JPH0648987B2 - 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 - Google Patents

部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法

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JPH0648987B2
JPH0648987B2 JP1099888A JP9988889A JPH0648987B2 JP H0648987 B2 JPH0648987 B2 JP H0648987B2 JP 1099888 A JP1099888 A JP 1099888A JP 9988889 A JP9988889 A JP 9988889A JP H0648987 B2 JPH0648987 B2 JP H0648987B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、目的とする蛋白質生成物の観点からは不完全
なメッセンジャーＲＮＡ（以下ｍＲＮＡと略す）配列か
らの酵素による逆転写と有機合成を組み合わせることに
より部分的合成遺伝子を作製し、これを微生物により発
現させて所望のポリペプチドを得る方法に関する。
発現された好ましい生成物には、微生物を開裂させて生
物活性物質を生産する際に問題となる、真核性の発現生
成物に共通して存在する、生物活性を不活性化するリー
ダー配列が含まれていない。本明細書では、好ましい例
として、ヒトの生長ホルモン（例えば下垂体機能減退矮
小発育症の治療に有用である）をコードする（暗号化す
る）遺伝子の作製およびその発現について例示する。
遺伝子を構成しているＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、
蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構造遺伝子と、Ｒ
ＮＡポリメラーゼの結合部位、リボゾーム結合のための
情報部位などを提供することによって構造遺伝子の情報
の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の両者を含んでい
る。暗号づけされた蛋白質は、その対応するＤＮＡか
ら、微生物内で、複数の過程を経て発現される。即ち、 １．調節領域（以下プロモーターという）内で酵素ＲＮ
Ａポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿っ
て移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリ
ボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写する。この転写は１個または
それ以上の終止コドンの位置で終了する。
２．ｍＲＮＡの「伝言」は、リボゾームにおいて、その
ｍＲＮＡが暗号づけているアミノ酸配列を持った蛋白質
に翻訳される。翻訳は開始信号、大抵はＡＴＧ（これは
ｆ−メチオニンと翻訳される）から始まる。
ＤＮＡは遺伝暗号に従い、トリプレット、即ち、アデノ
シン、チミジン、シチジンおよびグアニン（以下各々A,
T,CおよびＧと表わす）から個々別々に選ばれる隣接す
る３個のヌクレオチドの「コドン」によって個々のアミ
ノ酸を指定する。これらはコードストランド（暗号
鎖）、即ち２本鎖(duplex)ＤＮＡの暗号配列中にある。
２本鎖の残りの鎖、即ち「相補ストランド」は、コード
ストランド中の相補体と水素結合するヌクレオチド（塩
基）で形成されている。ＡとＴ、およびＣとＧが相補関
係にある。本発明の背景となる上記の事実およびその他
の関連事項はGene Expressionに詳しく述べられている
（Benjamin Lewin,Gene Expression１，２（１９７４
年）および３（１９７７年），John Wiley and Sons，
Ｎ．Ｙ．）。
本明細書で言及するこの文献およびその他の文献につい
ては、参考までにその都度言及することとする。
ＤＮＡの組み換えには、別々のＤＮＡ断片の結合を促進
するために、その隣接末端を色々の態様に修復する種々
の方法を利用することができる。ここでいう「結合」と
は、隣接するヌクレオチド間にホスホジエスステル結合
が形成することであり、これは大抵の場合、酵素Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより達成される。例えば平滑末端（鈍感
末端）も直接結合することができる。あるいはまた、隣
接末端に相補性の１本鎖を含んでいる断片は、水素結合
によって、「結合」のためのそれぞれの位置に配置され
るので好都合である。このような接着末端と呼ばれる１
本鎖は、ターミナルトランスフェラーゼを用いて鈍感末
端にヌクレオチドを付加することにより生成させること
ができる。またこれは、鈍感末端の１本の鎖をλ−エキ
ソヌクレアーゼの如き酵素で切り取ることにより生成さ
せることもできる。しかしこれは、制限エンドヌクレア
ーゼ（以下制限酵素という）によるのが最も普通であ
る。この制限酵素は、塩基対が４ないし６個の長さのヌ
クレオチドの特異な配列（制限部位という）内またはそ
の隣接部位のホスホジエステル結合を切断するものであ
り、多くの制限酵素およびその認識部位が知られている
（例えばＲ．Ｊ．Roberts，ＣＲＣ Critical Review
s in Biochemistry，１２３，（１９７６年１１月）参
照）。多くのものは互い違いに切断し、２本鎖断片の端
に短い相補性の１本鎖配列ができる。相補性配列である
ので、はみでた末端、即ち接着末端は塩基対によって再
結合することができる。２個の異なった分子をこの酵素
で切断すると、相補性１本鎖が交叉した対をつくり、新
しいＤＮＡ分子ができる。この新しいＤＮＡ分子は、ア
ニーリングした位置にある１本鎖の切断点を結合するリ
ガーゼを用いて、共有結合した完全なＤＮＡ分子とする
ことができる。開裂した２本鎖ＤＮＡに「コターミナ
ル」、即ち鈍感末端を残す様な制限酵素の場合は、この
鈍感末端を他の鈍感末端配列のものと、例えばＴ４リガ
ーゼにより再結合して組換えすることができる。
本発明の目的に使用される「クローニング媒体」は完全
な「レプリコン」を含有する非染色体性の１つの２本鎖
ＤＮＡであり、この媒体は形質転換により単細胞生物
（微生物）に入れられた時、複製され得るものである。
この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼ばれて
いる。現在クローニング媒体として一般に使用されてい
るのはビールスまたは細菌から得られるものであり、最
も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌ＤＮＡで
ある。
最近の生化学の進歩により、例えばプラスミッドが外来
性のＤＮＡを含む様な、「組換型」クローニング媒体が
作製される様になった。特殊な例では、この組み換え体
はヘテロローガスＤＮＡを含有することができる。ここ
でいうヘテロローガスＤＮＡとは、この組換型媒体によ
り形質転換することのできる微生物によって通常は産生
されないポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して結合可能な
末端を有する直鎖状ＤＮＡを得る。これを結合可能な末
端を持った外来性遺伝子と結合させると、生物学的機能
部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択するのに有
用な表現型の性質が付与されることになる。この組み換
え体を微生物に挿入して形質転換し、この形質転換体を
単離してクローン化する。この目的は外来性遺伝子のコ
ピーを含有している多数の転換体を得ることであり、ま
た特殊な場合には、さらにその遺伝子がコードしている
蛋白質を発現することにある。これに関連する技術およ
びその応用についてはRecombinant Moleculesに詳しく
記載されている(Miles International Symposium Serie
s１０；ReCombinant Molecules：Impact on Science an
d Society,Beers and Bosseff,eds.,Raven Press，Ｎ．
Ｙ．１９７７年）。
複製により遺伝子の数を増やすためにクローニング媒体
を使用することとは別に、遺伝子がコードしている蛋白
質を実際に発現しようという試みがなされ、そのいくつ
かは成功している。その最初の例として、脳ホルモン、
ソマトスタチンがlacプロモーターのコントロールの下
に大腸菌中で発現された(K.I takura et al.Science１
９８ １０５６．１９７７年）。極く最近、ヒトインシ
ュリンのＡ鎖およびＢ鎖が同じ方法で発現され、結合さ
れてこのホルモンを生成した(D.V.Goedde I et al.Pro
c.Nat′l.Acad.Sci.，ＵＳＡ７６ １０６、１９７９
年）。この両者では、遺伝子はその全てを合成により作
製したものであった。いづれの場合も、細胞内で蛋白質
分解酵素が目的とする生成物を分解するのは明らかであ
るので、その生成物を複合体の形で、即ち、「隔離」(c
ompartmentalization)により目的物を保護し、そして細
胞外で切り離されることができて所望の生成物を与え得
る別の蛋白質と結合した複合体の形で生成させる必要が
あった。この研究は本出願人の出願に係る英国特許ＧＢ
２００７６７５Ａ号、ＧＢ２００７６７０Ａ号、ＧＢ２
００７６７６Ａ号およびＧＢ２００８１２３Ａ号明細書
に記載されている。
以上述べたいくつかの例で合成遺伝子による方法が有用
であることがわかったが、生成物がもっと大きい蛋白質
である場合、例えば成長ホルモン、インターフェロンな
どである場合には、それらの遺伝子はそれに応じてさら
に複雑であり、手軽に合成することができないという現
実的な問題がある。同時に、複合蛋白質を伴なっていな
い生成物を発現することが望ましいであろうが、この様
な発現の必要性から、使用する微生物を、目的とする生
成物を製造するのにもっと好適な微生物に変更しなけれ
ばならない。
ある研究者たちは、有機合成からではなく、組織から精
製した相当するｍＲＮＡからの逆転写により得られた遺
伝子を発現しようと試みた。この試みには２つの問題が
あった。まず第１は、逆転写酵素は所望の全アミノ酸配
列のためのｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を完成しない前に、
ｍＲＮＡからの転写を停止することがある、ということ
である。従って、例えばVilla-Komaroffらはラットのプ
ロインシュリンのためのｃＤＮＡを得たが、それにはそ
のインシュリンプリカーサー（前駆体）の最初の３個の
アミノ酸のためのコドンが欠落していた(Proc.Nat′l.A
cad.Sci.，ＵＳＡ、７５３７２７、１９７８年）。次
に、プリカーサーの形で発現されるポリペプチドのため
のｍＲＮＡを逆転写したところ、生物活性蛋白質ではな
くそのプリカーサーのためのｃＤＮＡが生成した。とこ
ろでこの生物活性蛋白質は、真核細胞内においてはリー
ダー配列が酵素的に切断除去された結果として生成する
ものである。現在まで、この様な機能を発揮する細菌は
知られていない。従って、ｍＲＮＡ転写体は、生物活性
蛋白質自体ではなくプリカーサーの形の、リーダー配列
を含んだ発現生成物を製造してしまうのである（Villa-
Komaroff、前記（ラットプロインシュリン）、P.H.Seeb
urg et al Nature２７６、７９５、１９７８年（ラット
のプレ生長ホルモン））。最後に、ヒトのホルモン類
（またはそれらのプリカーサー）をｍＲＮＡ転写体から
細菌により発現しようという試みでは、明らかに細胞外
で開裂され得ない複合蛋白質が製造されただけであった
（例えば、Villa-Komaroff、前記（ペニシリナーゼ・プ
ロインシュリン）、Seeburg、前記（ベーターラクタマ
ーゼープレ生長ホルモン））。
ヒト生長ホルモン（ＨＧＨ）はヒトの脳下垂体で分泌さ
れる。１９１個のアミノ酸からなり、分子量が約21,500
であるこのＨＧＨはインシュリンの３倍以上大きい。こ
れまで、ＨＧＨは限られた供給源、即ちヒトの死体の下
垂体から面倒な抽出によって得られるだけであった。こ
の物質は絶えず不足しており、その適用は下垂体機能減
退矮小発育症の治療に制限されており、またそれです
ら、信頼できる計算によると、ヒト由来のＨＧＨは約５
０％の患者に供給するのがやっとである。
従って、ＨＧＨおよびその他のポリペプチド生成物を多
量に製造し得る新規な方法を開発する必要があり、この
要求は、有機合成で製造するには大きすぎるか、従って
また、全合成遺伝子を用いて微生物に発現させることが
困難なポリペプチド類において特に火急を要するもので
ある。哺乳類のホルモンをｍＲＮＡ転写体から発現する
方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得ることを約束
するものではあるが、現在のところ、所望のホルモンを
実際に切り離すことのできない、生物活性のない複合体
を微生物により製造することができるに過ぎない。
本発明は、面倒な全合成による作製に頼らず、暗号配列
の実質的な部分、好ましくは大部分を逆転写により得、
一方その暗号配列の残りを合成することにより、生物活
性を不活性化するリーダー配列またはその他の異質蛋白
質を伴なっていない所望のポリペプチドを発現すること
のできる完全な遺伝子を得、この部分的合成遺伝子を発
現する方法を提供するものである。あるいは、この合成
による残りの部分は、外来性蛋白質が細胞外で開裂され
て生物活性体が得られる設計された、蛋白質分解に抵抗
する複合体を生成させるものであってもよい。従って、
本発明は、従来、組織から多額の費用をかけて抽出する
ことにより、限られた量だけ生産されていた種々の物
質、およびこれまで工業的に生産することの出来なかっ
たその他の物質を、微生物学的に生産する方法を可能に
するものである。本明細書では、その最も好ましい実施
形式として、細胞内での蛋白質分解を避け、かつ細胞外
での開裂の間生物活性体を異質蛋白質中に隔離しておく
必要性を避けながら、医学的に重要なポリペプチドホル
モン（ＨＧＨ）を細菌により発現する最初の例を提供す
る。本発明によって利用できる様になったＨＧＨのため
の微生物資源により、下垂体機能減退矮小発育症の治
療、並びにこれまで組織から得ていたホルモンではまか
ないきれなかったその他の症状、例えば汎発性胃内出
血、仮関節、火傷治療、傷治療、ジストロフィーおよび
骨結合用として、このルモンを多量に提供することが初
めて可能となった。
本発明の以上述べた、およびその他の目的や特徴は以下
の記載および好ましい実施形式を例示した添付の図面か
ら、より明らかになるであろう。
第１図は、クローニングに使用するリンカー、開始信号
ＡＴＧおよびＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコード
する遺伝子断片を作製するための合成機構を示す。コー
ドストランド、即ち上側の鎖(U)および相補性ストラン
ド、即ち下側の鎖(L)の矢印は、描かれた断片の形成に
使用されるオリゴヌクレオチドを表わしている。
第２図は、ＵおよびＬオリゴヌクレオチドを結合させて
第１図の遺伝子断片を形成させる結合媒体および該遺伝
子断片のプラスミッドクローニング媒体への挿入を示し
ている。
第３図には、下垂体ｍＲＮＡ転写体のHaeIII制限酵素断
片のＤＮＡ配列（コードストランドのみ）が描かれてお
り、それらがコードしているヒト生長ホルモンのアミノ
酸も番号付けして記入してある。ここには非翻訳ｍＲＮ
Ａに相当するＤＮＡ（ストップ以下）および主要な制限
部位も示されている。
第４図には、合成に由来しないＨＧＨのアミノ酸をコー
ドする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製およ
びヒト下垂体から単離されたｍＲＮＡからの逆転写によ
る相補ＤＮＡの形の該遺伝子断片の作製が示されてい
る。
第５図は、第２図および第４図のプラスミッドを用い
て、細菌内でＨＧＨを発現し得るプラスミッドを作製す
る方法を示す。
本発明の一般的手法は、一緒になって所望の生成物の発
現をコードする複数個の遺伝子断片を、１つのクローニ
ング媒体中に組み合わせることにある。これらの内少な
くとも１個は、Ullrichらの方法(A.Ullrich et al,Scie
nce１９６ １３１３、１９７７年）などにより組織か
ら単離されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮ
Ａ断片である。このｃＤＮＡは目的生成物のためのコド
ンの実質的な部分、好ましくは少なくとも大部分を提供
し、一方遺伝子の残りの部分は合成により供給される。
この合成による断片およびｍＲＮＡ転写による断片は別
々にクローンし、最後の組合わせ段階での使用のために
量産する。
合成遺伝子と、MaxamおよびGilbert(Proc.Nat′l Acad.
Sci.ＵＳＡ７４ ５６０、１９７７年）の方法で決定さ
れた相補ＤＮＡの間に、目的産物のためのコドンをどの
様に分配するかは、種々の考え方によって影響を受け
る。逆転写によって得られる相補ＤＮＡは必ず、少なく
とも目的生成物のカルボキシル末端部のためのコドンを
含有しており、そのカルボキシル末端に隣接する翻訳終
止信号の下流に非翻訳ｍＲＮＡのためのその他のコドン
を合せて含有している。非翻訳ＲＮＡのためのＤＮＡの
存在は、ほとんど無関係である。この種の不当に長い配
列は、所望の生成物のためのＤＮＡを複製し、発現する
のに使用される細胞源を確保しつつ、制限酵素による開
裂等によって除去してもよい。特殊な場合には、このｃ
ＤＮＡは所望の全てのアミノ酸配列と共に、目的産物の
アミノ末端の上流に異質のコドンを含んでいる。例え
ば、全部ではないが、多くのポリペプチドホルモンは、
リーダー配列や例えば細胞膜移送に関連する蛋白質の信
号配列を含んだプリカーサーの形で発現される。真核細
胞内で発現される場合には、これらの配列は酵素により
除去され、ホルモンはその遊離した形、即ち生物活性な
形でペリプラズム域に入る。しかし微生物細胞がこの様
な機能を営むことは期待し得ないので、ｍＲＮＡ転写体
からこの様な信号配列やリーダー配列を除去しておくこ
とが望ましい。この様な除去操作中に、翻訳開始信号も
失なわれ、またほとんどの場合、目的産物のためのコド
ンの一部も失なわれる。本発明の部分的合成遺伝子の合
成による成分は、これらの後者のコドンを回復するもの
であり、さらに、このハイブリッド（雑種）遺伝子を最
終的に挿入しようとしている媒体が適切に配置された開
始信号を欠いている場合には、新たに翻訳開始信号を供
給するものである。
前駆体生長ホルモンｃＤＮＡからのリーダー配列の除去
は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけている部分の内部
にある制限部位を利用することによって好適に行なうこ
とができる。しかし本発明はこの様な部位を利用できる
かどうかに無関係に実施することもできる。即ち、ｍＲ
ＮＡに由来しない遺伝子を広範囲に合成する必要性を避
けるための、所望のポリペプチドのアミノ末端に十分近
い場所の制限部位を利用できるかどうかに無関係に実施
することができる。所望のポリペプチドおよびリーダー
配列または他の生物活性を不活性化する配列をコードし
ているｃＤＮＡにおいて、後者のコドンと完全な（成
熟）ポリペプチドのためのコドンとの境界は、その完全
なポリペプチドのアミノ酸配列からわかる。単に選択し
たそのペプチドをコードしている遺伝子内へ消化してい
き、望ましくないリーダー配列またはその他の配列を除
去すればよい。従って、例えば次の様なｃＤＮＡである
とすると、 〔ここで矢印は消化の終止を表わす〕 上側の配列ａおよびｂを除去する様にエキソヌクレアー
ゼ消化の反応条件を選ぶと、その後Ｓ１ヌクレアーゼ消
化により下側の配列ｃおよびｄが自動的に除去される。
あるいは、より正確には、デオキシヌクレオチドトリホ
スフェート(d(A,T,C,G)TP)の存在下でＤＮＡポリメラー
ゼ消化を行なうこともできる。例えば、上の例では、ｄ
ＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させて配列
Ｃを除去し（Ｇで停止する）、次いでＳ１ヌクレアーゼ
でａを消化する。ｄＴＴＰの存在下でＤＮＡポリメラー
ゼを作用させてｄを除去し（Ｔで停止する）、次いでＳ
１ヌクレアーゼでｂを切断する、等々（A.Kornberg，Ｄ
ＮＡ Synthesis,p８７−８、Ｗ．Ｈ．Freeman and C
o.,San Francisco、１９７４年参照）。
より好ましくは、Razinらのミスマッチ（不適切な組み
合せ）修復合成法（A.Razin et al.Proc.Nat′l Acad.S
ci.ＵＳＡ７５，４２６８、１９７８年）を利用して、
目的産物をコードしているｃＤＮＡの部分内の好都合な
位置に制限部位を作製してもよい。この方法によって、
ミスマッチ置換分を包んでいるプライマーを用いて存在
しているＤＮＡ配列中の１個またはそれ以上の塩基を置
換することができる。少なくとも７種の回文的４−塩基
対配列が、既知の制限酵素によって特異的に認識され
る。それらは、ＡＧＣＴ(Alu I)、ＣＣＧＧ(Hpa II)、
ＣＧＣＧ(Tha l)、ＧＡＴＣ(Sau ３Ａ）、ＧＣＧＣ(Hh
a)、ＧＧＣＣ(HaeIII)およびＴＣＧＡ(Taq l)である。
確率的には非常にしばしばあり得ることであるが、ｃＤ
ＮＡ配列が、上記の様な認識部位と１個の塩基だけが異
なっている配列を含んでいる場合は、修復合成によっ
て、適切な置換塩基を含んでいる、従って所望の制限部
位を含有している複製ｃＤＮＡが得られる。開裂によっ
て望ましくないリーダー配列のＤＮＡが除去され、その
後、完全なポリペプチドの発現に必要なコドンが合成に
より回復される（下式参照）。
勿論、所望によりもっと長い制限部位を同様にして挿入
することができるし、また、希望する位置に、その制限
部位に共通している塩基が２個しか存在しない場合で
も、連続修復によって４−塩基制限部位を作製すること
ができることは容易に理解されるはずである。
この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だけでなく、外
来性ではあるが特別に設計したある大きさの蛋白質を発
現するのが望ましい場合にも応用される。この様な応用
例として次の４種類のものを挙げることできる。まず第
１に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋白と結合するこ
とによって免疫原生が付与されるハプテンまたはその他
の免疫決定因子を発現してもよく、この様にしてワクチ
ンが製造され得る（英国特許第２００８１２３Ａ号明細
書参照）。また、生物学的安全性の見地から、目的とす
る生成物を、細胞外で開裂して活性体に変換し得る様に
設計したその他の生物活性不活性化蛋白質との複合体の
形で発現してもよい。第３の応用は、細胞膜を通って排
泄された生成物の輸送信号ポリペプチドを開裂すること
が出来るならば、所望の生成物の前に輸送信号ポリペプ
チドをつけて、細胞膜を通して排泄させることにより目
的産物を製造することができる。最後に、細胞外で特異
的に開裂され得る様に設計された外来性蛋白質との複合
体は、そうしなければ微生物宿主にとって内因性の蛋白
質分解酵素で容易に分解されてしまう目的産物を隔離す
るのに使用し得る。これらの内、少なくとも最後の３つ
の応用例では、ｍＲＮＡ転写体の暗号配列を完全にする
為に使用される合成によるこの「アダプター分子」は、
例えば酵素の作用によって特異的に開裂され得るアミノ
酸配列のためのコドンをさらに持っていてもよい。例え
ばトリプシンまたはキモトリプシンはアルギニン−アル
ギニン(arg-arg)またはリジン−リジン(lys-lys)などで
特異的に開裂する（英国特許第２００８１２３Ａ号、前
記） 以上記載したことから明らかな様に、本発明は非常に多
方面の応用性を持っており、それらはいづれも以下に述
べる共通した特質をもっている。
１．目的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な
部分をコードしているｍＲＮＡ転写体であるが、それ自
体を発現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さ
い、異なったポリペプチドが産生されるであろうｍＲＮ
Ａ転写体を使用する。
２．目的産物に含まれているアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列のための蛋白質暗号化コドンが存在する場合は、
これを除去する。
３．有機合成により、所望の配列の残りの部分をコード
する断片を製造する。
４．ｍＲＮＡ転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複
製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、また
は異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断
し得る目的産物を発現する。
勿論、発現生成物はいづれの場合も、翻訳開始信号によ
って暗号化されているアミノ酸から始まる（ＡＴＧの場
合はｆ−メチオニン）。これは細胞内で除去されると期
待し得るし、またいづれにせよ、最終生成物の生物活性
には本質的な影響を与えないと期待し得る。
本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の製造に一般に
利用し得るものであるが、特に哺乳動物のポリペプチド
ホルモン類およびその他の医療に使用し得る物質、例え
ばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、すい臓性ポリペ
プチド、アドレノコルチコトロピン、ベーターエンドル
フィン、インターフェロン、ウロキナーゼ、凝血因子、
ヒトアルブミンなどを発現するのに特に適している。以
下に本発明の好ましい実施形式を記載するが、これは、
ヒト生長ホルモンをコードする部分的合成遺伝子を作製
し、クローンし、そして微生物により発現するものであ
る。
ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒体の作製およ
び発現 １．ｍＲＮＡ転写体のHaeIII断片のクローニング Ullrichらの方法により、ＨＧＨのためのポリアデニル
化ｍＲＮＡを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た(A.Ullrich et al.Science１９６，１３１３、１９７
７年）。Wickensらの方法に従い、このＲＮＡ５μｇか
ら２本鎖（dsと略す）ｃＤＮＡ１．５μｇを作製した(W
ickens et al.J.Biol.Chem.２５３ ２４８３、１９７
８年）。ただし、２番目の鎖の合成には、ＤＮＡポリメ
ラーゼ１の代りにＲＮＡポリメラーゼ「Klenow frag-me
nt」を使用した(H.Klenow,Proc.Nart′l.Acad.Sci.ＵＳ
Ａ，６５ １６８，１９７０年）。ＨＧＨの制限パター
ンについては第３図に示す様に、HaeIII制限部位が３′
非暗号領域内およびＨＧＨの２３および２４番目のアミ
ノ酸をコードする配列内に存在する。このdsＨＧＨｃＤ
ＮＡをHaeIIIで処理するとＨＧＨの２４から１９１番目
のアミノ酸をコードする５５１の塩基対（bpと略す）か
らなるＤＮＡ断片が得られる。例えばｃＤＮＡ９０ngを
HaeIIIで処理し、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳
動し、５５０bpの領域を溶離すると、約１ngのｃＤＮＡ
が得られる。
Bolivarらの方法によって調製したｐＢ３２２を、この
ｃＤＮＡのためのクローニング媒体として選択した(F.B
olivar et al.Gene ２ ９５−１１３、１９７７
年）。ｐＢＲ３２２の特徴は十分に解明されており(J.
G.Sutcliffe,Cold Spring Harbor Symposium４３ ７
０、１９７８年参照）、これは多数のコピーを複製する
プラスミッドである。また、このプラスミッドはアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子（それぞれAp
R、TcRと表わす。第４図参照）を含んでいるのでアンピ
シリンおよびテトラサイクリンの両者に対して耐性を
有、また、制限酵素PstI、EcoRIおよびHindIIIの認識部
位を含んでいる。
HaeIIIおよびPstIの両者とも、それによる開裂生成物は
鈍感末端を有する。従ってChangらの「ＧＣテイリング
法」(Chang.A.C.Y.et al.Nature２７５ ６１７、１９
７８年）を用いて、ｐＢＲ３２２をPstIで開裂した鈍感
末端生成物とｍＲＮＡ転写体をHaeIIIで消化したものを
結合することができ、ｃＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２のPs
tI部位に挿入してｃＤＮＡ上にHaeIII制限部位（ＧＧ↓
ＣＣ）を復元する一方、その挿入体のそれぞれの末端に
PstI制限部位（ＣＴＧＣＡ↓Ｇ）を復元することができ
る。
前記した様に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ(TdT)を用いて、３′末端に約２０ｄＣ
を付加した(Chang，Ａ．Ｙ．Ｃ．，前記）。同様にし
て、６０ngのPstIで処理したｐＢＲ３２２の３′末端に
約１０個のdGを付加した。このdC付加ds ｃＤＮＡとdG
付加ベクター（媒体）ＤＮＡを、１０mMトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ7.5）、１００mM NaCl、0.25mM ＥＤＴＡの１３
０μｌ中でアニーリングした。この混合物をＥ．Coli×
１７７６の形質転換に使用する前に、７０℃に加熱し、
徐々に３７℃まで冷却し（１２時間）、次いで２０℃に
冷却した（６時間）。
×１７７６でクローンしたこのプラスミッドpHＧＨ３１
につき、MaxamおよびGilbertの方法（Proc.Nat′l.Aca
d.Sci.ＵＳＡ７４ ５６０、１９７７年）を用いてＤＮ
Ａ配列を分析した結果、第３図に示す様にＨＧＨの２４
から１９１のアミノ酸のためののコドンが確認された。
Ｅ．Coli Ｋ−１２株×１７７６はＦ−ton Ａ５３dap
Ｄ８min Ａｌ supE４２ △４０〔gal-uvrB〕λ−min
Ｂ２rfb−２nalA２５oms−２thyA５７metC６５oms−１
△２９〔bioH-asd〕cycＢ２ cycA１ hsdR２の遺伝子
型を有する。×１７７６はアメリカ予防衛生研究所（Ｎ
ＩＨ）により、ＥＫ２宿主ベクター系として公認されて
いる。
×１７７６はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）偏性要求性
菌であり、ムコ多糖類コラン酸(colanic acid)を合成す
ることができない。従って、細胞の代謝および生長を支
えるに十分な栄養は存在しているが、ＤＡＰが欠乏して
いる環境ではＤＡＰ欠乏で死亡する。これはチミンまた
はチミジンを要求し、代謝活性を維持するに十分な栄養
はあるがチミンおよびチミジンがない環境では、ＤＮＡ
の崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。×１７７６は
胆汁に対する感受性が極めて強く生存することができな
い。従ってラットの胃腸管を生きて通過することができ
ない。また、×１７７６は洗剤、抗生物質、薬物および
化学薬品に対して感受性が非常に強い。さらに×１７７
６は紫外線による損傷を暗回復または光回復することが
できず、従って、野生型のＥ．Coli（大腸菌）より太陽
光に対する感受性が数オーダー強い。×１７７６は多く
の形質導入ファージに対して抵抗し、種々の突然変異が
ために、異なったタイプの複合プラスミッド(conjugati
ve plasmids)の遺伝には複合が不十分である(conjugati
on deficient)。×１７７６は、ナリジクシックアシッ
ド(nalidixic acid)、サイクロセリンおよびトリメトプ
リムに対して抵抗性がある。従って、これらの薬物を培
地に加えることにより、この株をモニターし、形質転換
中、汚染菌の形質転換を不可能にすることができる。
×１７７６は、１００μｇＤＡＰ／mlおよび４μｇチミ
ジン／mlを追加したＬブロスまたはペナセイ(Penassay)
ブロス中、約５０分の世代時間で生長し、定常期には８
〜１０×１０８細胞／mlの密度に達する。１〜２分渦巻
きにそして前後にゆっくり振盪して細胞を１００％生存
可能の状態に保って懸濁する。×１７７６についてのさ
らに詳しいことはCurtisらの文献を参照のこと(R.Curti
s et al.,Molecular Cloning of Recom binantＤＮＡ、
９９−１７７、Scott and Werner eds.,Academic Pres
s、Ｎ．Ｙ．１９７７年）。×１７７６は１９７９年７
月３日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＴＣＣ）に寄託された（ＡＴＣＣ番号３１５３
７、無制限寄託）。
２．合成遺伝子断片の作製およびクローニング（第１図
および第２図参照） ＨＧＨ部分的合成遺伝子の作製計画は、ｍＲＮＡ転写体
と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部
位を有する合成遺伝子を作成することであった、従っ
て、第１図に示す様に、このＨＧＨの最初の２４個のア
ミノ酸のための合成遺伝子は、２３番目のアミノ酸に続
いてHaeIII開裂部位を含んでいる。この合成断片の遠位
末端にはリンカーが設けられている。このリンカーによ
り、合成断片は、ｍＲＮＡ転写体および合成断片が最終
的に結合するプラスミッドの、制限開裂によって生じる
１本鎖末端とアニーリングすることができる。
第１図に示す様に、２本鎖断片の５′末端には、EcoRI
およびHindIII制限エンドヌクレアーゼのための一本鎖
接着末端が含まれており、これによりプラスミッドの作
製が容易に促進される。左末端のメチオニンコドンは翻
訳開始部位を提供している。１１量体から１６量体の種
々の大きさの１２本の異なったオリゴヌクレオチドをCr
eaの改良ホスホトリエステル法により合成した(Crea,R,
Prcc.Nat′l.Acad.Sci.ＵＳＡ７５ ５７６５、１９７
８年）。Ｕ１からＵ６、およびＬ１からＬ６のこれらの
オリゴヌクレオチドは矢印で示してある。
１０μｇのＵ２からＵ６およびＬ２からＬ６を、公知の
方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび（γ
３２−Ｐ）ＡＴＰを用いて加燐酸化(phosphorylate)し
た(Goeddel，Ｄ．Ｖ．ら、Proc.Nat′l.Acad.Sci.ＵＳ
Ａ７６ １０６、１９７９年）。
Ｔ４リガーゼを触媒として用いた３つの別々の反応を行
なった：即ち、１０μｇの５′−ＯＨ断片Ｕ１を加燐酸
化したＵ２，Ｌ５およびＬ６と結合し：加燐酸化したＵ
３，Ｕ４，Ｌ３およびＬ４を結合し：そして１０μｇの
５′−ＯＨ断片Ｌ１を加燐酸化したＬ２，Ｕ５およびＵ
６と結合した。これらの結合反応は３００μｌの２０mM
トリス−塩酸（ｐＨ7.5）、１mM MgCl2、１０mMジチオ
トレイット、０．５mMＡＴＰ中、Ｔ４リガーゼ１００単
位を用い、４℃で６時間行なった。次いで、これらの３
種の結合混合物を合わせ、Ｔ４リガーゼ１００単位を加
え、２０℃で１２時間反応させた。この混合物をエタノ
ールで沈殿させ、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動した。８４塩基対移動帯をゲルから切取り、溶離
した。ｐＢＲ３２２（１μｇ）をEcoRIおよびHindIIIで
処理し、大きい断片をゲル電気泳動法で単離し、合成Ｄ
ＮＡと結合した。この混合体を用いてE.Coli.Ｋ−１２
株２９４(endA.thi-、hsr-、hsmk +)を形質転換した。２９
４株は１９７８年１０月３０日、ＡＴＣＣに寄託された
（ＡＴＣＣ番号３１４４６、無制限寄託）。１個の形質
転換体のプラスミッドｐＨＧＨ３からのEcoRI-HindIII
挿入体の配列をMaxamおよびGilbertの方法（前記）によ
り分析した結果、第１図に示した通りであることを確認
した。
３．細菌によるＨＧＨの発現のためのプラスミッドの作
製（第５図） ｐＨＧＨ３中の合成断片およびｐＨＧＨ３１中のｍＲＮ
Ａ転写体を用い、発現用プラスミッドｐＧＨ６を使用し
て、第５図に示す様に、両方の断片を含有する複製可能
なプラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロモータ
ーを含有するこの発現用プラスミッドを次の様にして作
製した。Backmanらの方法に従い、９５塩基対の非相同
(heterologous)ＤＮＡ断片で分離されている２個の９５
塩基対ＵＶ５lacプロモーター断片を含有する２８５塩
基対EcoRI断片をプラスミッドｐＫＢ２６８から単離し
た(K.Backman,et al.,Cell１３巻 ６５−７１、１９７
８年）。この２８５塩基対断片をｐＢＲ３２２のEcoRI
部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持った適
切な解読相内に向って配置しているプロモーター群を有
するクローンｐＧＨ１を単離した。このテトラサイクリ
ン耐性遺伝子から遠位のEcoRI部位をEcoRIによる部分消
化で破壊し、その結果得られる１本鎖EcoRI末端をＤＮ
ＡポリメラーゼIで修復し、鈍感末端結合によりプラス
ミッドを再環化した。作成されたプラスミッドｐＧＨ６
は、完成したＨＧＨ用遺伝子を挿入することができるプ
ロモーター系について適切に配置され単一のEcoRI部位
を含有している。
ＲＮＡ転写体と結合させるための合成断片を得るため
に、１０μｇのｐＨＧＨ３をEcoRIおよびHaeIII制限エ
ンドヌクレアーゼで開裂させ、ＨＧＨアミノ酸１〜２３
の暗号配列を含有している７７塩基対断片を８０ポリア
クリルアミドゲルで分離した。
次いで５μｇのプラスミッドｐＨＧＨ３１をHaeIIIで切
断した。５５１塩基対ＨＧＨ配列および一緒に移動した
ｐＢＲ３２２の５４０塩基対をゲル電気泳動法により精
製した。次いでXmaIで処理してＨＧＨ配列のみを切断
し、３′非コード領域から３９塩基対を除去した。得ら
れた５１２塩基対断片を、５４０塩基対のｐＢＲ３２２
HaeIII断片から、６％ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動により分離した。０．３μｇの７７塩基対EcoR
I-HaeIIIを１６μｌの反応液中、Ｔ４リガーゼを用いて
４℃で１４時間ポリメリ化した。リガーゼを不活性化す
るために、この混合物を７０℃で５分間加熱し、次いで
EcoRI(EcoRI部位によってダイマー化（二量化）した断
片を開裂するため）およびSmaI(XmaIダイマーを開裂す
るため）で処理し、EcoRI接着末端およびSmaI鈍感末端
を有する５９１塩基対断片を得た。６％のポリアクリル
アミドゲルを用いて精製し、この断片約３０ngを得た。
ところで、発現用プラスミッドｐＧＨ６はXmaI認識部位
を含んでいないことに留意すべきである。しかしなが
ら、SmaIはXmaIと同じ部位を認識し、しかしその中間部
を切断し、鈍感末端を生成するのである。従ってｐＨＧ
Ｈ３１から導かれたこの断片のSma−切断末端は、鈍感
末端でｐＧＨ６に結合していくことができる。
縦列lacＵＶ５プロモーターを含む発現用プラスミッド
ｐＧＨ６を、順次HindIII、ヌクレアーゼＳ１およびEco
RIで処理し、ゲル電気泳動法により精製した。この様に
して得た１個のEcoRI接着末端および１個の鈍感末端を
有するベクター５０ngを、１０ngの５９１塩基対ＨＧＨ
ＤＮＡと結合させた。この結合混合物を用いてE.Coli
×１７７６を形質転換した。テトラサイクリン（１２．
５μｇ／ml）に抵抗して生長するコロニーを選択した。
ハイブリッド（雑種）ＨＧＨ遺遺伝子をｐＧＨ６に挿入
することによってテトラサイクリン耐性遺伝子のための
プロモーターが破壊されるが、縦列lacプロモーターに
よってテトラサイクリン耐性のための構造遺伝子が通読
され、この選択特性が保持されることに注目すべきであ
る。この様にして約４００の形質転換体を得た。Grunst
ein-Hognessの方法によるフィルターハイブリダイゼー
ションによってＨＧＨ配列を含む１２のコロニーを確認
した(Proc.Nat′l.Acad.Sci.ＵＳＡ，７２ ３９６１、
１９７５年）。これらのコロニーの内、３種のコロニー
から分離したプラスミッドが、HaeIII、PvuIIおよびPst
Iで開裂した時、期待する制限パターンを示した。１個
のクローン、ｐＨＧＨ１０７のＤＮＡ配列を測定した。
この形質転換体によって発現されたヒト生長ホルモン
は、フアデバスＨＧＨプライストキット（Phadebas Ｈ
ＧＨ ＰＲＩＳＴ Kit、Farmacia）を用い、溶菌上澄液
を順次希釈したものを直接放射免疫分析することにより
簡単に検出された。
ＨＧＨの発現がlacプロモーターのコントロール下（支
配下）で行なわれたことを示すために、ｐＨＧＨ１０７
をlacレプレッサーを過剰生産するE.Coli株Ｄ１２１０l
ac+(iQo+Zty+)に入れた。インデューサー、ＩＰＴＧ
（イソプロピルチオガラクトシド）を添加するまで、有
意な量のＨＧＨ発現生成物は検出されなかった。
ｐＨＧＨ１０７のEcoRI部位を除去することにより、lac
プロモーターのリボゾーム結合部位コドンとＡＴＧ開始
信号との距離は、天然におけるそのリボゾーム結合部位
コドンとβ−ガラクトシダーゼのための開始信号との間
の距離と同じになるであろう。この天然の距離を模倣す
ることによって発現が増加するかどうかを調べる為に、
ｐＨＧＨ１０７をEcoRIで開裂し、得られた１本鎖末端
をＳ１エンドヌクレアーゼで消化し、次いでＴ４リガー
ゼを用いて鈍感末端結合して再環化することにより、ｐ
ＨＧＨ１０７をｐＨＧＨ１０７−１に変換した。この様
にして得たプラスミッドは同様にＨＧＨを発現すること
ができるけれども、驚くべきことに、発現の程度はｐＧ
Ｈ１０７より低いことが直接放射免疫分析によってわか
った。
本発明は上に述べた好ましい実施形式を限定されるので
はなく、特許請求の範囲の記載によってのみ限定される
ものであることは、当業者には容易に理解されるだろ
う。プロモーター系、親プラスミッド、目的とするポリ
ペプチド生成物またはその他の因子を種々選択し直すこ
とにより、これまで述べたものに種々の変更を加えるこ
とは勿論可能である。例えば、他のプロモーター系を本
発明において使用することができる。この様なプロモー
ター系としてはラムダープロモーター、アルビノースオ
ペロン（Phi８０ｄ ara）、またはコリシンＥ１、ガラ
クトース、アルカリホスファターゼあるいはトリプトフ
ァンプロモーター系などを挙げることができる。細菌に
よる発現のために使用する宿主生物としては、例えばエ
ンテロバクテリアケア(Enterobacteriaceae)、例えば大
腸菌株、サルモネラ(Salmonella)；バシラーケア(Bacil
laceae)、例えば枯草菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌
(Pneumococcus)；連鎖球菌(Sreptococcus)；およびイン
フルエンザ菌(Haemophilus influenzae)などが挙げられ
る。勿論、どの微生物を選ぶかによって、アメリカ予防
衛生研究所の組み換えＤＮＡのためのガイドライン（４
３Fed.Reg.６０，０８０、１９７８年）に従って行なわ
れなければならないクローニングおよび発現操作におい
て、物理的封じ込めの程度を調節しなければらない。
本発明は実験室規模で実施するのは好ましいけれども、
E.Coli×１７７６は、生物学的安全性の為に故意に虚弱
性が導入されているので、大規模に工業生産するには限
界があることがわかった。生物学的封じ込めよりも、む
しろ適当な物理学的封じ込めを行なえば、E.Coli.Ｋ−
１２株２９４（前記）およびE.Coli.株ＲＲＩ、遺伝子
型：Pro-Leu-Thi-RB -recA+StrrLacy-の様な微生物を大
規模操作に使用することができる。E.Coli.ＲＲＩは、H
frドナー（高頻度組換型供与菌）としてのE.Coli.Ｋ１
２株ＫＬ１６とかけあわせることにより、E.Coli.ＨＢ
１０１(H.W.Boyerら、J.Mol.BiO.４１ ４５９−４７
２、１９６９年参照）から得ることができる(J.H.Mille
r,Experiments in Molecular Genetics;Cold Spring Ha
rbor,New York，１９７２年参照）。E.Coli.ＲＲＩは、
１９７８年１０月３０日、ＡＴＣＣに寄託された（無制
限寄託、ＡＴＣＣ番号３１３４３）。×１７７６株も同
様に１９７９年７月３日、ＡＴＣＣに寄託された（ＡＴ
ＣＣ番号３１５３７）。その他、プラスミッドｐＨＧＨ
１０７（ＡＴＣＣ番号４００１１）、プラスミッドｐＧ
Ｈ６（ＡＴＣＣ番号４００１２）、ｐＨＧＨ１０７で形
質転換した×１７７６株（ＡＴＣＣ番号３１５３８）お
よびｐＧＨ６で形質転換したE.ColiＫ１２株２９４（Ａ
ＴＣＣ番号３１５３９）も１９７９年７月３日、ＡＴＣ
Ｃに寄託された。
本発明によって製造される微生物は、ヒト生長ホルモン
を工業的スケールで発酵により製造する方法に使用する
ことができ、多量の生成物を得ることができ、従来不可
能であった分野に使用することができる。例えば形質転
換E.Coli株は、常法により通気し、撹拌している鋼鉄製
またはその他の発酵容器中の水性培地、例えば、適当な
栄養物（例えば炭水化物またはグリセール）、硫酸アン
モニウムの様な窒素源、燐酸カリウムの如きカリウム
源、微量元素、硫酸マグネシウムなどを含んだ、ほぼ中
性ｐＨの（例えばｐＨ７±０．３）、約３７℃の水性培
地中で増殖させることができる。形質転換微生物は、抗
生物質耐性の如き１またはそれ以上の選択特性を示すこ
とが好ましく。それによって選択圧がかかって野生型E.
Coli競合増殖が抑制される。例えば、アンピシリンまた
はテトラサイクリン耐性微生物の場合、その抗生物質を
発酵培地に加え、それに対する耐性を持っていない野生
型生物を選別することができる。
発酵が完了したら細菌懸濁液を遠心分離するかあるいは
ブロスから細胞固形物を集め、次いで物理的または化学
的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残骸を除去し、
可溶性生長ホルモンを単離精製する。
ヒト生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれか
の方法により、またそれらを組み合わせることによって
精製することができる。（１）ポリエチレンイミン分別
法、（２）セファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００によ
るゲル濾過クロマトグラフィー、（３）ビオレックス(B
iorex)−７０レジンまたはＣＭセファデックスによるイ
オン交換クロマトググラフィー、（４）硫酸アンモニウ
ムおよび／またはpH分別法、および（５）ハイブリドー
マス(hybridomas)または免疫感作動物から単離した抗−
ＨＧＨ ＩgGから調製した抗体レジンを用いたアフィニ
ィティークロマトグラフィー；このホルモンは酸性条件
または僅かに変性させた条件下で脱着させる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードする
遺伝子を含有する合成遺伝子断片の模式図、第２図は合
成遺伝子のプラスミッドへの挿入を示す模式図、第３図
はＨＧＨをコードしているｍＲＮＡ転写体のＤＮＡ配列
を示す模式図、第４図はｍＲＮＡ転写体のプラスミッド
への挿入を示す模式図、第５図はＨＧＨを発現し得るプ
ラスミッドの作製を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３１５３９

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（１）(a)メッセンジャーＲＮＡからの逆
    転写により、アミノ酸配列が知られている特定のポリペ
    プチドのための暗号配列の少なくとも実質的な部分を含
    んではいるが、該ポリペプチドとは異なった生成物を発
    現する第１遺伝子断片を得、 (b)該第１遺伝子断片が、該ポリペプチドに含まれてい
    るアミノ酸配列以外のアミノ酸配列のための蛋白質暗号
    コドンを含んでいる場合には、該ポリペプチドのための
    暗号配列の少なくとも実質的な部分を保持しながら該蛋
    白質暗号化コドンを除去し（この場合、得られた断片が
    尚該ポリペプチドとは異なる発現生成物をコードする様
    に該蛋白質暗号化コドンを除去する）、 （ただし、工程(a)または、要すれば工程(b)の生成物は
    該ポリペプチドの全てのアミノ酸配列より少ないアミノ
    酸配列を暗号化している断片であり）、 (c)該ポリペプチドのアミノ酸配列の残部を暗号化する
    １個またはそれ以上の遺伝子断片を有機合成により得
    （少なくとも１個の遺伝子断片は該ポリペプチドのアミ
    ノ末端部を暗号化しており、かつ５′末端に開始コドン
    ＡＴＧを含んでいる）、そして、 (d)工程(c)の合成遺伝子断片および、その時の事情次第
    で工程(a)または(b)により作製した断片を、複製可能な
    クローニング媒体の、発現プロモーターの支配下にある
    お互いにとって適当な読み取り相に位置づけ、かつ、該
    ポリペプチドをコードするＤＮＡがその５′末端に開始
    コドンＡＴＧを含む様に位置づける、 ことにより得られる、特定のポリペプチドをコードして
    いる合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡの両者から誘導されたＤ
    ＮＡを細菌中で発現し得る複製可能なクローニング媒体
    で該細菌を形質転換し、 （２）該形質転換細菌を、旺盛な増殖を維持するに必要
    な適当な栄養培地中、通気、撹拌下で培養し、 （３）生産されたポリペプチドを培養混合物から分離す
    ることからなる、該ポリペプチドの生産方法。
  2. 【請求項２】合成ＤＮＡ部分が特異的に開裂し得るアミ
    ノ酸配列を更にコードしており、この配列により細胞外
    で開裂させて特定のポリペプチドを生産することができ
    る第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】特定のポリペプチドがヒト成長ホルモンで
    ある第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】特定のポリペプチドがヒト成長ホルモンで
    ある第２項に記載の方法。
  5. 【請求項５】ヒト成長ホルモンがそのリーダー配列また
    はその他の異質蛋白質を伴なわずに発現される第３項に
    記載の方法。
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