werden gedeblokkeerd met 2% w/v benzeensulfonzuur, 0,1 M

tetraethylammoniumfluoride in THF/pyridine/water CS: X s 1 volume-verhouding), gevolgd door behandeling met ammoniak. De gedeblokkeerde dodecanucleotiden werden met HPLC gezuiverd op "Partisil 10 SAX” (microscopisch klein siliciumoxyde, waarvan derivaten ge-10 maakt waren met quaternaire ammoniumgroepen (Whatman)).

Polymerisatie van dodecanucleotiden;

Elk synthetisch dodecanucleotide (2 ug) werd gefosforyleerd in een 10 ydnn reactie, die 10 - 50 yCi bevatte van P-ATP, 50 mM tris-Cl pH 7,8, 5 mM magnesiumchloride, 0,25 mM niet gelabeld 15 ATP, 10 mM mercaptoêthanol en 3 eenheden (1 eenheid is de hoeveel- 32 heid die de overbrenging van 1 nanomol van P-fosfaat van r 22 X* P)-ATP naar het 5% hydroxyeindpunt van een polynucleotide veroorzaakt in 30 minuten bij 37°C onder standaardanalyseomstan-digheden, zie b.v. Richardson, Nucleic Acids Research, 2, 815) 20 van polynucleotidekinase (E.C. 2.7.1.78) bevatte. Na 60 minuten bij 37°C werden de twee dodecanucleotiden gemengd, werd niet gelabeld ATP toegevoegd om het ATP te verhogen tot 1 mM samen met 0,1 eenheden (1 eenheid is de hoeveelheid die 100 monomol van d(A-T)100Q zal converteren in een exonuclease III-resistente vorm 25 in 30 minuten bij 30°C onder standaardanalyseomstandigheden, zie b.v. Modrich en Lehman, J. Biol. Chem., 245, 3626 (1970) van T^ DNA ligase (E.C. 6.5.1.1) en werd het reactiemengsel gedurende 24 uren bij 25°C geïncubeerd. ATP en niet geligateerde nucleotide-monomeren werden verwijderd door naar beneden voeren door een 30 "Sephadex G-50” (superfijn deeltjesvormig verknoopt gemodificeerd dextranpolymeer (Pharmacia)) kolom (20 cm x 0,8 cm) in 50 mM na-triumchloride, 10 mM tris-Cl pH 7,5, 0,2% w/v natriumdodecylsul-faat (SDS). De dubbelstrengpolymeren werden door ethanolprecipita-tie geconcentreerd. Het produkt bleek na afscheiding een mengsel 35 te zijn van polymeren van willekeurige lengte, die 2 tot meer dan 81 0 0 43 7 - 13 - 5QQ herhalingen van de basiseenheden bevatten.

Clonen van het synthetische gen.

Ca] Stomp einde-reparatie van het synthetische gen.

Men incubeerde 2 ug van het zoals boven beschreven bereide 3 '

5 polymeer in een 40 ydm mengsel met 50 mM tris-Cl pH 7.8. 5 mM

magnesiumchloride, 1 mM mercaptoëthanol, 0.125 mM van elk. van de vier deoxynucleotidetrifosfaten en 2 eenheden Cl eenheid is de hoeveelheid die de opname van 10 nanomol van nucleotide in een zuur precipiteerbare vorm veroorzaakt in 30 minuten bij 37°C on-10 der standaardanalyseomstandigheden, waarbij poly dCA-T] wordt ge bruikt als mal, zie b.v. Richardson e.a., J. Biol. Chem., 239, 222 C19643 van E. coli DNA polymerase I CE.C. 2.7.7.7]. Het mengsel werd gedurende 20 minuten bij 10°C geïncubeerd en het mengsel zonder verdere zuivering gebruikt.

15 Cb] Bereiding van de cloonvector pWT 121.

Men ontsloot 50 yg van pWT 121 DNA met een tweevoudige overmaat van Hin d III CE.C. 3.1.23.21]. Het mengsel werd tweemaal met een gelijk volume fenol geëxtraheerd en met ethanol neergeslagen.

20 Reparatie met jï. coli DNA polymerase voor het verkrijgen van stompe einden werd zoals boven onder Ca] uitgevoerd.

Het DNA met stomp einde werd vervolgens behandeld met bac-teriële basische fosfatase CE.C. 3.1.3.1) om eindstandige fosfaten te verwijderen en te verhinderen dat het 0ΝΑ recirculariseerde ge-25 durende de daaropvolgende ligatie. Het DNA werd gedurende 30 mi- n nuten bij 37 C geïncubeerd bij aanwezigheid van een tweevoudige overmaat van enzym in 10 mM tris-Cl pH 7,5, 0,1% SDS. Het mengsel werd daarna uitputtend geëxtraheerd met fenol, verschillende malen met chloroform gewassen en vervolgens met ethanol neergesla-30 gen.

Cc) Stamp einde-ligatie.

Dcdecanucleotidepolymeer met stomp einde uit Ca) en stomp einös-pWÏ 121 CNA uit Cb) werden in een gewichtsverhouding van 1 : 1 gemengd en bij 15°C gsligateerd met 0,2 eenheden van DNA- 3 35 ligase in een 20 ycm mengsel dat 50 mM tris-Cl pH 7,3, 5 mM mag- 81 0 0 43 7 - 14- nesiumchloride, 1 mM ATP en 10 mM mercaptoëthanol bevatte. IMa 24 uren waren de pWT 121/(asp-phe]n recombinantplasmiden gereed voor gebruik.om E_. coli cellen te transformeren.

Transformatie en gen-expressie: 5 E_. coli K12 HB 101 cellen (genotype gal , lac , ara , pro , arg , strrj ree A , r^ * M^ 5 Boyer, H.W. en Roullard -Dussoix, D., J. Mol. Biol., 41, 459 - 472] werden getransformeerd volgens de procedure van Katz et al (19731 J. Bacteriol, 114, 577 - 591, en gebracht op L-agarplaten, aangevuld met ampicilline 10 (100 Ljg/cm^].

Recombinantclonen werden gezuiverd door "streaking" om enkelvoudige kolonies te krijgen. Aldus geïsoleerde cloons werden onderzocht op kolonie-hybridisatie op nitrocellulosefilters (Grunstein en Hogness (1975], Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72, 15 3961 - 3965] onder toepassing van een kinas-e-gelabeld synthetisch dodecanucleotide als hybridisatiesonde. Enkelvoudige kolonies, positief volgens koloniehybridisatie, werden gegroeid tot een 3

AgQQ van 0,6 in 25 cm M9 medium (Miller (1972], Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 3 20 biz.433] aangevuld met ampicilline (100 ug/cm ] en tryptofaan 3 3 ' (40 ug/cm ]. Een monster van 1 cm werd uit deze onderdrukte cul- ' 14 tuur genomen en gedurende 10 minuten gelabeld met 5 yCi C-amino- zuren alvorens gegroefd te worden gedurende 10 minuten bij 200 3 ydm van 20% w/v "casaminozuren" (Difco]. De cellen werden gecen-25 trifugeerd ("gepelleteerd”] (10.000 x g gedurende 10 minuten], verschillende malen gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing 3 die 100 ug/cm gelatine bevatte om overmaat label te verwijderen ' 3 en de uiteindelijke pellet gelyseerd in 50 ydm van een buffer (FSB] die 10% v/v glycerol, 0,01% w/v broomfenolblauw, 5% v/v /3-30 mercaptoëthanol, 3% w/v SOS en 65 mM tris-Cl pH 0 bevatte, door gedurende 2 minuten op S0°C te verwarmen. De rest van de aanvanke- 3 lijke 25 cm cultuur werd gepelleteerd (10.000 x g gedurende 10 minuten] en gehersuspendeerd in een gelijk volume van M9 medium, aangevuld met ampicilline (100 yg/cm ] en /3-indoolacrylzuur 35 (5 yg/cm^l. Na verschillende keren inductie, werden monsters van 8100437 3 - 15 - 1 cm verwijderd en zoals boven beschreven, gelabeld. Porties van 3 de uiteindelijke lysaten van 5-10 ydm werden op acrylamidegels gescheiden C12,5% polyacrylamide + 0,1% SDS, zie b.v.Laemmli,

Nature 227, B80 - S85 Q9703 3 . De gels werden gedroogd en auto- 5 radiografisch bekeken om de posities van de gelabelde eiwitten te bepalen. De vergelijking van de patronen van niet-geinduceerde en geïnduceerde cellen, konden onder de controle van de trypto- faanpromotor gesynthetiseerde eiwitten worden geïdentificeerd.

Fig.4 toont een autoradiogram van een 12,5% acrylamide : 14 10 0,1% SDS gel waarop C-gelabelde eiwitten zijn gescheiden, die gesynthetiseerd waren in Ei. coli cellen, die recombinant pWT 121

Casp-phe] plasmiden droegen. Spoor 1 toont eiwitten, gelabeld 14 Π 3 met C-aminozuren bij aanwezigheid van 40 yg/cm L-tryptofaan, d.w.z. op de Hin d ÏII plaats ingebrachte genen zullen onderdrukt 15 worden en geen eiwit zou worden gevormd. Spoor 2 toont eiwitten, 14 gelabeld met C-aminozuren bij afwezigheid van L-tryptofaan en 3 bij aanwezigheid van 5 yg/cm /3-indoolacrylzuur, d.w.z. ingebrachte genen zullen volledig geïnduceerd worden en zouden het eiwit waarvoor door de invoeging was gecodeerd, moeten exprimeren.

20 CHet eiwit dat sterk tevoorschijn komt in spoor 2, bleek een repe terend polymeer van Casp-phe3 te zijn.3 De sporen 3 en 4 corresponderen met de sporen 1 en 2, met dien verstande, dat tweemaal de hoeveelheid eiwit gebruikt werd. De standaardproteïnemolecuulge-wichten, die rechts van het plaatje zijn aangegeven, zijn die van 25 een standaardmengsel van eiwit, verkregen van het Radiochemical

Centre, Amersham, Buckinghamshire, Engeland.

Isolatie van gelabelde eiwitten uit gels:

Bepaalde eiwitbanden werden geïsoleerd uit acrylamidegels door het proteïnelysaat te scheiden in een reeks evenwijdige spo-30 ren. Een van deze sporen werd met een ontleedmes uit de gel gesne den en gekleurd met Coomsssie Brilliant Blue R CGurr, Searle Diagnostics] terwijl de rest van de gel gedurende 20 minuten geweekt werd in 15% v/v glycerol en bij -70°C werd opgeslagen. De gekleurde gelschijf werd gedroogd en autoradiografiscn onderzocht 35 van 24 - 43 uren om de pasitie van de gelabelde banden vast te 8100437 - 16 - stellen. Dit maakte excisie mogelijk van het relevante gedeelte van de bevroren gel. De gelschijven werden opgebraken door ze te 3 dwingen door een 1 cm wegwerpspuit zonder naald en het gelabelde eiwit werd met 10 mM triëthylammoniumbicarbonaat, pH 7,5, geduren-5 de 24 uren geëlueerd. Gelfragmenten werden do.or centrifugeren verwijderd en de bovendrijvende vloeistof werd tegen 10 mM tri-ethylammoniumbicarbonaat gedialyseerd. Op deze wijze werden opbrengsten van gelabelde eiwitbanden van 50 - 75% verkregen. Enzymontsluitingen; 10 Ruwe cellysaten of geïsoleerde banden van acrylamidegels werden ontsloten met proteolytische enzymen in oplossing bij con- 3 centraties van 1-10 mg/cm , of met equivalente hoeveelheden op een vaste drager onbeweeglijk gemaakte enzymen, voor perioden tot 72 uren. Men gebruikte 10 mM triëthylammoniumbicarbonaat voor ont-15 sluitingen in het pH-gebied van 7-8, terwijl 10 mM glycine/natri- umhydroxydebuffers tot een pH van 10,5 werden gebruikt.

Dunnelaagchromatografie:

Enzymontsluitingen van gelabelde eiwitten werden op Merck silicagel TLC-platen met concentratiezone C20 x 20 cm3 gescheiden 20 onder toepassing van n-butanol azijnzuur : water C8 : 2 : 2 volu- meverhouding} of van n-propanol : geconcentreerd (0,8803 ammonia (7 : 3 volumeverhouding3 als oplosmiddel. Na ontwikkeling werden de platen gedroogd en autoradiografisch onderzocht onder toepassing van Kodak "Kodirex" röntgenfilm om de gelabelde peptidepro-25 dukten te detecteren. Ontsluitingen met chymotrypsine (E.C.

3.4.4.53 of subtilisine (E.C. 3.4.4.163 onbeweeglijk gemaakt op een vaste drager af met subtilisine of proteinase K (E.C.3.4.21.143 in oplosbare vorm gaven alle een mengsel van produkten. Hiertussen bevond zich in elk geval een verbinding die met authentiek 30 aspartyl-fenylalanine co-chromatagrafeerde. (Fig.5 van de teke ning laat een autoradiogram zien van een silica-dunnelaagchromato- grafieplaat waarop de produkten gescheiden zijn van een enzymati- 14 sche ontsluiting van (asp-phe3n eiwit. C-gelabeld (asp-phe3n eiwit, geïsoleerd uit een 12,5% acrylamide : 0,1% SDS gel, werd' ge-35 dubende 16 uren bij 37°C ontsloten met subtilisine, dat op een vas- 8100437 - 17 - te drager onbeweeglijk was gemaakt. De dunnelaagchromatografie-plaat werd met n-propanol : 0,880 ammonia (7 : 3 v/v) ontwikkeld. De pijlen wijzen naar de posities van markeurs van authentieke (asp-phe) en (phe-asp).) Deze verbinding, na winning van de TLC-5 plaat en hydrolyse in zoutzuur, gaf alleen aspartinezuur en fenyl- alanine.

Hydrolyse van geïnduceerd eiwit voor het bereiden van L-aspartine- * zuur en L-fenylalanine: 14

Uit een acrylamidegel geïsoleerd C-gelabeld (asp-phe)n 10 eiwit, of een ruwe cellysaat, bereid door lyse van geïnduceerde 14 C-gelabelde E_. coli cellen, die pWT 121/Casp-phe) plasmiden voeren, in een buffer die 5% v/v /3 -mercaptoëthanol, 3% w/v SDS en 75 mM trls-Cl pH 8 bevatte, werd voor hydrolyse gebruikt. Een 3 lysaat, bereid uit 1 cm van een geïnduceerde celcultuur, of het 15 geïsoleerde geïnduceerde eiwit van een gelijke volumehoeveelheid 3 cultuur, werd ingesloten in een buis met 1 cm 0 Π zoutzuur en gedurende 16 uren op 110°C verwarmd. Na deze tijd werd de buis geopend en de inhoud verwijderd en drooggedampt. Onderzoek van ht hydrolysaat met dunnelaagchromatografie toonde de aanwezigheid 14 20 van C-gelabeld L-aspartinezuur en L-fenylalanine, samen met klei nere hoeveelheden andere aminozuren.

Voorbeeld II

Een polymeer (asp-phe3 kan met behulp van een enzym, zoals chymotrypsine of subtilisine, dat bij aromatische aminozuren door-25 knipt, worden gespleten. Anderzijds kan een polymeer (asp-phe-lys- lysJn worden verkregen, dat door trypsine of door een enzym van vergelijkbare specificiteit of door een combinatie van enzymen kan worden gespleten onder vorming van het dipeptide-asp-phe. Het is b.v. bekend dat een dergelijke splijting bij gepaarde basis-30 aminozuurresten optreedt in de werkwijze waarmee hormoonvoorlopers tot actieve species worden gespleten, b.v. het corticotropine-/3-lipotropine-nSH-encefalinesystaem (Nakanishi, et al, Nature (137S), 278, 423 - 427J.

Een gen voor een dergelijk herhalend tetrapeptide kan wor-3Ξ den bereid door de samenvoeging van vier chemisch gesynthetiseerde 8100437 - 18 - dodecanucleotiden:

(1) A.A.G.A.T.T.T.C.A.A.A.A

(2) A.G.G.A.C.T.T.T.A.A.G.A

(3) A.G.T.C.C.T.T.T.T.T.G.A

5 C4) A.A.T.C.T.T.T.C.T.T.A.A

onder vorming van een repeterende structuur: 8100437 - is - in * * !—

CO

C (- · a. < L i- ' - f— ·—> ·ν ^

a * «-< < CD

cn < «-- * —' (0 <

CD

~ . (- Γ c tn · a > < r-i |- η-

CD

01 !— £ ^ u ? H w H* 0)- (- JZ t- · a. » oj <

^ w <J

a “ <| ω <C *

(C CD

.CD

t - (-

CD

cn a u ~ tSL * cn ~ ' !- ~ C · m (— >. c * .-i !—

<L

w «'. (- Γ c_j.

O *-------!— a cd ,—· ·—* ·

<J

f— · ~ V) a. m < oi· C cc · <tr * g < . CD Ü LU (— C · i-' ,-------d < <CI .J ~ - (- m cn _i 8100437 - 20 -

Dit brengt het gebruik van twee codons voor elk van de aminozuren met zich mee: G.A.T. en G.A.C. voor asp; T.T.T. en T.T.C. voor phe; en A.A.A. en A.A.G voor lys. Deze zijn alle aanvaardbaar in Ei. coli. De enige restrictie-enzymherkenningsplaats binnen dit po-5 lymere gen is die voor EcoRI' (A.G.A T.T.T).

Reparatie van het bovenstaande polymere gen onder toepassing van J5. coli DNA-polymerase I geeft een molecuul dat leest in het correcte leesraam op stomp einde-ligatie in de Hin d III plaats van het plasmide pWT 111, b.v.

10 De experimentele procedure is zoals beschreven in voorbeeld I. Het vereiste polypeptide, verkregen bij inductie, kan met b.v. trypsine worden gespleten en het asp-phe-dipeptide worden geïsoleerd.

Voorbeeld III

15 Kleine hoeveelheden van het tripeptide Pyro-glu-his-gly hebben het vermogen om een anorexische responsie op te wekken in dieren, d.w.z. het veroorzaakt een reductie in de voedselopname, en is derhalve van belang bij de regeling van eetlust bij mensen. (D.Trugstad et al., Acta Endocrinol, 8£, 196 - 208 (1978)).

20 Een polymeer van de vorm (glu-his-gly-lys-lys) zou bij ge bruik van b.v. trypsine worden gespleten onder vorming van het tripeptide glu-his-gly. Glutaminezuur kan in pyroglutaminezuur worden omgezet door de werking van warmte, zie b.v, het Amerikaanse octrooischrift 2.528.267.

25 Voor een dergelijk repeterend polymeer wordt gecodeerd door een repeterend gen, dat samengesteld is uit vier chemisch gesynthetiseerde oligonucleotiden, twee tetradecanucleotiden en twee hexadecanucleotiden:

(1) A.G.G.A.A.C.A.C.G.G.T.A.A.G

30 (2) A.A.A.G.A.G.C.A.T.G.G.C.A.A.A.A

(3) C.T.C.T.T.T.C.T.T.A.C.C.G.T

(4) G.T.T.C.C.T.T.T.T.T.G.C.C.A.T.G

Deze oligonucleotiden kunnen gefosforyleerd worden en door ligatie worden verbonden, onder toepassing van de bovenbeschreven technie- 35 ken, waarbij een structuur wordt verkregen: 8100437 - 21 - cn in • ' " cj a I cn 05 · w

•Η < t— J

Γ s

CJ CD

*· /—* · <C iH h— ^ < W f— ÖC ·

CD CJ

' CD 0 > < J H- H i < t-

W · · /—I

* < H ^ cn * . w > < H- r-! « ·

’ U CD

<H CD CJ

00 *

CD CJ

‘ F— CM < 05 w · •H <C H- JZ ·

a CD

- *

CD CJ

3 I—I <C i- 6C *

. CD CJ

• * < H- cn · · > < t- r'è ^

CD S CJ

05 * > < H- cn i—1 . w . < *- ^ I · Γ f- <

CD CJ

00 .

CD CJ

m m

* CJ CD

05 <-* •H <C I l—

J= w -C

CJ CD

*» , » Γ < *- 3 r-) < h-

Ofl · · CD U "3-

9 I W

CD CJ

< in ch 8 1 0 0 43 7 - 22 -

Twee codons worden voor elk aminozuur gebruikt: G.A.A en G.A.G voor glutaminezuur? C.A.C en C.A.T voor histidine; G.G.T en G.G.C voor glycine? en A.A.A en A.A.G voor lysine. Al deze codons zijn in E_. coli aanvaardbaar. Er zijn geen restrictie-enzym 5 verkenningsplaatsen in dit gen. De experimentele procedure is zo als beschreven in voorbeeld I. Dit gen leest in het correcte leesraam wanneer het b.v. stomp-eindig geligateerd is in de Hin d III plaats van het plasmide pWT 111.

Voorbeeld IV

10 Het pentapeptide arg-lys-asp-val-tyr is een analogon van het hormoon thymopoiëtine, dat werkzaamheid bezit bij het induceren van de differentiëring van pro-thymocyten tot thymocyten (Goldstein et al., Science, (1979], 204, 1309 - 1310]. Het vindt farmaceutische toepassing bij de behandeling van thymische kwalen. 15 Een repeterend gen, dat codeert voor een polymeer van dit thymische hormoonanalogon kan worden geconstrueerd uit vier che~ misch gesynthetiseerde oligonucleotiden, twee tetradecanucleoti-den en twee hexadecanucleotiden:

(13 A.C.C.G.T.A.A.A.G.A.T.G.T.T.T.A 20 (23 C.C.G.A.A.A.G.G.A.T.G.T.C.T

(3] T.T.T.C.G.G.T.A.A.A.C.A.T.C.T.T

(4] T.A.C.G.G.T.A.G.A.C.A.T.C.C

Deze oligonucleotiden kunnen worden gefosforyleerd en samen-gevoegd door ligatie onder vorming van een structuur: 25 8100437 - 23 - on < H ' • ^ · (- r-i < « *—’ ·

cD CJ

• * cj cd f cj cd > < t Λ i“ - < • · ·

CJ U CD

r-C · Ü · · «—» (0 (— < · <C 'S' > · w

CD / CJ

w g · Γ H- < a CD < i- <c ·

CD CJ

CD U , CD · <—> * >

> < OJ H

i-1 · '—' . < • · < H· bC ·

^ Ü CJ

ta

CJ CD

M m

Γ U CD

£ <1 K

rj · i- < cn

fl· < W

o h < >

, CD CJ

|— ^ a CD < f“ 03 · *

. CD U

• < t— cn - ^ · > <. <-· i~ , i—1 · * , < *“ ' (— < * *

in CD CJ

CD

U CD

CJ cd" < H- ϊΠ cn 8100437 - 24 -

In deze structuur worden enkelvoudige codons gebruikt voor tyrosine (T.A.C) en aspartinezuur (G.A.T), terwijl twee codons gebruikt worden voor arginine CC.G.T en C.G.A), lysine (A.A.A en A.A.GJ en valine CG.T.T en G.T.C). Er is een enkele restrictie-5 enzymherkenningsplaats binnen het gen voor het enzym Acc I.

CG.T.C.T.A.C) deze plaats herhaalt elke 30 baseparen. Oit gen is ontworpen om in het correcte leesraam te worden gelezen wanneer het door stomp-eindeligatie wordt ingebracht in de Hin d III plaats van het plasmide pWT 111, bij wijze van voorbeeld. De experimentele 10 procedure is zoals beschreven in voorbeeld I.

Voorbeeld V

De encefalinen zijn in de natuur voorkomende peptiden, gevonden in de hersenen van de mens, welke, naar men zegt, een rol als pijndoders hebben. Ze zijn daarom van aanzienlijk farmaceu-15 tisch belang. Er zijn twee verbindingen bekend, met-encefaline, dat de volgorde (try-gly-gly-phe-met) heeft en leu-encefaline, waarin het eindstandige methionine vervangen is door leucine.

Dit voorbeeld heeft betrekking op met-encefaline, maar een soortgelijke benadering is toepasbaar op leu-encefaline. Een polymeer 20 van (tyr-gly-gly-phe-met-lys-lys] kan b.v. door trypsine worden gespleten onder vorming van het vereiste pentapeptide. Een dergelijk polymeer wordt gespecificeerd door een repeterend gen, geconstrueerd uit zes chemisch gesynthetiseerde oligonucleotiden, twee octadecanucleotiden en vier dodecanucleotiden: 25 C1J G.T.A.T.G.G.T.G.G.A.T.T.T.A.T.G.A.A.

C23 G-.-A.A.A.T.A.C.G.G.A.G.G.

C3] C.T.T.T.A.T.G.A.A.A.A.A.

C4) T.A.T.T.T.C.T.T.C.A.T.A.A.A.T.C.C.A.

CSJ A.T.A.A.A.G.C.C.T.C.C.G.

30 , (6) C.C.A.T.A.C.T.T.T.T.T.C.

Deze oligonucleotiden kunnen worden gefosforyleerd en samengevoegd door ligatie op twee wijzen, Hetzij kunnen alle zes oliga-nucleotiden worden gemengd en geligateerd onder vorming van het vereiste polymeer in één trap, anderzijds kunnen oligonucleotiden 35 1, 2 en 4 en oligonucleotiden 3, 5 en 6 afzonderlijk worden geli- 8100437 - 25 - gateerd tot blokken, die vervolgens gemengd en geligateerd kunnen worden onder vorming van hetzelfde polymeer met de structuur: } 8100437 - 26 - cn ui • \ u u < I- • (-n

< 03 CJ

< t—

< H

‘ < H

cn · · > < t- (—i · ·

< H

» · * CO cj · /—1 * ^ CD I— CH < ε . w l < " I- <

(D

x: !- < Q. * · ;Η. i

CJ M CO

t-i CO N rH f CJ CD

ÖO C · ^ . co ε · u -

< · H

> · <, · «-! CO u Öfl

CO r—* CJ

J · CN ·

CJ ^ CO

u · ς > < I- +j Λ H" ^ I ·

< H

cn · >i =C . (— h · v

. < H · H

« · M

co / cj cn-va· > < > n · - I- r-c . ε. '

L < ^ H

'co CJ

P

QJI- < E · ·—· «C I— _ · '—> I- <

CD

-Cf- < α - - I- H < - · cr <c ^ o (—

> rH CJ

1-i CO W LU CJ

ÖO

„ co α < > ·

rH CO CJ

oo co u , , “ I— < c. . ^

> < H- CO

+J . w CO u , cn cn 8100437 - 27 -

In deze structuur wordt A.T.G gebruikt om te coderen voor methionine en T.T.T om te coderen voor fenylalanine, worden meervoudige codons gebruikt voor de andere aminozuren: tyrosine CT.A.T en T.A.C]; glycine (G.G.T, G.G.A en G.G.C] en lysine CA.A.A en A.A.G) 5 Er zijn enkelvoudige herkenningsplaatsen tinnen het gen voor de enzy men Mnl I (C.C.T.C), Mbo II CG.A.A.G. A) en EcoRI' CG.G.A.T.T.T] zoals bovenstaand aangegeven. Deze plaatsen herhalen elke 42 basen. Het gen is ontworpen om in het correcte leesraam te lezen wanneer het b.v. door stomp-eindeligatie wordt ingébracht in de Kin d III 10 plaats van het plasmide pWT 121.

8100437

Claims

1. Synthetisch gen, dat in de coderingsstreng codons bevat voor de aminozuren van een gewenst peptide in tandemherhaling.

2. Synthetisch gen volgens conclusie 1, zoals in wezen hier beschreven met bijzondere verwijzing naar de voorbeelden en/of de 5 tekening.

3. Werkwijze voor het bereiden van een synthetisch gen volgens conclusie 1, welke de zelfopbouw en ligatie en desgewenst reparatie van een veelheid van geschikte oligonucleotiden omvat, waarbij de opbouw voor het verkrijgen van het repeterende karakter bewerkt 10 wordt door zelfcomplementaire overlappende einden bij de eindpunten van de·groep oligonucleotiden die na opbouw de repeterende eenheid van het gen omvat.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de 15 tekening.

5. Synthetisch gen volgens conclusie 1, bereid met eenwerkwijze volgens conclusie 3 of 4.

6. Plasmidevector, welke daarin ingebracht op een inbrengings-plaats, gelegen naast een bacteriële promotor en stroomafwaarts 20 van een procaryotische ribosoom bindingsplaats, een synthetisch gen omvat volgens een of meer van de conclusies 1, 2 of 5, zodanig dat het gen onder bacteriële promotorcontrole staat.

7. Plasmidevector volgens conclusie 6, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of 25 de tekening.

3. Werkwijze voor de bereiding van een plasmidevector volgens conclusie B, welke het inbrengen van een synthetisch gen volgens een of meer van de conclusies 1, 2 of 5 op de inbrengingsplaats daarvan omvat.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, in wezen zoals hier beschre ven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening. 8100437 - 29 -

10. Plasmidevector volgens conclusie 6, bereid met een werkwijze volgens conclusie 8 of 9.

11. Cel, welke getransformeerd is doordat daarin een plasmidevector is ingebracht volgens een of meer van de conclusies 6, 7 of 5 10.

12. Cel volgens conclusie 11, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

13. Werkwijze voor het transformeren van een cel, waarbij daar- 10 in een plasmidevector volgens een of meer van de conclusies 6, 7 of 10 wordt ingébracht.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

15. Cel, getransformeerd met een werkwijze volgens conclusie 13 of 14.

15. Werkwijze voor de expressie van een peptide, waarbij een cel volgens een of meer van de conclusies 11, 12 of 15 wordt gekweekt .

17. Werkwijze volgens conclusie 16, in wezen zoals hier be schreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

18, Peptide, geëxprimeerd met een werkwijze volgens conclusie 16 of 17.

25 IS. Synthetisch gen volgens conclusie 1 voor de expressie van de repeterende polypeptiden Caspartyl-fenylalanine)n, waarin n een geheel getal van tenminste 2 voorstelt, omvattende een dubbel-strengs DNA-mclecuul dat in de coderingsstreng tenminste twee nucleotide opvolgingen omvat, die coderen voor de expressie van aspar-30 tinezuur, en alternerend daarmee tenminste twee nucleotide opvolgin gen omvat, die coderen voor de expressie van fenylalanine, en in de andere streng repeterende en aLternerende nucleotide volgorden, die complementair zijn aan die welke cederen voor aspartinezuur en fenylalanine.

20. Synthetisch gen volgens conclusie 19, met de structuur 8100437 - 30 - 5’ pT-T-T-C-G-A-C-T-T-C-G-A 3’ 3’ G-A-A-G-C-T-A-A-A-G-C-Tp 5’

21. Synthetisch gen volgens conclusie 19, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of 5 de tekening.

22. Werkwijze volgens conclusie 3 voor de bereiding van een synthetisch gen volgens conclusie 19, waarbij een eerste dodecanucleo-tide-opeenvolging wordt verschaft, die codeert voor aspartyl-fenyl-alanine, de geschikte nucleotide monomeren met elkaar te koppelen, 10 een tweede dodecanucleotide opeenvolging te verschaffen die comple mentair is aan de eerste opeenvolging, beide dodecanucleotiden te fosforyleren onder toepassing van polynucleotidekinase en de eerste en tweede opeenvolgingen met elkaar te mengen onder vorming van een dubbelstrengs DNA~structuur.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij de dubbelstrengs- structuur gepolymeriseerd wordt door te incuberen met T^-DNA-ligase.

24. Werkwijze, volgens conclusie 22, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

25. Synthetisch gen volgens conclusie 19, bereid met een werk wijze volgens een of meer van de conclusies 22 - 24.

26. Plasmidevector volgens conclusie 6, welke pWT 121 is, welke daarin ingebracht op de Hin d III plaats daarvan een synthetisch gen omvat volgens een of meer van de conclusies 19 - 21 of 25.

27. Plasmidevector volgens conclusie 26, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of ' de tekening.

28. Werkwijze volgens conclusie 8, voor de bereiding van een plasmidevector volgens conclusie 26, waarbij een synthetisch gen 30 volgens een of meer van de conclusies 19 - 21 of 25 wordt ingé bracht op de Hin d III plaats van pWT 121.

29. Werkwijze volgens conclusie 28, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekenin-g.

30. Plasmidevector volgens conclusie 26, bereid met een werk- 8100437 - 31 - wijze volgens conclusie 28 of 29.

31. Cel volgens conclusie 11, welke een £. coli HB 101 cel is, die getransformeerd is doordat daarin een plasmidevector is ingébracht volgens een of meer van de conclusies 2S, 27 of 30.

32. Cel volgens conclusie 31, in wezen zoals hier beschreven, met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

33. Werkwijze volgens conclusie 13 voor de transformatie van een cel die een E_. coli HB 101 oei is., waarbij daarin een plasmide- 1Q vector wordt ingébracht volgens een of meer van de conclusies 2S, 27 of 30.

34. Werkwijze volgens conclusie 33, in wezen zoals hier beschreven, met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

35. Cel volgens conclusie 31, getransformeerd met een werkwij ze volgens conclusie 33 of 34.

36. Werkwijze volgens conclusie 16 voor de expressie van een peptide, waarbij een cel volgens een of meer van de conclusies 31, 32 of 35 wordt gekweekt. 20 37.. Werkwijze volgens conclusie 36, in wezen zoals hier beschre ven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

38. Peptide, geëxprimeerd met een werkwijze volgens conclusie 36 of 37. 25 39. [Aspartyl-fenylalanine]n, waarin n een geheel getal van ten minste 2 voorstelt.

40. Werkwijze volgens conclusie 36, voor de expressie van Cas-partyl-fenylalanine]^, waarbij een synthetisch gen volgens een cf meer van de conclusies 19 - 21 of 25 wordt ingébracht in een in-30 brengingsplaats van een plasmidevector, die in de correcte fase voor het ingebrachte gen leest, waarbij de inbrsngingsplaats gelegen is naast een bacteriële promotor en stroomafwaarts is gelegen van een prokaryotische rcbosoom bindingsplaats, competents microbe-cellen worden getransformeerd onder toepassing van de verkregen plas-35 midevector, de getransformeerde cellen worden gekweekt en het geex- - 8100437 - 32 - primeerde plasmide wordt verzameld.

41. Werkwijze volgens conclusie 40, in wezen zoals hier beschreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening. 5 42. (Aspartyl-fenylalanine)n, geëxprimeerd met een werkwijze volgens conclusie 40 of 41.

43. Werkwijze voor de bereiding van aspartyl-fenylalaninemethyl-ester, waarbij (aspartyl-fenylalanine)n volgens conclusie 39 of 42 wordt onderworpen aan enzymatische splijting onder toepassing van 10 een voor aminozuren met aromatische zij ketens specifiek enzym ten einde asparty1-fenylalanine te verkrijgen, en het produkt wordt ge-methyleerd.

44. Werkwijze volgens conclusie 43, waarbij het gebruikte enzym chymotrypsine, subtilisine of proteinase K. is.

45. Werkwijze volgens conclusie 43, in wezen zoals hier be schreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

46. Asparty1-fenylalaninemethylester, verkregen met een werkwijze volgens een of meer van de conclusies 43 - 45.

47. Werkwijze voor de bereiding van L-fenylalanine of L-aspar- tinezuur, waarbij (asparyl-fenylalanine) volgens conclusie 39 of 42 wordt onderworpen aan zure of enzymatische hydrolyse en het gewenste produkt van het hydrolysaat wordt afgescheiden.

48. Werkwijze volgens conclusie 47, waarbij het zure hydroly- 25 semiddel zoutzuur is.

49. Werkwijze volgens conclusie 47, waarbij het enzymatische hydrolysemiddel carboxypeptidase, aminopeptidase of een niet-speci-fiek endopeptidase is.

50. Werkwijze volgens conclusie 47, in wezen zoals hier be- 30 schreven met in het bijzonder verwijzing naar de voorbeelden en/of de tekening.

51. L-fenylalanine of L-aspartinezuur, bereid met een werkwijze volgens een of meer van de conclusies 47 - 50. 8 1 0 0 43 7