DE3050725C2 - - Google Patents
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Description
Die DNA (Desoxyribonucleinsäure), aus der Gene bestehen,
enthält sowohl Protein codierende oder "Struktur"-Gene als
auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information
dadurch vermitteln, daß sie Bereiche für
die RNA-Polymerase-Bindung, Information für ribosomale Bindestellen
usw. bereitstellen. Codiertes Protein wird von der
korrespondierenden DNA innerhalb eines Organismus durch
einen vielstufigen Prozeß exprimiert, wobei:
- 1. das Enzym RNA-Polymerase in der Kontrollregion (im folgenden "Promoter" genannt) aktiviert wird und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Boten- (Messenger)-Ribonucleinsäure (mRNA) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren "Stop"-Codons beendet wird:
- 2. die mRNA-Botschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem "Start"-Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird).
In Übereinstimmung mit dem genetischen Code, spezifiziert
die DNA jede Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon"
von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt
werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im
folgenden A, T, C oder G genannt werden. Diese treten in
dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer
Doppelstrang-("Duplex")-DNA auf, dessen bleibender oder
"komplementärer" Strang aus Nucleotiden ("Basen") gebildet
wird, die mit den ihnen komplementären Basen im codierenden
Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist
komplementär zu T und C komplementär zu G. Die bisher beschriebenen
und weitere Erkenntnisse, die sich auf den
Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert
in Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) und
3 (1977), John Wiley und Sons, N.Y.
Es stehen eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination
zur Verfügung, nach denen aneinander angrenzende Enden
separater DNA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten
werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden
geschieht durch Bildung von Phosphodiesterbindungen
zwischen aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch
die Wirkung eines Enzyms, einer T4 DNA-Ligase. Auf diese
Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden
werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären
Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft,
da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die jeweiligen
Enden in die Position für die anschließende Verbindung
gebracht werden. Solche Einzelstränge, als cohäsive Enden
bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an
stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase
Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, daß ein
Strang eines stumpfen Endes mit einem Enzym wie λ-Exonuclease
abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restriktionsendonucleasen
(im folgenden "Restriktionsenzyme"),
die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen
Nucleotidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis
6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkennungsstelle"),
schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre
Erkennungsstellen bekannt. Siehe z. B. R. J. Roberts, CRC
Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Viele
davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre
Einzelstrangsequenzen an den Enden eines an sich doppelsträngigen
Fragments entstehen. Als komplementäre Sequenzen
können die überstehenden oder "cohäsiven" Enden
durch Basenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche
Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht
durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge
ein neues DNA-Molekül. Durch die Verwendung von Ligase, das
die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche
heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste
kovalente Bindung. Restriktionsenzyme, die an geschnittener
doppelsträngiger DNA "stumpfe"Enden hinterlassen, erlauben
eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch
beispielsweise T4-Ligase.
Für den vorliegenden Zweck wird folgendes "clonierender
Vektor" genannt: ein nichtchromsomales Stück einer doppelsträngigen
DNA, das ein intaktes Replikon enthält, so daß
der Vektor repliziert werden kann, wenn er in einen einzelligen
Organismus ("Mikrobe") durch Transformation gebracht
wird. Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird
"Transformante" genannt. Derzeit sind die clonierenden
Vektoren, die üblicherweise verwendet werden, von Viren
und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von
bakterieller DNA, genannt "Plasmide".
Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren
zur Konstruktion von "rekombinanten" clonierenden Vektoren
geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das
exogene DNA enthält, bestehen. In besonderen Beispielen
kann die Rekombinante "heterologe" DNA einschließen, wobei
damit eine DNA gemeint ist, die für Polypeptide codiert,
die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt
werden, welcher empfindlich ist für die Transformation
durch den rekombinanten Vektor. Es werden somit Plasmide
mit Restriktionsenzymen geschnitten, um lineare DNA zur
Verfügung zu stellen, die verbindbare Enden hat. Diese werden
an ein exogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare
Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur
Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon und eine
phänotypische Eigenschaft aufweist, die benützt werden kann,
um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird
durch Transformation in einen Mikroorganismus überführt,
und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel
ist, große Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen
Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die
Expression des Proteins, für welches das Gen codiert. Über
die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung
ist in extenso berichtet in Miles International
Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science
and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, N.Y.
(1977).
Neben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den
Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es
Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich
eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene
codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen
für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluß des
lac-Promoters in einem E. coli Bakterium exprimiert
(K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)). Kürzlich
gelang auf die gleiche Weise die Expression der A- und
B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das
Hormon bilden (D. V. Goeddel et al., Proc. Nat. Acad.
Sci., USA 76, 106 (1979)). In jedem Fall wurden die Gene
vollständig durch Synthese konstruiert. In jedem Fall
würden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb
der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen
Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d. h. als
Tandem mit einem anderen Protein, das das gewünschte Produkt
durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb
der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte
Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden
Patentschriften beschrieben: GB
20 07 675 A; GB 20 07 670 A; GB 20 07 676 A; GB 20 08 123 A.
Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher
diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen
hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den
Fall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z. B. Wachstumshormonen,
Interferon usw., deren Gene in korrespondierender
Weise komplexer und weniger geeignet für eine
leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert,
derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes
Protein zu exprimieren, da die Notwendigkeit von deren
Expression die Verwertung von Material erfordert, das
innerhalb des Organismus besser für die Konstruktion des
angestrebten Produkts verwendet werden könnte.
In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht
worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden,
sondern durch reverse Transkription von korrespondierender
Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde.
Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens
kann die reverse Transkriptase die Transkription von
der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cDNA für die
komplette, gewünschte Aminosäuresequenz beenden. So haben
beispielsweise Villa-Komaroff et al. eine cDNA für Ratten-
Proinsulin erhalten, dem die ersten drei Aminosäuren des
Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 75,
3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription
von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert
werden, eine cDNA für den Vorläufer ergeben, statt des
bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryotischen
Zelle Führersequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen)
enzymatisch abgetrennt werden. Bisher ist keine Bakterienzelle
aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so daß das
mRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben
hat, die die Leader-Sequenz der Vorläuferform enthalten,
als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff, a.a.O.
(Ratten-Proinsulin); P. H. Seeburg et al., Nature 276, 795
(1978) (Rattenwachstumshormon)).
Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur
bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren
Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur
Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offensichtlich
nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich
ist, z. B. Villa-Komaroff, a.a.O. (Penicillinase-Proinsulin);
Seeburg, a.a.O. (β-Lactamase-Wachstumshormon).
Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in
der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren
und ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 21 500, mehr
als dreimal so groß wie Insulin. Bis zur vorliegenden Erfindung
konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeitsaufwendig
aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden -
der Hypophyse aus menschlichen Leichen. Die daraus
folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei
der Behandlung von durch Funktionsstörung der Hypophyse
verursachtem hypophysären Zwergenwuchs begrenzt, und sogar
hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, daß
vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge
erhalten werden kann, daß nicht mehr als 50% der Betroffenen
damit behandelt werden können.
Zusammengefaßt besteht daher eine Notwendigkeit für neue
Methoden, um HGH und andere Polypeptidprodukte in großen
Mengen herzustellen. Diese Notwendigkeit ist besonders
akut in dem Fall, wenn Polypeptide zu groß sind, um organische
Synthese zuzulassen oder, aus diesem Grund, mikrobiologische
Expression von vollständigen synthetischen
Genen. Die Expression von Säugetierhormonen von mRNA-Transskripten
hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten,
die dem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits
jedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion
von bioinaktiven Konjugaten erlaubt, von denen die gewünschten
Hormone nicht brauchbar getrennt werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt zur
Expression quasi-synthetischer Gene geeignete Plasmide zur Verfügung, wobei
durch reverse Transskription ein wesentlicher Bestandteil,
vorzugsweise die Mehrheit der codierenden Sequenz zur Verfügung
gestellt wird, ohne den arbeitsaufwendigen Umweg
der vollständigen synthetischen Konstruktion, während die
Synthese des Rests der codierenden Sequenz ein komplettes
Gen liefert, das fähig ist zur Expression des gewünschten
Polypeptids, ohne die Begleitung von bioinaktivierenden
Leader-Sequenzen oder anderem Fremdprotein. Alternativ
dazu kann der synthetische Rest ein gegen Proteolyse
resistentes Konjugat ergeben, so gebaut, daß das Schneiden
des Fremdproteins außerhalb der Zelle ermöglicht ist,
wodurch die bioaktive Form erhalten wird. Die Erfindung
stellt folglich Plasmide, einsetzbar für die mikrobielle
Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die
bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch kostenaufwendige
Extraktion aus Gewebe hergestellt werden konnten
und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet
waren.
Die Art, auf welche dieses Ziel und Vorteile
der Erfindung erreicht werden können, wird aus der folgenden
Spezialbeschreibung verständlich sowie aus den beigefügten Zeichnungen, die sich auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der Erfindung beziehen. Es zeigt
Fig. 1 das Syntheseschema für die Konstruktion eines
Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren
des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen
mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern,
die beim Clonen verwendet werden. Die Pfeile im
codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem
komplementären oder unteren Strang ("L") bezeichnen
die Oligonucleotide, die miteinander verbunden
wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;
Fig. 2 die Verbindungen der "U"- und "L"-Oligonucleotiden,
für die Bildung des Genfragments aus Fig. 1, und
dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendem
Vektor;
Fig. 3 die DNA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines
HaeIII-Restriktionsenzymfragments eines Hypophysen-
mRNA-Transkripts, mit den numerierten Aminosäuren
des menschlichen Wachstumshormons, für das sie
codieren. Schlüsselrestriktionserkennungsstellen
sind bezeichnet, ebenso DNA (auf "Stop" folgende)
für nicht translatierte mRNA;
Fig. 4 die Konstruktion eines clonierenden Vektors für
ein Genfragment, das für die Aminosäuren des
menschlichen Wachstumshormons codiert, welches
nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion
dieses Genfragments als komplementäre
DNA durch reverse Transkription von mRNA, die
aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert
wurde;
Fig. 5 die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien
zur Expression des menschlichen Wachstumshormons
fähig ist, beginnend mit den Plasmiden der
Fig. 2 und 3.
Der generelle Weg der Erfindung ist die Kombination mehrerer
Genfragmente in einem einzigen clonierenden Vektor, wobei
diese Genfragmente in Kombination für die Expression des gewünschten
Produkts codieren. Von den Genfragmenten ist mindestens
eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription
von mRNA abgeleitet ist, welche aus Gewebe isoliert wurde,
wie durch die Methode nach A. Ullrich et al., Science 196,
1313 (1977). Die cDNA stellt einen wesentlichen Bestandteil,
vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons für das gewünschte
Produkt zur Verfügung, während restliche Teile des
Gens synthetisch erhalten werden. Die synthetischen und die
mRNA-Transkriptfragmente werden getrennt geclont, um ausreichende
Mengen für den Einsatz in dem späteren Kombinationsschritt
zur Verfügung zu stellen.
Eine Vielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung
der Codons für das Endprodukt, z. B. zwischen synthetischer
und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären
DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxam
und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977).
Komplementäre DNA, die durch reverse Transkription erhalten
wird, wird auf unveränderliche Weise Codons für mindestens
eine Carboxyl-Endgruppe des gewünschten Produkts enthalten,
ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Translations-
Stopsignalen, benachbart zum Carboxylende liegende
Codons für nicht translatierte mRNA. Die Anwesenheit von DNA
für nicht translatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl
übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z. B. durch
Schneiden mit Restriktionsenzymen entfernt werden können, um
zelluläres Material zu erhalten, das für die Replikation
und Expression der DNA für das angestrebte Produkt benötigt
wird. In besonderen Fällen wird die cDNA Codons für die
vollständige, gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso
wie fremde Codons stromaufwärts vom Aminoende des angestrebten
Produkts. Zum Beispiel werden viele, wenn nicht alle,
Polypeptidhormone in einer Vorläuferform exprimiert mit
Leader- oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispielsweise
beim Transport zur Zellwand beteiligt ist. Während der
Expression von eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen
enzymatisch beseitigt, so daß das Hormon in seiner freien,
bioaktiven Form in den periplasmatischen Raum eindringt.
Man kann sich jedoch nicht darauf verlassen, daß mikrobielle
Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert,
Sequenzen, die für solche Signale oder Leader-Sequenzen
codieren, vom mRNA-Transkript zu entfernen. Im Verlauf
dieses Entfernungsvorgangs geht auch das Translations-
Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige
Codons für das angestrebte Produkt entfernt. Die synthetische
Komponente des quasi-synthetischen Genprodukts der
Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso
stellt sie ein neues Translations-Startsignal zur Verfügung,
wobei der Vektor, in dem sich das Hybridgen letztlich entwickeln
wird, selbst keinen günstig gelegenen Start aufweist.
Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus Wachstumshormon-cDNA
wird begünstigt durch das Zurverfügungstellen einer Restriktionserkennungsstelle
innerhalb des das Wachstumshormon
codierenden Teils des Gens. Es kann nichtsdestotrotz
auch ohne das Zurverfügungstellen einer solchen Erkennungsstelle
durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne
Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Restriktionserkennungsstelle,
die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten
Polypeptids liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche
Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht
von mRNA abgeleitet ist. In jeder cDNA, die für das gewünschte
Polypeptid und eine Leader- oder andere bioinaktivierende
Sequenz codiert, wird sich daher die Grenze zwischen
den Codons der letzteren und denen des reifen Polypeptids
an der Aminosäurensequenz des reifen Polypeptids
zeigen. Man kann einfach in die Gene verdauen, die für
das Peptid der Wahl codieren, und so die ungewünschten
Leader- oder andere Sequenzen entfernen. Wenn daher beispielsweise eine cDNA folgender Struktur gegeben ist:
etc.
wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet
ist, kann eine Reaktionsbedingung für eine Exonuclease-
Verdauung gewählt werden, um die oberen Sequenzen
"a" und "b" zu entfernen, wonach eine S1-Nuclease-Verdauung
automatisch die unteren Sequenzen "c" und "d"
eliminiert. Alternativ dazu und präziser kann man DNA-
Polymerase-Verdauung in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten
("d(A,T,C,G)TP") einsetzen. Im obengenannten
Beispiel wird daher DNA-Polymerase in der Gegenwart von
dGTP die Sequenz "c" entfernen (und bei "G" anhalten),
daraufhin wird S1-Nuclease "a" verdauen; DNA-Polymerase
in Gegenwart von dTTP wird "d" entfernen (und bei "T"
anhalten) und S1-Nuclease wird dann "d" herausschneiden
usw. Siehe allgemein A. Kornberg, DNA Synthesis, S.
87-88, W. H. Freeman und Co., San Francisco (1974).
Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Restriktionserkennungsstelle
an einem passenden Punkt innerhalb des Bereichs
der cDNA, die für das gewünschte Produkt codiert,
konstruieren, durch Anwendung der "unpassenden" ("mismatch")
Reparatursynthesetechnik von A. Razin et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 75, 4268 (1978). Bei dieser Technik können
eine oder mehrere Basen in eine bestehende DNA-Sequenz
substituiert werden, wobei Primer verwendet werden, die
den unpassenden Substituenten enthalten. Mindestens sieben
palindromartige 4-Basenpaarsequenzen werden selektiv durch
bekannte Restriktionsenzyme erkannt, das sind AGCT (AluI),
CCGG (HpaII), CGCG (ThaI), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC
(HaeIII), und TCGA (TaqI). Wenn die cDNA-Sequenz eine Sequenz
enthält, die sich von einer derartigen Erkennungsstelle
in nur einer einzigen Base unterscheidet, was
statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese
eine replizierte cDNA zu erhalten, die die geeignete,
substituierte Base enthält und damit die gewünschte
Restriktionserkennungsstelle. Durch einen Schnitt
wird die DNA vom unerwünschten Leader entfernt, wonach
durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für
die Expression des kompletten Polypeptids benötigt werden.
Zum Beispiel:
Es ist natürlich offensichtlich, daß längere Restriktionserkennungsstellen
auf ähnliche Weise eingesetzt werden können,
wo das erwünscht ist, oder daß durch sukzessive Reparatur
4-Basenpaar-Restriktionserkennungsstellen gebildet werden
können, wo lediglich 2 Basen gemeinsam mit der Erkennungsstelle
am gewünschten Punkt erscheinen usw.
Es werden sich Anwendungsmöglichkeiten zeigen, bei denen es
wünschenswert ist, nicht nur die Aminosäuresequenz des angestrebten
Produkts, sondern auch eine bestimmte Menge fremdes,
aber speziell hergestelltes Protein zu exprimieren. Vier
derartige Anwendungen werden durch Beispiele erwähnt werden.
Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder
eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf
welche Immunogenität durch Konjugation zu einem zusätzlichen
Protein übertragen wird, so daß eine Vaccine produziert wird.
Siehe allgemein GB 20 08 123 A. Es kann jedoch wieder
aus Sicherheitsgründen wünschenswert sein, das angestrebte
Produkt als eine Konjugate eines anderen, bioinaktiven Proteins
zu exprimieren, die so gebaut sind, daß extrazelluläres
Schneiden ermöglicht ist, um die aktive Form zu erhalten.
Drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen
Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt
vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen
durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange
das Signal-Peptid danach geschnitten werden kann. Schließlich
kann eine Fremdverbindung verwendet werden, die so gebaut
ist, daß ein spezifischer extrazellulärer Schnitt möglich
ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das
sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen
des mikrobiellen Wirts. Zumindest in den letzten drei Anwendungsbereichen
kann der synthetische molekulare Adapter,
der verwendet wird, um die codierende Sequenz des mRNA-Transkripts
zu vervollständigen, zusätzlich Codons eingebaut
haben für Aminosäuresequenzen, die spezifisch geschnitten
werden, beispielsweise durch enzymatische Wirkung. Beispielsweise
schneidet Trypsin oder Chymotrypsin bei Arg-Arg
oder Lys-Lys usw. Siehe GB-Patent 20 08 123 A.
Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die
Erfindung in ihrem breitesten Bereich die mannigfaltigen
Anwendungen erlaubt, von denen alle die folgenden Eigenschaften
gemeinsam aufweisen:
- - es wird ein mRNA-Transkript verwendet, das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, das jedoch, falls es alleine exprimiert wird, ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würde, entweder kleiner oder größer als das angestrebte Produkt;
- - Protein codierende Codons für andere als solche Aminosäuren, die im angestrebten Produkt enthalten sind, werden, falls vorhanden, entfernt;
- - organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz codieren; und
- - das mRNA-Transkript und das (die) synthetische(n) Fragment(e) werden zusammengefügt und in eine einen Promoter enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes, konjugiertes Protein, oder das angestrebte Produkt konjugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und exprimiert wird.
Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall
mit der Aminosäure beginnen, für die das Translations-Startsignal
codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin).
Man kann erwarten, daß diese Aminosäure intrazellulär
entfernt wird, oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden
Produkts im wesentlichen unbeeinflußt läßt.
Mit Hilfe der Erfindung kann ein Verfahren allgemeiner Anwendbarkeit
bei der Produktion von nützlichen Proteinen, einschließlich
Antikörpern, Enzymen und ähnlichem zur Verfügung
gestellt werden, im besonderen die
Expression von Polypeptidhormonen von Säugetieren und
anderen Substanzen mit medizinischer Anwendung,
z. B. Glucagon, gastrointestinale Inhibitorpolypeptide,
Polypeptide der Bauchspeicheldrüse, Adrenokortikotropin,
β-Endorphine, Interferon, Urokinase, Blutgerinnungsfaktoren,
menschliches Albumin usw. Im folgenden wird eine
bevorzugte Ausführungsform, die die Erfindung erläutert,
beschrieben, bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für
menschliches Wachstumshormon codiert, konstruiert, geclont
und mikrobiell exprimiert wird.
Polyadenylierte mRNA für menschliches Wachstumshormon
(HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzierenden
Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von
A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). 1,5 µg von
Doppelstrang-("ds")-cDNA wird präpariert aus 5 µg dieser
RNA, im wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al.,
J. Biol. Chem. 253 2483 (1978), mit der Ausnahme, daß die
RNA-Polymerase "Klenow-Fragment", (H. Klenow, Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 65, 168 (1970)) für die DNA-Polymerase I in
der Zweit-Strangsynthese eingesetzt wurde. Das Restriktionsmuster
von HGH ist derartig, daß HaeIII-Restriktionserkennungsstellen
in der 3′ nichtcodierenden Region und in der
Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und 24 des HGH codieren,
vorhanden sind, wie gezeigt in Fig. 3. Eine Behandlung der
ds-HGH-cDNA mit HaeIII gibt ein DNA-Fragment von 551 Basenpaaren
("bp"), die für die Aminosäuren 24 bis 91 des HGH
codieren. 90 ng der cDNA wird mit HaeIII behandelt, in
einem 8%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen
und die Region bei 550 bp eluiert. Man erhält annähernd
1 ng cDNA.
pBR322, hergestellt nach F. Bolivar et al., Gene 2 (1977)
95-113, wird als clonierender Vektor für die cDNA ausgewählt.
pBR322 ist vollständig charakterisiert, (J. G.
Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 (1978)),
ist ein mit zahlreichen Kopien replizierendes
Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-Resistenz
aufweist, die auf den Einschluß der korrespondierenden
Gene ("ApR" bzw. "TcR" in Fig. 4) zurückzuführen
sind, wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme
PstI, EcoRI und HindIII enthält, wie in der
Figur gezeigt.
Die Schneideprodukte von HaeIII und PstI haben stumpfe
Enden. Es kann folglich das GC-Anhängeverfahren nach Chang
A.C.Y. et al., Nature 275,617 (1978) angewendet werden, um
die stumpfendigen Produkte der PstI-Schnitte von pBR322
mit der HaeIII-Verdauung des mRNA-Transkripts zu verbinden,
so daß das cDNA-Fragment in die PstI-Erkennungsstelle
von pBR322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die
HaeIII-Restriktionserkennungsstellen (GG↓CC) auf der cDNA
und die PstI-Restriktionserkennungsstellen (CTGCA↓G) an
jedem Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt
werden.
Es wird also terminale Desoxynucleotid-Transferase (TdT)
verwendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3′-Ende anzufügen,
wie bereits früher beschrieben, Chang A.Y.C.,
a.a.O. Auf ähnliche Weise werden an das 3′-Ende von 60 ng
PstI-behandeltem pBR322 etwa 10 dG-Reste angehängt. Das
Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDNA mit der dG-ergänzten
Vektor-DNA wird in 130 µl von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)
100 mM NaCl und 0,25 mM EDTA durchgeführt. Die Mischung
wird auf 70°C erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37°C
abgekühlt, und schließlich auf 20°C (6 Stunden) abgekühlt,
ehe es zum Transformieren von E. coli x1776 verwendet
wird. Eine DNA-Sequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach
der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasmids in x1776,
stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des
HGH überein, wie in Fig. 3 gezeigt.
Der Stamm E. coli K-12 x1776 hat den Genotyp F-tonA53,
dapD8, minA1, supE42, Δ 40 (gal-uvrB), λ -, minB2, rfb-2,
nalA25, oms-2, thyA57*, metC65, oms-1, Δ 29 (bioH-asd),
cycB2, cycA1, hsdR2. x1776 wurde vom National Institutes
of Health als ein EK2 Wirts-Vektor-System bescheinigt.
x1776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure
(DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolansäure
synthetisieren. Die Zelle unterliegt daher dem
DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP begrenzt
ist, jedoch genügend Nährsubstrat vorhanden ist,
um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum
aufrechtzuerhalten. Der Stamm ist Thymin- oder
Thymidin-bedürftig und unterliegt dem Thymin-Mangeltod
mit Abbau der DNA, wenn Thymin und Thymidin in der Umgebung
fehlen, jedoch genügend Nährsubstrate vorhanden sind,
um die Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten. x1776
ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig
zu überleben, d. h. unfähig, eine Passage durch den
Intestinaltrakt von Ratten zu überleben. x1776 ist hochgradig
empfindlich gegen Detergentien, Antibiotika,
Arzneimittel und Chemikalien. x1776 kann weder die
Dunkelreparatur noch die Photo-Reaktivierung von UV-induzierten
Schäden durchführen und ist daher um mehrere
Größenordnungen empfindlicher gegen Sonnenlicht als der
Wildtypstamm von E. coli. x1776 ist resistent gegen viele
transduzierende Phagen und läßt bei der Konjugation nur
mangelhaft die genetische Übertragung von vielen verschiedenen
Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasmiden
zu, was auf die Anwesenheit von verschiedenen Mutationen
zurückzuführen ist. x1776 ist resistent gegen Nalidixinsäure,
Cycloserin und Trimethoprim. Diese Substanzen können
daher dem Medium zugegeben werden, um das Überprüfen
des Stamms zu ermöglichen und eine Transformation von
Kontaminanten während der Transformation auszuschließen.
x1776 wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min.
sowohl in L-Nährmedium als auch Penassay-Medium,
wenn dieses mit 100 µg DAP/ml und 4 µg
Thymidin/ml supplementiert wird und erreicht eine Enddichte
von 8-10 × 10⁸ Zellen/ml in der stationären Phase.
Vorsichtiges, kreisförmiges Hin- und Herschütteln für
eine Zeitspanne von 1 bis 2 Minuten suspendiert die Zellen
vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100%.
Zusätzliche Details bezüglich x1776 sind zu finden bei
R. Curtis et al., Molecular Cloning of Recombinant DNA,
99-177, Scott und Werner, eds., Academic Press (N.Y. 1977).
x1776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle
American Type Culture Collection am 3. Juli 1979
unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt.
Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH-
quasi-synthetischen Gens, daß ein synthetisches Fragment
konstruiert wird, das stumpfendige Restriktionsschneidestellen
aufweist, die an den Punkten sitzen, an denen
an das Fragment das mRNA-Transkript angeknüpft werden
soll. Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren
des HGH enthält daher, wie in Fig. 1 gezeigt, eine auf
die Aminosäure 23 folgende HaeIII-Schneideerkennungsstelle.
Das distale Ende des synthetischen Fragments
wird mit einem Verbindungselement (im folgenden "Linker")
versehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende
erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dem
Plasmid erhalten wird, in das das mRNA-Transkript und
das synthetische Fragment letztlich eingebaut werden
sollen.
Wie in Fig. 1 gezeigt, haben die 5′-Enden des doppelsträngigen
Fragments einzelsträngige cohäsive Enden
für die EcoRI- und HindIII-Restriktionsendonucleasen,
um die Plasmid-Konstruktion zu erleichtern. Das Codon
für Methionin am linken Ende stellt eine Erkennungsstelle
für die Initiation der Translation zur Verfügung. Es werden
zwölf verschiedene Oligonucleotide, die in ihrer Größe
von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert,
und zwar nach dem bewährten Phosphotriester-Verfahren nach
Crea, R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Diese
Oligonucleotide, U₁ bis U₆ und L₁ bis L₆ sind durch Pfeile
bezeichnet.
10 µg Substanz von U₂ einschließlich U₆ und L₂ einschließlich
L₆ werden unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase
und (γ³²-P)ATP phosphoryliert, und zwar nach dem veröffentlichten
Verfahren von Goeddel, D. V. et al. Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 76, 106 (1979).
Es werden drei getrennte T4-Ligase-Katalysierte Reaktionen
durchgeführt: 10 µg des 5′-OH-Fragments U₁ werden mit
phosphoryliertem U₂, L₅ und L₆ vereint; phosphoryliertes
U₃, U₄, L₃ und L₄ werden vereint; weiterhin werden 10 µg
des 5′-OH-Fragments L₁ mit phosphoryliertem L₂, U₅ und U₆
vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4°C für sechs
Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300 µl von 20 mM
Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und
0,5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4-Ligase verwendet
werden. Die drei Verknüpfungsmischungen werden dann
vereint, 100 Einheiten T4-Ligase zugegeben, worauf man
die Reaktion 12 Stunden lang bei 20°C ablaufen läßt. Die
Mischung wird dann mit Äthanol ausgefällt und auf einem
10%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen.
Die Bande, die bis zur 84 Basenpaar-Stelle gewandert
ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert.
pBR322 (1 µg) wird mit EcoRI und HindIII behandelt, das
große Fragment durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit
der synthetischen DNA verknüpft. Diese Mischung wird verwendet,
um den Stamm E. coli K-12 294 (end A, thi-, hsr-,
hsmk⁺) zu transformieren. Der Stamm 294 wurde am
30. Oktober 1978 bei der Hinterlegungsstelle American Type
Culture Collection unter der Nummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen
hinterlegt. Eine Sequenzanalyse nach der
Maxam und Gilbert-Technik, a.a.O., bei der EcoRI-HindIII-Insertion
von einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte
das in Fig. 1 dargestellte.
Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mRNA-Transkript
in pHGH31 wird ein zur Replikation fähiges
Plasmid konstruiert, das beide Fragmente enthält, wobei
das Expressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Fig. 5
gezeigt. Das Expressionsplasmid, das einen lac-Promoter
als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermaßen konstruiert.
Ein 285 Basenpaare langes EcoRI-Fragment, das zwei 95 Basenpaare
lange UV5-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche
durch ein 95 Basenpaare langes, heterologes DNA-Fragment
abgetrennt wurden, wird aus dem Plasmid pKB268 isoliert,
siehe K. Backman et al., Cell. Vol. 13, 65-71 (1978).
Das 285 bp-Fragment wird in die EcoRI-Erkennungsstelle
von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGH1 isoliert, in dem
die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz hin
und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind.
Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene EcoRI-Erkennungsstelle
wird durch teilweise EcoRI-Verdauung
zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI-Enden
mit DNA-Polymerase I repariert und das Plasmid durch stumpfendige
Verbindung wieder in Ringform gebracht. Das resultierende
Plasmid, pGH6, enthält eine einzige EcoRI-Erkennungsstelle,
die passend liegt im Hinblick auf das
Promoter-System, in das das komplette Gen für HGH eingebaut
werden kann.
Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem
RNA-Transkript fertigzustellen, werden 10 µg von pHGH3
mit EcoRI- und HaeIII-Restriktionsendonucleasen geschnitten
und das 77 Basenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen
für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird
aus einem 8%igen Polyacrylamid-Gel isoliert.
Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 (5 µg) mit HaeIII
geschnitten. Die 551 bp HGH-Sequenz und ein mitgewandertes
540 bp HaeIII-Fragment von pBR322 werden durch Gel-Elektrophorese
gereinigt. Eine anschließende Behandlung
mit XmaI schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare
von der 3′-nichtcodierenden Region entfernt werden. Das
resultierende 512 bp-Fragment wird von dem 540 bp pBR322-HaeIII-Stück
durch Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel
getrennt. 0,3 µg des 77 bp EcoRI-HaeIII-Fragments
werden mit T4-Ligase in einer 16 µl Reaktion
14 Stunden lang bei 4°C polymerisiert. Die Mischung wird
dann für 5 Minuten (5′) auf 70°C erhitzt, um die Ligase
zu inaktivieren, anschließend mit EcoRI behandelt (um
Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer EcoRI-Erkennungsstellen
dimerisiert haben), weiterhin mit SmaI behandelt
(um XmaI-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591 bp-Fragment
mit einem EcoRI-Ende, das cohäsiv ist, und einem SmaI-Ende,
das stumpf ist, erhalten wird. Nach der Reinigung auf einem
6%igen Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses
Fragments. Es sollte bemerkt werden, daß das Expressionsplasmid
pGH6 keine XmaI-Erkennungsstelle enthält. SmaI erkennt
jedoch die gleiche Erkennungsstelle wie XmaI, aber
schneidet genau durch die Mitte, so daß stumpfe Enden erhalten
werden. Das Sma-geschnittene Ende des Fragments,
das von gHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig
an pGH6 gebunden werden.
Das Expressionsplasmid pGH6 kann verwendet werden, um die
591 bp HGH-DNA zu clonieren. Dazu wird das Plasmid, das
den lac-UV5-Promoter in Tandemform enthält, sukzessive mit
HindIII, Nuclease S1 und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese
gereinigt. 50 ng des resultierenden Vektors, der ein cohäsives EcoRI-Ende
und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der
591 bp HGH-DNA verbunden. Diese Verbindungsmischung wird
verwendet, um E. coli x1776 zu transformieren. Die Kolonien
werden durch Wachstum auf Tetracyclin (12,5 µg/ml) selektiert.
Es ist bemerkenswert, daß die Insertion des hybriden
HGH-Gens in pGH6 den Promoter für die Tetracyclin-Resistenz
zerstört, daß jedoch der Tandem-lac-Promoter das Durchlesen
der Strukturgene für Tetracyclin-Resistenz erlaubt und auf
diese Weise die Selektionscharakteristik erhalten bleibt.
Es wurden annähernd 400 Transformanten erhalten. Mit der
Grunstein-Hogness-Methode, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72,
3961 (1975), wurden durch Filterhybridisierung 12 Kolonien
identifiziert, die die HGH-Sequenz enthalten. Die aus drei
dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben das erwartete
Restriktionsmuster, wenn sie mit HaeIII, PvuII und PstI geschnitten
wurden. Von einem Clon, pHGH107, wurde die DNA-Sequenz
bestimmt.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorliegende
Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte
Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschließlich
auf den Schutzbereich der Patentansprüche. Andere Abänderungen
als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die
Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, des angestrebten
Polypeptidprodukts oder sonstigem. Andere, für
die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme
bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem
Arabinose-Operon (phi80 dara) oder dem Colicin-E1-, Galactose-,
alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Promoter. Wirtsorganismen
für die bakterielle Expression können ausgewählt
werden beispielsweise aus der Familie der Enterobacteriaceae,
z. B. die Stämme Escherichia coli und Salmonella; aus der
Familie der Bacillaceae, z. B. Bacillus subtilis; weiterhin
Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae.
Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der
physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression
beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien
für rekombinante DNA des National Institutes of Health,
43 Fed. Reg. 60, 080 (1978) durchgeführt werden sollen.
Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung im Labormaßstab
eignet sich der Stamm E. coli x1776 besonders gut; es
könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung
im großen Maßstab der Stamm weniger geeignet ist,
und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich
aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden.
Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung,
eher als biologischer, können für die Arbeit
im großen Maßstab auch solche Organismen wie E. coli K-12
Stamm 294, a.a.O., und E. coli Stamm RR1, Genotyp: Pro-Leu-
Thi-RB-recA⁺Strr Lac y- verwendet werden. E. coli RR1 wurde
durch Paarung aus dem Stamm E. coli HB101 (H. W. Boyer et al.,
J. Mol.Bio. (1969) 41 459-472) mit dem Stamm E. coli K-12,
Stamm KL16 als Hfr-Donor erhalten. Siehe auch J. H. Miller,
Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor,
New York, 1972). Eine Kultur von E. coli RR1 wurde am
30. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection
ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der
Nummer ATCC 31343 hinterlegt. Auf ähnliche Weise wurde eine
Kultur von x1776 am 3. Juli 1979 bei der American Type
Culture Collection unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt.
Am 3. Juli 1979 wurden bei der American Type Culture
Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pGH6 (ATCC 40012); E. coli
K12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATCC 31539).
Claims (2)
1. Ein Plasmid für die Expression, das Funktionsgene für
Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält, sowie einen
lac-Promoter in Tandem-Struktur, der zwischen den
genannten Genen liegt und so orientiert ist, daß er die
Expression in Richtung des Gens für Tetracyclinresistenz
in Gang setzt, das ferner eine Mehrzahl von Restriktionserkennungsstellen
enthält, die stromabwärts vom genannten
Promoter-System liegen, die jeweils cohäsive und
stumpfe Enden nach dem Schneiden liefern, wodurch richtiges
Einfügen von heterologer DNA zwischen den genannten
Erkennungsstellen ermöglicht wird, so daß diese unter
die Kontrolle des genannten Promoter-Systems gelangt.
2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
es folgendes Plasmid ist:
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