DD157343A5 - Mikrobielle expression von quasi-synthetischen genen - Google Patents

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DD157343A5 DD80222413A DD22241380A DD157343A5 DD 157343 A5 DD157343 A5 DD 157343A5 DD 80222413 A DD80222413 A DD 80222413A DD 22241380 A DD22241380 A DD 22241380A DD 157343 A5 DD157343 A5 DD 157343A5
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Herbert L Heyneker
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Abstract

Es werden Verfahren und Mittel fuer die Konstruktion und mikrobielle Expression quasi-synthetischer Gene beschrieben, die aus der Kombination von organischer Synthese und enzymatischer, reverser Transkription von Boten-RNA-Sequenzen hervorgehen, die vom Standpunkt des gewuenschten Poteinprodukts unvollstaendig sind. Bevorzugten Produkten der Expression fehlen bioinaktivierende Fuehrersequenzen, die in eukaryotischen Expressionsprodukten ueblich sind, jedoch problematisch in bezug auf das mikrobielle Schneiden, das erst dasbioaktive Material liefert. Eine bevorzugte Ausfuehrungsform ist naeher erlautert, bei der ein Gen, das fuer menschliches Wachstumshormon codiert (welches beispielsweise fuer die Behandl. von hypophysaerem Zwergenwuchs benoetigt wird), konstruiert und exprimiert wird.

Description

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Berlin, den 10,12*1980 AP C 07 G/222 413 57 800 / 12
Verfahren zum Konstruieren eines sich replizierenden clonierenden Vektors
Die Erfindung betrifft die mikrobielle Expression von quasi-synthetischen Genen über die Herstellung eines sich replizierenden clonierenden Vektors6 Es gelingt dadurch die Bereitstellung eines menschlichen Wachstumshormons, das in der Medizin bei der Behandlung von hypophysären Zwergenwuchs eingesetzt werden kann«.
Bekannte technische' Lösungen
Die DIIA (Desoxyribonucleinsäure), aus der Gene bestehen, enthält sowohl Protein codierende oder "Struktur1t~Gene als auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information dadurch vermitteln, daß sie Bereiche (sites)'für die RNA-Polymerase-Bindung, Information für ribosomale Bindestellen usw. bereitstellen,, Codiertes Protein wird von der korrespondierenden DHA innerhalb eines Organismus durch einen vielstufigen Prozeß exp^rimisrt> wobei:
1. das Enzym KEfA-Polynierase in der Kontrollregion (im folgenden "Promotor" genannt) aktiviert wird und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Boten-(Messenger)-Ribonucleinsäure (mKÜTA) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren "Stop"~Codons beendet wird;
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.2* die mRNA-Botschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei. einem "Start"-Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird)*
In Übereinstimmung mit dem genetischen Code spezifiziert die DM jede Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon" von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im folgenden A, T, C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-("Duplex")-DNA auf, dessen bleibender oder "komplementärer" Strang aus Nucleotiden ("Basen") gebildet wird, die mit den ihnen komplementären Basen im codierenden Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen« A ist komplementär zu T, und 0 ist komplementär zu G, Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert in Benjamin Lewin, Gene Expression, 1, 2 (1974) und.3 (1977) John ^iley und "ons, N, Y, Diese und andere Veröffentlichungen, die hlsr angesprochen sind, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen»
Schneiden und Verbinden von DNA ·
Es stehen eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination zur Verfügung, nach denen aneinandergrenzende Enden separater DHA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden geschieht durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen
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aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch die wirkung eines iinzyms, einer 'il4-DM-Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die jeweiligen Enden in die Position für die anschließende Verbindung gebracht werden. Solche Einzelstränge, als kohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang eines stumpfen %ides mit einem Enzym wieA.-Exonuclease abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restriktionsendonucleasen (im folgenden "Restriktionsenzyme"), die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen liucleotidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkenmmgsstelle") s, schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erkennungsstellen bekannt. Siehe ze B, Re J» Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (KoVe 1976)* ^iele davon machen versetzte ;: l.: Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangse'quenzen an den Enden eines an sich doppelsträngigen Fragments entstehen« Als komplementäre Sequenzen können die überstehenden oder "kohäsiven" Enden durch Basenpaarung re~ kombiniereiio Wenn zwei unterschiedliche Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül« Durch die Verwendung von Ligase, die .die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die^neuen DNA-Moleküle eine feste kovalente Bindung.
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Restriktionsenzyme, die an geschnittener doppelsträngiger DNA "stumpfe" Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombi~ nation mit anderen stumpfendigen Sequenzen duroh beispielsweise T4-Ligase·
Cionierende Vektoren und rekombinate DNA
PUr den vorliegenden Zweck wird folgendes "clonierender Vektor" genannt: ein nichtchromsomales Stück einer doppelsträngigen DNA, das ein intaktes Replikon enthält, so daß der Vektor repliziert werden kann, wenn"er in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") durch transformation gebracht wird* Ein auf diese weise transformierter Organismus wird "iransformante" genannt. Derzeit sind die clonierenden Vektoren, die üblicherweise verwendet v/erden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DNA, genannt "Plasmide".
Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von "rekombinanten" clonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das exogene DNA enthält, bestehen· In besonderen Beispielen kann die ^ekombinate "heterologe" DNA einschließen, wobei damit eine DNA gemeint ist, die für. Polypeptide codiert, die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt werden, v/elcher empfindlich ist für die !Transformation durch den rekombinanten Vektor« Es werden somit Plasmide mit ^estriktionsenzymen geschnitten, um lineare DNA, die verbindbare Enden hats zur Verfugung zu stellen. Diese werden an ein exogenes ^en gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon und eine phäno'typische Eigenschaft aufweist t die benutzt werden kann.
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um i'ransformanten zu selektieren. Das rekombinante 'J-'eil wird durch Transformation in einem. Ivlikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist, große Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für v/elches das Gen codiert« Über die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International Symposium °eries 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, Ne Y. (1977K
Expression von rekombinanter DSTA
Heben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren«, In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluß des lac-sr-Promoters in einem E* coli Bakterium exprimiert (K. Itakura et al«, Science, 198, 1056 (1977))* Kürzlich gelangt auf die gleiche ^eise die Expression der A- und B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das Hormon bilden (D. Ve Goeddel et al., Proc«, Eat'l«, Acad. Sei», USA,.76, 106 (1979)). In jedem Pail wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert«, In jedem Pail wurden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, woäurch dessen Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d. he als Tandem mit einem
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anderen Protein, das das gewünschte produkt durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden veröffentlichten englischen Patentschriften des Anmelders der vorliegenden Anmeldung beschrieben: GB-PS 2 007 675A, 2 007 670 A, 2 007 676 A und 2 008 123 A.
Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den Fall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z.B. Wachstumshormonen, Interferon usw., deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es'wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu exprimieren, da die Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material erfordert, das innerhalb des Organismus besser für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet v/erden könnte«
In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse Transkription von korrespondierender Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde. Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens kann die reverse iranskriptase die Transkription von der mEUA kurz vor der Fertigstellung der cDNA für die komplette gewünschte Aminosäuresequenz beenden. So haben beispielsweise Villa-Komaroff et al. eine cDM für Ratten-Proinsulin erhalten,
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der die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Hat 1I, Acad. Sei., USA, 75, 3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert v/erden, eine cDNA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält j wenn in einer eukaryoti.schen Zelle iftihrersequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen) enzymatisch abgetrennt werden, ^isher ist keine Bakterienzelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so daß das mRHA-Transkript eher die Expression, von Produkten ergeben hat, die die Leader-Sequenz der Vorläuferform enthalten, als das bioaktive"Protein selbst (Villa-Komaroff, a«, a«, 0. (Ratten-Proinsulin); P0 H9 Seeburg et ale, Hat ure s 276, 795 (1978) (Rattenwachstumshormon))«,
Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offensichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z* Be Villa-Komaroff, a, ae 0. (Penicillinase-Proinsulin); Seeburg, ae a„ 0. (ß-Lactamase-Wachstumshormbn)·
J%c hstumsho rmon
Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren und ist rai*t einem Molekulargewicht von-etwa 21.500 mehr als dreimal so groß wie Insulin« Bis zur vorliegenden Erfindung konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeitsaufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden -~ der
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Hypophyse aus menschlichen Leichen. Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Punktionsstörung der Hypophyse verursachtem hypophysären Zwergenwuchs begrenzt, und sogar hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen verrautet, daß vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, daß nicht mehr als 50 % der Betroffenen damit behandelt werden können,.
Ziel der Erfindung
Zusammengefaßt besteht daher eine Notwendigkeit für neue Methoden, um HGH und andere Polypeptidprodukte in großen Mengen herzustellen, Diese Notwendigkeit ist besonders skut in dem Pail, wenn Polypeptide zu groß sind, um organische Synthese zuzulassen oder, aus diesem Grund, mikrobiologische Expression von vollständigen synthetischen Genen. Die Expression von Säugetierhormonen von niRNA-Transskripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten, die dem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits jedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion von bioinaktiven Konjügaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können.
Wesen der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Konstruieren eines sich replizierenden clonierenden Vektors und damit zur Herstellung menschlichen Wachstumshormons zu entwickeln β
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AP 0 07 G/222 413 57 800 / 12
Erfindungsgemäß bereitgestellt wird somit ein Verfahren zum Konstruieren eines sich replizierenden clonierenden Vektors, der in einem mikrobiellen Organismus zur Expression eines speziellen Polypeptids mit bekannter Aminosäuresequenz fähig ist, bei dem ein für das Polypeptid codierendes Gen in den chlonierenden Vektor eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters für die Expression gebracht v/ird, gekennzeichnet dadurch, daß
a) ein erstes, durch reverse Transkription von Boten-RETA erhaltenes Genfragraent für ein Expressionsprodukt erhalten wird, das sich von dem Polypeptid unterscheidet, wobei das -Fragment zumindest einen wesentlichen Bestandteil der für das Polypeptid codierenden Sequenz enthält,
b) in den Fällen, in denen das erste Fragment Protein codierende Codons für Aminosäuresequenzen enthält, die sich von denen, die in dem Polypeptid enthalten sind, unten?-
• scheiden, diese Codons eliminiert werden, während zumindest ein wesentlicher Bestandteil der genannten codierenden ^equenz beibehalten wird und das erhaltene Fragment dennoch für ein Expressionsprodukt codiert, das sich von dem Polypeptid unterscheidet,
wobei das Produkt aus dem Schritt (a) oder, falls erforder~ lieh, aus dem Schritt (b) ein Fragment darstellt, das für weniger als alle Aminosäuren des Polypeptids codiert, daß ferner ' ' .·
c) durch organische Synthese ein oder mehrere Genfragmente, die für den -^est der AininogäUx-esequenz des Polypeptids codieren, bereitgestellt v/erden, wobei mindestens-eins
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• " AP C 07 G/222
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dieser Fragmente für den ^mino-Ende-Bestandteil des Polypeptide codiert, und
d) daß das (die) "enfragment(e)·aus Schritt (c) und dasjenige, das in Schritt (a) oder (b), je nach Sachlage, hergestellt wurde, in einem sich replizierenden clonierenden Vektor in richtiger Lesephase zueinander und unter der Kontrolle eines Promoters für die Expression angeordnet v/erden, wodurch ein sich replizierender dotierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der Aminosäuresequenz des Polypeptids fähig ist.
Der clonierende Vektor aus Schritt (d) ist vorzugsweise ein bakterielles Plasmid.
Das ^erfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das für den ^mino—^nde-Bestandteil des Polypeptids codierende, synthetische Fragment zusätzlich für die Expression einer spezifisch schneidbaren Aminosäuresequenz codiert, und daß die Fragmente stromabwärts von und in Lesephase mit exprimierten Protein codierenden Godons angeordnet werden, wodurch das konjugierte Expressionsprodukt des Plasmids spezifisch geschnitten werden kann, um das Polypeptid zu erhalten.
Erfindungsgemäß ist die Aminosäuresequenz des Polypeptids ohne.anhängendes Fremdprotein exprimierbar und wird vorzugsweise exprimiert , und das Fragment aus Schritt (a) enthält mindestens eine Mehrheit der codierenden Sequenz für das Polypeptid« . ·
&. Z £* Ί a
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AF C 07 G/222 413 57 800 / 12
Das o· ge Polypeptid ist vorzugsweise das menschliche Wachstumshormon und das erste Fragment Protein enthält codierende Codons für Aminosäuresequenzen, die sich von denen im menschlichen Wachstumshormon unterscheiden, wobei Eliminierungsscliitfc (b) das Haelll-Restriktionsenzymfragment des ersten Fragments liefert,,
Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß ein synthetisches Fragment und ein mMA-Transkript-Fragment. vor ihrer Anordnung im clonierenden Vektor miteinander verknüpft werden, wobei die entgegengesetzten Enden des Frag·- ments und des Transkrips unterschiedlich entweder einzelsträngig oder stumpf sind} so daß sichergestellt ist, daß die Verknüpfung der beiden Fragmente in der richtigen Orientierung für die Expression des Polypeptide erfolgte
Erfindungsgemäß schließt Schritt (b) ein:
das Verdauen des Haelll-Fragments mit einem anderen Restriktionsenzym,, das Abschneiden von Codons für untre.nslatierte Boten-RIIA und das gleichzeitige Bereitstellen eines Einzelstrangendes an 'einem Ende des entstehenden Fragments und vorzugsweise ist das zweite Restriktionsenzym Xtnal«,
Das Verfahren zum Herstellen von menschlichem Wachstumshormon enthält folgende S
a) Behandeln einer lebensfähigen Kultur bekaterieller Transformanten, die Plasmide enthalten, die in einem transformierten Bakterium zur Expression von Y/achstums-"formen fähig sind, wobei dem Bakterium kein fremdes
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konjugiertes Protein anhängt, in einem
a) Fermentationsgefäß, das mit Belüftungs- und Schüttelnder Rühr-) I/litt ein ausgestattet ist, in einer wäßrigen, ITährsubsträte enthaltenden Fermentationsboullion,
b) Wachsenlassen der Kultur unter Belüften und Schütteln (oder Rühren), während zusätzliche liährsubstrate zugegeben werden, die erforderlich sind, um verstärktes Wachstum zu erhalten, '
c) Abtrennen der erhaltenen Zellmasse aus der Fermentationsboullion,
d) Lysieren der Zellen, um deren Inhalt freizulegen,
e) Trennen der ZelItrümmer vom Überstand und
f) Isolieren und Heinigen des menschlichen Wachstumshormons, das im Überstand enthalten ist.
Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien Transformanten von E, coli sind, die eine ^elektionseigenschaft aufweisen, und daß ein Selektionsdruck angewendet wird, um konkurrierendes Wachstum von E. coli-Wildtyp zu behindern.
Die vorliegende Erfindung stellt Methoden und Mittel zur Expression quasi-synthetischer <-rene zur Verfügung, wobei durch reverse Transkription ein'wesentlicher Bestandteil, vorzugsweise die Mehrheit der codierenden ^equenzj zur Ver-
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fügung gestellt wird, ohne den arbeitsaufv/endigen Umweg der vollständigen synthetischen Konstruktion, während die Synthese des Restes der codierenden Sequenz ein komplettes Gen liefert, das fähig ist zur Expression'des gewünschten Polypeptids, ohne die -"egleitung von bioinaktivierenden Leader-^equenzen oder anderem I'remdprotein» Alternativ dazu kann der synthetische Rest ein gegen Proteolyse resistentes Konjugat ergeben, so gebaut, daß das Schneiden den des Premdproteins außerhalb der Zelle ermöglicht ist, wodurch die bioaktive Form erhalten wird«, Die Erfindung' stellt folglich Methoden und Mittel für die mikrobielle Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch, kostenaufwendige Extraktion aus "ewebe hergestellt werden konnten, und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet waren. In ihrer am meisten bevorzugten I1OIm stellt die Erfindung die erste Möglichkeit dar, mit der ein medizinisch signifikantes Polypeptidhormon (menschliches Wachstumshormon) bakteriell experimiert wird, wobei sowohl die intrazelluläre Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Kompartimentierung der bioaktiven X!'orm mit -^remdprotein
S bis zum extrazellulären «chneiden vermieden werden·' Der mikrobielle Ursprung für menschliches Wachstumshormon, ermöglicht durch die Erfindung, bietet vorerst einen reichen Vorrat des Hormons für die -Behandlung von Zwergenwuchs, zusammen mit anderen Anwendungsmöglichkeiten, die bisher jenseits der Kapazität der Hormone lagen, die aus Geweben zu erhalten waren, einschließlich diffusem Magenbluten, Pseudoarthrose, der therapie γόη Brandwunden, ^undheilung Dystrophy und der Heilung von Knochenbrüchen.
Der generelle Weg der Erfindung ist die Kombination mehrerer
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Genfragmente in einem einzigen clonierenden Vektor, wobei diese Genfragmente in Kombination für die Expression des gewünschten Produkts codieren« Von den Genfragmenten ist mindestens eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription von mRKfA abgeleitet ist, welches aus Gewebe isoliert wurde, wie durch die Methode nach A9 Ullrich et al., Science, 196, 1313 (1977)« Die cDlIA stellt einen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons, für das gewünschte Produkt zur Verfügung, während restliche Teile des Gens synthetisch erhalten werden« Die synthetischen und die mRNA-Transkriptfragmente v/erden getrennt geclont, um ausreichende Mengen für den Einsatz in dem späteren Kombinationsschritt zur Verfügung zu stellen.
Vielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung der Codons für das Endprodukt, s. B, zwischen synthetischer und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxam und Gilbert, Proc. Hat 1I. Acad. Sei., USA, 74,560 (1977). Komplementäre DlTA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche V/eise Codons für mindestens eine Carboxylendgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Translations-Stopsignalen, benachbart zum Carboxylende liegende Codons für nichttranslatierte mRNA. Die -Anwesenheit von DNA für nichttranslatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z.B. durch Schneiden mit -^e strikt ions enzymen entfernt werden.können, um zelluläres Material zu erhalten, das für die Replikation und Expression der DNA für das ange-
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strebte Produkt benötigt'wird» In besonderen Fällen werden die cDNA-Codons für die vollständige gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso wie fremde Codons stromaufwärts vom Aminoen&e des angestrebten Produkts. Zum Beispiel v/erden viele, wenn nicht alle, Polypeptidhormone in einer Vorläuferform exprimiert mit Leader- oder uignalseque'nzen für ein Protein, das beispielsweise beim transport zur Zellwand beteiligt ist« Während der Expression von eukaryotisehen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt, so daß das Hormon in seiner freien bioaktiven Form in den periplasmatischen "aum eindringtβ Man kann sich 'jedoch nicht darauf verlassen, daß mikrobielle Zellen diese funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert, Sequenzen, cLie für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mlöTA-Transkript zu entfernen« Im Verlauf dieses EntfernungsVorgangs geht auch das Translations-Startsignal verloren, und nahezu immer'werden ebenso einige ^odons für das angestrebte Pro- dukt entfernt» ^ie synthetische Komponente des quasi-synthetischen Genprodukts der Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso stellt sie ein neues Translations- ^tartsignal zur Verfügung, wobei der Vektor, in dem sich das Hybridgen letztlich entwickeln wird, selbst keinen günstig gelegenen ^.tart aufweist»
Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus WachstumshormoncDNA wird begünstigt durch das Zurverfügungstellen einer Restriktionserkennungsstelle 'innerhalb des das Wachstumshormon codierenden 'i'eils des· Gens. Die Erfindung kann nichtsdestotrotz auch ohne das Zurverfügungstellen einer solchen Erkennungsstelle durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne
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Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Restriktionserkennungssteile, die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten Polypeptide liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht, von mRHA abgeleitet ist« In jeder cDNA, die für das gewünschte Polypeptid und eine Leader- oder andere bioinaktivierende Üequenz codiert, wird sich daher die Grenze zwischen den ^odons der letzteren und denen des reifen Polypeptids an der iminosäurensequenz des reifen Polypeptids zeigen. Man kann einfach in die ^ene verdauen, die für das Peptid der ^ahl codieren, und so die ungewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen, "enn daher beispielsweise eine cDM. folgender Struktur gegeben ist:
k-a—4*- b-J
.· r γ ι
TiDAAGCCCTGATCGT «·* AATTCGGGACTAGCA ...
wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet ist, kann eine Reaktionsbedingung für eine Exonuclease-Yerdauung gewählt v/erden, um die oberen Sequenzen "a" und "b" zu entfernen, wonach eine S1-l\fuclease-Verdauung automatisch die unteren Sequenzen "c" und "d" eliminiert. Alternativ dazu und präziser· kann man DIIA-Polymerase-Terdauung in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten (ltd(A,T,C,G)TPn) einsetzen. Im obengenannten Beispiel wird
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daher DNA-Polymerase in Gegenwart von dGTP die ^equenz "c" entfernen (und bei "G" anhalten), daraufhin wird S1-Huclease "a" verdauen; DHA-Polymerase in Gegenwart von dTTP wird "d" entfernen (und bei "T" anhalten) und S1-Uuclease wird dann "d" herausschneiden usw. Sj[eiie allgemein A9 Kornberg, DNA-Synthesis, S. 87 bis 88,- W. E9 Preeman und Co9,' Francisco (1974)·
Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Sestriktionserkennungsstelle an einem passenden Punkt innerhalb des Be~ reichs der cDIA, die für das gewünschte Produkt codiert, konstruieren, durch Anwendung der "unpassenden" (mismatch) Reparatursynthesetechnik von A. Razin et al., Proce Nat 1I* Acad. Sei., USA, 75, 4268 (1978). Bei dieser Technik können eine oder mehrere Basen in eine bestehende DNA-Sequenz substituiert werden, wobei Primer verwendet werden, die den unpassenden ^ubstituenten enthalten. Mindestens sieben palindromartige 4-Basenpaarsequenzen werden selektiv durch bekannte -^estriktionsenzyme erkannt, das sind AGCT (AIuI), CCGG (Hpall), CGCG (Thal), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC (Haelll), und TCGA (Taql). ^enn die cDMA-üequenz eine Sequenz enthält, die sich von einer derartigen Erkennungsstelle in nur einer einzigen Base unterscheidet, was statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese eine replizierte cDITA zu erhalten, die die geeignete substituierte Base enthält und damit die gewünschte Restriktionserkennungsstelle« Durch einen Schnitt wird die DNA vom unerwünschten Leader entfernt, wonach durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptide benötigt werden«,
Zum Beispiel \a— Leader j __
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Codon für .. gewünschtes Produkt
CDMA
CAGG
''mismatch"Reparatursynthese
CCGG
Hpall
Synthese "a"
quasi-
synthetische DHA
Codons für gewünschtes Produkt
Bs ist natürlich offensichtlich, daß längere itestriktionserkennungssteilen auf ähnliche Weise eingesetzt werden können, wo das erwünscht ist, oder daß durch sukzessive Keparatur 4-Ba8enpaare~Restriktionserkennungsstellen gebildet werden können, v/o lediglich zwei Basen gemeinsam mit der Erkennungsstelle am gewünschten Punkt erscheinen usw.
Es werden sich Anwendungsmöglichkeiten zeigen, "bei denen es wünschenswert ist, nicht nur die Aminosäuresequenz des angestrebten Produkts, sondern auch eine bestimmte Menge fremdes, aber speziell hergestelltes Protein zu exprimieren. Vier derartige Anwendungen werden durch Beispiele erwähnt werden. Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf welche Immunogenität durch Konjugation zu einem zu-
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sätzlichen Protein übertragen wird, so daß eine Vaccine produziert wird (Siehe allgemein GB-PS 2 008 123 A). Es kann jedoch wieder aus Sicherheitsgründen wünschenswert seinj das angestrebte Produkt als eine Konjugate eines anderen bioinaktiven Proteins zu exprimieren, die so gebaut ist, daß extrazelluläres Schneiden ermöglicht ist, um die aktive Form zu erhalten» drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange das Signal-Peptid danach geschnitten werden kanne Schließlich kann eine Fremdverbindung verwendet werden, die so gebaut ist, daß ein spezifischer extrazellulärer· Schnitt möglich ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen des mikrobiellen ^irts. Zumindest in den letzten drei Anwendungsbereichen kann der synthetische molekulare Adapter, der verwendet wird, um die codierende °equenz des mRJJA-Tra.nskrijfe zu vervollständigen, zusätzlich Codons eingebaut haben für Aminosäuresequenzen, die spezifisch geschnitten werden, beispielsweise durch enzymatische Wirkung« Beispielsweise schneidet Trypsin oder Chymotrysin bei Arg-Arg oder Lys-Lys usw· (siehe GB-PS 2 008 123 A),
Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die Erfindung in ihrem breitesten Bereich die mannigfaltigsten Anwendungen erlaubt, von denen alle die folgenden Eigenschaften gemeinsam aufweisen:
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— Es wird ein mREA-Transkript verwendet, das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten Aminosäuresequenz des Polypeptide codiert, das jedoch, falls es all eine exprimiert wird, ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würdes entweder kleiner oder größer als das angestrebte Produkt;
— Protein codierende ^odons für andere als solche
• Aminosäuren, die im angestrebten Produkt erhalten sind, werden, falls vorhanden, entfernt §
— organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz
• codieren; und
— das mRNA-Transkript und das (die) synthetische(n) Fragmente) werden zusammengefügt und in einen einen Promoter enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes konjugiertes Protein, oder das angestrebte Produkt konjugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und exprimiert wird*
Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall mit der Aminosäure beginnen, für die das .Translations-Startsignal codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin). Man kann erwarten? daß diese Aminosäure intrazellulär entfernt wird oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden
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Produkts im wesentliehen unbeeinflußt laßt*
Obv/ohl die Erfindung ein Verfahren allgemeiner Anwendbarkeit bei der Produktion von nützlichen Proteinen, einschließlich Antikörpern, Enzymen und ähnlichem zur Verfügung stellt, ist die Erfindung im besonderen auf die Expression von Polypeptidhormonen von Säugetieren und anderen Substanzen mit medizinischer Anwendung gerichtet, ze Β, Glucagon, gastrointestinale Inhibitorpolypeptide, Polypeptide der Bauchspeicheldrüse, Adrenokortikotropin, ß-Endorphine, Interferon, Urokinase, Blutgerinnungsfaktoren, menschliches Albumin usw.
Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele näher erläutert. In der dazugehörigen Zeichnung, die sich auf bevorzugte Beispiele beziehen, zeigen:
1: das Syntheseschema ,für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim Clonen verwendet werden«. Die Pfeile im codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem komplementären oder unteren Strang ("L") bezeichnen die Oligonucleotide, die miteinander verbunden wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;
2i die Verbindungen der "U"- und "L"~01igonucleotide für die bildung des Genfragments aus -^ig* 1 und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendem
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Pig» 3: die DNa-Sequenz (nur der codierende Strang) eines HaeIH~Restriktionsenzymfragments eines HypophysenmEKTA-Transkripts mit den numerierten Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren; Schlüsselrestriktionserkennungsstellen sind bezeichnet, ebenso DIiA (auf "Stop" folgende) für nichttranslatierte mPJtfA;
Pig« 4: die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein ^enfragment, das für die Aminosäuren, des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplementäre DMA durch reverse !Transkription von mKNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;
Pige 5ϊ die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons fähig ist, beginnen mit den Plasmiden der i'"ig, 2 und 3. '
Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform, die die Erfindung erläutert, beschrieben, bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für menschliches Wachstumshormon codiert, konstruiert, geclont und mikrobiell exprimiert wird.
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Konstruktion und Expression eines clonierenden Vektors für menschliches Wachstumshormon
1. Cionieren des Haelll-Fragments des rnRNA-Transkripts
,f 3 und 4), , . .-
Polyadenylierte mRM für menschliches Wachstumshormon (HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzierenden Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von A. Ullrich -et al., Science, 196, 1-313 (1977). 1,5/Ug von Doppelstrarig-C'dsO-cDliA v/erden prägniert aus 5/Ug dieser 'KHA, im wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al., j. Biolo uheme, 253, 2483 (1978),. mit der Ausnahme, daß die HIIA-Polymerase "Klenow-Pragnient", (H, Klenow, Proc. Nat 1I. Acad. Sei., USA, 55, 168 (1970)) für die DM-Polymerase I in der Zweit-Strangsynthese eingesetzt wurde. Das Restriktionsmuster von HGH ist derartig, daß Haelll-Restriktionserkennungsstellen in der 3' nichtcodierenden Region und in der Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und 24 des HGH codieren, vorhanden sind, wie gezeigt in Fige 3. Eine Behandlung der ds-HGH-cDNA mit Haelll gibt ein DNA-Fragment von 551 Basenpaaren ("bpu)> die für die Aminosäuren 24 bis 91 des HGH codieren. 90 ng der cDIA werden mit Haelll behandelt, in einem 8$igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die Region bei 550 bp eluiert* Man erhält annähernd 1 ng cBITA,
pBR322, hergestellt nach F. Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95 bis 1.13, wird als clonierender Vektor für die cDlTA ausgewählt« pBR322 ist vollständig charakterisiert (J0 G6 Sutcliffe, Gold. Spring Harbor Symposium, 43: 70 (-1978)), und ist ein mit zahlreichen Kopien (multicopy) repli-
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zierendes Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracylin-Resistenz aufweist, die. auf den Einschluß der korres-
R R
pondierenden Gene (uAp t! bzw» "Tc " in I1Ig0 4) zurückzuführen sind j wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Pstl, EcoRI und Hindlll enthält, wie in der Figur gezeigt«
Die Schneideprodukte von Haelll und Pstl haben stumpfe Endenβ Es kann folglich das GG-Anhängeverfahren nach Chang Ae C. Y. et al·, Nature, 275, 617 (1978) angewendet werden, um die stumpfendigen Produkte der Pstl-Schnit-te von pBR322 mit der Haelll-Verdauung des mRNA-Transkripts zu verbinden, so daß das cDNA-Fragment in die PstI-Erkennungsstelle von pBR322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die Haelll-Restriktionserkennungsstellen (GG^CC) auf der cDITA und die Pstl-Restriktionserkennungsstellen (CTGCA^G) an federn -^nde des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden,
Es wird also terminale Desoxynucleotid-Transferase (TdT) verwendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3f-Ende anzu~ fügen, wie bereits früher beschrieben^ Chang A«, Y. C, a«. ae O0 Auf äiialiche Weise werden an das 3'-^nde von 60 ng Pstl-behandeltem pBR322 etwa 10 dG-Reste angehängt. Das Verschmelzen der dC-ergänzten.ds-cDM mit der dG-ergänzten · Vektor-DM wird in 130^uIvon 10 mM Tris-HCi (pH = 7,5), 100 mM HaCl und .0,25 mM EDTA durchgeführt. Die Mischung wird auf 70 0C erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37 0C abgekühlt, und schließlich auf 20 0C (6 Stunden) abgekühlt, ehe sie zum Transformieren von E, coil χ 1776 verwendet wird· Eine DUA-öequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach der
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Methode von Maxam und Gilbert, Proc* Nat'l» Acad* Sei,, USA, 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasraids in x17?6, stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 Ms 191 des HGH überein, wie -in Fig, 3 gezeigt«
Der stamm E. coli K-12 x1776" hat den Genotyp F""tonA53g ä^SSäi EiSM» £ÜEMSj Δ 40Xgaj^vrB)4. Λ; "", minB2, rfb^2., nalA25?, om.s-2, thjA57f, metC65s oms~1., Δ29 ίbioH-asd), £Z2Als liää.^· 2C1776 wurde vom National 'Institutes
of Health als ein EK2~Wirts~Vektor-System bescheinigt.
XI776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure (DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolan-(clanic)-säure synthetisieren. Die Zelle unterliegt daher dem DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP begrenzt ist, jedoch genügend Uährsubstrat vorhanden ist, um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der ktamm ±Β% Thymin- oder '-i-'hymidin-bedürftig und unterliegt dem Thymin~4!angeltod mit Abbau der DHA, wenn ^hymin und 'J-'hymidin in der Umgebung fehlen, jedoch.'genügend Hährsubstrate vorhanden sind, um die S-fcoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten, x17?6 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, d. h· unfähig, eine Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten zu überleben. XI776 ist hochgradig empfindlich gegen Detergentien, Antibiotika, -Arzneimittel und Chemikalien. χ177β kann weder die Dunkelreparatur noch die Photo-ßeaktivierung von UV-induzierten Schäden durchführen und ist daher um mehrere Größenordnungen empfindlicher gegen Sonnenlicht als der Wildtypstamm von E. coli. x17?6 ist resistent gegen viele transduzierende Phagen und läßt bei der Konjugation,nur
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mangelhaft die genetische Übertragung von vielen verschiedenen Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasraiden zu, was auf die Anwesenheit von verschiedenen Mutationen zurückzuführen ist« x1776 ist resistent gegen Halidixinsäure, Cycloserin und !Trimethoprim«, %ese Substanzen können daher dem Medium zugegeben werden, um das Überprüfen des ^tamms zu ermöglichen und eine Transformation von Kontaminanteh v/ahrend der 'i'ransformation auszuschließen©
x1776 wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min. · sowohl in L-Iahrmedium (Z-broth) als auch Penassay-Medium (Penassay broth), wenn diese mit 100/Ug DAP/ml und 4/Ug Thymidin/ml supplementiert werden und erreicht eine End-
8 dichte von 8 bis 10 χ 10 Zellen/ml in der stationären Phase«, Vorsichtiges kreisförmiges Hin- und Her schütteln für eine Zeitspanne von 1 bis 2 Minuten suspendiert die Zellen vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100 i&o Zusätzliche ^etails bezüglich x1776 sind zu finden bei R, Curtis et al., Molecular Cloning of Recombinant DKAj 99 bis 177s Scott und Werner, eds., Academic Press (1. Y. 1977)· z1776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection am 3 ο Juli 1979 unter der Hummer ATCC 31537 hinterlegt,
2e Konstruktion und Cionieren des
_synt_het_ischen_ Genfragments (Fig. 1 und 2)m
Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH-quasi-synthetischen Gens, daß ein synthetisches Fragment konstruiert wird? das stumpfendige Restriktionsschneide-
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stellen aufweist, die an den Punkten sitzen, an denen an das Fragment das mPJJA-Transkript angeknüpft werden soll» Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren des HGH erhält daher, wie in Fig. 1 gezeigt, eine auf die Aminosäure 23 folgende Haelll-Schneideerkennungsstelle. Das distale Ende des synthetischen Fragments wird mit einem Verbindungselement (im folgenden "Linker") versehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dem Plasmid erhalten wird, in das das mRBA-Transkript und das synthetische' Fragment letztlich eingebaut werden sollen.
Wie in Fig. 1 gezeigt, haben die 5'-Enden des doppelsträngigen Fragments einzelsträngige kohäsive binden für die EcoRI«· und Hindlll—Restriktionsendonucleasen, um die Plasmid-Konstruktion zu erleichtern« Das Codon für Methionin am linken -^nde stellt eine ^rkennungsstelle für die Initiation der Translation zur Verfügung» Ss werden zwölf verschiedene Oligonucleotide, die in ihrer Größe von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem bewährten Phosphotriester-Verfahren nach Gres. R. Proc* lc Acad. Sei«, USA, 75, 5765 (1978). Diese Oligonucleotide j IL bis LV und L^ bis Lg, sind durch Pfeile bezeichnet«
10/Ug Substanz von U0 einschließlich U^ und L2 einschließlich "Lr werden unter Verwendung der T--Polynucleotidkinase und (ψ -P)ATP phosphoryliert, und zv/ar nach dem veröffentlichten Verfahren von Goeddel, De V.·et al. Proc. Nat 1I. Acade Sei., USA, 76, 106 (1979).
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Es werden drei getrennte T4~Ligase-katalysierte Reaktionen durchgeführt: 10/Ug des 5f~OH-Fragments IL werden mit phosphoryliertem U?, Iv- und Lg vereint; phosphoryliertes U^,U. j L-2 und It L werden vereint; weiterhin werden 10/Ug des 5f~0H~i1raginents L., mit phosphoryliertem Lp, Ur und DV vereint, j;iese Verknüpfungen werden bei 4 ,C für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300/ul von 20 mlvl Tris-HCl (pH = 7,5), 10'mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitöl und 0j5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4~ Ligase verwendet v/erden, ^ie drei Verknüpfungsmischungen werden dann vereint, 100 Einheiten T4-Ligase zugegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20 0C ablaufen läßt. Die Mischung wird dann mit Ethanol ausgefällt und. auf einem ·1Obigen Poiyacrylamid-Gel einer Elektro- . phorese unterworfen» -^ie Bande, die bis zur 84~Basenpaar-Stelle gewandert' ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert. pBR322 (1/Ug) wird mit EcoRI und Hindlll behandelt, das große Fragment -wird durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DlTA verknüpft. Diese Mischung wird verwendet, um den Stamm E. coli K-12 294 (end A, thi"*, hse"~, hsm,+) zu transformieren'. Der Stamm 294 wurde am 30. Oktober 1978 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen hinterlegt, ^ine Sequenzanalyse nach der Maxam und Gilbert-Technik, a« a, 0., bei der EcoRI - Hindlll-Insertion von einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte das in ^1Ig. 1 Dargestellte. .
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3. Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression von HGH .(Fig.,.52
Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mRM-'.t'ranskript in pHGH31 wird ein zur Beplikation fähiges Plasmid konstruiert, das beide Fragmente enthält, wobei das Expressionsplasmid pGH6 verwendet -wird, wie in Fig. gezeigt. Das Expressionsplasmid, das einen lac~Promoter als !Tandem enthält, vmrde zuerst folgendermaßen kon-
} struierte Ein 285-Basenpaare-langes EcoRI-Fragment, das zwei 95-Basenpaare-lange UVS-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche durch ein 95~Basenpaare-langes, heterologes DNA-Fragment abgetrennt wurden, v/ird aus dem Plasmid pKB268 isoliert, siehe K. Backman et al., Cell. Vol. 13, 65 bis 71 (1978)c Das 285-bp-Fragment wird in die EcoRI-Erkennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGH1 isoliert, in dem die Promoter auf das Gen für l'etracyclin-Resistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene EcoRI-Erkennungssteile wird durch teilweise
' EcoRI-Verdauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI--^nden werden mit DITA-Polymerase I repariert und das Plasmid wird durch stumpfendige Verbindung wieder in Ringform gebracht. Das Resultierende Plasmid (pGH6) enthält eine einzige EcoRl-Erkennungsstelle, die passend liegt im Hinblick auf das Promoter-System, in das das komplette Gen für.HGH eingebaut werden kann»
Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem RITA- Transkript fertigzustellen, werden 10/Ug von pHGH3 mit EcoRI- und Haelll-Restriktionsendonucleasen geschnit- ' ten und das 77-Basenpaare-Fragraent, das die codierenden
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Sequenzen für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8%igen Polyacrylamid~Gel isoliert*
Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 (5,ug) mit Haelll geschnitten« Die 551-bp-HGH-^equenz und ein mitgewandertes 54O-bp-HaeIII-£'ragment von pBR322 werden durch Gel« . Elektrophorese gereinigt» Eine anschließende Behandlung mit Xmal schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3'-nichtcodierenden Region entfernt werden· Das resultierende 512-bp·-Fragment wird von dem 54O-bp-pBR322-Haelll-Stück durch Elektrophorese in einem' 6 folgen Polyacrylamid-Gel getrennt, 0,3/Ug des 77-bp-EcoRI-HaeIII-Fragments γ/erden mit 24-Mgase in einer I6yul-Reaktion 14 Stunden lang bei 4 0C polymerisierte Die Mischung wird dann für 5 Minuten auf 70 C erhitzt, um die Ligase au inaktivieren, anschließend mit EcoRI behandelt (um Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer EcoRI-Erkennungsstellen dimerisiert haben), weiterhin mit Smal behandelt (um Xmal-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591-bp~I1ragment mit einem EcoRI-Ende» das kohäsiv ist, und einem Smal-^nde, das stumpf ist, erhalten wird» Nach der Reinigung auf einem Sfolßen .Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses Fragments* Es sollte bemerkt werden, daß das Expressionsplasmid pGH6 keine Xmal-Erkennungsstelle enthält. Smal erkennt jedoch die gleiche ^rkenn'ungs st eil e wie Xraal, aber schneidet genau durch die Mitte, so daß stumpfe Enden erhalten werden* Das Smatgeschnittene Ende des Pragments, das von gHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pGH6 gebunden werden«
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Das Expressionsplasmid pGH6, das den lac-UV5-Promoter in Tandemform enthält, wird sukzessive mit Hindlll, Uuclease S1 und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt. 50 riß des resultierenden Vektors, der ein kohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der 591-1Up-HGH-DNA verbunden« -^iese Verbindungsmischung wird verwendet, um B«, coli χ177β zu transformieren. Die Kolonien werden durch Wachstum auf Tetracyclin (12,5/Ug/ml) selektiert» S8 ist bemerkenswert, daß die Insertion des hybriden HGH-Gens in pGH6 den Promoter für die Tetracyclin-Resistenz zerstört, daß jedoch der Tandem-lac-Promoter das durchlesen der Strukturgene für Tetracyclin-Resistens erlaubt und auf diese 1/s'eise die Selektionscharakteristik erhalten bleibt. Es wurden annähernd 400 Transformanten erhalten. Mit der Grünstein-Hogness-Methode, Proc« Hat 1I. Acad. Sei., USA, 72, 3961 (1975), wurden durch J1IIterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequenz enthaltene Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben das erwartete Restriktionsmuster, wenn sie mit Haelll, PvuII und Pstl geschnitten wurden. Von einem Clon (pHGH107) wurde die DHA-Sequenz bestimmte
Menschliches Wachstumshormon, das von Transformanten produziert v/ird, kann ohne weiteres durch direkten Radioimmunoassay nachgewiesen werden, welcher aus Verdünnungsreihen des Überstands lysierter Zellen durchgeführt wird, unter Verwendung von Phadebas HGH PRIST kit (Parmacia)«,
Um aufzuzeigen, daß die HGH-Expression unter der Kontrolle des lac-Proraoters steht, wird pHGH107 in einen E* colim D1210 (Iac+(i^0+z+y+)), einem ötamm, der den Iac-
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Repressor überproduziert, transformiert. Bis zur Zugabe des Induktors IPTG (Isopropylthiogalactosidolipoid) kann keine nennenswerte Menge von HGH-Expression nachgewiesen v/erden.
Bin Entfernen der EcoRI-Erkennungssteile in pHGH107 hätte zur Folge j daß das ATG-Startsignal von den Codons der Ansatzstelle für die Ribosomen des lac-Promoters den gleichen Abstand hätte, den diese Codons natürlicherweise vom Startsignal für B-Galactosidase haben. Um festzustellen, ob die Expression durch Nachahmung dieses natürlichen Abstands zu steigern ist, wurde pHGH107 ind pHGH107-1 überführt, indem das erstere Plasmid mit EcoRI geöffnet wurde, die entstehenden Einseistrangenden mit S1-Endonuclease verdaut wurden und das Plasmid durch Verbinden der stumpfen Enden mit is4-Ligase wieder in Ringform überführt wurde» Obwohl sich zeigte, daß das erhaltene Plasmid in ähnlicher Weise zur Expression von HGH fähig war, produzierte es jedoch HGH überraschenderweise in geringerem Umfang als pHGH107, wie durch direkten Radioirnmunoassay gezeigt v/erden konnte»
Für den Fachmann ist offensichtlich; daß die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschließlich auf den Schutzbereich der Patentansprüche, Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Sy st ems, des Elternplasmid's, des angestrebten Polypeptidprodukts oder sonstigem«, Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem Arabäjiose-Operon (phiSO dara) oder·.dem Colicin-EI-, Galactose-, alkalische
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Phosphatase- oder Tryptophan-Promoter. WirtsOrganismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familie der -^nterobacteriaceae, ζ. Β« die Stämme Escherichia coli und Salmonella; aus der Familie der Bacillaceae, z. Be Bacillus subtilis; weiterhin Pneumococcus; Streptococcus .und Haemophilus Ahfluenzae. natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien für rekombinante DIJA des National Institutes of Health,-43 Fed0 Reg« 60 OSO (1978)' durchgeführt werden sollen.
Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung im Labοmaßstab eignet sich der Stamm E. coli χ 1776 besonders gut, es könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung im großen Maßstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absieht- · lieh aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden« Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung, eher als biologischer, können für die Arbeit im großen Maßstab auch solche Organismen wie E. coli K-12 Stamm 294» &· Q·· 0., und E, coli Stamm RR1, Genotyp: Pro""Leu~Thi~R-n~reCA+Strr Lac y~ verwendet werden. E. coli RR1 wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HBT01 (H. W, Boyer et al., J. Mol. Bi0, 41, 459 bis 472 (1969)) mit dem ütamm E. coli K-12, Stamm KLI6 als Hfr-Donor erhalten. Siehe auch J, H. LIiIler, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972).'^ine Kultur von E. coli RR1 wurde am 30. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der Nummer ATCC 31343 hinterlegt. Auf
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ähnliche Weise wurde eine Kultur von x1776 am 3« Juli 1979 bei der American Type Culture Collection unter der Hummer Al1CC 31537 hinterlegt,, Am 3* Juli 1979 wurden bei der American Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pHGH107 (ATCC 40011); Plasmid pGH6 (A'i'OC 40012); der Stamm X1776, der mit pHGH107 transformiert wurde (ATCC 31538), und Ee coil K-12 Stamm 294, transformiert mit pGHö (ATCC 31539), · "
lach der Erfindung hergestellte Organsmen können für die in industriellem Maßstab durchgeführte fermentative Produktion von menschlichem Wachstumshormon eingesetzt werden, wodurch ein Produkt in solchen Mengen und für Anwendungsgebiete erhcilten wird, wie es bisher unerreichbar-war. Beispielsweise können transformierte E, coli-Kulturen gezüchtet werden in wäßrigem Medium in einem tahl- oder einem anderen Fermentationsgefäß, auf übliche Weise belüftet und geschüttelt, in wäßrigem Medium bei beispielsweise 37 0C und nahezu neutralem pH (beispielsweise pH = 7 + 0,3) f ergänzt mit geeigneten Hahrsubstraten (beispielsweise Kohlenhydrat oder Glycerin)s Stickstoffquellen (z. B. Ammoniumsulfat), Kaliumquellen,·(z. B. Kaliumphosphat), Spurenelementen, Magnesiumsulfat .und ähnlichem. Transformante Organismen weisen vorzugsweise eine oder mehrere Selektipnscharakteristiken auf, beispielsweise Antibiotika-Resistenzen, so daß ein Selektionsdruck ausgeübt werden kann, um konkurrierendes Wachstum von Wildtyp-E» coli"zu behindern« Für den Pail eines gegen Ampicillin oder Tetracyclin resistenten Organismus kann beispielsweise das Antibiotikum zum Fermentationsmedium gegeben werden^so daß 1^iIdtyp-Organismen ausselektiert werden, die nicht·, gegen diese Antibiotika resistent sind.
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Nachdem vollständig fermentiert wurde, wird die bakterielle Suspension zentrifugiert oder die Zellmasse auf andere weise aus der Kulturbrühe gesammelt, daraufhin wird mit physikalischen oder chemischen Mitteln lysiert. Die Zelltrümmer werden vom Überstand getrennt und das lösliche Wachstumshormon wird isoliert und gereihigt.
Menschliches Wachstumshormon kann aus Balferienextrakt gereinigt .werden, indem man eine der folgenden Methoden oder ei'ne Kombination dieser anwendet:
1) Polyethylimin-Fraktionierung;
2) Gel~^iltrierimgs-%iromatographie auf Sephacryl S-200;
3) lonenaustausch-Chromatographie auf Biorex-70 Harz oder CM Sephadex;
4) Ammoniumsulfat und/oder ph-Fraktionierung; und
5) Affinitäts-Chromatographie, wobei Antikörper-Harze verwendet v/erden, die aus anti-HGH IgG hergestellt v/erden, welches aus iramunosensitivi ert en Tieren oder Hybridgeweben (hybridomas) isoliert wurde; das Hormon wird unter sauren oder mild denaturierenden Bedingungen herausgelösto

Claims (8)

  1. AP C 12 Ή /222 413 57 800 12
    zum xvonstru.ieren
    Verfahren/feines sich replizierenden klonierenden Vektors, der in einem mikrobiellen Organismus zur Expression eines speziellen Polypeptids mit bekannter'Aminosäuresequenz fähig ist, "bei dem ein für das Polypeptid codierendes Gen in den klonierenden Vektor eingefügt und unter die Kontrolle eines Promotors für die Expression gebracht wird, gekennzeichnet dadurch, daß
    a) ein erstes» durch reverse Transkription von Boten-EM erhaltenes Genfragment für ein Expressionsprodukt erhalten wird, wobei das Fragment zumindest einen Bestandteil der für das Polypeptid codierenden Sequenz enthält, ·
    b) in den Fällen, in denen das erste Fragment Protein codierende Codons für AminosäureSequenzen enthält, die sich von denen, die in dem Polypeptid enthalten sind, unterscheideny diese Codoris eliminiert werden, während zumindest ein Teil der genannten codierenden Sequenz beibehalten wird und das erhaltene Fragment dennoch für
    . ein Expressionsprodukt codiert,
    wobei das erste oder codierende Fragment für weniger als alle Aminosäuren des Polypeptids codiert, daß ferner
    c) durch organische Synthese zumindest eines der synthetischen Genfragmente, die für den Eest der Aminosäuresequenz des Polypeptids codieren, bereitgestellt wird, · wobei mindestens eines dieser Fragmente für den Amino-Ende-Bestandteil des Polypeptids codiert, und
    d) daß das (die) Genfragment(e) aus Schritt (c) und dasjenige, das in.Schritt (a) oder (b), Oe nach Sachlage hergestellt wurde, in einem sich replizierenden, klonierenden Vektor in richtiger Lesephase zueinander und
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    unter der Kontrolle eines Promoters für die Expression angeordnet werden, wodurch ein sich replizierender, klonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der Aminosäuresequenz des Polypeptids fähig ist.
    2, Verfahren nach Punkt 1,gekennzeichnet dadurch, daß der klonierende Vektor aus Schritt (d) ein bakterielles Plasmid ist.
    Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das (die) für den Amino-Ende-Bestandteil des Polypeptids codierende (n), synthetische(n) Fragment(e) zusätzlich für die Expression einer spezifisch schneidbaren Aminosäuresequenz codiert (codieren), und daß die Fragmente stromabwärts von und in Lesephase mit exprimierten, Protein codierenden Codons angeordnet werden, wodurch das konjugierte Expressipnsprodukt des Plasmids spezifisch geschnitten werden kann, .um das Polypeptid zu erhalten.
    4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids ohne anhängendes Fremdprotein exprimierbar ist.
    5· Verfahren nach Punkt 4? gekennzeichnet dadurch, daß das Fragment aus Schritt (ä) mindestens eine Mehrheit der codierenden Sequenz für das Polypeptid enthält.
  2. 6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß ein synthetisches Fragment und ein mRM-Transkript-Fragment vor ihrer Anordnung im klonierenden Vektor miteinander verknüpft, werden, und wobei die entgegengesetzten Enden des Fragments und des Transkripts unterschiedlich entweder einzeisträngig oder stumpf sind, so daß sichergestellt
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    ist, daß die Verknüpfung der beiden Fragmente in der richtigen Orientierung für die Expression des Polypeptids erfolgt.
    Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid das menschliche Wachstumshormon ist, und daß das erste Fragment Protein codna?ende Codons für Aminosäuresequenzen enthält, die sich von denen im menschlichen Wachstumshormon unterscheiden.) und wobei der Eliminierungssohritt (b) das HaeIII-Eestriktionsenzymfragment des ersten Pragments liefert.
  3. 8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß Schritt (b) einschließt: das Verdauen des Haelll-Pragments mit einem anderen Restriktionsenzym, das Abschneiden von Codons für untranslatierte Boten-EM und das gleichzeitige Bereitstellen eines Einzelstangendes an einem Ende des entstehenden Pragments«
  4. 9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß das zweite Restriktionsenzym Xmal ist·
  5. 10. Verfahren nach Punkt 1 zum Konstruieren eines sich replizierenden klonierenden Vektors, der in einem mikrobiellen Organismus zur Expression eines Humanwachstumshormons fähig ist, bei dem ein für das Humanwachstumshormon codierendes Gen in den klonierenden Vektor eingefügt und unter die Kontrolle eines Promotors, für die Expression gebracht wird j gekennzeichnet dadurch, daß e'in erstes Genfragrnent für ein Expressionsprodukt erhalten wird, das einen Teil der für .das Hunianwachstumshormon codierenden Sequenz enthält, wobei dieses erste Genfragment für weniger als alle'Aminosäuren der Aminosäuresequenz des Humanwachstumshormons codiert,
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    daß mindestens ein zweites Genfragment bereitgestellt wird, das für den Rest der Aminosäuresequenz des Humanwachstumshormons codiert, wobei mindestens dieses Fragment für den Amino-End-Bestandteil des Humanwachstumshormons codiert, und
    die obengenannten Genfragmente in einem sich replizierenden klonierenden Vektor in richtiger Lesephase zueinander und unter der Kontrolle eines Promotors für die Expression angeordnet werden, wodurch ein sich replizierender klonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der Aminosäuresequenz ohne anhängendes Fremdprotein fähig ist.
    11» Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Genfragmente so gewählt werden, daß sie als wesentlichen Bestandteil DIiA oder Replikationsprodukte davon enthalten.
  6. 12. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß das Plasmid gegenüber mindestens einem Antibiotikum resistent gemacht wird.
  7. 13. Verfahren nach Punkt 12, gekennzeichnet dadurch, daß ein PiasiBid gebildet wird, dem der tet-Promotor fehlt und das trotzdem gegenüber Tetracyclin resistent ist.
  8. 14. Verfahren nach Punkt 10 oder 11,· gekennzeichnet dadurch, daß das für das Humanwachstumshormon codierende Gen unter die Kontrolle eines lac-Promotors in Tandem-Struktur gestellt wird.
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    15» Verfahren nach Punkt 14,· gekennzeichnet dadurch, daß das Plasmid Plasmid pHG-H 107 ist.
    16O Verfahren nach Punkt 14, gekennzeichnet dadurch, daß das Plasmid Plasmid ρHGH 107-1 ist.
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