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Genetische Information befindet sich auf dem Desoxyribonucleinsäure-Doppelstrang ("DNA" oder "Gene") in Form der Reihenfolge, in der der eine spezifische Information, den Code, liefernde DNA-Strang die charakteristischen Basen seiner sich wiederholenden Nucleotidbestandteile darbietet. Die "Merkmalsauslösung" oder "-ausbildung" der spezifischen oder codierten Information zur Bildung von Polypeptiden erfolgt in einem zweiteiligen Prozess. Entsprechend den Befehlen bestimmter Regulationsbereiche (Regulationsgene oder"Regulone") im Gen kann RNA-Polymerase zur Bewegung entlang dem den Code liefernden Strang veranlasst werden, wobei Matrizen-RNA (m-RNA) oder Messenger-RNA (Ribonucleinsäure) in einem als Transkription oder "Herstellung einer Arbeitskopie" bezeichnenten Prozess gebildet wird.
In einer anschliessenden Translations"-Stufe verwandeln die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit der im Cytoplasma löslichen Ribonucleinsäure, der t-RNA oder Transfer-RNA, die Botschaft oder Information der m-RNA in Polypeptide. Zu der Information, die m-RNA von DNA transkribiert, gehören auch Signale für den Beginn und die Beendigung der Ribosomenübertragung sowie für die Identität und Sequenz der Aminosäuren, aus denen das Polypeptid besteht. Der codierende DNA-Strang enthält lange Sequenzen von Nucleotid-Tripletts, die als Codierungseinheiten oder"Codone"bezeichnet werden, weil die charakteristischen Basen der Nucleotide in jedem einzelnen Triplett oder Codon spezifische Informationsbits zum Code beitragen.
Beispielsweise ergeben drei als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) bezeichnete Nucleotide ein m-RNA-SignaL, das als "beginne mit der Übertragung" verstanden wird, während Beendigungscodone TAG, TAA und TGA als "beendige die Übertragung" verstanden werden. Zwischen den Beginn- und Beendigungscodonen liegen die sogenannten Strukturgene, deren Codone die schliesslich übertragene Aminosäuresequenz bestimmen oder definieren. Diese Definition verläuft nach dem allgemein gesicherten "genetischen Code" (vgl. z. B. J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin Inc., N. Y., 3. Aufl. 1976), der die Codone für die verschiedenen Aminosäuren umschreibt.
Der genetische Code ist in dem Sinn degeneriert, dass verschiedene Condone die gleiche Aminosäure ergeben können, aber insofern genau als es für jede Aminosäure ein Codon oder mehrere Codone für diese Säure und keine andere gibt. So beinhalten beispielsweise alle der Codone TTT, TTC, TTA und TTG, wenn als solche gelesen, die Information für Serin und keine andere Aminosäure, Während der Transkription muss die richtige Reihenfolge oder der richtige Ableserahmen aufrecht erhalten werden. In diesem Zusammenhang ist z.
B. zu bedenken, was geschieht, wenn die die Arbeitskopie erzeugende RNA-Polymerase verschiedene Basen als den Anfang eines Codons (unterstrichen) in der Sequenz.... GCTGGTTGTAAG.... liest :
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Das schliesslich erzeugte Polypeptid hängt dann in ausschlaggebender Weise von der räumlichen Beziehung des Strukturgens zu dem Regulon ab.
Ein besseres Verständnis des Prozesses der genetischen Expression oder Merkmalausbildung soll durch die Definition bestimmter Genbestandteile gefördert werden :
Operon - ein Gen aus Strukturgen oder-genen für die Polypeptidsynthese und dem Regulationsbereich ("Regulon"), der diese Synthese regelt.
Promoter - ein Gen innerhalb des Regulons, womit RNA-Polymerase eine Verbindung zum Beginn der Transkription eingehen muss.
Operator-ein Gen, mit dem Repressorprotein eine Verbindung eingeht und dadurch die Bindung von RNA-Polymerase an dem benachbarten Promoter verhindert.
Induktor - eine Substanz, die Repressorprotein entaktiviert, indem sie den Operator freisetzt und eine Verbindung der RNA-Polymerase mit dem Promoter ermöglicht und damit den Beginn der Transkription einleitet.
Catabolitaktivatorprotein ("CAP")-Bindungsstelle-ein Gen, das zyklisches Adenosinmonophosphat ("c AMP")-vermitteltes CAP bindet und üblicherweise gleichfalls für die Einleitung der m-Trankription erforderlich ist. Die CAP-Bindungsstelle kann in besonderen Fällen unnötig
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sein. Beispielsweise beseitigt eine Promotermutation in dem Lactoseoperon des Phagen x plac UV5 die Notwendigkeit von cAMP und CAP für die Expresson ; J. Beckwith et al, J. Mol. Biol.
69, ISS-160 [1972].
Promoter-Operator-System-wie hier gebraucht, ein brauchbarer Regelbereich eines Operon hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens einer CAP-Bindungsstelle oder der Fähigkeit, Information für Repressorproteinexpression zu liefern.
Zur Definition und für den Gebrauch in der nachfolgenden Erörterung von Rekombinations-DNA werden noch folgende Begriffe erläutert : Clonbildungsträger - nicht aus Chromosomen stammende doppelsträngige DNA enthaltend
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mierter Organismus wird als "Transformant" bezeichnet.
Plasmid - für die vorliegenden Zwecke ein Clonbildungsträger, der aus Viren oder Bakterien stammt, wobei es sich bei den letzteren um "bakterielle Plasmide" handelt.
Komplementarität - durch die Basensequenzen von DNA-Einzelsträngen, die die Bildung von doppelsträngiger DNA durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen auf den betreffenden Strängen ermöglichen, übertragene Eigenschaft. Adenin (A) passt komplementär zu Thymin (T), während Guanin (G) komplementär zu Cytosin (C) ist.
Die Fortschritte auf dem Gebiet der Biochemie in den letzten Jahren haben zu der Konstruktion von "Rekombinations"-Clonbildungsträgern geführt, worin beispielsweise Plasmide, die exogene DNA enthalten, gebildet werden. In besonderen Fällen kann der Rekombinationspartner "heterologe" DNA enthalten, worunter DNA verstanden wird, die Informationen für Polypeptide liefert, die normalerweise von dem Organismus nicht erzeugt werden, der einer Transformation durch den Rekombinationsträger zugänglich ist. So werden Plasmide unter Bildung von linearer DNA mit verbindbaren Enden oder Termini gespalten. Diese werden mit einem exogenen Gen mit verbindbaren Termini unter Bildung einer biologisch funktionsfähigen Gruppe mit einem intakten Replicon und einer angestrebten phänotypischen Eigenschaft verbunden.
Die Rekombinationsgruppe wird durch Transformation in einen Mikroorganismus eingebracht, und Transformanten werden isoliert und mit dem Ziel zur Clonbildung gebracht, grosse Populationen zu erhalten, die zur Expression der neuen genetischen Information fähig sind.
Methoden und Mittel zur Ausbildung von Rekombinationsclonbildungsträgern und zur Transformation von Organismen mit denselben sind in der Literatur ausführlich beschrieben, vgl. z. B. H. L. Heynecker et al, Nature 263,748 bis 752 [1976] ; Cohen et al, Proc. Nat. Acad.
Sei. USA 69,2110 [1972] ; ibid., 70,1293 (1973] ; ibid., 70,3240 (1973] ; ibid., 71, 1030 [1974] ;
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in Scientific American 233,24 [1975]. Ausserdem wird auf den DTV-Atlas zur Biologie, 2. Auflage, Deutscher Taschenbuchverlag, München 1968, Nachr. Chem. Tech. Lab. 26,349 [1978] und die dort genannten Literaturstellen, Molekular-Biologie, Umschau-Verlag Frankfurt a. M., 1967, Pflanzenphysiologie von Dieter Hess, VTB, E. Ulmer GmbH Stuttgart, 1976 und Grundlagen der Biochemie, Otto Müller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1978, verwiesen. Alle diese Veröffentlichungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung.
Es gibt verschiedene bekannte Arbeitsweisen für die DNA-Rekombination, wobei aneinander angrenzende Enden einzelner DNA-Bruchstücke oder Fragmente auf die eine oder andere Weise zur Erleichterung der Bindung zugeschnitten werden. Der Ausdruck Bindung oder Verbindung bezieht sich auf die Ausbildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen angrenzenden Nucleotiden, meist mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase. So können unempfindliche Enden direkt miteinander verbunden werden. Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren angrenzenden Enden können stattdessen aber auch durch Wasserstoffbindung aktiviert werden, die die jeweiligen Enden für eine anschliessende Verbindung in eine geeignete Lage bringt.
Solche Einzelstränge, die als Bindeenden oder Cohäsivtermini bezeichnet werden, können durch das Anfügen von Nucleotiden an unempfindliche Enden unter Verwendung von terminaler Transferase und manchmal einfach
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durch Abzwicken eines Stranges eines unempfindlichen Endes mit einem Enzym, wie x-Exonuelease, ausgebildet werden. Wieder kann man sich, und dies ist das üblichste, Restriktionsendonucleasen bedienen, die Phosphodiesterbindungen in und um bestimmte Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basepaaren spalten. Viele Restriktionsendonucleasen und ihre Erkennungsstellen sind bekannt, wobei die. sogenannte EcoRI-Endonuc1ease die am häufigsten angewendete ist. Restriktionsendonucleasen, die doppelsträngigen DNA bei rotationssymmetrischen "Palindromen" spalten, lassen Cohäsivtermini zurück.
Somit kann ein Plasmid oder ein anderer Clonbildungsträger unter Bildung von Termini gespalten werden, die jeweils die Hälfte der Erkennungsstellen der Restriktionsendonuclease aufweisen. Ein mit der gleichen Restriktionsendonuclease erhaltenes Spaltprodukt von exogener DNA weist zu den Plasmidtermini komplementäre Enden auf. Wie weiter unten noch gezeigt, kann synthetische DNA mit Cohäsivtermini stattdessen auch für den Einbau in den gespaltenen Träger vorgesehen werden. Zur Unterdrückung der Wiedervereinigung der Cohäsivtermini des Trägers während der Einfügung von exogener DNA können die Termini mit alkalischer Phosphatase aufgeschlossen werden, was zu einer Molekularselektion von Enden für den Einbau des exogenen Fragments führt.
Der Einbau eines Fragments mit einer bezüglich anderer Merkmale des Trägers richtigen Orientierung kann eine Unterstützung erfahren, wenn sich das Fragment auf Träger-DNA befindet, die durch zwei verschiedene Restriktionsendonucleasen herausgeschnitten worden ist und selbst Termini aufweist, die jeweils die Hälfte der Erkennungssequenz der verschiedenen Endonucleasen darstellen.
Weitgespannte Bemühungen auf dem Gebiet der Rekombinations-DNA-Forschung in den letzten Jahren haben nur zu wenigen Ergebnissen geführt, die sich direkt praktisch verwerten lassen.
Dies hat sich besonders im Fall missglückter Versuche gezeigt, durch "synthetische DNA" codierte Polypeptide u. dgl. auszubilden, unabhängig davon, ob die synthetische DNA in üblicher Weise Nucleotid um Nucleotid aufgebaut oder durch Rücktranskription aus isolierter in RNA (komplementäre oder"cDNA") erhalten worden ist. In dieser Beschreibung wird angegeben, was allem Anschein nach die erste Expression eines funktionnellen Polypeptidproduktes aus einem synthetischen Gen darstellt, wobei auch damit zusammenhängende Entwicklungen mitgeteilt werden, die allgemeinere Anwendbarkeit verheissen.
Das Produkt, auf das Bezug genommen wird, ist Somatostatin (US-PS Nr. 3, 904, 594), ein Inhibitor der Sekretion von Wachstumshormon, Insulin und Glucagon, dessen Wirkungen seine Anwendung bei der Behandlung von Acromegalie, akuter Pankreatitis und von insulinabhängigem Diabetes begründen (vgl. R. Guillemin et al, Annual Rev. Med. 27,379, 1976). Das Somatostatinmodell lässt eindeutig die Anwendbarkeit der hier beschriebenen neuen Entwicklungen auf mehreren wichtigen Gebieten erkennen, wie dies auch aus den Zeichnungen und der weiteren Beschreibung hervorgeht.
Die Zeichnungen erläutern Zusammenhänge, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Anwendung finden, d. h. die Expression des Hormons Somatostatin durch bakterielle Transformanten mit Rekombinationsplasmiden, sowie die Erzeugung von Humaninsulin.
Fig. 1
Schematische Darstellung des Prozesses : Das durch chemische DNA-Synthese hergestellte Gen für Somatostatin wird an das ss-Galactosidase-Gen von E. coli auf dem Plasmid pBr322 angelagert. Nach Transformation in E. coli dirigiert das Rekombinationsplasmid die Synthese eines Vorläuferproteins, das in vitro durch Bromcyan spezifisch an den Methioninresten unter Bildung von aktivem Säugerpolypeptidhormon gespalten werden kann. Mit A, T, C und G werden die charakteristischen Basen (Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) der Desoxyribonucleotide in dem codierenden Strang des Somatostatingens bezeichnet.
Fig. 2
Schematische Struktur eines synthetischen Gens, dessen Codierstrang (d. h. der"obere" Strang) Codone für die Aminosäuresequenz von Somatostatin (wie angegeben) aufweist.
Fig. 3
Schematische Erläuterung der bevorzugten Methode zum Aufbau von Nucleotidtrimeren, die zum Aufbau von synthetischen Genen eingesetzt werden. Bei der angewendeten üblichen Bezeichnung für die Darstellung von Nucleotiden in Fig. 3 befindet sich das 5'-OH links und das 3'-OH rechts, z. B.
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Fig. 4 Fliessschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids (z. B. pSOMll-3), das zur Ausbil-
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Apr bzw. Tcr bezeichnen Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, und Tcs bedeutet Tetracyclinempfindlichkeit infolge der Herausnahme eines Teiles des Tc r -Gens. Die Verhältnisse der Orte der verschiedenen, für Restriktionsendonuclease spezifischen Spaltstellen auf den Plasmiden zueinander sind angegeben (z. B. EcoRI, BamI, usw. ).
Fig. 5A und 5B
Es sind die Nucleotidsequenzen der Schlüsselteile von zwei Plasmiden dargestellt sowie die Richtung der Messenger-RNA- ("mRNA")-Transkription, die stets von dem 5'-Ende des Codierstranges ausgeht. Die Restriktionsendonuclease-Substratstellen sind wie dargestellt. Jede wiedergegebene Sequenz enthält sowohl die Steuerelemente des lac- (Lactose)-Operons, als auch Codone zur Expression der Aminosäuresequenz von Somatostatin (kursiv). Die Aminosäuresequenzzahlen für ss-Galactosidase ("ss-gal") stehen in Klammern.
Fig. 6 bis 8
Wie weiter unten noch näher ausgeführt, sind in diesen Figuren die Ergebnisse vergleichender Radioimmunprüfungsversuche dargestellt, die die Somatostatinaktivität des durch die Rekombinationsplasmide ausgebildeten Produktes zeigen.
Fig. 9
Schematische Struktur von synthetischen Genen, deren codierende Stränge Codone für die Aminosäuresequenz des A- und B-Stranges von Huminaninsulin aufweisen.
Fig. 10
Fliessschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids, das zur Expression der B-Kette von Humaninsulin fähig ist.
1. Herstellung von Genen, die den Code für heterologe Polypeptide liefern
Den Code für ein beliebiges Polypeptid mit bekannter Aminosäuresequenz liefernde DNA kann durch Auswahl der Codone nach dem genetischen Code hergestellt werden. Zur Erleichterung der Reinigung u. dgl. werden Oligodesoxyribonucleotidfragmente aus beispielsweise etwa 11 bis 16 Nucleotiden gesondert zubereitet und dann in der gewünschten Reihenfolge angeordnet. Man bereitet also erste und zweite Reihen von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten von zweckmässiger Grösse. Die Verbindung der ersten Reihen in der richtigen Sequenz führt zu einem DNA-Codierstrang zur Polypeptidexpression (vgl. z. B. Fig. 2, Fragmente A, B, C und D). Die zweiten Reihen führen nach entsprechender Verbindung in der richtigen Reihenfolge zu einem Strang, der zu dem Codierstrang komplementär ist (z. B.
Fig. 2, Fragmente E, F, G und H). Die Fragmente der jeweiligen Stränge überlappen vorzugsweise derart, dass die Komplementarität ihre Selbstanordnung über Wasserstoffbindung der Cohäsivtermini von Fragmentblöcken begünstigt. Nach dieser Anordnung bzw. diesem Aufbau wird das Strukturgen durch Verbinden oder Verknüpfen in der üblichen Weise fertiggestellt.
Die Degeneration oder Entartung des genetischen Codes ermöglicht beträchtliche Freiheit bei der Wahl von Codonen für eine gegebene Aminosäuresequenz. Für die erfindungsgemässen Zwecke wird jedoch die Codonwahl durch drei Überlegungen erleichtert. Erstens werden Codone und Fragmenge ausgewählt, und die Zusammenstellung der Fragmente erfolgt stufenweise, um eine unzulässige Komplementarität der Fragmente untereinander zu vermeiden, abgesehen von den Fragmenten, die in dem angetrebten Gen nebeneinander liegen. Zweitens werden an AT-Basenpaaren (z. B. etwa fünf oder mehr) reiche Sequenzen vermieden, insbesondere, wenn ihnen eine
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an GC-Basenpaaren reiche Sequenz vorangeht, wodurch eine vorzeitige Beendigung der Transkrition vermieden wird.
Drittens besteht wenigstens ein grösserer Teil der gewählten Codone aus solchen, die für die Expression von mikrobiellen Genomen (vgl. z. B. W. Fiers, et al, Nature 260,500, 1976) bevorzugt sind. Als für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone werden die folgenden bezeichnet :
Tabelle I
Bevorzugte Bedeutung von Codonen
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<tb>
<tb> erste <SEP> dritte
<tb> Stellung <SEP> Stellung
<tb> (51-Ende) <SEP> (3'-Ende) <SEP>
<tb> (von <SEP> oben <SEP> zweite <SEP> Stellung <SEP> (von <SEP> links <SEP> nach <SEP> rechts) <SEP> (von <SEP> oben
<tb> nach <SEP> unten <SEP> T <SEP> C <SEP> A <SEP> G <SEP> nach <SEP> unten)
<tb> phe----cys <SEP> T
<tb> T <SEP> phe <SEP> ser <SEP> tyr--C
<tb> leu---Stop <SEP> Stop <SEP> A
<tb> -- <SEP> ser <SEP> Stop <SEP> trp <SEP> G
<tb> leu <SEP> pro <SEP> his <SEP> arg <SEP> T
<tb> leu <SEP> pro <SEP> his <SEP> arg <SEP> C
<tb> leu <SEP> pro <SEP> gln---A
<tb> C--pro <SEP> gln--G <SEP>
<tb> ile <SEP> thr <SEP> asn--T
<tb> ile <SEP> thr <SEP> asn <SEP> ser <SEP> C
<tb> --- <SEP> --- <SEP> --- <SEP> --- <SEP> A
<tb> A <SEP> met <SEP> thr <SEP> lys <SEP> --- <SEP> G
<tb> (Start)
<tb> val <SEP> ala <SEP> asp <SEP> gly <SEP> T
<tb> val---asp--C
<tb> val---glu--A
<tb> G <SEP> val <SEP> ala <SEP> glu--G
<tb>
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Wenn das Strukturgen eines angestrebten Polypeptids in einen Clonbildungsträger zur Expression als solches eingeführt werden soll, wird dem Gen ein"Start"-Codon (z. B. ATG) vorangestellt, und ihm folgen unmittelbar ein oder mehrere Beendigungs- oder Stop-Codone (vgl. Fig. 2).
Die Aminosäuresequenz eines bestimmten Polypeptids kann jedoch, wie unten beschrieben, mit weiterem Protein ausgebildet werden, das ihr vorangeht und/oder folgt. Wenn der Verwendungszweck des Polypeptids Spaltung des weiteren Proteins erfordert, werden entsprechende Spaltstellen neben der Polypeptid-weiteres Protein-Codon-Bindung eincodiert. So ist beispielsweise in Fig. 1 das Produkt der Expression ein Vorläufer-Protein aus Somatostatin und dem grössten Teil des ss-Galactosidase-Polypeptids. In diesem Fall ist ATG zum Codieren für den Start der Translation
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nicht erforderlich, weil die Ribosomenkonstruktion des zusätzlichen ss-gal-Proteins das Somatostatin- strukturgen durchliest.
Der Einbau des ATG-Signals ergibt jedoch den Code für die Erzeugung von Methionin, eine Aminosäure, die durch Bromcyan spezifisch gespalten wird, woraus sich eine einfache Methode zur Umwandlung von Vorläuferprotein in das erstrebte Polypeptid ergibt.
Fig. 2 erläutert ein weiteres bevorzugtes Merkmal für heterologe DNA, die zur Rekombination verwendet werden soll, d. h., dass Cohäsivtermini vorgesehen sind, die vorzugsweise einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle umfassen. Aus den oben erörterten Gründen werden die Termini vorzugsweise dazu bestimmt, nach Rekombination einzelne verschiedene Erkennungsstellen hervorzurufen.
Nachdem die beschriebenen Entwicklungen als in Verbindung mit dem Somatostatinmodell erfolgreich verlaufend nachgewiesen wurden, wird anerkannt werden, dass eine heterologe DNA- - Codierung für praktisch jede bekannte Aminosäuresequenz mutatis mutandis angewendet werden kann. So sind die beschriebenen und noch zu beschreibenden Arbeitsweisen mutatis mutandis auf die Erzeugung von Polyaminosäuren, wie Polyleucin und Polyalanin, Enzymen, Serumproteinen und analgetischen Polypeptiden, wie ss-Endorphinen anwendbar, die Schmerzschwellen usw. beeinflussen können. Die erzeugten Polypeptide sind vorzugsweise als solche Säugerhormone oder Zwischenprodukte dafür. Zu solchen Hormonen gehören unter anderem Somatostatin, Humaninsulin, Human- und Rinderwachstumshormon, luteinisierendes Hormon, ACTH und Pankreaspolypeptid.
Zu den Zwischenprodukten gehören unter anderem Humanvorproinsulin, Humanproinsulin und die A- und B-Ketten von Humaninsulin. Ausser in vitro hergestellter DNA kann die heterologe DNA cDNA enthalten, die bei der Rücktranskription von mRNA gebildet wird, vgl. z. B. Ullrich et al, Science 196,1313, 1977.
2. Rekombinationsstoffe mit einem Code für die Expression von Vorläuferprotein
Bei dem in Fig. 1 schematisch dargestellten Prozess liefert die Expression ein Vorläuferprotein, das durch ein spezifischen heterologes Strukturgen (Somatostatin) codiertes Polypeptid und ausserdem Protein (das einen Teil des ss-Galactosidaseenzyms enthält) umfasst. Eine selektive Spaltstelle neben der Somatostatin-Aminosäuresequenz ermöglicht eine nachfolgende Abtrennung des angestrebten Polypeptids von überflüssigem Protein. Der erläuterte Fall ist für eine grosse Gruppe von Arbeisweise repräsentativ, die durch die Erfindung erschlossen worden sind.
In den meisten Fällen wird die Spaltung ausserhalb der replikativen Umgebung des Plasmids oder andern Trägern, beispielsweise nach Gewinnung der mikrobiellen Kultur bewirkt. Auf diese Weise kann eine temporäre Konjugation von kleinen Polypeptiden mit überflüssigem Protein erstere, z. B. gegen einen in vivo erfolgenden Abbau durch endogene Enzyme, schützen. Gleichzeitig bringt das zusätzliche Protein gewöhnlich das angestrebte Polypeptid um seine Bioaktivität während der extracellulären Spaltung, wodurch die biologische Gefahrlosigkeit des Vorganges erhöht wird. In besonderen Fällen ist es natürlich zweckmässig, die Spaltung innerhalb der Zelle zu bewirken.
Beispielsweise können mit DNA mit einem Code für Enzyme, die Insulinvorläufer in die aktive Form überführen, Clonbildungsträger ausgebildet werden, die mit einer andern DNA mit einem Code für die Expression der Vorläuferform zusammenarbeiten.
In einem bevorzugten Fall fehlen dem bestimmten angestrebten Polypeptid innere Spaltstellen entsprechend demjenigen, das zum Abwerfen von überflüssigem Protein verwendet wird, doch können, wie ohne weiteres ersichtlich, auch dann, wenn diese Bedingung nicht erfüllt ist konkurrierende Reaktionen das angestrebte Produkt liefern, wenn auch in geringerer Ausbeute.
Wenn das angestrebte Protuk methioninfrei sein soll, dann erweist sich eine Bromcyanspaltung beim Methionin neben der angestrebten Sequenz als hoch wirksam. In entsprechender Weise können arginin-und lysinfreie Produkte, z. B. mit Trypsin oder Chymotrypsin bei arg-arg, lys-lys oder ähnlichen Spaltstellen neben der angestrebten Sequenz enzymatisch gespalten werden. Falls bei der Spaltung beispielsweise unerwünschtes Arginin an das angestrebte Produkt gebunden bleibt, kann es durch Carboxypeptidaseaufschluss entfernt werden. Bei Verwendung von Trypsin zur Spaltung bei arg-arg können Lysinstellen innerhalb des angestrebten Polypeptids vorher geschützt werden, beispielsweise mit Maleinsäure- oder Citraconsäureanhydrid.
Die beispielsweise erörterten Spaltarbeitsweisen sind lediglich repräsentative Varianten der vielen verschiedenen Möglichkeiten, die für den Fachmann auf Grund der hier angegebenen Lehre offensichtlich sind.
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Abspaltbares Protein kann am C- oder N-Ende eines bestimmten Polypeptids oder sogar innerhalb des Polypeptids selbst ausgebildet werden, wie dies bei der Einschlusssequenz, durch die sich Proinsulin und Insulin voneinander unterscheiden, der Fall ist. Wieder kann der verwendete Träger den Code für die Expression von Protein mit sich wiederholenden Sequenzen des angestrebten Polypeptids liefern, die jeweils durch selektive Spaltstellen voneinander getrennt sind. Es ist jedoch besonders bevorzugt, wenn Codone für überschüssiges Protein vor dem Strukturgen des angestrebten Produktes übertragen werden, wie bei dem in den Zeichnungen erläuterten Fall. In allen Fällen soll für die Aufrechterhaltung des passenden Ableserahmens in bezug auf das Regulon gesorgt werden.
3. Expression von Immunogenen
Die Fähigkeit, sowohl ein spezifisches Polypeptid als auch überflüssiges Protein auszubilden, ergibt ein brauchbares Mittel für die Erzeugung von immunogenen Substanzen. Polypeptid-"Haptene" (d. h. Substanzen, die spezifisch durch Antikörper und ähnliche Stoffe gebundene Determinanten enthalten, aber gewöhnlich zu klein sind, um eine Immunwirkung hervorzurufen) können als Konjugate mit zusätzlichem Protein ausreichender Grösse für eine Immunogenität ausgebildet werden. Das ss-gal-Somatostatin-Konjugat, dessen Herstellung hierin beschrieben ist, ist tatsächlich von immunogener Grösse und kann deshalb Antikörper erzeugen, die das Somatostatinhapten binden. Proteine mit mehr als 100 Aminosäuren, meist mit mehr als 200 Aminosäuren, zeigen immunogenen Charakter.
Wie vorstehend beschrieben hergestellte Konjugate können zur Bildung von Antikörpern verwendet werden, die sich in Radioimmun- oder andern Prüfungen auf das Hapten und auch für die Erzeugung von Vaccinen eignen.. Im folgenden wird ein Beispiel für die letztgenannte Anwendung gegeben. Bromcyan-oder andere Spaltprodukte von viralem Mantelprotein ergeben Oligopeptide, die sich an Antikörper binden, der selbst zu dem Protein wird. Erhält sie die Aminosäuresequenz eines solchen Oligopeptidhaptens, kann daher heterologe DNA als Konjugat mit weiterem Protein ausgebildet werden, das Immunogenität beisteuert. Solche Konjugate können als Vaccinen verwendet werden, die geringere Nebenwirkungen zeigen, als sie mit der Verwendung von Mantelprotein selbst zur Erzielung von Immunität verbunden sind.
4. Die Kontrollelemente
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zu dem Organismus in seinem nicht umgewandelten oder untransformierten Zustand gebracht worden ist. Chromosomen-DNA von lactoseabhängigem E. coli enthält als ein Lactose- oder "lac"- - Operon, das den Lactoseaufschluss unter anderem durch Bildung des Enzyms ss-Galactosidase vermittelt. In dem erläuterten Fall werden die lac-Kontrollelemente aus einem Bakteriophagen, x plac 5, erhalten, der für E. coli infektiös ist. Das lac-Operon des Phagen war seinerseits durch Überführung aus der gleichen bakteriellen Species erhalten worden, daher die "Homologie".
Homologe Regulone, die sich zur Verwendung in dem beschriebenen Verfahren eignen, können stattdessen auch aus für den Organismus nativer Plasmid-DNA stammen.
Die Einfachheit und Wirksamkeit des lac-Promoter-Operator-Systems begründen seine Verwendung in dem beschriebenen System genauso wie seine Fähigkeit, von IPTG (Isopropylthio-
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die Colicin El-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Operone. Aus dem letzteren, (. h."Tryp-Operon") stammende Promoter-Operatoren können 100% igue Repression während der Induktion (mit Indolacrylsäure) und Gewinnung vermitteln.
5. Plasmidaufbau, allgemein
Die Einzelheiten des in Fig. 4 schematisch erläuterten Prozesses ergeben sich aus dem weiter unten folgenden experimentellen Teil. Bei diesem Punkt ist es jedoch von Nutzen, einige der zum Aufbau des Rekombinationsplasmids der bevorzugten Ausführungsform angewendeten Arbeitsweisen kurz zu erörtern.
Bei der Clonbildung und Expression des synthetischen Somatostatingens werden zwei Plasmide verwendet. Jedes Plasmid hat eine EcoRI-Substrat-Stelle bei einem andern Bereich des ss-Galac-
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tosidase-Strukturgens (vgl. Fig. 4 und 5). Die Einfügung des synthetischen Somatostation-DNA- - Fragments in die EcoRI-Stellen dieser Plasmide bringt die Expression der genetischen Information in das Fragment ein, das sich unter der Kontrolle der lac-Operon-Kontrollelemente befindet.
Nach der Einfügung des Somatostatinfragments in diese Plasmide sollte die Translation zu einem
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Das Schema des Plasmidaufbaus beginnt mit dem Plasmid pBR322, einem wohldefinierten Clonbildungsträger. Die Einführung der lac-Elemente in dieses Plasmid erfolgt durch Einfügung eines HaeIII-Restriktions-Endonucleasefragments (203 Nucleotide), das den lac-Promoter, die CAP-Bindungsstelle, den Operator, die Ribosomenbindungsstelle und die ersten 7 Aminosäurecondone des ss-Galactosidase-Strukturgens aufweist. Das HaeIII-Fragment stammt aus X plac5 DNA. Das
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bunden, wodurch EcoRI-Termini an den Einfügungspunkten erzeugt werden. Durch Verbinden dieser HaeIII-und wiederhergestellten EcoRI-Termini werden die EcoRI-Restriktionsstellen (vgl.
Fig. 4 und 5) an jedem Terminus erzeugt. Transformanten von E. coli RR1 mit dieser DNA werden auf einem 5-Brom-4-chlor-incolylgalactosid- (X-gal)-Madium auf Resistenz gegen Tetracyclin (Tc) und Ampicillin (Ap) selektioniert. Auf diesem Indikatormedium können Kolonien, die für die Synthese von ss-Galactosidase auf Grund der erhöhten Anzahl von lac-Operatoren, die Repressor titrieren, verantwotlich sind, durch ihre blaue Farbe identifiziert werden. Zwei Orientierungen des HaeIII-Fragments sind möglich, aber sie werden auf Grund der asymmetrischen Lage einer Hha-Restriktionsstelle in dem Fragment unterschieden. Das Plasmid pBH10 wird weiter modifiziert, wodurch die zu dem lac-Operator (pB20) distale EcoRI-Endonuclease-Stelle eliminiert wird.
Die acht chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotide (Fig. 2) werden an den 5'-Termini mit [P]-X-ATP durch Polynucleotidkinase markiert und mit T4 DNA-Lignase verbunden. Durch Wasserstoffbindung zwischen den überlappenden Fragmenten erfolgt eine Selbstanordnung des Somatostatingens und schliesslich eine Polymerisation zu grossen Molekülen infolge der cohäsiven Restriktionsstellentermini. Die Ligaturprodukte werden mit EcoRI-BamHI-Restriktionsendonucleasen behandelt, wodurch das Somatostatingen, wie in Fig. 2 dargestellt, erzeugt wird.
Das synthetische Somatostatingenfragment mit EcoRI-und BamI-Termini wird an das pBH20- - Plasmid gebunden, das mit den EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen und alkalischer Phosphatase vorbehandelt worden war. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase führt zu einer Molekularselektion von Plasmiden mit dem eingefügten Fragment. Mit dieser gebundenen DNA erhaltene ampicillinresistente Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclinempfindlichkeit aussortiert, und mehrere werden bezüglich der Einfügung eines EcoRI-BamHI-Fragments passender Grösse untersucht.
Beide Stränge der EcoRI-BamHI-Fragmente von Plasmiden aus zwei Clonen werden einer Nucleotidsequenzanalyse, beginnend mit den BamHI-und EcoRI-Stellen, unterworfen. Die Sequenzanalyse wird bis in die lac-Regelelemente ausgedehnt. Die lac-Fragmentsequenz erweist sich als intakt, und in einem Fall werden die Nucleotidsequenzen pSOM1 beider Stränge unabhängig voneinander bestimmt, wobei jede die in Fig. 5A angegebene Sequenz ergibt.
Das EcoRI-Pst-Fragment des pSOM1-Plasmids mit dem lac-regelnden Element wird entfernt und durch das EcoRi-Pst-Fragment von pBr322 ersetzt, wodurch das Plasmid pSOMll erzeugt wird. Das EcoRI-Fragment von X plac5, das den lac-Operonkontrollbereich und den grössten Teil des ss -Galactosidase-Strukturgens aufweist, wird in die EcoRI-SteIIe von pSOMll eingefügt.
Zwei Orientierungen des EcoRI-lac-Fragments von x plac sind zu erwarten. Eine davon würde den richtigen Ableserahmen bis in das Somatostatingen hinein behalten und die andere nicht.
Die Analyse von für sich allein isolierten Clonen auf Somatostatinaktivität ergibt dann Clone, die das richtig orientierte Gen enthalten, und einer dieser Clone wird als pSOMll-3 bezeichnet.
6. Der Mikroorganismus
Als mögliche Organismen für die Transformation sind verschiedene einzellige Mikroorganis- men vorgeschlagen worden, beispielsweise Bakterien, Fungi und Algen. Dabei handelt es sich um solche einzelligen Organismen, die in Kulturen oder durch Fermentation gezüchtet werden
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können. Bakterien sind grösstenteils die für das Arbeiten damit am besten geeigneten Organismen.
Zu einer Transformation zugänglichen Bakterien gehören Enterobacteriaceae, z. B. Stämme von Escherichia coli und Salmonella ; Bacillaceae, wie Bacillus subtitis ; Pneumococcus ; Streptococcus und Haemophilus influenzae.
Der für die im folgenden beschriebenen experimentellen Arbeiten gewählte Organismus ist E. coli, Stamm RR1, Genotyp : Pro Leu Thi RB MB rec A Str Lac y. E. coli RR1 wird aus E. coli HB101 (H. W. Boyer et al, J. Mol. Biol. 1969 41,459 bis 472) durch Paarung mit E. coli K-12 Stamm KL16 als Hfr-Donor, vgl. J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972) [Kulturen von Coli RR1 und E. Coli RR1 (pBR322) sind bei der American Type Culturs Collection ohne irgendwelche Beschränkung hinsichtlich der Zugänglichkeit hinterlegt worden und haben die ATCC-Nummern 3/343 und 3/344 erhalten].
Der Somatostatin erzeugende Organismus ist gleichfalls hinterlegt worden (ATCC Nr. 31447).
Im Fall von Humaninsulin werden A- und B-Ketten-Gene in E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi -, hsr -, hsmk +), A TCC Nr. 31446 geclont, und dieser Organismus wird zur Expression der A-Kette E. coli K-12 Stamm 294 [pIAl], ATCC Nr. 31448 verwendet. Die B-Kette von Humaninsulin wird zuerst in einem Derivat von HB101, d. h. E. coli K-12 Stamm D1210, ein lac (iQo+zty+), ausgebildet, und dieser B-Gen enthaltender Organismus ist gleichfalls hinterlegt worden (ATCC Nr. 31449). Das B-Gen kann aber auch in den zuerst genannten Organismus, d. h. Stamm 294, eingeführt und davon ausgebildet werden.
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
Beispiel 1
I. Somatostatin
1. Aufbau von Somatostatingenfragmenten
Zuerst werden acht Oligodesoxyribinucleotide, die in Fig. 2 mit A bis H bezeichnet sind, nach der modifizierten Triestermethode von K. Itakura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 [1975] aufgebaut. Im Fall der Fragmente C, E und H wird jedoch eine verbesserte Arbeitsweise angewendet, wobei zunächst vollständig geschützte Trimere als Grundeinheiten für den Aufbau längerer Oligodesoxyribonucleotide hergestellt werden. Die verbesserte Arbeitsweise ist schematisch in Fig. 3 dargestellt, worin B Thymin, N-benzoyliertes Adenin, N-benzoyliertes Cytosin oder N-isobutyraliertes Guanin bedeutet.
Unter Bezugnahme auf Fig. 3 verläuft mit einem Überschuss von I (2 mmolar) die Kupplungsreaktion II (1 mmolar) mit Hilfe eines starken Kupplungsreagens 2, 4, 6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mmolar ; 2) in 60 min nahezu vollständig. Nach Entfernung der 5'-Schutzgruppen mit einer 2%igen Benzolsulfonsäurelösung kann das 5'-Hydroxydimere V durch einfache Lösungsmittelextraktion mit wässerige NaHCO-,-Lösung in CHCl3 von einem Überschuss des 3'-Phosphodiestermonomeren IV abgetrennt werden. Der vollständig geschützte Trimerblock wird danach aus dem 5'-Hydroxydimeren V, I (2 mmolar) und TPSTe (4 mmolar) hergestellt und durch Chromatographie an Kieselgel nach B. T. Hunt et al, Chem. and Ind. 1868 [1967] isoliert.
Die Ausbeuten der nach der verbesserten Arbeitsweise hergestellten Trimeren sind in Tabelle II angegeben.
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Tabelle II Ausbeute an vollständig geschützten Trimeren
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<tb>
<tb> Sequenz <SEP> Ausbeute <SEP> Sequenz <SEP> Ausbeute <SEP>
<tb> TTT <SEP> 81% <SEP> ATG <SEP> 69%
<tb> TTT <SEP> 75% <SEP> GCC <SEP> 61%
<tb> GGA <SEP> 41% <SEP> CCA <SEP> 72%
<tb> AGA <SEP> 49% <SEP> CAA <SEP> 72%
<tb> ATC <SEP> 71% <SEP> TTA <SEP> 71%
<tb> CCT <SEP> 61% <SEP> CAT <SEP> 52%
<tb> ACA <SEP> 63% <SEP> CCC <SEP> 73%
<tb> ACC <SEP> 65% <SEP> AAC <SEP> 59%
<tb> CGT <SEP> 51% <SEP> GAT <SEP> 60%
<tb>
Die acht Oligodesoxyribonucleotide werden nach der Entfernung aller Schutzgruppen durch Hochdruckflüssigchromatographie an Permaphase AAX (R. A. Henry et al J. Chrom. Sei. II, 358 [1973]) gereinigt.
Die Reinheit jedes Oligomeren wird durch Homochromatographie an Dünnschicht- - DEAE-Cellulose und auch durch Gelelektrophorese in 20%iger Acrylamidplatte nach Markieren
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DNA-Fragment wird ein markiertes Hauptprodukt erhalten.
2. Verknüpfung und Acrylamidgelanalyse von Somatostatin-DNA
Die 5'-OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente A bis H werden getrennt mit T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert. Zur Phosphorylierung wird (32 p] - À -ATP verwendet, wodurch die Reaktionsprodukte autoradiographisch verfolgt werden können, obwohl, wie ersichtlich, auch unmarkiertes ATP verwendet werden kann, wenn eine Autoradiographie weggelassen wird.
Unmittelbar vor der Kinasereaktion werden 25 uCi [À - 32 P ] -ATP (etwa 1500 Ci/mmolar) Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74,1507 [1977]) in 0, 5 ml Eppendorf-Rohren zur Trockne
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fraktion, 400 Einheiten/ml ; 27) während 16 h bei 4 C verknüpft. Die Fragmente C, D, G und H werden unter vergleichbaren Bedingungen verknüpft. Proben von jeweils 2 ml werden zur Analyse durch Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamidgel und anschliessend durch Autoradiographie (H. L. Heyneker et al, Nature 263,748 [1976] entnommen, wobei nicht umgesetzte DNA- - Fragmente durch rasch wanderndes Material dargestellt werden und die monomere Form der verknüpften Fragmente mit Bromphenolblau (BPB) wandert.
Auf Grund der kohäsiven Enden der verknüpften Fragmente A, B, E und F sowie der verknüpften Fragmente C, D, G und H erfolgt auch eine gewisse Dimerisierung. Diese Dimeren stellen das am langsamsten wandernde Material dar und können durch Restriktionsendonuclease EcoRI bzw. BamHI gespalten werden. Die zwei Halbmoleküle (verknüpftes A + B + E + F und verknüpftes C + D + G + H) werden in einer weiteren Verknüpfungsstufe verbunden, die 16 h bei 4 C in einem Endvolumen von 150 111 durchgeführt wird. Zur Analyse wird 1 111 entnommen. Das Reaktionsgemisch wird 15 min auf 650C erwärmt,
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wodurch die T4-DNA-Ligase entaktiviert wird. Die Wärmebehandlung hat auf das Wanderungsbild der DNA-Mischung keinen Einfluss.
Dem Reaktionsgemisch wird für die Spaltung der multimeren Formen der Somatostatin-DNA in 30 min bei 37 C ausreichende Restriktionsendonuclease BamHI zugesetzt. Nach Zugabe von NaCl auf 100 mMol wird die DNA mit EcoRI-Endonuclease aufgeschlossen. Der Restriktionsendonucleaseaufschluss wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet. Das Somatostatin-DNA-Fragment wird durch präparative Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamidgel von nichtumgesetzten und teilweise verknüpften DNA-Fragmenten befreit. Die das Somatostatin-DNA-Fragment enthaltende Band wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Zerschneiden des Gels in kleine Stücke und Extraktion mit Elutionspuffer (0, 5 m Ammoniumacetat, 10 mm MgCl2, 0,1 mm EDTA, 0, 1% SDS) über Nacht bei 260C eluiert.
Die DNA wird
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und gegen den gleichen Puffer dialysiert, wodurch eine Somatostatin-DNA-Konzentration von 4 I1g/ml erhalten wird.
3. Aufbau von Rekombinationsplasmiden
In Fig. 4 ist schematisch die Art. und Weise dargestellt, in der das Somatostatingen enthaltende Rekombinationsplasmid aufgebaut werden, weshalb in Verbindung mit der folgenden Erörterung darauf Bezug genommen wird.
A) Das Stammplasmid pBr 322
Das für die experimentelle Somatostatinclonbildung gewählte Plasmid ist pBR322, ein kleines Plasmid (Molekulargewicht etwa 2, 6 Megadalton) mit gegen die Antibiotika Ampicillin (Ap) und Tetracyclin (Tc) resistenten Genen. Wie in Fig. 4 angegeben, weist das ampicillinresistente Gen eine Spaltstelle für die Restriktionsendonuclease Pst I und das tetracyclinressistente Gen eine entsprechende Stelle für Restriktionsendonuclease BamHI auf, und eine Eco RI-Stelle befindet sich zwischen den Ap4 und TC r-Genen. Das Plasmid pBR322 stammt aus pBR313, einem 5, 8 Megadalton Apr Tcr Col ' -Plasmid (R. L. Rodriquez et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 5,471 bis 477 [1976], R. L.
Rodriques et al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, in Molecular Mechanismus in the Control of Gene Expression, S. 471 bis 477, Academic Press, Inc. [1976]. Das Plasmid pBR322 und die Art seiner Gewinnung sind ausführlich in'F. Bolivar et al, "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System", Gene [November 1977] beschrieben.
B) Aufbau des Plasmids pBH10
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6 mm ss-Mercaptoäthanol in einem Gesamtvolumen von 20 111 aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 min langes Erwärmen auf 65 C abgebrochen. Die pBR322-behandelte DNA wird mit der
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verknüpfte DNA-Mischung wird gegen 10 mm Tris-HCl PH 7, 6 dialysiert und zur Transformation von E. coli Stamm RR1 verwendet. Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclin-undAmpicillin- - Resistenz auf Minimalmediumplatten ausgewählt, die 40 I1g/ml 5-Brom-4-chlor-incolylgalactosid- - (X-gal)-Medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) enthalten.. Zur Synthese von ss-Galactosidase-fähigen Kolonien werden durch ihre blaue Farbe identifiziert.
Nach der Durchsicht von 45 unabhängig voneinander isolierten blauen Kolonien erweisen sich drei davon als zwei EcoRI - Stellen enthaltende Plasmid-ENA, die durch etwa 200 Basenpaare voneinander getrennt sind. Die Lage eines asymmetrisch angeordneten
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HhaI-Fragments in dem HaeIII-lac-Kontrollfragment, b. p. 203, (W. Gilbert et al, in Protein-Ligand Interactions, H. Sand und G. Blauer, Herausgeber (De Gruyter, Berlin [1975] S. 193 bis 210) ermöglicht die Bestimmung der Orientierung des HaeIII-Fragments, nun ein EcoRI-Fragment,
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h.C) Aufbau des Plamismids pBH20
Plasmid pBH10 wird dann modifiziert, um die zu dem lac-Operator distale EcoRI- - Stelle zu eliminieren.
Dies wird durch die bevorzugt verlaufende EcoRI-Endonucleasespaltung an der distalen Seite unter teilweisem Schutz durch RNA-Polymerase der andern EcoRI-Stelle
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50 mm) abgebrochen. Die DNA wird mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Äthanol gefällt und in 100 111 T4-DNA-Verknüpfungspuffer wieder suspendiert. Nach Zugabe von 1 ul T4 DNA-Ligase wird die Mischung 12 h bei 12 C inkubiert. Die verknüpfte DNA wird in E. coli Stamm RRI transformiert und Ap r Tc r - Transformanten werden auf X-gal-Antibiotikummedium selektioniert.
Durch Restriktionsenzymanalyse von DNA aus 10 isolierten blauen Kolonien ergibt sich, dass diese Clone Plasmid-DNA mit einer EcoRI-Stelle enthalten. Sieben dieser Kolonien haben die
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sequenz von der EcoRI-Stelle bis in den lac-Regelbereich eines dieser Plasmide, pBH20, wird bestätigt gefunden. Dieses Plasmid wird dann zur Clonbildung des Somatostatingens verwendet.
D) Aufbau von Plasmid pSOM 1
20 Mg Plasmid pBH20 werden mit Restriktionsendonuclease EcoRI und BamHI in einem Gesamtvolumen von 50 il vollständig aufgeschlossen. Nach Zugabe von bakterieller alkalischer Phosphatase (0, 1 Einheit von Worthington BAPF) wird die Inkubation 10 min bei 65 C fortgesetzt. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet, und die DNA wird mit 2 Volumen Äthanol gefällt, zentrifugiert und in 50 111 10 mm Tris-HCl PH 7, 6, 1 mm EDTA gelöst. Die alkalische Phosphatasebehandlung verhindert mit guter Wirkung eine Selbstverknüpfung der EcoRI-BamHI-behandelten pBH20-DNA, aber kreisförmige Rekombinationsplasmide, die Somatostatin-DNA enthalten, können auch nach Verknüpfung noch ausgebildet werden.
Da E. coli RR1 durch lineares Plasmid-DNA nur mit sehr geringer Wirksamkeit transformiert wird, enthält der
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verwendet. Die Transformationsversuche werden in einem P3-physikalischen Behältergerät National Institutes of Health, USA, Recombinat DNA Research Guidelines, 1976) durchgeführt. Transformanten werden auf Platten aus Minimalmedium, das 20 gg/ml Ap und 40 fig/ml X-gal enthält, selektioniert. Es werden 10 Transformanten, von denen alle Tc-empfindlich sind, isoliert. Zur Bezugnahme werden sie als pSOM1, pSOM2, usw..... pSOM10 bezeichnet. Bei dem Vergleichsversuch werden keine Transformanten erhalten. Vier der zehn Transformanten enthalten Plasmide mit sowohl einer EcoRI-als auch einer BamHI-Stelle.
Die Grösse des kleinen EcoRI, BamHI-Fragments dieser Rekombinationsplasmide ist in allen 4 Fällen der Grösse der in vitro hergestellten Somatostatin-DNA vergleichbar. Basensequenzanalyse nach Maxam und Gilbert Proc. Nat. Acad. Sei.
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USA 74,560 [1977] ergibt, dass das Plasmid OPSOM1 das gewünschte Somatostatin-DNA-Fragment als Einfügung enthält.
Die DNA-Sequenzanalyse des Clons mit Plasmid OPSOM1 lässt erwarten, dass damit ein Somatostatin enthaltendes Peptid erzeugt wird. Somatostatinradioimmunaktivität lässt sich jedoch in Extrakten von Zellkörnern oder überstehenden Kulturflüssigkeiten nicht nachweisen. Die Gegenwart von Somatostatin lässt sich auch nicht nachweisen, wenn die wachsende Kultur direkt zu 70%iger Ameisensäure und Bromcyan gegeben wird. Es ist beobachtet worden, dass E. coli RRI-Extrakte exogenes Somatostatin sehr rasch abbauen. Das Fehlen von Somatostatinaktivität in Clonen, die Plasmid OPSOM1 enthalten, kann sehr wohl eine Folge eines intracellulären Abbaus durch endogene proteolytische Enzyme sein.
Plasmid OPSOM1 wird daher zum Aufbau eines Plasmids verwendet, das den Code für ein Vorläuferprotein liefert, das Somatostatin enthält und gross genug ist, um einem proteolytischen Abbau zu wiederstehen.
E) Der Aufbau der Plasmide pSOM11 und pSOMll-3
Es wird ein Plasmid aufgebaut, worin das Somatostatingen am C-Terminus des ss-Galactosidasegens angeordnet werden kann, das die Translation in Phase hält. Das Vorhandensein einer EcoRI-Stelle nahe dem C-Terminus dieses Gens und die verfügbare Aminosäuresequenz dieses Proteins (B. Polisky et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 73,3900 [1976], A. V. Fowler et al, ibid 74,1507 [1976], A. I. Bukhari et al, Nature New Biology 243,238 [1973] und K. E. Langley, J. Biol. Chem. 250,2587 [1975]) ermöglichen die Einführung des EcoRI, BamHI-So- matostatingens in die EcoRI-Stelle unter Aufrechterhaltung des richtigen Leserahmens.
Zum Aufbau eines solchen Plasmids werden 50 ug pSOMl-DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI in einem Gesamtvolumen von 100 gl aufgeschlossen. Ein präparatives 5%iges Polyacrylamidgel wird zur Abtrennung des grossen Pst-EcoRI-Fragments verwendet, das das Somatostatingen des kleinen Fragments mit den lac-Regelelementen aufweist. Die grosse Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Aufteilen des Gels in kleine Stücke und Extraktion bei 65 C über Nacht eluiert. In vergleichbarer Weise werden 50 ug des Plasmids pBr322 DNA mit PstI- und EcoRI-Restruktionsendonuclease aufgeschlossen, und die beiden erhaltenen DNA-Fragmente werden durch präparative Elektrophorese auf einem 5%igen Polyacrylamidgel gereinigt.
Das kleine PstI-EcoRI-Fragment von pBR322 (1 tig) wird mit dem grossen PstI-EcoRI-DNA-Fragment (5 ug) aus pSOM1 in einem Gesamtvolumen von 50 ul mit einer Einheit T4-DNA-Ligase in 12 h bei 120C verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wird zum Transformieren von E. coli RRI verwendet, und Transformanten werden auf X-gal-Medium auf Ampicillinresistenz selektioniert. Erwartungsgemäss
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X-gal-Indikatorplatten. Das erhaltene Plasmid, pSOMll, wird für den Aufbau des Plasmids pSOMll-3 verwendet. Eine Mischung aus 5 Ilg pSOM11-DNA und 5 u. g X plac -DNA wird mit 10 Einheiten EcoRI 30 min bei 37 C aufgeschlossen.
Der Restriktionsendonucleaseaufschluss wird durch Phenol- - Chloroform-Extraktion beendet. Die DNA wird dann mit Äthanol gefällt und in 50 111 T4-DNA-Ligase- - Puffer erneut suspendiert. Eine Einheit T4-DNA-Ligase wird zu der Mischung gegeben, worauf
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dialysiert und zum Transformieren von E. coli, Stamm RR1, verwendet. Transformanten werden auf X-gal-Platten, die Ampicillin enthalten, auf Ap selektioniert und auf wesentliche ss -Galactosidaseerzeugung ausgelesen. Etwa 2% der Kolonien sind blau (pSOMll-1, 11-2 usw.). Restriktionsenzymanalyse von aus diesen Clonen erhaltener Plasmid-DNA ergibt, dass alle Plasmide ein neues EcoRI-Fragment von etwa 4, 4 Megadalton aufweisen, das die lac-Operon-Regelstellen und den grössten Teil des ss-Galactosidasegens aufweisen.
Da zwei Orientierungen des EcoRI-Fragments möglich sind, wird die asymmetrische Lage einer HindIII-Restrictionsstelle dazu benutzt festzustellen, welche dieser Kolonien dieses EcoRI-Fragments mit fortschreitender lac-Transkription bis in das Somatostatingen aufweist. HindIII-BamHI-Doppelaufschlüsse zeigen, dass nur die Clone, die die Plasmide pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 und pSOM11-7 aufweisen, das EcoRI- - Fragment in dieser Orientierung enthalten.
4. Radioimmunprüfung auf Somatostatinaktivität
Die standardisierte Radioimmunprüfung (RIA) auf Somatostatin (A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148,784 [1975] wird durch Verringerung des Prüfvolumens und
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modifiziert. Tyr 11 -Somatostatingewöhnlich in 70%iger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, in einem konischen Polypropylenrohr (0, 7 ml, Sarstedt) über feuchtem KOH im Vakuum getrocknet. Nach Zugabe von 20 il
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tor ("Trasylol", Calbiochem. ) und zirka 10000 Zählungen [J]-Tyr"-Somatostatin. Nach wenigstens 16 h bei Zimmertemperatur werden 0, 333 ml Ziegen-antikaninchen--Globulin (Antibodies, Inc., P = 0, 03) in PBSA-Puffer zu den Proberöhrchen gegeben.
Die Mischung wird 2 h bei 370C
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an Antiserum werden 20% der Zählungen ohne unmarkiertes konkurrierendes Somatostatin gefällt.
Der Hintergrund mit unendlichem Somatostatin (200 ng) macht gewöhnlich 3% aus. Die Hälfte der maximalen Konkurrenz wird mit 10 pg Somatostatin erhalten. Vorversuche mit Extrakten von E. coli Stamm RRI (Empfängerstamm) ergaben, dass weniger als 10 pg Somatostatin in Gegenwart von 16 ug oder mehr bromcyanbehandeltem bakteriellen Protein ohne weiteres erkennbar sind. Mehr als 2 flg Protein aus mit Ameisensäure behandelten bakteriellen Extrakten wirken sich durch Verstärkung des Hintergrundes etwa störend aus, aber diese Störung wird durch Bromcyanspaltung weitgehend kompensiert. Rekonstruktionsversuche zeigen, dass Somatostatin in mit Bromcyan behandelten Extrakten stabil ist.
A) Konkurrenz durch bakterielle Extrakte
Die Stämme E. coli RRI (pSOM11-5) und E. coli RR1 (pSOM11-4) werden in Luria-
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die 5 mg/ml Bromcyan enthält, suspendiert. Nach etwa 24 h bei Zimmertemperatur werden die aliquoten Anteile mit Wasser auf das 10fache verdünnt, und die in Fig. 6 angegebenen Volumina werden dreimal auf Somatostatin geprüft. In Fig. 6 bedeutet "B/B 0" das Verhältnis von in Gegenwart der Probe gebundenem [125 J] -Somatostatin zu dem in Abwesenheit von konkurrierendem Somatostatin gebundenem. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt von drei Rohren. Der Proteingehalt der unverdünnten Proben wird mit 2, 2 mg/ml für E. coli RRI (pSOM11-5) und mit 1, 5 mg/ml für E. coli RRI (pSOM-4) bestimmt.
B) Das Auslesen von pSOM11-Clonen auf Somatostatin
Wie oben in Verbindung mit Fig. 6 beschrieben werden mit Bromeyan behandelte
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werden zur Radioimmunprüfung entnommen, deren Ergebnisse in Fig. 7 erscheinen. Der Bereich der Prüfpunkte ist angegeben. Die Werte für Picogramm Somatostatin sind von einer Standardkurve abgelesen, die als Teil des gleichen Versuches erhalten wurde.
Die oben angegebenen Ergebnisse der Radioimmunprüfung können folgendermassen zusammengefasst werden : Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Versuche mit OPSOM1 zeigen vier Clone (pSOMl1-3, -11-5, -11-6 und -11-7) ohne weiteres nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität (Fig. 6 und 7). Restriktionsfragmentanalyse ergibt, dass pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 und pSOM11-7 die gewünschte Orientierung des lac-Operon aufweisen, wohingegen pSOM11-2 und 11-4 die entgegengesetzte Orientierung zeigen. Es besteht somit eine einwandfreie Beziehung zwischen der richtigen Orientierung des lac-Operon und der Erzeugung von Somatostatin-Radioimmunaktivi- tät.
C) Wirkungen von IPTG-Induktion und CNBr-Spaltung auf positive und negative Clone
Die Ausgestaltung des Somatostatinplasmids lässt darauf schliessen, dass die Synthese von Somatostatin unter der Kontrolle des lac-Operon steht. Das lac-Repressorgen ist nicht in dem Plasmid enthalten, und der Empfänger- oder Rezipientenstamm (E. coli RRl) enthält das Wildtyp-Chromosomen-lac-Repressorgen, das nur 10 bis 20 Repressormoleküle je Zelle (15)
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erzeugt. Die Anzahl der Plasmidkopien (und damit die Anzahl an lac-Operatoren) beläuft sich auf etwa 20 bis 30 pro Zelle, so dass eine volständige Repression unmöglich ist.
Wie aus der folgenden Tabelle III hervorgeht, wird die Aktivität von Somatostatin in E. coli RRI (pSOMll-3) durch IPTG, einem Induktor des lac-Operons, erhöht. Wie erwartet ist der Grad der Induktion gering und liegt zwischen dem 2, 4- bis 7fachen. Im Versuch 7 (Tabelle III) wird a-Aktivität, ein Mass der ersten 92 Aminosäuren von ss -Galactosidase gleichfalls um einen Faktor von 2 induziert. In mehreren Versuchen kann eine nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität vor der Bromeyanspaltung des gesamten cellularen Proteins nicht festgestellt werden. Da das bei der Radioimmunprüfung verwendete Antiserum S 39 ein freies N-terminales Alanin erfordert, ist vor der Bromcyanspaltung eine Aktivität nicht zu erwarten.
Tabelle III
Somatostatinradioimmunaktivit ät
Abkürzungen :
LB = Luriabrühe
IPTG = Isopropylthiogalactosid
CNBr = Bromcyan
SS = Somatostatin
Protein wird nach der Methode von Bradford, Anal. Biochem. 72,248 [1976] bestimmt.
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<tb>
<tb>
IPTG <SEP> CNBr <SEP>
<tb> Versuch <SEP> Stamm <SEP> Medium <SEP> 1 <SEP> mmolar <SEP> 5 <SEP> mg/ml <SEP> pg <SEP> SS/ <SEP> g <SEP> Protein
<tb> 1 <SEP> 11-2 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> < 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 12
<tb> 11-4 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> < 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 11-5 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 15
<tb> 2 <SEP> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 12
<tb> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> - <SEP> < 0, <SEP> 1
<tb> 3 <SEP> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 61
<tb> 11-3 <SEP> LB-+ <SEP> 8
<tb> 11-3 <SEP> LB <SEP> +- < 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 71
<tb> 11-3 <SEP> VB+Glycerin* <SEP> + <SEP> + <SEP> 62
<tb> 5 <SEP> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> Glycerin <SEP> + <SEP> + <SEP> 250
<tb> 6 <SEP> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 320
<tb> 11-2 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> < 0,
<SEP> 1
<tb> 7 <SEP> 11-3 <SEP> LB <SEP> + <SEP> + <SEP> 24
<tb> 11-3 <SEP> LB-+ <SEP> 10
<tb>
*Vogel-Bonner-Minimalmedium plus Glycerin
D) Gelfiltration von mit Bromcyan behandelten Extrakten
Mit Ameisensäure und Bromcyan behandelte Extrakte der positiven Clone (pSOM11-3, 11-5,11-6 und 11-7) werden vereinigt, (Gesamtvolumen 250 fil), getrocknet und in 0, 1 ml 50%iger
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Essigsäure wieder suspendiert. Nach Zugabe von [H]-Leucin wird die Probe auf eine
0, 7 x 47 cm-Säule aus Sephadex G-50 in 50%iger Essigsäure aufgebracht. Aliquote Anteile von jeweils 50 (il der Kolonnenfraktionen werden auf Somatostatin geprüft. Vereinigte negative Clon- extrakte (11-2,11-4 und 11-11) werden genauso behandelt. Die Ergebnisse sind der Fig. 8 zu entnehmen.
Auf der gleichen Säule wird bekanntes Somatostatin (Beckman Corp.) wie angegeben (SS) eluiert. In diesem System wird Somatostatin von ausgeschlossenen grossen Peptiden und vollständig eingeschlossenen kleinen Molekülen gut getrennt. Nur Extrakte von für Somatostatin positiven Clonen zeigen Radioimmunaktivität in den Säulenfraktionen, und diese Aktivität wird in der gleichen Position wie chemisch synthetisiertes Somatostatin eluiert.
Zusammenfassung der Aktivitätsinformation
Die Daten für den Beweis der Synthese eines Polypeptids mit der Somatostatinaminosäurese- quenz sind wie folgt zusammenzufassen : (1) Somatostatinradioimmunaktivität liegt vor in E. coli-Zellen mit dem Plasmid pSOM11-3, das ein Somatostatingen mit erwiesener richtiger Sequenz enthält und die richtige Orientierung des lac-EcoRI-DNA-Fragments hat. Zellen mit dem verwandten Plasmid pSOM11-2, das das gleiche Somatostatingen enthält, aber eine entgegengesetzte Orientierung des lac-EcoRI-Fragments hat, erzeugen keine nachweisbare Somatostatinaktivität.
(2) Wie auf Grund des Gestaltungsschemas vorherzusehen, ist bis zur Bromcyanbehandlung des Zellextraktes eine nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität nicht zu beobachten.
(3) Die Somatostatinaktivität steht unter der Kontrolle des lac-Operons, was durch Induktion durch IPTG, einen Induktor des lac-Operons, nachgewiesen wird.
(4) Die Somatostatinaktivität ergibt auf Sephadex G-50 ein gemeinsames Chromatogramm mit bekanntem Somatostatin.
(5) Die DNA-Sequenz des geclonten Somatostatingens ist richtig. Wenn die Translation nicht in Phase ist, wird ein Peptid gebildet, das sich in jeder Stellung von Somatostatin unterscheidet. Es wird eine Radioimmunaktivität festgestellt, die anzeigt, dass ein dem Somatostatin nahestehendes Peptid gebildet worden ist, und die Translation muss in Phase sein. Da Translation in Phase erfolgt, bestimmt der genetische Code, dass ein Peptid mit der genauen Sequenz von Somatostatin gebildet wird.
(6) Schliesslich inhibieren die obigen Proben von E. coli RR1 (pSOM11-3) -Extrakt die Freisetzung von Wachstumshormon aus Hypophysenzellen von Ratten, wohingegen parallel und mit identischer Proteinkonzentration hergestellte Proben von E. coli RR1 (pSOM11-2) keine Wirkung auf Wachstumshormonfreisetzung ausüben.
Stabilität, Ausbeute und Reinigung von Somatostatin
Die Stämme mit dem EcoRI-lac-Operon-Fragment (pSOM11-2, pSOM11-3, usw.) trennen sich hinsichtlich des Plasmidphänotyps. Beispielsweise ist nach etwa 15 Generationen etwa die Hälfte der E. coli RR1 (pSOM11-3) -Kultur für ss-Galactosidase verantwortlich, d. h. weist den lac-Operator auf, und etwa die Hälfte hievon ist ampicillinresistent. Für Somatostatin positive (pSOM11-3) und negative (pSOM11-2) Stämme sind unbeständig, und deshalb rührt der Wachstumsnachteil vermutlich von der Überproduktion der grossen aber unvollständigen und inaktiven Galactosidase her.
Die Ausbeute an Somatostatin schwankt von 0, 001 bis 0, 03% des gesamten cellularen Proteins (Tabelle I), vermutlich infolge der Selektion von Kulturzellen mit Plasmiden mit einem fehlenden lac-Bereich. Die höchsten Ausbeuten an Somatostatin werden mit Präparaten erzielt, bei deren Herstellung das Wachstum von einer einzigen ampicillinresistenten richtungsgebenden oder konstitutiven Kolonie ausgegangen ist. Selbst in diesen Fällen haben 30% der Zellen bei der Gewinnung oder Ernte Verluste an lac-Bereich. Lagerung in gefrorenem Zustand (Lyophilisierung) und Wachstum bis zur Gewinnung aus einer einzigen derartigen Kolonie ist daher für das beschriebene System angezeigt.
Ausbeuten können beispielsweise durch Verwendung von Bakterienstämmen erhöht werden, die lac-Repressor überproduzieren, so dass eine Expression vor Vorläuferprotein vor Induktion und Ernte praktisch völlig unterdrückt wird. Wie bereits erörtert, kann aber auch ein Tryptophan- oder anderes Operatorpromotersystem angewendet werden, das gewöhnlich vollständig unterdrückt ist.
In dem rohen Extrakt, der beim Aufbrechen der Zellen in z. B. einer Eaton-Presse erhal-
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ten wird, ist das ss-Galactosidase-Somatostatinvorläuferprotein unlöslich und findet sich in dem Korn der ersten Zentrifugierung mit geringer Geschwindigkeit. Die Aktivität kann in 70% niger Ameisensäure, 6m Guanidiniumhydrochlorid oder 2%igem Natriumdodecylsulfat gelöst werden. Vorzugsweise wird jedoch der Rohextrakt aus der Eaton-Presse mit 8m Harnstoff extrahiert und der Rückstand mit Bromcyan gespalten. Bei den anfänglichen Versuchen ist Somatostatinaktivität aus E. coli Stamm RRI (pSOMll-3) durch Alkoholextraktion des gespaltenen Produktes und Chromatographie an Sephadex G-50 in 50%iger Essigsäure etwa 100fach angereichert worden.
Wird das Produkt erneut an Sephadex G-50 chromatographiert und dann einer Hochdruckflüssigchromatographie unterworfen, kann praktisch reines Somatostatin erhalten werden.
II. Humaninsulin
Die oben beschriebenen Arbeitsweisen werden als nächstes auf die Erzeugung von Humaninsulin angewendet. So werden die Gene für die Insulin B-Kette (104 Basenpaare) und für die Insulin A-Kette (77 Basenpaare) aus der Aminosäuresequenz der Humanpolypeptide jeweils mit einzelsträngigen Kohäsivtermini für die EcoRI-und BamHI-Restriktionsendonuclease und jeweils für die getrennte Einführung in pBR322-Plasmide bestimmt, gestaltet. Die synthetischen Fragmente, Deca- bis Pentadecanucleotide, werden durch die Blockphosphotriestermethode unter Verwendung von Trinucleotiden als Baublöcke synthetisiert und schliesslich mit einer Hochleistungs- flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Die synthetischen Gene für Humaninsulin A- und B-Ketten werden dann getrennt in Plasmid pBR322 zur Clonbildung gebracht.
Die synthetischen Gene werden dann in Clonform an E. coli- ss -Galactosidasegen wie oben angelagert, wodurch eine wirksame Transkription und Translation und ein stabiles Vorläuferprotein erhalten wird. Insulinpeptide werden vom ss -Galactosidasevorläufer gespalten, durch Radioimmunprüfung nachgewiesen und gereinigt. Insulinradioimmunprüfungsaktivität wird dann durch Vermischen der E. coli-Produkte erzeugt.
1. Ausgestaltung und Synthese von Humaninsulingenen
Die für Humaninsulin aufgebauten Gene sind in Fig. 9 dargestellt. Die Gene für Humaninsulin, B-Kette und A-Kette, werden aus der Aminosäuresequenz von Humanpolypeptiden gestaltet. Die E'-Enden jedes Gens haben einsträngige kohäsive Termini für die EcoRI-und BamHI-Restriktionsendonuclease für die richtige Einfügung jedes Gens in das Plasmid pBR322. In der Mitte des B-Ketten-Gens für die Aminosäuresequenz Glu-Ala wird eine HindIII-Endonuclease- - Erkennungsstelle eingebaut, um Verbreitung und Nachweis jeder Hälfte des Gens gesondert vor dem Aufbau des gesamten B-Kettengens zu ermöglichen. Die B-Ketten-und A-Ketten-Gene werden so gestaltet, dass sie von 29 verschiedenen Oligodesoxyribonucleotiden, vom Decameren bis zu den Pentadecameren, aufgebaut werden.
Jeder Pfeil bezeichnet das Fragment, das durch die verbesserte Phosphotriestermethode synthetisiert wird, H1 bis H8 und Bl bis B12 für das B-Kettengen und AI bis All für das A-Kettengen.
2. Chemische Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden
Die für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden angewendeten Materialien und Methoden sind im wesentlichen die in Itakura, K. et al [1975] J. Biol. Chem. 250,4592 und Itakura, K. et al [1975] J. Amer. Chem. Soc. 97,7327 beschriebenen, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen :
EMI17.1
in Acetonitril in Gegenwart von 1-Methylimidazol, Van Boom, J. H. et al [1975] Tetrahedron 31, 2953, synthetisiert. Die Produkte werden in grossem Massstab (100 bis 300 g) durch präparative Flüssigchromatographie (Prep 500 LC, Waters Associates) isoliert. b) Unter Anwendung der Lösungsmittelextraktionsmethode (Hirose, T. et al [1978] Tetrahedron Letters, 2449) werden 32 bifunktionelle Trimeren (vgl.
Tabelle IV) in einem Massstab von 5 bis 10 mm und 13 Trimeren, 3 Tetrameren und 4 Dimeren als 3 r -Terminusblöcke in einem Massstab von 1 mMol synthetisiert. Die Homogenität der vollständig geschützten Trimeren wird durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel in zwei Methanol/Chloroform-Lösungsmittelsystemen : Lösungsmittel a 5% Vol. /Vol. und Lösungsmittel b 10% Vol. /Vol. (vgl. Tabelle IV) kontrolliert.
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Ausgehend von diesen verschiedenen Verbindungen werden 29 Oligodesoxyribonucleotide mit definierter Sequenz synthetisiert, 18 für das B-Ketten-und 11 für das A-Ketten-Gen.
Als Grundeinheiten für den Aufbau von Polynucleotiden werden zwei Arten von Trimerblöcken, d. h. die bifunktionellen Trimerblöcke von Tabelle IV und entsprechende an der 3'-Hydroxygruppe durch eine Anisoylgruppe geschützte 3'-Terminus-Trimeren verwendet. Das bifunktionelle Trimere wird mit einer Mischung aus Pyridin, Triäthylamin und Wasser (3 : 1 : 1, Vol. /Vol.) zu derentsprechenden 3'-Phosphodiesterkomponente und mit 2% Benzolsulfonsäure zu der entsprechenden 5'-Hydroxykomponente hydrolysiert. Der bereits erwähnte 3'-Terminus-Block wird mit 2%iger Benzolsulfonsäure behandelt, wodurch die entsprechende 5'-Hydroxylverbindung gebildet wird.
Die Kupplungsreaktion eines Überschusses des 3'-Phosphodiestertrimeren (1, 5 Moläquivalente)
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kurze Kieselgelsäule auf einem Sinterglasfilter geleitet. Die Säule wird zuerst mit CHCl3 zum Eluieren einiger Nebenprodukte und des Kupplungsreagens und dann mit CHCl3 : MeOH (95 : 5 Vol. /Vol.), worin nahezu das gesamte, vollständig geschützte Oligomere eluiert wird, gewaschen. Unter diesen Bedingungen bleibt der eingesetzte 3'-Phosphodiesterblock-Reaktions- teilnehmer in der Säule. In entsprechender Weise werden Blockkupplungen wiederholt, bis die gewünschte Länge aufgebaut ist.
Tabelle IV
Synthese von Trimerbaublöcken
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<tb>
<tb> Verbin-Ausbeute** <SEP> Rf <SEP> Reinheit*** <SEP> zugegen <SEP> in
<tb> Nr. <SEP> dung* <SEP> (%) <SEP> a <SEP> b <SEP> (%) <SEP> (s. <SEP> Fig. <SEP> 9) <SEP>
<tb> 1. <SEP> AAG <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 93 <SEP> B5, <SEP> B6 <SEP>
<tb> 2. <SEP> AAT <SEP> 49 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP> 95 <SEP> Hl, <SEP> Al, <SEP> A6 <SEP>
<tb> 3. <SEP> AAC <SEP> 52 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 93 <SEP> H5, <SEP> B6, <SEP> A2, <SEP> A8 <SEP>
<tb> 4. <SEP> ACT <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 91 <SEP> B4, <SEP> B5, <SEP> B6 <SEP>
<tb> 5. <SEP> ACC <SEP> 56 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 96 <SEP> B7
<tb> 6. <SEP> ACG <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 90 <SEP> H5, <SEP> B7 <SEP>
<tb> 7.
<SEP> AGG <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP> 89 <SEP> H6, <SEP> H7, <SEP> B9 <SEP>
<tb> 8. <SEP> AGT <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 96 <SEP> B9, <SEP> A2, <SEP> All <SEP>
<tb> 9. <SEP> AGC <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> 92 <SEP> H8, <SEP> Bl, <SEP> A5, <SEP> Al0 <SEP>
<tb> 10. <SEP> AGA <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 91 <SEP> A9
<tb> 11. <SEP> TTC <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP> 95 <SEP> B4, <SEP> B7, <SEP> A3 <SEP>
<tb> 12. <SEP> TTC <SEP> 49 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 94 <SEP> H3, <SEP> H5, <SEP> A2, <SEP> A3, <SEP> A5 <SEP>
<tb> 13. <SEP> TCT <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 96 <SEP> A4
<tb> 14. <SEP> TCA <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 92 <SEP> Hl, <SEP> H2, <SEP> H4, <SEP> Al <SEP>
<tb> 15.
<SEP> TCG <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 91 <SEP> A2
<tb> 16. <SEP> TGG <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 87 <SEP> H3,A1,A10
<tb> 17. <SEP> TGC <SEP> 51 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> 93 <SEP> H6, <SEP> B2, <SEP> A4, <SEP> A7, <SEP> A8 <SEP>
<tb> 18. <SEP> TGA <SEP> 46 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 94 <SEP> H7
<tb> 19. <SEP> TAC <SEP> 61 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 90 <SEP> B4, <SEP> A11 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Tabelle IV (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Verbin-Ausbeute <SEP> Rf <SEP> Reinheit*** <SEP> zugegen <SEP> in
<tb> Nr. <SEP> dung* <SEP> (%) <SEP> a <SEP> b <SEP> (%) <SEP> (s. <SEP> Fig. <SEP> 9) <SEP>
<tb> 20. <SEP> TAA <SEP> 55 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 95 <SEP> B5, <SEP> AI0 <SEP>
<tb> 21.
<SEP> CCT <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 97 <SEP> H3, <SEP> H4, <SEP> B10 <SEP>
<tb> 22. <SEP> CAC <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP> 92 <SEP> A3
<tb> 23. <SEP> CAA <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP> 93 <SEP> H2, <SEP> H6, <SEP> H8, <SEP> A7 <SEP>
<tb> 24. <SEP> CTT <SEP> 41 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 54 <SEP> 92 <SEP> B2, <SEP> B9, <SEP> A4 <SEP>
<tb> 25. <SEP> CGA <SEP> 40 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP> 93 <SEP> A7
<tb> 26. <SEP> CGT <SEP> 75 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 89 <SEP> H2, <SEP> H4, <SEP> B3, <SEP> B1 <SEP>
<tb> 27. <SEP> GGT <SEP> 35 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP> 90 <SEP> B3
<tb> 28. <SEP> GTT <SEP> 46 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 93 <SEP> B2
<tb> 29. <SEP> GTA <SEP> 38 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 95 <SEP> B6, <SEP> B8, <SEP> A6 <SEP>
<tb> 30.
<SEP> GAA <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 88 <SEP> H7, <SEP> B3, <SEP> B8, <SEP> A5 <SEP>
<tb> 31. <SEP> GAT <SEP> 52 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 89 <SEP> B10, <SEP> A9 <SEP>
<tb> 32. <SEP> GCA <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 93 <SEP> A9
<tb>
* vollständig geschützte Tridesoxynucleotide ; 5-09-Dimethoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ss-cyan- äthylphosphat ** Gesamtausbeute, bezogen auf die 5'-Hydroxylmonomeren *** Auf Grund der HPLC-Analyse
Während der Oligonucleotidsynthese wird ausgiebig von der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Gebrauch gemacht, u. zw. für die Analyse von a) jedem Trimer- und Tetramerblock, b) den als Zwischenprodukte auftretenden Fragmenten (Hexameren, Nonameren und Decameren), c) der letzten Kupplungsreaktion und d) zur Reinigung der Endprodukte.
Für die HPLC wird ein Spectra-Physics 3500B Flüssigchromatograph verwendet. Nach Entfernung aller Schutzgruppen mit konz. NH, OH bei 50 C (6 h) und 80%iger Essigsäure bei Zimmertemperatur (15 min) werden die Verbindungen an einer Permaphase AAX (DuPont) (Van Boom, J. et al [1977] J. Chroma-
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digkeit von 2 ml/min durchgeführt. Auch die Reinigung der 29 End-Oligonucleotide wird an Permaphase AAX unter den gleichen oben angegebenen Bedingungen durchgeführt. Die Materialien mit dem gewünschten Peak werden vereinigt, durch Dialyse entsalzt und lyophilsiert. Nach Mar-
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die Homogenität jedes Oligonucleotids durch Elektrophorese auf einem 20%igen Polyacrylamidgel kontrolliert.
3. Anordnung und Clonbildung von B-Kettengen und A-Kettengen
Das Gen für die B-Kette von Insulin weist eine EcoRI-Restriktionsstelle am linken Ende, eine HindIII-Stelle in der Mitte und eine BamHI-Stelle am rechten Ende auf. Dadurch ist es möglich, beide Hälften, die linke EcoRI-HindIII-Hälfte (BH) und die rechte HindIII-BamHI- - Hälfte (BB), in dem gut geeigneten Clonbildungsträger pBR322 getrennt zu clonen und nach Feststellung ihrer Sequenzen zu dem vollständigen B-Gen zu verbinden (Fig. 10).
Die BB-Hälfte wird durch Verknüpfen aus 10 Oligodesoxyribonucleotiden, in Fig. 9 mit B1 bis B10 bezeichnet,
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Humaninsulin erzielt worden ist, kann folgendermassen zusammengefasst werden : a) Radioimmunaktivität ist für beide Ketten nachgewiesen worden. b) Die nach Clonbildung und Plasmidaufbau erhaltenen DNA-Sequenzen sind direkt als der Gestaltung entsprechend nachgewiesen worden. Da Radioimmunaktivität erhalten wird, muss die Translation in Phase sein.
Der genetische Code bestimmt daher, dass Peptide mit der Sequenz von Humaninsulin erzeugt werden. c) Nach der Bromcyanspaltung verhalten sich die E. coli-Produkte in drei verschiedenen chromatographischen Systemen, bei denen die Trennung auf verschiedenen Prinzipien beruht (Gelfiltration, Ionenaustausch und Umkehrphasen-HPLC) als Insulinketten. d) Die von E. coli erzeugte A-Kette ist durch HPLC in einem kleinen Massstab gereinigt worden und hat die richtige Aminosäurezusammensetzung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines vorher gewählten heterologen Polypeptids oder Zwischenproduktes dafür, dadurch gekennzeichnet, dass man einen zur Transformation eines mikrobiellen Wirtes geeigneten Rekombinations-Clonbildungsträger, der ein einem mikrobiellen Wirt homologes Regulon aufweist, herstellt, daran ein DNA-Einsatzstück anknüpft, welches für ein vorher gewähltes heterologes Polypeptid oder ein Zwischenprodukt dafür codiert, um den Rekombinations-Clonbildungsträger zu erhalten, in welchem sich das DNA-Einsatzstück im richtigen Leserahmen mit dem Regulon befindet, und den Clonbildungsträger in einem transformierten Mikroorganismus zur Expression bringt, um dabei das vorher gewählte heterologe Polypeptid oder Zwischenprodukt dafür unter Kontrolle des Regulons in gewinnbarer Form herzustellen.