DD210466A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten plasmids - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids, das sich als Klonierungstraeger zur Expression wenigstens eines Polypeptids in einem transformierten Bakterienwirt verwenden laesst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine erste DNA-Sequenz, die fuer wenigstens ein funktionelles Fragment codiert, das von einem Proteingen aus der aeusseren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums stammt, in Lesephase verknuepft mit (a) einer zweiten DNA-Sequenz, die fuer einen induzierbaren Promotor codiert, und (b) einer dritten DNA-Sequenz, die fuer eine Aminosaeuresequenz des obigen wenigstens einen Polypeptids codiert, oder einer Insertationsstelle, d. in Lesephase mit einem Translationscodon verknuepft und zur Aufnahme dieser dritten DNA-Sequenz befaehigt ist, und mit einer vierten DNA-Sequenz, die fuer die Aminosaeuresequenz eines Repressorproteins codiert, das zu einer Bindung an das induzierbare Promotorsignal unter selektiver Verhinderung einer Transkription befaehigt ist.

Description

Aktenzeichen: AP C 12 N/250 915/8

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids, das sich als Klonierungsträger zur Expression wenigstens eines Polypeptids in einem transformierten Bakterienwirt verwenden läßt.

Die erfindungsgemäß erhältlichen rekombinanten Plasmide bestehen aus einer ersten DNA-Sequenz, die für wenigstens ein funktionelles Fragment codiert, das von einem Proteingen., aus der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums stammt, wobei diese erste DNA-Sequenz in Lesephase verknüpft ist mit

(a) einer zweiten DNA-Sequenz, die für ein induzierbares Promotorsignal codiert, und

(b) einer dritten DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz des obigen wenigstens einen Polypeptids codiert, oder

einer Insertionsstelle, die in Lesephase, mit einem Translationscodon verknüpft und zur Aufnahme dieser dritten DMA-Sequenz befähigt ist, und mit einer vierten DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz eines Repressorproteins codiert, das zu einer Bindung an das induzierbare Promotorsignal unter selektiver

* Verhinderung einer Transkription befähigt ist.

Diese rekombinanten Plasmide werden erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man eine erste DNA-Sequenz, die ° für wenigstens ein funktionell es Fragment codiert, das von einem Proteingen aus der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums stammt, in Lesephase verknüpft mit (a) einer zweiten DNA-Sequenz, die für ein induzierbares Promotorsignal codiert und

(b) einer dritten DNA-Sequenz, die für die Aminosäurese- quenz des obigen wenigstens einen Polypeptids codiert, oder

einer Insertionsstelle, die in Lesephase mit einem Translationscodon verknüpft und zur Aufnahme dieser dritten DNA-Sequenz befähigt ist, und mit einer vierten DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz eines Repressorproteins codiert, das zu einer Bindung an das induzierbare Promotorsignal unter selektiver Verhinderung ein.e,r Transkription befähigt - ist.

. . .

Eine genetische Information ist bekanntlich auf Molekülen (Genen) doppeIsträngiger Desoxyribonucleinsäure (DNA) gemäß der Sequenz eincodiert, in welcher der DNA-Codierungsstrang die charakteristischen Basen seiner sich wiederho- !enden Nucleotidkomponenten präsentiert. Die vier stick- stoffhaltigen Basen, die die beiden Stränge von DNA-Nucleotiden charakterisieren, sind, über wasserstoffbrücken so verknüpfte komplementäre Paare, daß hierdurch die Doppelheli.x von DNA gebildet wird, wobei Adenin (A) mit. Thymin

(T) verknüpft ist und Guanin (G) mit Cytosin (C) verknüpft ist. Eine Expression der eincodierten Information beinhaltet einen aus zwei Teilen bestehenden Prozeß. Unter dem Einfluß bestimmter Steuerregionen im Gen kann ein Enzym '(RNA-Po lymerase) veranlaßt werden, sich längs des DNA-Codierungsstrangs zu bewegen, wodurch bei einem Transkription genannten Prozeß Messenger-Ribonucleinsäure (rnRNA) synthetisiert wird. Der'DNA-Codierungsstrang enthält für

-j

RNA-Polymerase erkennbare Signale für sowohl eine Initiation als auch eine Termination der Transkription. In einer anschließenden Translationsstufe überführen die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit Transfer-RNA die RNA-Botschaft in Proteine oder Polypeptide, die die Zellforin und Zellfunktion bestimmen. Die durch mRNA von DNA transkribierte Information beinhaltet auch Signale für die Initiation und Termination einer ribosomalen Translation

' sowie Signale, die die Identität und Sequenz der Aminosäuren spezifizieren, aus denen das Polypeptid besteht.

Der DNA-Codierungsstrang enthalt lange Sequenzen aus Nucleotidtripletts, die Codone genannt werden, bei denen die charakteristischen .Basen der Nucleotide in jedem,Triplett oder Codon spezifische Bits an Information eincodieren. So ergeben beispielsweise drei als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) gelesene Nucleotide ein mRNA-Signal, welches als Translationsstart interpretiert wird, während Terminationscodone TAG, TAA und TGA als Translationsstop inter- . pretiert werden. Zwischen dem Initiationscodon und dem Terminationscodon liegt das sogenannte Strukturgen, dessen Codone die schließlich translatierte Aminosäuresequenz delinieren ♦ Diese Definition läuft nach dem wohlbekannten genetischen Code ab (siehe beispielsweise Molecular Biology of the Gene, 3. Auflage von J.D. Watson, New York, W.A. Benjamin,- Inc., 1976), der die Codone für die verschiedenen Aminosäuren festlegt. Ss gibt 6 4 mögliche Codonsequenzen, jedoch nur 20 bekannte' Aminosäuren, und der genetische Code ist daher in dem Sinn degeneriert, daß verschiedene Codone die gleiche Aminosäure ergeben können. Der Code ist jedoch dadurch genau, daß es für jede Aminosäure wenigstens ein Codon gibt und daß jedes Codon zu einer einzigen Aminosäure und keiner anderen Aminosäure führt. So codieren beispielsweise alle Codone TTT, TTC, TTA und TTG, wenn sie als solche gelesen werden, für Serin und keine sonstige Aminosäure. Selbstverständlich muß während der Translation die geeignete Lesephase oder

^ou der geeignete Leserahmen beibehalten werden, damit sich im schließlich gebildeten Polypeptid die richtige AminoDie DNA-Sequenz in.der Steuerregion des Gens, das die Ini- ° tiationder Transkription vermittelt., wird als Promotor des Gens bezeichnet, während das spezifische Signal, das in die nach dem Strukturgen, an dem die Transkription endet, in die DNA eincodiert ist, als Transkriptionstermina-

tionsstelle bezeichnet wird. Die Mechanismen, auf denen die Initiation und Termination der Transkription beruhen, sind noch nicht völlig klar. Es wird jedoch angenommen, daß der Promotor für die Stelle sorgt, an die sich die RNA-Polymerase binden muß, damit eine Transkription initiiert wird, und daß die Wirksamkeit oder Stärke eines bestimmten Promotorsignals oder Terminatorsignals bestimmt wird von der Effizienz, mit welcher die RNA-Polymerase diese Signale erkennen und in Wechselwirkung treten kann. ]Q Dies ist wiederum großteils abhängig von der besonderen Basensequenz der DNA an diesen oder in der Nähe dieser Stellen, wozu beispielsweise auf Ann. Rev. Genet. 13, 1979, 319 bis 353 hingewiesen wird.'

]5 Die Steue.rregionen einiger Gene können auch DNA-Sequenzen beinhalten, die durch bestimmte Effektormoleküle erkannt werden können, deren Wirkung die Wechselwirkung zwischen RNÄ-Polymerase und DMA positiv oder negativ beeinflussen kann, so daß es hierdurch zu einer weiteren' Regulierung einer Genexpression bei der Stufe der Transkription kommen kann. Die Expression der genetischen Information durch solche Gene kann beispielsweise in Abwesenheit einer bestimmten Substanz inhibiert sein, so daß man von einer induzierbaren Expression spricht. Andererseits kann es auch Gene geben, wie beispielsweise das Lipoproteingen des gramnegativen Bakteriuuis Escherichia coli /E. coli/, dessen Steuerregionen von Effektormolekülen nicht beeinflußt werden. Bei solchen Genen hält die Expression der genetischen Information kontinuierlich während der Lebensdauer der Zelle an, so daß sie als !-constitutive Expression bezeichnet wird. Die Steuerregionen solcher Gene bestehen im allgemeinen nur aus einem Promotorsignal und einem Terminatorsignal, die der zu transkribierenden DNA-Sequenz unmittelbar vorangehen oder folgen.

. .

Die Steuerregionen sorgen dafür, daß die mRNA-Synthese an einer Transkriptionsinitiationsstelle beginnt, die am oder in der Nähe des Promotors liegt, und daß diese Syn-

these bis zum Erreichen der Transkriptionsterminationsstelle weiterläuft, so daß ein mRNA-Molekül vorbestimmter Länge mit einer Basensequenz gebildet wird, die zur Basensequenz der transkribierten DNA komplementär ist. Die DNA-Sequenz zwischen diesen beiden Punkten definiert nicht nur das Strukturgen, dessen Codone zur Polypeptidexpression schließlich trans1atiert werden, sondern auch eine untranslatierte Region an'einer der beiden Seiten-des Strukturgens.

Eine' Transkription führt daher normalerweise zu einem mRNÄ-Molekül·, das eine translatierbare RNA-Sequenz trägt, die zwischen zwei untranslatierten Regionen liegt. Die untranslatierte Region, die sich vor der Struktursequenz befindet, wird als die 5'-untranslatierte Region bezeichnet, während man die Region,- die nach' den Struktursignal'.en folgt, als die 3 '-untranslatierte Region bezeichnet. Wie im folgenden im einzelnen beschrieben wird, lassen sich zur Erzeugung der neuen erfindungsgemäßen Klonierungsträger mit .Erfolg sowohl die DNA-Codierungssequan-' zen für beide dieser untranslatierten Regionen als'auch die DNA-Codierungssequenzen verwenden, die das Promotorsignal und das Terminatorsignal bestimmter Gene beinhalten, und all diese Sequenzen können hierin einzeln oder kollektiv als funktionalIe Fragmente solcher Gene bezeichnet werden.

Unter einem Kloniarungsträger wird vorliegend ein nichtchromosomales doppelsträngiges DMA-Molekül in Plasmidform verstanden, das nach Einbau in einen einzelligen Organismus durch einen als Transformation bezeichneten Prozeß repliziert werden kann. Ein so transformierter Organismus wird als Transformant bezeichnet. Für die vorliegenden Zwecke ist ein Plasmid ein- ringförmiges nichtchromosomales doppelsträngiges DNA-Molekül, das von Viren oder Bakterien abgeleitet ist, wobei letzteres als bakterielles Plasmid bezeichnet wird-

Die in den letzten Jahren in der Biochemie erzielten Fortschritte haben zur Konstruktion rekombinanter Klonierungsträger geführt, wodurch beispielsweise Plasmide gebildet werden, die exogene DNA enthalten. In besonderen Fällen kann ein rekombinantes Plasmid auch eine DNA enthalten, die für Polypeptide codiert, welche gewöhnlich von dem Organismus nicht gebildet werden, der einer Transformation durch das rekombinante Plasmid zugänglich ist, und die exogene DNA kann in einigen Fällen auch ein humanes genetisches Material enthalten. Plasmide werden typischerweise unter Bildung linearer DNA gespalten, die über legierbare Enden verfügt. Diese Enden werden an ein exogenes Gen mit legierbaren Enden gebunden, wodurch man ein biologisch funktionelles Bruchstück mit einer gewünschten phenotypisehen Eigenschaft erhält. Das rekombinante Bruchstück wird durch Transformation in einen Mikroorganismus inseriert, wobei Transformanten mit dem Ziel isoliert und kloniert werden,um auf diese Weise zu größeren Populationen zu gelangen, die zu einer Expression der neuen genetischen Information befähigt sind. Die Methoden und Mittel zur Bildung rekombinanter Klonierungsträger und zur Transformierung von Organismen mit diesen Klonierungsträgern sind in der Literatur ausführlich beschrieben, und allgemeine Erörterungen hierüber sind zu finden in Scientific American 233, 24 bis 3 3 (1975) und in Scientific American 242, 7 4 bis 94 (1980) ..

Für eine DNA-Rekombination gibt es eine Reihe von Techniken, und hiernach werden benachbarte Enden getrennter DNA-Fragments so zurechtgemacht, daß hierdurch eine Ligation erleichtert wird. Hierunter wird die Ausbildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen benachbarten Nucleotiden durch Vermittlung über ein katalytisches Enzym, wie T4-DMA-Ligase, verstanden. Auf diese Weise lassen sich DNA-Fragmente mit Blunt-Enden direkt ligieren. Wahlweise werden Fragmente, die komplementäre Einzel stränge an ihren aneinanderliegenden Enden enthalten, auch durch Wasserstoffbrücken verbunden, die die jeweiligen Enden für eine

anschließende Ligation festlegen. Solche Einzelstränge, die als kohäsive Enden bezeichnet werden, können durch Addition von Nucleotiden an Blunt-Enden unter Verwendungeiner Terminal transferase gebildet werden, oder sie lassen sich gelegentlich auch einfach durch sogenanntes Chewing-Back eines Strangs eines Blunt.-Endes mit einem Enzym, wie X.-Exonuclease, bilden. Gewöhnlich werden solche Einzelstränge jedoch durch Restriktionsendonucleasen gebildet,-die auch als Restriktionsenzyme bezeichnet werden, weiehe die Phosphodiesterbindungen in und um seltene Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren spalten. Es gibt eine Reihe bekannter Restriktionsendonucleasen und entsprechender Erkennungssequenzen, wobei die sogenannte Eco RI-Endonuclease eine' der am haufigsten verwendeten Sndgnuclease.n ist.

Restriktionsendonucleasen, die dcppelsträngige DNA an'seltenen Sequenzen spalten, beispielsweise an rotationssymmetrischen Palindromen,können kohäsive Enden übriglassen.

Hierdurch kann ein Plasmid oder ein sonstiger Kloniarungsträger unter Übriglassen von Enden gespalten werden, die jeweils aus einer Hälfte der Restrikticnsendonuclease-Er-· kennungsstelIe bestehen. Ein mit der gleichen Restriktionsendonuclease erhaltenes Spaltprodukt einer exogenen DNA verfügt über Enden, die zu denen der Plasmidenden komplementär sind. Wahlweise kann auch synthetische DNA, die kohäsive Enden enthält, in den gespaltenen Träger inseriert .werden. Zur Unterbindung einer Wiedervereinigung der kohäsiven Enden des Trägers während einer Insertion exogener DNA kann man die Enden mit alkalischer Phosphatase verdauen, wodurch sich eine Molekularselektion für eine Sperre zur Einverleibung des exogenen Fragments ergibt. Eine Einverleibung eines Fragments in der geeigneten Orientierung in bezug auf andere Aspekte des Trägers läßt sich verbessern, wenn das Fragment Träger-DNA verdrängt, die von zwei verschiedenen Restrikticnsendonucleasen herausgeschnitten wird, und' wenn-das Fragment selbst Enden enthält, die jeweils eine Hälfte der Erkennungssequenz der gleichen

- 9 zwei verschiedenen Endonucleasen darstellen.

Infolge weitreichender Arbeiten auf dem Gebiet der rekombinanten DNA in den letzten Jahren gibt es bereits eine Reihe erfolgreicher und technisch brauchbarer Wege zur Expression funktioneller Polypeptidprodukte, wie Insulin, Somatostatin, Humanwachstumshormon und Tierwachstumshormon. Die vorliegende.Erfindung bezieht sich nun auf eine Verbesserung eines dieser Wege.

Demnach wurde eine Klasse rskombinanter bakterieller Plasmidklonierungsträger zur Expression exogener Gene in transformierten Bakterienwirten gefunden, die ein inseriertes DNA-Fragment enthalten, das für das gewünschte Polypeptid codiert, welches in Lesephase mit einem oder mehreren funktioneilen Fragmenten verknüpft ist, das von einem Proteingen aus der äußeren Zellmembran irgendeines gramnegativen Bakteriums stammt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform codiert die exogene DNA für Säugetierhormone, Enzyme oder immunogene Proteine oder Zwischenprodukte hierfür, wobei die funktioneilen Fragmente vom Lipoproteingen von Escherichia ccii abgeleitet sind und das gewünschte Polypeptid in Transformanten von Escherichia coli exprimiert wird. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist. die für das gewünschte Protein codierende DNA-. Sequenz mit vier speziellen funktioneilen Fragmenten verknüpft und wird in Verbindung damit exprimiert, wobei diese Fragmente mit dem Lipoproteingen von Escherichia coli in Verbindung stehen, nämlich dem Promotor, der 5'-untranslatierten Region, der 3'-untranslatierten Region und der Transkriptionsterminationsstelle dieses Gens.

Diese Expressionsplasmide können ferner auch einen zweiten Promotor enthalten, nämlich vorzugsweise einen induzierbaren Promotor und insbesondere die ß-Galactosidase von Escherichia coli oder den lac-Promotor, die unmittelbar nach dem Lipoproteinpromocor inseriert ist, so daß die exogene DNA nur in Anwesenheit eines Lactoseinduktors ex-

-ιοί primiert wird. Bei Induktion wird die für das gewünschte Polypeptid codierende DNA von beiden Promotoren transkribiert/ wodurch sich die Ausbeute des gewünschten Produkts erhöht. Hierdurch kann man somit sowohl konstitutive als auch induzierbare Genexpressionen erreichen.

Bei den induzierbaren Klonierungsträgern werden als Trans-.formanten jedoch vorzugsweise spezielle Stämme von.Escherichia coli verwendet, nämlich vor allem solche Stämme, die das Lactoserepressorrnolekül überproduzieren können. Bei der Wildtypzelle von Escherichia coli werden lediglich etwa 10 Kopien des Lactoserepressormolekuls. zu jeder Zeit in der Zelle gehalten, und dies ist gerade ausreichend für eine.Repression, nämlich eine Hemmung der Expression, des einen lacZ-Gens, das normalerweise in der Zelle enthalten ist. Nicht ausreichend ist dies dagegen zur Blockierung der Expression der exogenen DNA, die in ein induzierbares Expressionsplasmid kloniert ist, da zu einer bestimmten Zeit in jeder Zelle 10 bis' 20 Kopien des Klonierungsträgers vorhanden sein können, von denen jeder einen aktiven lac-Promotor enthält. Es- sind daher wesentlich größere Mengen an Lactoserepressor erforderlich, und aus diesem Grund ist der zur Transformation verwendete Stamm vorzugsweise ein spezieller Stamm von Escherichia coli, nämlich ein Stamm JA221/F', lad*' Iac' pro', der' das !iiutante Gen .lad" trägt. Das Gen lad" ist eine Mutante von lad, nämlich dem normalen Gen, das für den Lactoserepressor codiert. Das mutants Gen überproduziert den Lactoserepressor, so daß zu jeder bestimmten Zeit für etwa 100 bis 150 Moleküle pro Zelle gesorgt ist. Das Gen lad wird auf dem Plasmid F-Prim in diesem Stamm von Escherichia coli getragen.

Die Tatsache, daß nach diesem Weg eine Expression des gewünschten Polypeptide in Transformanten erforderlich ist, die das Plasmid F-Prim enthalten, gibt Anlaß zu bestimmten Nachteilen. Der erste dieser Nachteile besteht darin, daß die Klasse der Rezipienten für die induzierbaren Exnres-

sionsplasmide zwangsläufig auf diejenigen Stämme von Escherichia coli beschränkt ist, die das Gen lad" tragen, da Stämme ohne dieses Gen nicht genügend Lactoserepressor produzieren und somit ständig das gewünschte Expressionsprodukt bilden würden.

Der zweite Nachteil besteht darin, daß das Plasmid F-Prim ein Sexfaktor ist, der die Zellen von Escherichia coli zu einer Konjugierung veranlaßt, so daß es zu einem Transfer des Plasmids F-Prim von einer Zelle zur anderen kommt.

Stämme von Escherichia coli, die diesen Faktor enthalten, lassen sich nur schwer für eine eukaryotische Genklonierung verwenden, was die Brauchbarkeit dieses Wegs noch

weiter verringert

15

Ein weiterer Nachteil ergibt sich schließlich dadurch, daß normalerweise zwei oder drei Kopien des Plasmids F-Prim in einer Zelle vorhanden sind, von denen jede etwa 100 bis 150 Lactoserepressormoleküle enthält, und daß jede Zelle auch noch 10 bis 20 Kopien eines der induzierbaren Expressionsplasmide enthält, von denen jedes einen funktioneilen lac-Promotor trägt, so daß das Verhältnis aus Repressormolekülen und lac-Promotoren von Zelle zu Zelle stark schwankt und in einigen Fällen keine vollständige

" Repression des gewünschten Expressionsprodukts erreicht wird-. . '

Aufgabe der Erfindung ist daher auch die Schaffung einer

neuen Klasse von Plasmid-Klonierungsträgern, durch die on

sich diese Nachteile überwinden lassen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Konstruktion einer neuen Klasse rekombinanter bakterieller Plasmid-Klonierungsträger für eine Expression exogener Gene

in transformierten Bakterienwirten, wobei jedes Plasmid ein inseriertes DNA-Fragment enthält, das für das gewünschte Polypeptid codiert und das mit einem oder mehreren funktionellen Fragmenten verknüpft isc, die von einem Pro-

] teingen aus der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums stammen, und das ferner auch in Lesephase mit einem induzierbaren Promotorfragment verknüpft ist. Jedes Plasmid enthält weiter auch noch eine DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, das zu einer Bindung mit dem induzierbaren Promotorfragment und hierdurch zu einer Repression einer Transkription aus-diesem Fragment befähigt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stammen die funktioneilen Fragmente vom Lipoproteingen von Escherichia coli, ist das induzierbare Promotorfragment der lac-Promotor von Escherichia coli, enthält die DNA-Sequenz für den Repressor ein intaktes funktionelles lac-Gen von Escherichia coli und wird das gewünschte Polypeptid in Tranform'anten von Escherichia coli exprimiert.

Es sind drei Unterklassen von Plasmiden konstruiert worden, und die Vertreter einer jeden Unterklasse enthalten eine von drei alternativen Insertionsstellen. Hierbei kann die Selektion eines bestimmten Plasmids oder einer bestimmten Unterklasse von Plasmiden zur Genexpression die schließliche Stellung beeinflussen, an der das Expressions- produkt gefunden und gesammelt werden kann. Unter verwendung einer dieser Insertionsstellen kann das gewünschte Polypeptid beispielsweise mit einer Leadersequenz exprimiert werden, die am Stickstoffende liegt, welches das Signalpeptid des,Lipoproteins von Escherichia coli enthält, so daß das gewünschte Produkt durch die Cytoplasmamembran abgeschieden und das Signalpeptid in vivo durch für den Trans formanten native Prozesse abgetrennt werden kann, wodurch man zum exogenen Genprodukt gelangt. Unter Gebrauch der einen der beiden verbleibenden Insertionsstellen ist zu erwarten, daß das Expressionsprodukt entweder im Cytoplasma' der Zelle oder in der Zellwand zu finden ist. .

. . ' ·

Die Plasmide einer jeden Unterklasse teilen zwar eine gemeinsame Insertionsstelle, unterscheiden sich voneinander jedoch in ihren einzelnen Leserahmen. Jede Unterklasse

Ί enthält demnach drei Plasmide, deren Leserahmen sich im Effekt durch ein Basenpaar unterscheiden, wodurch die Selektion irgendeines gewünschten Leserahmens für jede Insertionsstelle ermöglicht wird, was die Anwendung der vorliegenden Erfindung mit einer breiten Vielfalt an DNA-Fragmenten erleichtert, ohne die Notwendigkeit irgendeiner direkten Abwandlung der Leserahmen dieser Fragmente.

Die exogene DNA, die für das gewünschte Polypeptid eodiert, wird'in den erfindungsgemäßen Plasmiden nur in Anwesenheit eines Lactoseinduktors exprimiert. In Abwesenheit eines Lactoseinduktors wird die Transkription des klonierten Gens dagegen vollständig reprimiert, da in jeder Kopie des Expressionsplasmids, das in der'Wirtszelle existiert, ein Gen lad anwesend ist. Eine induzierbare Genexpression läßt sich daher unter Einsatz der Klonie- rungsträger erreichen, auf die sich die'vorliegende Erfindung bezieht, ohne die Notwendigkeit eines Gebrauchs von Transformanten, die den Faktor von" F-Prim tragen. Die Expression der genetischen Information wird bei den erf'in-. dungsgemäßen Klonierungsträgern vom Inneren eines jeden Plasmids aus gesteuert, so daß diese Genexpression als autoreguliert bezeichnet wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung weiter beschrieben.

Struktur und Funktion der erfindungsgemäßen rekombinanten Bakter ienplasmide, mit denen sich in· Bakterientransf orir.an- ^ ten Genprodukte exprimieren lassen, wie Humaninsulin, werden in der folgenden Beschreibung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung erläutert. In dieser Zeichnung zeigen:

°~ Fig. 1 eine schematische Darstellung der 814 Basen- '.

paar-DNA-Sequenz für das Lipoproteingsn von Escherichia coii, worin die Transkriptionsinitiationsstellen und die Transkriptionstermina-

tionsstellen durch Pfeile (A) gekennzeichnet

sind, und worin die aus 7 8 Aminosäuren bestehende Sequenz des von der DNA-Sequenz abgeleiteten Prolipoproteins ebenfalls gezeigt ist und . 5 . ' unterhalb der entsprechenden Codone des DNA-Co

dierungsstrangs eingezeichnet ist;

Fig. 2 die vollständige und aus 322 Nucleotiden bestehende Sequenz der Lipoprotein-mRNA von Escheri-

10. chia coli, worin auch die von der mRNA-Sequenz

abgeleitete Aminosäuresequenz des Prolipoproteins angegeben und unterhalb der entsprechenden Codone der Nucleotidsequenz eingezeichnet ist; ' , . ·

Fig. 3 die vorgeschlagene Sekundärstruktur der Lipoprotein-mRNA von Escherichia coli, in welche das Translationsinitiationscodon eingeschlossen ist; ^; .

. '

Fig. 4 eine schematische Darstellung-des Prozesses, durch den ein eukaryotisches Protein oder ein sonstiges gewünschtes Polypeptid unter Gebrauch der erfindungsgemäßen Klonierungsträger exprimie'rt werden kann, wobei die Transkrip-

tionsinitiationsstellen und die Transkriptionsterminationsstellen durch Pfeile (A) gekennzeichnet sind und die Trans 1ationsinitiationsstellen und die/Terminationsinitiationsstellen durch Pfeile (Δ) bezeichnet sind;

Fig. 5 bis 27 zusammen eine schematische Ansicht der bevorzugten Methode zur Konstruktion der rekombinantan· Plasmid-Klonierungsträger, wobei die . relativen Stellunaen verschiedener Restriktions-

endonuclease-Spaltstelien gezeigt sind und mit Amp und Tc¹" Gene für eine Ampicillinresistenz und eine Tetracyclinresistenz angegeben sind;

und

Fig. 28 und 29 zusammen eine schematische Darstellung der bevorzugten Methode zur Modifikation eines der Plasmide, dessen Konstruktion in den Fig. 5 bis 27 gezeigt ist, unter Bildung des

entsprechenden erfindungsgemäßen Plasmids. .

Beste Art der Durchführung der Erfindung 1. Zusammenfassung vorläufiger Forschungsergebnisse

Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß die überwiegenden Proteine der äußeren Zellmembran gramnegativer Bakterien in ziemlich großen Mengen als eine Klasse in jeder Bakterienzelle vorhanden sind. So wurde beispielsweise festgestellt, daß das Lipoprotein von Escherichia coli, bei dem es sich um das am eingehendsten untersuchte Membranprotein handelt, auch das häufigste Protein, in der Zelle in bezug auf die Moleküianzahl ist, da es etwa 700 000 bis 750. 000 Lipoproteinmoleküle pro Zelle, gibt. Da ferner gezeigt worden ist, daß es für das Lipoprotein von Escherichia coli nur ein Strukturgen gibt, ist' klar, daß die Maschinerie zur Expression des Lipoproteingens sowohl bei der Transkription als auch der Translation äußerst effizient ist. Das Lipoproteingen dürfte wenigstens zehnmal effizienter exprimiert werden als die Gene für die Ribosomenproteine. Die Anwesenheit vergleichbarer Mengen anderer überwiegender Proteine der äußeren Zellmembran in Escherichia CoIi₇ wie des ompA-Proteins, und die Anwesenheit vergleichbarer Mengen der überwiegenden Proteine der äußeren Zellmembran bei anderen gramnegativen Bakterien, wie des Lipoproteins von Serratia marcescens, zeigen, daß diese Systeme ebenfalls über eine sehr effiziente Maschinerie zur Genexpression verfügen. Die hierin gemachten Ausführungen beziehen sich zwar großteils auf das Lipoproteinsystem in Escherichia coli, doch erstreckt sich die Erfindung selbstverständlich auch auf rekombinante Klonierungsvektoren, die von der Maschineria für eine

Genexpression Gebrauch machen, die mit irgendeinem der Proteingene der äußeren Zellmembran irgendeines gramnegativen Bakteriums verbunden ist.

Die Mechanismen, die.für die äußerst effiziente Expression des Lipoproteingens von Escherichia coli verantwortlich sind, sind zwar bisher noch nicht vollständig klar, doch wird angenommen, daß zur Abundanz von Lipoproteinmolekülen in einer Bakterienzelle mehrere Faktoren beitragen müssen. Der Fig. 1 zufolge ist die DNA-Mucleotidsequenz des Lipoproteingens von Escherichia coli vor kurzem bestimmt worden, und ihre Analyse hat manche seltene Eigenschaften ergeben, die mit der Expression dieses Gens assoziiert sind.- . · '

Vor allem ist gefunden worden, daß die Lipoproteinpromotorregion im Vergleich zu anderen bekannten Promotorsequenzen von Genen von Sscherichia coli ein höchst verblüffendes Merkmal aufweist, nämlich einen äußerst hohen A-T-Gehalt, der für eine äußerst effiziente Transkription des Lipoproteingens wesentlich sein dürfte. Das Segment aus den 261 Basenpaaren'(bp), das der Transkriptionsinitiationsstelle vorangeht (Stellung -261 bis Stellung -1 gemäß Fig.¹ 1), verfügt über einen sehr hohen A.-T-Gehalt' von 70%, was im Gegensatz steht zu den 53 % für die transkribierte Region oder die mRNA-Region) der 322 Basenpaare (Stellungen +1 bis +322), den 44 % für ein Segment der 126 bp nach der TranskriptionsterminationsstelIe (Stellungen +323 bis +449) und den 49 % für den mittleren A-T-Gehalt des Chromosoms von Escherichia coli. Der A-T-Genalt des Segments von der Stellung -45 bis zur Stellung -I, innerhalb derer" die Nucleotidsequenz des Lipoprotsinpromo-, tors (lpp) zu liegen scheint, ist außergewöhnlich hoch (80 %) und scheint der höchste Gehalt unter den bisher sequenzierten Promotorregionen von Escherichia coli zu sein. Der Ä-T-Reichtum der Promotorsequenz dürfte die Helixstruktur der DNA destabilisieren und hierdurch die durch RNA-Polymerase vermittelte S.trangentspiralisierung

erleichtern, die für die Initiation einer Transkription notwendig ist.

Abgesehen von seinem A-T-Gehalt scheint der lpp-Promotor auch eine Hepanucleotidsequenz an den Stellungen -15 bis -9 (lediglich acht Basenpaare distal zur Transkriptionsinitiationsstelle) zu enthalten, die homolog ist zur generalisierten Pribnow-Box, wobei ferner auch eine Dodecanucleotidsequenz an den Stellungen -38 bis -27 vorhanden sein dürfte, die homolog ist zur generalisierten RNA-PoIymeräseerkennungsstelle. Die Homologie dieser Sequenzen, ist überraschend, da die Sequenz, der Pribnow-Box des lpp-Promotors nur eine Base hat, die mit der generalisierten Sequenz nicht zusammenpaßt, während die Sequenz der Erkennungsstelle nur mit fünf von zwölf Basen der generalisierten Sequenz nicht zusammenpaßt. Die Bedeutung, die diese spezifischen Basensequenzen an diesen Stellen für eine effiziente Transkription haben, ist wohl dokumentiert, da Mutanten mit verbesserter Promotoreffizienz eine erhöhte Homologie dieser Regionen mit den generalisierten Sequenzen zeigen.

Eine weitere Analyse der DNA-Sequenz von Fig. 1 hat gezeigt, daß das Lipoproteingen neben einem äußerst starken Promotor auch ein Oligo-T-Transkriptionsterminationssignal aufweist, das sich zwischen den Stellungen +316 und +322· befindet und wenigstens genau so effizient ist wie alle anderen bisher untersuchten Transkriptionsterrninationssteilen von Sscherichia coli. Es wird angenommen, daß dieser Faktor zur Gesamteffizienz der Transkription beiträgt, indem er die Geschwindigkeit der mRNA-Produktion erhöht und die Größe des mP-.NA-Moleküis begrenzt, das von der DNA tranDer Fig. 2 zufolge ist auch die vollständige Nucleotidsequenz der Lipoprotein-mRNA von Escherichia coli bestimmt worden, und hierbei hat sich ergeben, daß die mRNA in ihrer· Struktur über mehrere seltene Merkmale' verfügt, die

] für eine effiziente Translation des mRNA-Transkripts wichtig zu sein scheinen. Die mRNA besteht aus 322 Nucleotiden, von.denen sich 38 in der 5'-untranslatierten Region und 50 in der 3'-untranslatierten Region befinden, so daß 234 Nucleotide in der translatierten Region übrigbleiben, die'für den Lipoproteinvorläufer oder für das Prolipoprotein codieren. Die mRNA-Sequenz von Fig. 2 ist zur DNA-Sequenz von Fig. 1 komplementär, mit der Ausnahme des Nucleotids in Stellung 313, das bei der aus Fig. 2 hervorgehenden¹ RNA-Sequenz das Nucleotid C ist, während es.bei der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz das Nucleotid A darstellt. Der Grund für diesen Unterschied, ist gegenwärtig nicht bekannt.

Die Lipoprotein-mRNA hat sich als außergewöhnlich stabil erwiesen, wobei angenommen wird, daß diese Stabilität möglicherweise auf die Bildung extensiver Sekundärstrukturen im Molekül zurückzuführen ist. Wie die Fig. 3 zeigt, kann die mRNA neun stabile haarnadelartige Stamm- und Schlaufenstrukturen bilden (die durch die römischen Zahlen I bis IX bezeichnet werden), deren stabilste Struktur die Struktur I ist, die sich in der 3'-untranslatierten Region befindet. Diese Sekundärstrukturen dürften für die längere funktioneile Halbwertszeit verantwortlich sein, . die "für die Lipoprotein-mRNA im Vergleich zu anderen mRNA von Es-cherichia coli beobachtet worden sind, und sie dürften hierdurch die Verfügbarkeit dieses Moleküls zur Ribosomentranslation erhöhen.

Bei der Bildung der aus Fig. 3 hervorgehenden haarnadelartigen Strukturen sind zwar 6 8 % der gesamten Nucleotide im mRNA-Molekül involviert, doch ist zu beachten, daß es in den' ersten 64 Nucleotiden vom 5'-Ende her keine stabilen haarnadelartigen Strukturen gibt, während zwischen dem 65. Nucleotid und dem 3'-Ende 85 % der Nucleotide bei der Bildung haarnadelartiger Strukturen beteiligt sind-. Dies ist insofern signifikant, weil in der' 5'-untranslatierten .Region (Stellungen +Ibis +38} anscheinend zwei

extensiv invertierte Wiederholungssequenzen von Nucleotiden vorhanden sein dürften, die die Bildung von Sekundärstrukturen in dieser Region wahrscheinlich verändern. Hierdurch ist in diesem Segment die Ribosomenbindestelle vollständig den Ribosomen ausgesetzt, so daß die Initiation der Translation erleichtert wird. Das Ausmaß der Translationsinitiation wird durch die Anwesenheit von zwei möglichen Ribosomenbindestellen in- diesem Bereich des Moleküls möglicherweise noch weiter erleichtert.

Schließlich wird durch die Anwesenheit aller drei Trans Iationsterminationscodone in der 3'-untranslatierten Region der vctRNA (UAA, Stellungen +273 bis +27 5, UAG, Stellungen +276 bis +278, und UGA, Stellungen +285 bis +287 - siehe Fig. 2), von denen sich alle drei im gleichen Leserahmen wie die translatierbare oder codierende Region der mRNA befinden, für eine seltene Stützsequenz von Tandemterminatoren, was möglicherweise zur .Gesamteffizienz der Translation beiträgt, da hierdurch eine saubere Termination der Translation in vor Fehlern sicherer Weise gewährleistet wird. . ' ' *

Der kumulative Effekt dieser und anderer einzigartiger Merkmale der Lipoprotein-mRNA dürfte zur sehr effizienten Translation dieser genetischen Information in Zellen von Escherichia coli führen.

Abgesehen von der Effizienz der Expression weist das Lipoprotein von Escherichia coli auch noch das weitere wichtige Merkmal auf, daß es ein sogenanntes Sekretorprotein darstellt, nämlich von einem Vorläufer gebildet wird, der dann über die Cytoplasmamembran ausgeschieden und zum Lipoprotein verarbeitet wird. Durch Translation des Transkripts von Lipoprotein-rnRNA ergibt: sich daher in der Tat dieser· Vorläufer, der als Prolipoprotein bezeichnet wird und der an seinem Aminoende eine Peptidextension oder ein Signalpeptid enthält, das aus 20 Aminosäureresten besteht, deren Sequenz bestimmt worden ist, an die -sich die bekann-

te Sequenz aus 58 Aminosäuren des Lipoproteins anschließt. Die bei diesem Sekretionsprozeß ablaufenden Mechanismen sind bisher zwar noch nicht klar, doch dürfte hierbei das Signalpeptid die in vivo ablaufende Translokation des Prolipoproteins durch die Cytoplasmamembran so lenken, daß bei diesem Prozeß die Peptidextension selbst entfernt und reifes Lipoprotein gebildet wird.

Analoge Prozesse dürften auch bei der Produktion der überwiegenden Proteine der. äußeren Zellmembran aller gramnegativenBakterien auf treten . So hat sich beispielsweise durch Analyse und Vergleich der DNA-Sequenz des Lipoproteingens von Se-rratia marcescens (S. marcescens) mit der DNA-Sequenz des Ipp-Gens von Escherichia coli ergeben, daß es verblüffende,Homologien in der Promotorregion (84 %) und in der 5'-untrans 1atiertsn Region (95 %) gibt. Darüber hinaus ist der A-T-Gehalt in der Promotorregion des Lipoproteingens von Serratia marcescens äußerst hoch (78 %) und somit zum Gehalt an Lipoproteingen von Esche--

20. richia coli (SO %) vergleichbar. Die DNA-Sequenz, die für die Peptidextension des Prolipoproteins von Serratia marcescens codiert, unterscheidet sich zwar etwas von der DNA-Sequenz von Escherichia coli, doch führen die sich hierdurch ergebenden .Abänderungen in der Aminosäurese— quenz zu keiner Veränderung der Grundeigenschaften des Signalpeptids für das Prolipoprotein von Escherichia coli und für andere ba'kterielle Sekretorproteine. Ferner scheint die Lipoprotein-niRNA von Serratia marcescens als von der DNA-Sequenz abgeleitete Sequenz zur Bildung von sieben stabilen haarnadelartigen Stammstru.kturen und Schlaufenstrukturen befähigt zu sein. Die Existenz des Lipoproteins in einer Reihe verschiedener Arten gramnegativer Bakterien ist nun bestätigt worden, wobei gefunden wurde, daß die Lipoprotein-mRNA von Escherichia coli mit

3~> DNA von wenigstens den folgenden' sieben Bakterienspezies (neben Serratia marcescens) aus der Familie der Enterobacteriaceae Hybride bildet: Shigella dysenteriae, Salmonella thypimurium, Citrobacter freundii, .Klebsieila ' aero-

genes, Enterobacter aerogenes, Edwardsieila tarda und Erwinia amylovora, und dies bestätigt ein Ausmaß an Homologie des Lipoproteingens zwischen Escherichia coli und anderen gramnegativen Bakterien. All diese und .andere Erkenntnisse dürften eine Ausdehnung der Erfindung auf rekombinante Plasmid-Klonierungsträger rechtfertigen, bei denen von einer analogen und äußerst effizienten Maschinerie zur Genexpression unter Zuhilfenahme irgendeines gramnegativen Bakteriums Gebrauch gemacht wird.

Das einmalige Verhalten bei der Biosynthese und Anordnung der Proteine der äußeren Zellmembran von gramnegativen Bakterien, das oben ausführlich behandelt worden ist, macht die Lipoproteingene und sonstigen überwiegenden Proteingene der äußeren Zellmembran dieser Organismen zu äußerst attracktiven Trägern, durch die sich die'Expression exogener DNA-Insertfragmente in Bakterientransformanten steuern läßt. Die Struktur und Funktion mehrerer solcher Klonierungsträger wird hierin näher beschrieben. · -

2. Strategie zur Genexpression

Aus den obigen Ausführungen ergibt sich, daß der überwiegende Teil der Merkmale, die für die effiziente Transkripticn und Translation des Lipoproteingens von Escherichia coli verantwortlich zu sein scheinen, auf den'funktionallen Fragmenten des Gens beruhen, nämlich dem Promotor/ der 5'-untranslatierten Region, der- 3'-untranslatierten Region und.der Transkriptionsterxninationsstelle, die alle entweder unterhalb oder oberhalb des lpp-Strukturgens angeordnet sind, wie in Fig. 4 durch die Linie a gezeigt ist, Durch Insertion eines Strukturgens für ein eukaryotisches Protein oder ein sonstiges gewünschtes Polypeptid in ein Expressionsplasmid, das verschiedene Kombinationen der vorstehenden funktionellen Fragmente enthält, und durch .Transformation eines Bakterienwirts mit einem solchen Plasrnid läßt sich erreichen, daß die Transkription und die anschließende Translation des Strukturgens unter der

- 22 Steuerung durch diese funktionellen Fragmente abläuft.

Aus dem Fachmann geläufigen Gründen ist die Nacheinanderanwendung aller obiger funktionell er Fragmente in einem einzigen Expressionsplasmid besonders wünschenswert und zweckmäßig. Durch Fusion des Strukturgens für das gewünschte Polypeptid an seinem 5'-Ende mit einer DNA-Sequenz, die sowohl den Promotor als auch die 5'-untranslatierte Region des lpp-Gens von Escherichia coli enthält (wobei diese DNA-Sequenz am besten auch noch das;gesamte 260 bp große und an A-T-Gehait reiche DNA-Segment enthält, das der Transkriptionsinitiationsstelle vorangeht), läßt sich durch Einsatz eines der stärksten Bakterienpromotoren eine äußerst wirksame Transkription erreichen, wobei sich eine äußerst effiziente Translation durch Gebrauch einer DNA-Sequenz ergibt, die für Merkmale codiert, welche die Initiation der Translation unter Einschluß der wirksamsten Ribosomenbindestelle initiiert. Durch Fusion des Struktur- geris an seinem 3'-Ende mit einer DNA-Sequenz, die die 3¹-untranslatierte Region und das Transkriptionsterminationssignal, des lpp-Gens von Escherichia coli enthält, dürfte ferner auch die Effizienz der Translation weiter verbessert werden, da hierdurch ein transkriptionelles Durchlesen (die Synthese' einer unnötig ' langen 3'-untranslatierten Region in .der itiRNA) vermieden und, was noch wichtiger ist, der Verlauf der mRNA-Produktion erleichtert wird. Durch Bildung einer Sekundärstruktur in der 3'-untranslatierten Region verbessert sich ferner auch die Stabilität • des mRNA-Moleküls .

. . .

Wie später im einzelnen noch beschrieben wird,kann das Sekretionsverhalten des Lipoproteins auch zur Steuerung eines weiteren Merkmals der Expression eines Eukaryontenproteins oder eines sonstigen gewünschten Polypeptids her-3^ angezogen werden,nämlich zur Lokalisierung wo das Expressions produkt erwartungsgemäß zu finden ist. In Abhängigkeit von'der Stelle im Tpp-Gen, die zur Insertion der exogenen DNA gewählt worden ist, kann sich das Expressions-

produkt erwartungsgemäß entweder im Cytoplasma der TransformantenzelIe, im periplastischen Raum oder in der äußeren Membran der Zelle akkumulieren.

Die Fig. 4 zeigt schematisch ein Verfahren, bei welchem ein Transformantorganismus nach obigem Reaktionsschema ein natürliches Eukaryontenprotein exprimiert. Bei der aus Fig. 4 hervorgehenden besonderen Ausführungsform wird das Strukturgen für das Eukaryontenprotein in das Signalpeptid des Ipp-Gens mehrere Basenpaare nach dem Translationsinitiationscodon und nach bestimmten funktioneilen Fragmenten eingesetzt (nämlich dem Promotor und der' 5'-untranslatierten Region), die normalerweise im Lipoproteingen vorhanden sind. Ein Vergleich der Linie a mit der Linie b von Fig. 4 zeigt, daß die Orientierung dieser funktionellen Fragmente identisch ist mit der natürlichen Orientierung dieser Elemente im Lipoproteingen, während das exogene DNA-Insertionsfragment den Großteil des Signalpeptids und auch einen Teil der Strukturregion des Lipoproteingens verdrängt.

Die Linie b von Fig. 4 zeigt, daß das Fremdgen an seinem 3'-Ende an ein extra Translationsterminationscodon geknüpft ist, das selbst wiederum verschmolzen ist mit dem Rest des Lipoproteinstrukturgens. Dies ist dann noch weiter vorne in der üblichen Weise an die 3'-untranslatierte Region des Ipp-Gens geknüpft, die mit der Transkriptionsterminationssteile endet. Auch hier zeigt ein Vergleich der Linie a mit der Linie b in Fig. 4, daß die dem DNA-Insertionsfragment folgenden funktioneilen Fragmente praktisch mit . denjenigen identisch sind, die normalerweise im Lipcprotein vorhanden sind.-

Die vom lpp-Gen stammende 3'-untranslatierte Region codiert für eine mRNA-Sequenz, die zur Bildung einer Stamm- und Schlaufenstruktur befähigt ist, welche in der Fig. 3 durch die Zahl I bezeichnet ist, und die obigen Ausfüh- . rungen zufolge die stabilste Sekundärstruktur in der Lipo-

Ί protein-mRNA darstellt. Die aus Fig. 4 in der Linie b hervorgehende rekombinante DNA-Sequenz enthält jedoch auch ein Endstück des Lipoproteinstrukturgens, das aus 105 Basenpaaren besteht, die bei der Stellung +168 beginnen, die 5' in Fig. 3 durch.den Pfsil (A) gekennzeichnet ist. Diese Region wird so gewählt, daß sich die Stabilität des mRNA-Transkripts durch Einschluß von vier weiteren Stamm- und Schlaufenstrukturen (die in Fig. 3 durch die Zahlen II, III, IV und V bezeichnet sind) weiter verbessern läßt, ohne daß es hierdurch zu einer übermäßigen Erhöhung der Größe' des gebildeten mRNA-Moleküls kommt. Diese.Region wird jedoch, wie später noch gezeigt wird, am Ende nicht translatiert.

Eine Translation der aus der Linie b von Fig. 4 hervorgehenden rekombinanten DMA-Sequenz führt zu einer mRNA-Sequenz, die in Fig. 4- schematisch durch die Linie c gezeigt ist. Diese Sequenz enthält, wie ersichtlich, die :5'-untranslatierte Region und die 3'-untranslatierte Region, die beide normalerweise bei der Produktion des Lipo^- proteins vorkommen. Die mRNA enthält jedoch auch noch eine Region, die für das Eukaryontenprotein codiert, der eine Region vorangeht, die für ein kurzes Segment des Signalpeptids des Prolipoproteins codiert und der eine weitere

2^ Region folgt, die für ein Segment des Lipoproteins codiert. Diese- letztgenannte Region wird infolge der Inser-· tion eines Terminationscodons (das in den Linien b und c von Fig. 4 durch einen Pfeil (Δ) bezeichnet ist), am 3'-Ende des eukaryotiscnen Strukturgens am Ende jedoch nicht

¹^ translatiert. Nach erfolgter Translation ist ein Polypeptid gebildet, das aus mehreren fremden Aminosäureresten besteht, die von der Aminosäuresequenz für das gewünschte Eukaryontenprotein gefolgt werden (siehe Linie d in Fig. 4). Von diesem konjugierten Expressionsprodukt ist zu er-

⁰^ warten, daß es sich innerhalb des Cytoplasmas der Zelle akkumuliert, weil es in Abwesenheit eines vollständigen Signalpeptids nicht zu einer Sekretion kommen kann. Bei bestimmten Proteinen kann man das Expressionsprodukt je-

- '25 -

doch vorn Cytcplasma in bekannter Weise reinigen, und das überflüssige Proteinfragment läßt sich dann unter Anwendung bekannter· Techniken abtrennen und vom natürlichen Proteinprodukt entfernen (siehe Linie e von Fig.4), wodurch man zum gewünschten Polypeptid gelangt,das dann bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt werden kann.

Wahlweise kann man die DNA-Sequenz, die für die fremden Aminosäuren codiert, auch in bekannter Weise aus dem Expressionsplasmid herausschneiden, bevor man den Bakterienwirt einer Transformation unterzieht, so daß das Expressionsprodukt genau dem gewünschten Fremdprotein entspricht und durch bekannte Techniken gereinigt werden kann.

Bei einer anderen Ausführungsform des obigen Reaktionsschemas werden die gleichen funktioneilen Fragmente verwendet, wobei die für das gewünschte Polypeptid codierende DNA-Sequenz jedoch weiter vorne eingesetzt wird, nämlich nach dem letzten Codon des Signalpeptids und somit an oder in der Nähe der Signalpeptidspaltstelle. Auch bei dieser Ausführungsform ist die Orientierung der funktioneilen Fragmente wiederum identisch zur natürlichen Orientierung dieser Elemente im Lipoproteingen, so daß voll Gebrauch gemacht werden kann vom damit verbundenen Vorteil einer effizienten Transkription und Translation unter Einschluß einer verbesserten Stabilität des mRNA-Transkripts • infolge der Einführung von vier weiteren Stamm- und Schleifenstrukturen, wie dies oben im einzelnen näher beschrieben worden ist.

. , ,

Die Transkription und schließliche Translation einer solchen rekombinanten DNA-Sequenz verläuft analog zu der oben beschriebenen und in Fig. 4 gezeigten Art und Weise mit der Ausnahme, daß nach erfolgter Translation ein PoIypeptid mit einem Signalpeptid gebildet wird, das dem Signalpeptid des Prolipoproteins entspricht, dem die Aminosäuresequenz des gewünschten Eukaryontenproteins folgt. Dieses Vorläuferprodukt kann dann durch die Cytoplasmen-

membran unter der Steuerung durch das Signalpeptid ausgeschieden werden, und während dieses Prozesses kann die Peptidextension selbst erkannt und durch enzymatische Wirkung entfernt werden, wie sie für die Transformantenzelle von Escherichia coli natürlich ist, wodurch sich ein Produkt ergibt, das aus dem natürlichen Eukaryontenprotein und möglicherweise mehreren fremden Aminosäureresten am Aminoende besteht, welches sich in der oben beschriebenen Weise abtrennen läßt. Dieses Produkt sammelt sich zu Beginn im Periplastenraum an und kann schließlich die äußere Zellmembran passieren und in das Kulturmedium eintreten,, sofern bestimmte Transformantenstämme von Escherichia coli verwendet werden, wie dies im folgenden näher beschrieben wird.

Durch Anwendung dieser Methode ist eine Störung des Zellwachstums durch die Ansammlung einer großen Menge an Expressionsprodukt im Inneren der Zelle weniger wahrscheinlich, weil hier das Eukaryontenprotein mit einem Signal-

2Ö peptid verknüpft ist, das ein natürliches Peptid für die Zelle darstellt. Ferner kann es durch die Anwesenheit des Signalpeptids auch zu einem Schutz des Fremdproteins vor einem möglichen abbauenden Einfluß im Inneren der Zelle kommen, durch den es sonst zu einer Erniedrigung der Ausbeute an Protein -und' auch einer Kontamination des Fremdproteins durch heterogene abbauende Produkte kommen könnte, was mit Schwierigkeiten bei einer, Reinigung verbunden wäre.

Bei einer weiteren anderen Ausführungsform des obigen Reaktionsschemas werden wiederum die gleichen funktioneilen Fragmente verwendet/ wobei die für das gewünschte Polypeptid codierende DNA-Sequenz jedoch noch weiter vorne inseriert wird, beispielsweise,wie hierin angegeben, nach dem'¹ Codon für den achten Aminosäurerest nach der Spaltstelle für das Signalpeptid. Auch bei dieser Ausführungsform ist die Orientierung der funktioneilen Fragmente wiederum identisch zur natürlichen Orientierung dieser Elemente im

Lipoproteingen, so daß voll Gebrauch gemacht werden kann von der Effizienz der Transkription und der damit verbundenen Translation unter Einschluß der verbesserten Stabilität des mRNA-Transkripts infolge der Einverleibung von vier weiteren Stamm- und Schleifenstrukturen, wie dies oben beschrieben worden ist.

Die Transkription und schließliche Translation einer solchen rekombinanten DNA-Sequenz läuft in einer analogen Weise ab, wie dies oben beschrieben und in Fig. 4 gezeigtist, mit der Ausnahme, daß nach erfolgter Translation ein Polypeptid gebildet wird, das ein Signalpeptid aus 20 Aminosäureresten enthält, die dem Signalpeptid des Prolipoproteins entsprechen·, an das sich zuerst acht' Aminosäurereste, die den ersten acht Aminosäureresten des reifen Li-" poproteins entsprechen, und dann die Aminosäuresequenz des gewünschten Eukaryontenproteins anschließen. Genau so wie bei der oben beschriebenen Ausführungsform kann auch dieses Vorläuferprodukt natürlich wiederum durch die Cytoplasmenmembran treten, und während dieses Prozesses kann das Signalpeptid erkannt und entfernt werden.- Das Produkt kann sich jedoch nicht im Periplasmenraum ansammeln. Die acht Aminosäuren, die dem Lipoprotein entsprechen, können vielmehr erkannt werden, und das Expressionsprodukt läßt sich dann weiterverarbeiten und in die äußere Membran der Zelle analog zur normalen Insertion des Lipoproteins in die äußere Membran inserieren. Sind erwartungsgemäß nur die ersten acht Aminosäurereste des Expressionsprodukts, das dem Lipoprotein entspricht, tatsächlich nur in der äußeren Zellmembran gebunden, dann ragt der Rest des Expressionsprodukts, der aus der Aminosäuresequenz des Eukaryontenproteins oder sonstigen gewünschten Polypeptids besteht, aus der äußeren Membran heraus.

Aus Obigem ergibt sich, daß sich durch Konstraktion eines Plasmid-Klonierungsträgers mit irgendeiner der oben beschriebenen drei Insertionsstelien und durch Einsatz ei-

nes solchen Plasmids zur Expression eines exogenen Genprodukts die Lage dieses Produkts mit ausreichender Sicherheit vorhersagen läßt, und es werden hierdurch geeignete Methoden zur Isolierung und Reinigung dieses Produkts vorgeschlagen. Die Wahl einer Insertionsstelle wird häufig von der Identität und Struktur des gewünschten Polypeptide selbst diktiert, und zwar vor allem dann, wenn die für ein solches Produkt am besten geeignete Reinigungsmethode bekannt ist.

Zur weiteren Erleichterung.der Expression einer breiten Vielfalt an exogenen DNA-Fragmenten unter Einsatz der erfindungsgemäßen-Klonierungsträger kann man an der Insertionsstelle eines jeden Expressionsplasmids eine kurze

J5 Polynucleotidsequenz einbauen, die die Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Eco Ri, Kind III und Bam HI enthält. Dies ergibt eine zusätzliche Flexibilität, da sich in jedes Plasmid unter Anwendung der einfachen und .wohlbekannten oben beschriebenen Techniken sechs verschiedene Arten an Restriktionsfragmenten inserieren lassen. Ss lassen sich daher erfindungsgemäß ohne weiteres- DNA-Insertionsfragmente verwenden, die so zurechtgemacht sind, daß sie irgendeines' der folgende Paare als kohäsive Enden enthalten: ECO RI-ECORI, Hind III-Hind III, Barn HI-Bam HI, Eco RI-Hind III, Eco RI-Bam- HI und Hind ΙΊΙ-Bam HI.

Die Expression einer genetischen Information wird obigen Ausführungen zufolge als induzierbar bezeichnet,wenn eine Transkription in Abwesenheit eines bestimmten Moleküls nicht initiiert werden kann. Ein Beispiel für eine in der Natur vorkommende induzierbare Genexpression ist'der Iac-, Promotor-Operator von Escherichia coli, der die Produktion von -ß-Galactosidase steuert, nämlich einem wichtigen Enzym bei der Lactoseverdauung. Die Expression dieses Gens wird .normalerweise durch die Anwesenheit eines Lactoserepressors ausgeschaltet, der sich an den lac-Promotor-Operator bindet, so "daß eine Wechselwirkung zwischen der RNA-PoIymerase und der Promotorseauenz verhindert und hierdurch

', eine Transkription (und anschließende Translation) des ß-Galactosidasestrukturgens gehemmt wird. In Anwesenheit von Lactose wird das Repressormolekül jedoch von der DNA entfernt und das Gen eingeschaltet, so daß die Transkription so lange abläuft, bis eine zur Verdauung der Lactose ausreichende Menge an ß-Galactosidaseenzym gebildet ist, worauf der Bepressor das Gen erneut ausschaltet.

Die oben beschriebenen konstitutiven lpp-Genklonierungsträger können induzierbar gemacht werden, indem man den lac-Promotor nach dem Ipp-Promotor inseriert, jedoch vor dem exogenen DNA-Insertionsfragment. In einem solchen . Fall ist eine Transkription der fremden DNA von jedem Prornotor durch das Repressormolekül blockiert und kann in

T5 Abwesenheit einer Substanz nicht ablaufen, die als Lactoseinduktor bezeichnet wird, und hierbei handelt es sich für die vorliegenden Zwecke um ein Molekül, das mit dem . Lactoserepressormolekül so reagiert und dieses so verän-. dert, daß sich das Repressormolekül nicht mehr an den lac-Promotor-Operator binden kann. Bei Induktion mit Lactose oder mit einem synthetischen Induktor, wie IPTG, kann die fremde DNA sowohl vom lpp—Promotor als auch vom lac-Promotor unabhängig transkribiert werden, und hierdurch wird eine etwa 5-mal höhere Genexpression ermöglicht als durch Einsatz des lao-Promotcrs allein.

Die induzierbaren Klonierungsträger des Gens lpp können wiederum für eine Autosteuerung modifiziert werden,, indem man in jedes -Plasmid ein funktionelles lacI-Gen von Sscherichia coli inseriert. Auf diese Weise läßt sich das 1 : 1-Verhältnis zwischen Lactoserepressorgenen und lac-Promotoren, das normalerweise in Wildtyp-Zellen von Escherichia coli vorhanden ist, in Transformanten aufrechterhalten, die für eine Expression des gewünschten Polypeptids ausgewählt sind. Solche Transf ormanten müssen demna-ch den für unerläßlich gehaltenen F-Prim-Faktor nicht tragen und somit mit diesem auch nicht versehen zu werden, und sie eignen sich auch nicht zur Unterdrückung der Expression

-JU-

des gewünschten Produkts durch Mikroorganismen, die mit den Expressionsplasmiden transformiert sind, die das lacl-Gen von Escherichia coli nicht enthalten,

Alle oben im Zusammenhang mit den konstitutiven und induzierbaren l'pp-Gen-Expressionsplasmiden beschriebenen wünschenswerten Merkmale können selbstverständlich mit gleichem Vorteil auch in die autogesteuerten induzierbaren lpp-Gen-Expressionsplasmide eingebaut werden, auf die sich die Erfindung bezieht. Zu diesen Vorteilen gehören.die· besondere Effizienz der Transkription und Translation, die gewöhnlich, mit den vier speziellen funktioneilen Fragmenten · des lpp-Gens verbunden ist, die verbesserte Stabilität des mRNA-Transkripts infolge der Einführung der vier weiteren

]5 Stamm— und Schleifenstrukturen in Verbindung mit dem mRNA-Transkript des 'terminaleh Teils des Lipoproteinstrukturgens, die Schaffung von drei verschiedenen Insertionsstellen für die 'Fremd-DNA zur Steuerung der Lage,..an der das Expressionsprodukt erwartungsgemäß gefunden werden kann,

20, und der Einbau von Eco.RI, Hind III und Bam RI Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen an der exogenen DNA-Insertionsstelle eines jeden Plasmids zur Erleichterung der Expression einer breiten Vielfalt an DNA-Insertionsfragmeri-

' . ten. . '

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmide läßt sich praktisch jedes Strukturgen expr linieren, ' das für ein gewünschtes Polypeptid codiert,¹ beispielsweise für Säugetier- und Humanhormone, Enzyme und immunogene Proteine (oder Zwischenprodukte hierfür). Zu solchen Proteinen gehören beispielsweise A-Ketteninsulin, B-Ketteninsulin, Proinsulin, Wachstumshormon, Somatostatin, Interferon und Trypanosomantigen, wobei die Erfindung jedoch nicht auf diese beispielsmäßigen Produkte beschränkt ist.

3 . Der- Transf ormant

Die auto-gesteuerten induzierbaren rekombinanten Klonie-

rungsträger, die das Gen für das gewünschte eukaryotische Protein oder ein sonstiges Polypeptid enthalten, werden vorzugsweise eingesetzt zur Transformation spezieller Stämme von Escherichia coli als Wirte zur Klonierung und anschließenden Produktion des Proteins. Die Zellstämme des verwendeten Wirts werden so ausgewählt, daß man im lpp-Gen eine sogenannte Deletionsmutante hat, so daß die Wirtszelle das Lipoprotein nicht produzieren kann. Der Einsatz eines Deletionsmutantenstamros des Transformanten

-|0 dürfte eine Stimulierung der Produktion des Fremdproteins ergeben. Weiter wird in lpp-defektiven Wirtszellen eine Sekretion des Fremdproteins durch die Cytoplasmenmembran erleichtert, da die Sekretionsstellen in der Zellmembran, die für eine Lipoproteinsekretion herangezogen werden

-J^ sollen, anstelle dieser Zellen für eine Sekretion des Fremdproteins verfügbar sind.

Der Einsatz der'lpp-defektiven Zellen ist dann besonders günstig, wenn das für das Fremdprotein codierende Gen an oder in der Nähe der Spaltstelle des Lipoproteinsignalpeptids inseriert ist. Dies- beruht darauf, weil Zellen be- ; kanntlich durchlässig sind, so daß Proteine, die die Cytoplasmenmembran solcher Zellen passieren, schließlich'durch die äußere Membran der Zelle in das Kulturmedium gelangen.

Dies dürfte nicht nur deshalb wünschenswert sein, weil eine Freisetzung des gewünschten Fremdproteins in das Kulturmedium gelegentlich auch eine leichtere Isolierung und Reinigung des Fremdproteins erlauben kann als dies möglich

wäre, wenn das Fremdprotein im Inneren der Zelle verbleien ^ou ben würde, sondern es ist auch deshalb wünschenswert, weil sich das Fremdprotein sonst im Periplasmenraum akkumuliert, was möglicherweise zu einer unerwünschten Störung der normalen Zelltätigkeit oder des normalen Zellwachstums führt. Durch eine Abscheidung des gewünschten eukaryotischen Gen- °~* produkts außerhalb der Zelle läßt sich auch ein Abbau dieses Produkts in kleinere Fragmente durch proteolytische Enzyme unterbinden, die normalerweise in der Zelle vorhanden sind.

4. Experimenteller Teil

Die oben beschriebenen Strategien und Techniken werden experimentell zur Konstruktion einer Gruppe rekombinanter bakterieller Plasmid-Klonierungsträger angewandt, auf die sich, die Erfindung bezieht. Der Vollständigkeit halber werden die speziellen experimentellen Stufen zur Herstellung der konstitutiven und induzierbaren lpp-Gen-Klonierungsträger hierin ganz beschrieben, und daran schließen

'0 sich dann die experimentellen Stufen an, die zum Aufbau eines der Plasmide, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht', verwendet werden. Es werden freie Arten oder Familien an Trägern beschrieben,, nämlich einmal für eine konstitutive Genexpression, die als pIN-I-Typ'bezeichnet

^ wird, und zum anderen Mal für eine induzierbare Genexpression, welche als pIN-II-Typ bezeichnet wird. Die erfindungsgemäßen auto-gesteuerten induzierbaren Expressionsplasmide werden hierin kollektiv als pIN-III-Typ oder

plN-III-Serien bezeichnet

20

Die Insertionsstelle, die in der DNA-Sequenz- lokalisiert ist, die für das Prolipoproteinsignalpeptid codiert, wird als Stelle A bezeichnet. Die Insertionsstelle, die unmittelbar nach dem letzten Codon des Signalpeptids lokali- " siert ist, bezeichnet man als die Stelle B. Die Insertionsstelle, die nach dem Codon für die acht Aminosäurereste des reifen Lipoproteins lokalisiert ist, bezeichnet man als die Stelle C (siehe Fig. 5). Für jede Stelle lassensich drei Plasmide herstellen (nämlich je eines, das jeder

der drei möglichen Leserahmen·entspricht), so daß sich bei jeder Reihe insgesamt neun Expressionsplasmide ergeben, die als A-I, A-2, Ä-3, 3-1, 3-2, B-3 und C-I, C-2, C-3 bezeichnet werden.

Die hierin verwendeten Restriktionsenzyme stammen von den New England Biolabs and Bethesda Research Laboratories.. Die T4-DNA-Ligase stammt von Bethesda Research Laboratories (sofern nichts anderes gesagt ist), während

- 33 die Sl-Nuclease von Miles Laboratories kommt.

A. Konstruktion von Plasmiden mit A-Stellen (pIN-I)

Die Fig. 6 bis 15 zeigen schematisch die Art und Weise, wie rekombinante Plasmide, die die A-Insertionsstelle enthalten, konstruiert werden, und hierauf wird im Zusammenhang mit der folgenden ausführlicheren Diskussion Bezug genommen.

1. Konstruktion_des_Plasmids_pKENl.ll

Die erste Stufe bei der Konstruktion der Ipp-Gen-Klonierungsträger mit Stelle A besteht in 'einer Konstruktion eines Plasrnids,das als Quelle für lpp-Genkomponenten bei anschließenden Stufen des Verfahrens dient. Als Plasmid zur Aufnahme des Ipp-Gens von Escherichia coli wird für diesen Zweck pSCIOl ausgewählt, nämlich ein kleines Plasmid (mit einem Molekulargewicht von etwa 5,8 Megadalton), das ein Gen trägt, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Tetracyclin (Tc) verleiht (J. Bacteriol . 132: 734 bis 737 (1977). Wie die Hinweiszahl 100 in Fig. 6 zeigt, enthält pSCIOl eine Spaltstelle für die Restriktionsendonucleasa Eco RI, die am 5'-Ende des Gens für die Tetracyclinresistenz lokalisiert ist. Das Plasmid pSCIOl stammt von Dr. S. Ohtsubovom Department of Microbiology, State university of New York, Stony Brook, V.St.A.

Wie bei der Hinweiszahl 101 in Fig. 6 schematisch gezeigt ist, werden 2 μg Plasmid pSCIOl DNA mit zwei'Einheiten der Rsstriktionsandonuclease Eco RI in 50 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 100 mMol Tris:HCl (pH 7,5), 75mMol NaCl, β mMol MgCl₂, 6 mMol ß-Mercaptoethanol und 100 μg/ml Rinderserumalbumin (im folgenden als BSA bezeichnet) bei 37°C über 60 Minuten vollkommen verdaut (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden als Eco RI-Puffer bezeichnet). Zur Verhinderung einer Selbstligation der mit Eco RI behandelten dSCIOI DNA wird das Ganze mit bakterieller alka-

lischer Phosphatase(im folgenden als BAP bezeichnet) versetzt (0,1 Einheiten an Worthington BAPF) und die Inkubation 60 Minuten bei 37⁰C fortgeführt. Die Reaktion wird durch Extraktion mit Phenol beendet, und die dabei erhaltenen linearisierten DNAs werden durch Fällung mit Ethanol gewonnen. '

Wie unter der Hinweiszahl· 102 in Fig. β hervorgeht, erhält man getrennt davon auch ein DNA-Fragment mit 2,8 Kilobasen (Kb), das das Ipp-Gen von Escherichia coli enthält, aus einem Hybriden λ Phagen,der das Ipp-Gen von Escherichia coli trägt (als /\lppEc-l bezeichnet). Das Ipp-Gen ist früher bereits in einem A-phagenvektor klo-. niert worden, nämlich in λ.5 40 (J. Mol. Biol. 98, 551 bis

564 (1975) und hierzu geht man wie folgt

vor:

Man verdaut Gesamt-DNA (200 μg), die aus einem Stamm K-12 von'Escherichia' coli isoliert worden ist, der für das Gen lpp rnerodiploid ist (JE5519/F506 /J. Bacteriol. 133, 81 bis '84 (1978']_/)', mit 200 Einheiten des Restrikticnsenzyms Hind III. DNA-Fragmente werden auf einem präparativen Ägarosegel abgetrennt, und Fraktionen von DNA-Fragmenten von

32

etwa 10 Kb, die mit 5'- P-Lipoprotein mJRNA eine positive Hybridisierung zeigen, werden unter Anwendung der Hybridisierungstechnik von Southern (J. Mol. Biol. 98, 503 bis 517) gesammelt. Ein Gemisch aus den zehn Kb Hind III-Fragmenten (die etwa 20-fach angereichert sind) und der mit Hind III gespaltenen X540-Vektor-DNA wird mit T4-DNA-Ligase umgesetzt, unter Verwendung der erhaltenen ligierten DNA transfiziert man dann Escherichia coli K802, NRRL 3-15016 (erhalten von Dr. F.R. Blattner vom Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison, V.St.A.). Die-. ser Stamm ist beim Northern Regional Research Laboratory, üS-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und von der dortigen ständigen Kulturensammlung frei beziehbar. Rekombinante Phagen, die das Gen lpp tragen, werden durch die Flecken-Hybridisierungstechnik.

. - 35 -

von Benton und Davis (Science 196, 180 bis 182 (1977))

3 *> unter Verwendung von 5'- ~P-Lipoprotein mRNA ausgelesen.

Einer der untersuchten Flecken, der eine positive Hybridisierung ergibt, trägt ein vollständig funktionelles lpp-Gen und wird als AlppEc-1 bezeichnet.

Sodann verdaut man vollständig 200 μg XlppEc-1 mit 200 Einheiten des Restriktionsenzyms Hae III in 500 μΐ- einer Reaktionsmischung aus 6 mMol Tris:HCl (pH 7,5), 6 mMol MgCl₂, 6 mMol NaCl, 6 mMol ß-Mercaptoethanol und 100 μg/l BSA (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden als Hae III-Puffer bezeichnet) 2 Stunden bei 37°C und reinigt das dabei erhaltene 2,8 Kb Hae III-Fragment, das das lpp-Gen von Escherichia coli enthält, durch Fraktionierung auf einem 5 %-igen Polyacrylamidgel nach folgendem Verfahren: Man extrahiert das Reaktionsgemisch zuerst mit Phenol, worauf man die DNA-Fragmente mit 2,5 Volumina Ethanol ausfällt, unter Vakuum trocknet, in 200 μΐ eines Puffers aus 5 % Glycerin, 2 0 mMol EDTA, 0,0 5 % Bromphenolblau und 0,05 % Xylolcyanol löst (dieses Gemisch wird im folgenden als Gelpuffer bezeichnet) und dann auf einem 5 %-igen Polyacrylamidgel fraktioniert. Die DNA-Bande, die zur Stellung 2,8 Kb'gewandert ist, wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA-Fragmente werden vom Gel durch Elektrophorese eluiert. Der Ethidiumbromidf a-rbstof f, der zur Lokalisierung der DNA-Bande im Gel verwendet worden ist, wird von den DNA-Fragmenten durch Extraktion mit Pheno-1 entfernt. Die DNA-Fragmente werden mit 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt, zentrifugiert, in 200 μΐ 0,3 molarem Matriumacetat gelöst, erneut mit 0,5 ml Ethanol ausgefällt und wiederum unter Vakuum getrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu etwa 10 μσ eines gereinigten 2,8 Kb Hae III-Frag'35 Zur Klonierung des 2,8 Kb Hae·Ill-Fragments' in pSCIOl befestigt man synthetische Eco RI-Linkermoleküle an den Enden des 2,8 Kb Hae III-Fragments, wie dies . schematisch bei der Hinweiszahl 103 von Fig. 6 gezeigt ist. Der Eeo RI-

5 ' 3 ' Linker ( .GGAATTCC von Collaborative Research) wird durch T4~Polynucleotidkinase (von P.L. Biochemicals).mit ATP in 50 ml eines Reaktionsgemisches phosphoryliert, das 3 Mol des Linkers, 66 mMol TrisrHCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₂/ 10 mMol ß-Mercaptoethanol, 60 μΜοΙ ATP und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase enthält. Das Gemisch wird. 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert, dann 10 Minuten auf 6O⁰C erwärmt und schließlich auf 37°C abgekühlt. Das Gemisch wird mit 5 μΐ 0,1 Mol ß-Mercaptoethanol und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinasa versetzt und die Reaktion 30 Minuten bei 37⁰C fortgeführt. Hierauf wird die Reaktion durch Einfrieren des Gemisches in einem Bad aus Trockeneis und Ethanol beendet.

Das 2,8 Kb Hae III-Fragment' (2 μg) wird mit 150 pMol phosphoryliertem Eco RI-Linker vermischt und mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 12,5 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 66 mMol Tris:HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₃, 10 mMol Dithiothreit (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden· als Ligasepuffer bezeichnet) und 0,6 mMol ATP 15 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Zur Beendigung der Reaktion wird das Gemisch mit Eco Rl-Puffer auf das -20-fache verdünnt und 10 Minuten auf 50⁰C erwärmt. Sodann gibt man-30 Einheiten des Reaktionsenzyms Eco RI zu und inkubiert das Gemisch zur Bildung von .Eco Rl-kohäsiven Enden während 1 Stunde bei 37°C. Die Umsetzung wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 6O⁰C beendet. .

Man gibt das Gemisch zu 2 μg der vorher linearisierten Plasmid pSCIOl-DNA und extrahiert das Ganze mit Phenol.

Mach Extraktion mit Ether werden die DMAs mit Ethanol aus- gefällt, unter Vakuum getrocknet und in 100 ul Ligasepuffer. gelöst. Das Gemisch wird 5 Minuten auf 37°C erwärmt, worauf man die Eco RI-kchäsiven Enden anelliert, indem man das Ganze zuerst 16 Stunden bei 4°C und dann 1 Stunde bei 0⁰C inkubiert. Hierauf gibt man ATP (Endmenge 0,4 mMol·) und eine Einheit T4 DNA-Ligase zu und inkubiert das Gemisch während 7 Stunden bei 12,5⁰C.

Unter Verwendung eines Viertels des Ligationsgemxsches transformiert man den lpp-Deletionsmutantenstamm JE5527, NRRL B-15012, von Escherichia coli (F , man, lpp-2, pps, .thi, his, rpsL, gyrA, recAl (Proc. Natl. Acad. Sei, USA 74, 1417 bis 1420 (1977)), der von Dr. Y. Hirota vom National Institute of Genetics, Mishima, Japan, stammt). Dieser Stamm ist beim Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. frei beziehbar. Die Transformation wird wie in Proc. Natl. Acad." Sei, USA 69, 2110 bis 2114 (1972) beschrieben durchgeführt, wobei man die gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten über Nacht auf Filterpapier 3MM von Whatman.wachsen läßt, das man- auf die Oberfläche einer L-Brühenplatte gibt, die 10 μ9/ΐη1 Tetracyelin enthält, und wobei man eine Sichtung bezüglich Ipp-Klonen durch Koloniehybridisierung durchführt (Nucleic Acids Res. 7, 2115 bis 2136 (1979)). Ein 0,9 5 Kb Msp I-Fragment von MppEc-1, das das Ipp-Gen enthält, wird in der in Proc. Natl. Acad. Sei, USA 72, 1184 bis 1188

(1975) beschriebenen Weise mit /ä-³²P/dATP und /<x-³²p/dCTP kerbtransplantiert und als P-Sonde verwendet. Einer der Transf ormanten', der eine positive Hybridisierung zeigt, enthält das Plasmid mit der in Fig. 6 bei der Hinweiszahl 104 gezeigten Struktur, und dieses Plasmid wird als pKSNlll bezeichnet. Dieses Plasmid ist von Escherichia coli CC620/pKENlll, NRRL 3-15011 erhältlich, nämlich einem Stamm, der in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und von dort frei beziehbar ist. Das Plasmid läßt sich unter Anwendung her-' kömmlicher Mittel aus NRRL B-15011 erhalten.

Als Stammpiasmid zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Ipp-Genexpressionsplasmide wird PBR322 ausgewählt (mit einem Molekulargewicht von etwa 2,6 Megadalton), das Gene trägt, die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampi-

1" cillin (Amp) und Tetracyclin (Tc) verleihen (Gene 2, 95 bis 113 (1977)). Das pBR322 enthält, wie aus der Fig. 7 hervorgeht, eine Eco Rl-Spaltstelle, die am 5.'-Ende des Gens für die Tetracyclinresistenz lokalisiert ist, sowie ferner auch eine Hind Ill-Spaltstelle, die innerhalb des Promotors für das Gen für die Tetracyclinresistenz lokalisiert ist, und eine Pvu I-Spaltstelle, die innerhalb des Gens für die Ampicillinresistenz lokalisiert ist. Das Plasmid pBR32 2 stammt von Dr. N. Arnheim vom Department of Biochemistry, State University of New York, Stony Brook, V.St.A. und ist im Handel erhältlich von Bethesda Research Laboratories.

Die Fig. 5 zeigt schematisch die verschiedenen Komponenten des Ipp-Gens, von denen jedes durch ein Symbol oder eine Schattierung identifiziert ist. Das schattierte Segment, das durch den Buchstaben a gekennzeichnet ist, bezeichnet die an A-T reiche Region von etwa 260 Basenpaaren, die der Transkriptionsinitiationsstelle vorangehen, und ent-

20 hält den lpp-Promotor. Die 5'-untranslatierte Region wird durch das Segment identifiziert,das in seiner Mitte einen Kreis aufweist und mit dem Buchstaben b markiert ist. Die Signalpeptidregion des Prolipoproteins ist durch das diagonal' schraffierte und schattierte Segment c identifiziert

*-5 Die Strukturregion des Ipp-Gens ist durch das diagonal schraffierte. Segment identifiziert, welches durch den Buchstaben d. gekennzeichnet ist, während mit dem gesprenkelten Segment e die 3'-untranslatierte Region und die Transkriptionsteririinationsstelle bezeichnet wird. Diese

^ou Symbole und Schattierungen werden in ähnlicher Weise zur Identifizierung der gleichen funktioneilen Fragmente des Ipp-Gens auch in den Fig. 7 bis 11, 15, 17 bis 18, 21 bis 23 und 26 bis 29 verwendet.

⁰^ Die Fig.7 zeigt die zur insertion eines Fragments, das den Promotor und die 5'-untranslatierte Region des Ipp-Gens trägt, in p3R322 anzuwendende Strategie. Das für diesen Zweck ausgewählte Fragment ist ein 46 2 bp'Alu I-

] Fragment von pKENlll, das, wie in Fig. 5 mit der Hinweiszahl 105A schematisch gezeigt ist, nicht nur die Promotorsequenz und die 5'-untranslatierte Region (Stellungen -45 bis -1 und Stellungen +1 bis +39) des lpp-Gens enthält, sondern ferner auch noch das gesamte und an A-T äußerst reiche Segment, das der Promotorsequenz vorangeht.

Zur Klonierung des 452 bp Alu I-Fragments, das die lpp-Promotorregion im pBR322 enthält, löscht man zuerst das DNA-Fragment, das zwischen der Eeo Rl-SpaltstelIe und der Hind Ill-Spaltstelle von pBR322 liegt (das den Promotor für das Gen für die Tetracyclinresistenz enthält), aus, wie dies schematisch bei 106 in Fig. 7. gezeigt ist, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man verdaut 11 μg pBR3 22 Plasmid-DNA mit 11 Einheiten Hind HI-Restriktionsendonuclease in 200 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 10 mMol Tris:HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₃, 60 mMol MaCl, 5 mMol ß-Mercaptoethancl und 100 μg/ml BSA (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden als Hind HI-Puffer bezeichnet) 1 Stunde bei 37⁰C. Nach beendeter Verdauung· unterzieht man das Ganze einer Extraktion mit Phenol und gewinnt die DNA durch Fällung mit Ethanol.

Zur Entfernung der Hind IH-kohäsiven Enden behandelt man die DNA 1 Stunde bei 20⁰C mit 1,5 μΐ Sl-Nuclease (Miles Laboratories) in einem Endvoiumen von 300 μΐ eines Puffers aus 30 mMol Natriumacetat (pH 4,25), 0,3 Mol NaCl und 4 mMol ZnSO, (der im folgenden als Sl-Puffer bezeichnet wird). Die Reaktion wird durch Zugabe von 30 μΐ 500 mMol Tris:HCl (pH 8,0) und 30 μΐ 250 mMol EDTA unterbrochen, worauf man das Ganze mit Phenol extrahiert. Zur Entfernung des Phenols extrahiert man das Gemisch mit Ether, worauf man über Nacht bei 4°C gegen 0,01 χ SSC^ (SSC = 0,15 Mol NaCl - 0,015 Mol Natriumeitrat) dialysiert und die DNAs durch Fällung mit Ethanol gewinnt.

Hierauf gibt man phosphcrylierten Eco RI-Linker (200 pMol zu und behandelt das Gemisch 1.6 Stunden bei 12,5⁰C mit 4

"i Einheiten T4 DNA-Ligase in 12,5 μΐ Ligasepuf f er, der 0,6 itiMöl ATP enthält. Zur Bildung von Eco RI-kohäsiven Enden versetzt man das Gemisch mit 30 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 75 μΐ Eco RI-Puffer und beläßt das Ganze 2

5- Stunden bei 37⁰C-. Sodann beendet man die Reaktion durch extraktion mit Phenol und Gewinnung, der DNAs durch Fällung mit Ethanol

Die Eco RI-kohäsiven Enden werden ligiert und das Plasmid hierdurch. rezirkularisiert, indem man das Ganze 7 Stunden bei 12,5⁰C' mit 0,3 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20. μΐ Ligasepuf f er behandelt, der 0,4 mMol ATP enthält. Unter Verwendung einer Teilmenge von 0,5 μg der ligierten DNA transformiert man dann den Stamm JE5519 von Escherichia

I^ coli, NRRL B-15Q13 (F-, aroD, man, argE, lac, gal, rpsL,· gyrA, recAl, erhalten von Dr. Y. Hirota., National Institute of Genetics,.Mishima, Japan). Dieser Stamm ist in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St..A. hinterlegt und von dort frei beziehbar. · Man 'läßt 10 gegenüber Ampicillin resistente und gegenüber Tetracyclin sensitive Transformanten über Nacht auf 1. ml L-Brühe wachsen, die 50 μg Ampicillin pro ml enthält. Die Plasmid-DNAs werden aus 0,5 ml der"Kultur unter Anwendung der alkalischen Schneildenaturierungsmethode isoliert, wie sie in J. Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979) beschrieben ist, und durch Restriktionsenzymkartographie analysiert. Eines der Plasmide hat die in Fig. 7 bei 107 gezeigte Struktur, und dieses wird als pKENOOS bezeichnet.

Das 462 bp Alu I-Fragment, das den lpp-Promotor enthält, wird, wie in Fig. 7 bei 108 schematisch gezeigt ist, in folgender Weise hergestellt: 100 μg pKENlll Plasmid-DNA verdaut man 3 Stunden bei 37°C mit Msp I-Restriktionsen-

zym in 600 μΐ eines Puffers aus 10 mMol. Tris: HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₂, 6 mMol KCl, 1 mMol Dithiothreit und 100

.. ml BAS (dieses Gemisch wird im folgenden als Hpa I-Puffer bezeichnet).. (Das pKENl11 enthält zwar zahlreiche Msp I-

Spaltstellen, wobei jedoch nur die zwei interessierenden Spaltstellen in Fig. 7 bei 109 gezeigt sind.) Nach erfolgter Extraktion mit Phenol werden die DNA-Fragmente mit 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt, unter Vakuum getrocknet, in 100 μΐ Gelpuffer gelöst und über 5 % Polyacrylamidgel fraktioniert. Sodann verdaut man etwa 6 μg eines gereinigten 0,95 Kb Msp I-Fragments mit Alu I-Restriktionsendonuclease in 400 μΐ Hind Ill-Puffer 2 Stunden bei 37°C, wodurch man zu einem 462 bp Alu I-Fragment gelangt, das durch Gelelektrophorese gereinigt wird.

Im Anschluß daran vermischt man 1 μg des 462 bp Alu I-Fragments mit 150 pMol phosphoryliertem Eco RI-Linker und behandelt das Ganze 16 Stunden bei 12,5⁰C mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 naMol ATP enthält. Die ligierte DNA wird hierauf zur Bildung von Eco RI-kohäsiven Enden eine Stunde bei 37⁰C mit 40 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 100 μΐ Eco RI-Puffer verdaut. Man beendet die Verdauung durch 10 Minuten langes Erwärmen des Gemisches auf 60⁰C, worauf man das Gemisch mit 0,6 μg an mit Eco RI verdauter' pKENOOS Plasmid-DNA versetzt und das Ganze mit Phenol extrahiert. Die DNAswerden durch Fällung mit Ethanol gewonnen, und die Eco RI-kohäsiven Enden werden durch 7 Stunden lange Behandlung bei 12,5⁰C mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuf f er miteinander verbunden, der 0,4 mMol ATP enthält. Unter Verwendung der ligierten DNAs transformiert man dann den Stamm JE5519 von Escherichia coli, NRRL B-15013, und selektiert die Transformanten bezüglich einer. Resistenz gegenüber Tetracyclin auf einer L-3rühenplatte , die 12,5 μg Tetracyclin pro ml enthält. Eine Analyse der Plasmid-DNAs, die aus den gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten durch die alkalische Schnelldenaturierungsmethode isoliert worden sind, zeigt eine Insertion des 462 bp Alu I-Fragments an der Eco Rl-Steile von

pKENOOS, wie sie bei 110 von Fig. 7 gezeigt ist, und eines der hierdurch erhaltenen Plasmide wird als pKENOOS bezeichnet.

- 42 ] 3. Konstruktion_des_Plasmids_gKEN010

Die nächste Stufe bei der Konstruktion der Klonierungsträger des Gens lpp mit Α-Stelle besteht in einer Eliminierung einer der beiden Eco RI-Spaltstellen von pKEN008. Dies ist notwendig, um sicherzustellen, daß die einzige Insertionsstelle, die für das zur Klonierung gewählte exogene Gen verfügbar ist, unmittelbar nach dem 462 bp Alu I-Fragment (welches jetzt ein Eco RI-Fragment ist) liegt, das den lpp-Genpromotor und die 5'-untranslatierte Region enthält. Die Strategie zur Entfernung der Eco RI-Stelle, die distal zum lpp-Genpromotor liegt, geht schematisch aus Fig. 8 hervor. '

Zur Bewerkstelligung dieses Ergebnisses geht man wie folgt vor: Man behandelt 4 μg mit Eco RI verdaute pBR322 Plasmid-DNA zuerst mit Sl-Nuclease zur Entfernung der Eco RI-kohäsiven Enden und dann mit BAP zur Verhinderung einer Selbstligation. Wie schematisch aus 111 in Fig. 8 hervorgeht, vermischt man die DNAs dann mit 0,75 μg des gereinigten 462 bp Alu -I-Fragments ( das von dem oben im Zusammenhang mit der Fig. 7 beschriebenen pKENlll stammt) und ligiert das Blunt-Ende 16 Stunden bei 12,5⁰C mit 2,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält. Eine Hälfte der ligierten DNA verwendet man zur Transformation des Stammes JE5519 von E,scherichia coil, NRRL B-15013, wobei sich dann ergibt, daß einer der Transformanten das Plasmid mit der in Fig. 8 bei 112 gezeigten Struktur enthält. Dieses Plasmid wird als pKEN002 bezeichnet. Man verdaut 2 5 μg pKEN0 0 2. Plasmid-DNA'mit Pvu I-Restriktionsenzym und Xba I-Restriktionsenzym in 500 μΐ eines Puffer aus 6 mMol TrisrHCl (pH 7,9), 6 mMol MgCl-/ 150 mMol NaCl, 6 mMol ß-Mercaptoethanol und 100 ;jg/ ml--BSÄ (dieses Gemisch wird- im folgenden als Barn HI-Puffer bezeichnet) 1 Stunde bei 37⁰C, wodurch man nach gelelekt.rophoretischer Reinigung ein 1,04.Kb Pvu I-Xba I DNA-Fragment erhält (das in Fig. 8 bei 113 gezeigt ist).

Wie aus Fig. 8 bei 114 schematisch hervorgeht, erhält man aus pKEN008 in folgender Weise ein 24 bp Xba I-Eco RI-DNA-Fragment: Man verdaut 25 μg pKEN008 Plasmid-DNA mit Eco RI-Restriktionsenzym und unterzieht ein 470 bp Eco RI-Fragment einer Reinigung durch Gelelektrophorese. Sodann verdaut man 1 μg des '470 bp Eco RI-Fragments mit Xba I-Restriktionsenzym und vermischt das Ganze mit 1 μg des vorher erhaltenen 1,04 Kb Pvu I-Xba I DNA-Fragments sowie mit 0,75 μg pKEN005 Plasmid-DNA, die vorher mit Pvu I-Restriktionsenzym und Eco RI-Restriktionsenzym verdaut worden ist (wie dies bei 115 in Fig. 8 gezeigt ist). Das DNA-Gemisch wird mit 0,8 Einheiten T4 DNA-Ligase in 50 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 mMol ATP enthält, 7 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Eine Hälfte' der ligierten DNA verwendet man zur Transformation des Stammes JE5519 von Escherichia coli, NRRL B-15013, wobei man entsprechende Transformanten bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Tetracyclin selektiert. Eine Analyse der aus 0,5 ml Kulturen der gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten durch die alkalische SchneiIdenaturierungsmethode erhaltenen Plasmid-DNAs zeigt, daß eines der Plasmide die in Fig. 8 bei' 116 gezeigte Struktur hat. Dieses Plasmid wird als pKENOlO bezeichnet.

4. Konstruktign_des_Plasmids_pKEN018

Die zur Klonierung eines DNA-Fragments, das die 3'-untranslatierte Region und die Transkriptionsterminationsstelle des lpp-Gens enthält, angewandte Strategie geht' aus Fig. 9 hervor. Als Fragment wird für diesen Zweck ein 0,95 Kb Pvu II-Hpa I-Fragment von pKENlll ausgewählt, wie dies schematisch bei 105D von Fig. 5 gezeigt ist. Das Pvu II-Restriktionsenzym spaltet die lpp-Gensequenz zwischen den Stellungen +1.67 und +163, und dieses Fragment enthält daher etwa die letzte Hälfte des lpp-Gens (siehe Fig. 1 und 5). Zur Insertion dieses Fragments in den Klonierungsträger in der gleichen Orientierung wie beim Promotorfragment befestigt man einen' Barn HI-Linker oder einen

] Sal I-Linker an der Pvu II-Spaltstelle oder der Hpa I-Spaltstelle. ;

Wie aus 117 von Fig. 9 schematisch hervorgeht, gelangt man zu einem 2,8 Kb Eco RI-Fragment ' ausgehend von pKENlll Plasmid-DNA durch Verdauung mit Eco RI-Restriktionsenzym und Fraktionierung auf einem Polyacrylamidgel, und 10 μg dieses gereinigten Fragments verdaut man dann voll stan- dig bei 37⁰C über eine Zeitdauer von 1 Stunde mit Pvu II-

IQ Restriktionsendonuclease in 500 μΐ Hae HI-Puffer. Die Umsetzung wird durch Extraktion mit Phenol beendet und das Gemisch¹ mit Ether extrahiert. Die DNA-Fragmente werden mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt, zentrifugiert, erneut in 200 μΐ.0,3 Mol Natriumacetat gelöst und wieder mit

]5 0,5 ml Ethanol gefällt. Sodann vermischt man 5 μ9'.αβ3 mit Pvu II verdauten 2,8 Kb Eco RI-Fragments mit 390 pMol phosphorylierten Barn HI-Linker und unterzieht das Ganze einer Blunt-Endligation durch 16 Stunden lange Behandlung bei 12,5⁰C mit 6 Einheiten T4 DNA-Ligase in 25 μΐ Ligasepuffer, der. 0,6 mMol AT? enthält. Das Reaktionsgemisch wird mit Hae HI-Puffer auf 150 μΐ verdünnt und. zur Inaktivierung der T4 DNA-Ligase 10 Minuten auf 60⁰C erwärmt. Nach Zugabe von 60 Einheiten Hae III-Restriktionsenzym inkubiert man das. Gemisch 1 Stunde bei 37⁰C.

Der hier verwendete Bam HI-Linker (die von Collaborative Research stammt und in gleicher Weise phösphoryliert worden ist wie dies oben im Zusammenhang mit dem Eco RI-Linker beschrieben worden ist) hat die Basensequenz

CCGGATCCGG , wobei die Erkennungssequenz für das Re-

5 ' 3 ' GGCC

striktionsenzym Hae Ij.1 mnn ^an der Verbindungsstelle

irgendeines der beiden.Linkerfragmente erzeugt worden ist. Durch Einsatz des Hae III-Restriktionsenzyms in der oben angegebenen Weise zur Verdauung der mit dem 3am HI-Linker verknüpften Pvu II-Fragmente (diese Fragmente enthalten keinerlei innere Hae III-Spaltstellen)kommt es .somit zur Entfernung überflüssiger multipler Barn HI-Lin-

kerfragmente, die an das Pvu II-Ende gebunden sind, so daß nur ein solches Linkerfragment zurückbleibt, das direkt an ein solches Ende gebunden ist. Dieses Verfahren bedeutet eine starke Vereinfachung der Reinigung des DNA-Fragments, das das 3'-Ende des lpp-Gens enthält, wie dies im folgenden naher beschrieben wird.

Nach Inaktivierung des Hae III-Enzyms durch 10 Minuten langes Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 6O⁰C verdaut man die DNA-Fragmente 2 Stunden bei 37⁰C vollständig mit Hpa I-Restriktionsenzym in 400 μΐ Hpa I-Puffer. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol extrahiert, und die DNA-Fragmente werden mit Ethanol gefällt, unter Vakuum getrocknet, in 100 μΐ Gelpuffer gelöst und auf einem 5 %-igen PoIyacrylainidgel fraktioniert. Die DNA-Bande, die zu einer 0,95 Kb-Stellung gewandert ist, wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA-Fragmente werden vom Gel durch Elektrophorese eluiert. Nach Entfernung des Ethidiumbromidfarbstoffs durch Extraktion mit Phenol werden die DNA-Fragmente mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt, zentrifugiert, in 200 μΐ 0,3 Mol Natriumacetat gelöst, erneut mit 0,5 ml Ethanol gefällt und wiederum unter Vakuum getrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu etwa 1 ug eines gereinigten 0,95 Kb Hae III-Hpa I-Fragments, wie dies bei 118 in Fig.

9 gezeigt ist.

Man vermischt 120 pMol phosphorylierten Sal !-Linker

5 ' 3 ' ( GGTCGACC , erhalten von Collaborative Research und nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben phosphory liert) mit 0,75 μg des gereinigten 0,95 Kb Hae· III-Hpa I-Fragments und unterzieht dieses einer Blunt-Endenligation mit 3,5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 25 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol AT? enthält, durch 16 Stunden lange Behandlung bei 12,5 ⁰C. Das Reaktionsgemisch wird mit so . viel Bam HI-Puffer vermischt, daß sich ein Endvolumen von 3 00 μΐ ergibt, worauf man das Ganze 10 Minuten auf 60⁰C erwärmt. Anschließend gibt man ausreichende Mengen an 3am HI-Restriktionsenzym und SaI I-Restriktionsenzym zu

und inkubiert das Gemisch 2 Stunden bei 37°C, um.so kohäsive Enden durch Spaltung des Bam HI-Linkers und des SaI I-Linkers zu bilden, der an das Pvu II-Ende bzw. das Hpa I-Ende gebunden ist, wodurch man zu einem 0,95 Kb Bam KI-SaI I-Fragment gelangt, wie dies in Fig. 9 bei 119 gezeigt ist. Die Verdauung mit Restriktionsendonuclease wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 60⁰C beendet.

An dieser Stufe vermischt man dann die Hälfte des Volumens des Gemisches (150 μΐ), das etwa 0,38 μg des 0,9 5 Kb Bam HI-SaI I-Fragments enthält, mit 1 μg pKEN014 Plasmid-DNA, die man- vorher mit Barn HI-Restriktionsenzym und SaI I-Restriktionsenzym verdaut und mit BA? behandelt hat, wie dies schematisch bei 120 von Fig. 9 gezeigt ist. Das Plasmid pKEN014 erhält man aus pBR3 22 durch vorherige Auslöschung am 346 bp Hind Ill-Barn HI-Fragment (das den Großteil des Gens für die Tetracyclinresistenz enthält) von pBR3 22. Dieses Fragment wird entfernt, um so die Größe der Expressionsplasmide auf einem Minimum zu halten (etwa auf 5 Kb). Die Auslöschung dieses Fragments erreicht man, wie dies in Fig. 9 bei 121 schematisch gezeigt ist, durch Verdauung mit Hind III, anschließende einstündige Behandlung bei 20⁰C mit Sl-Nuclease, Anknüpfung von Bam HI-Lin-

25' ker, vollständige Verdauung mit Barn HI, Rezirkularisationdurch T4 DMA-Ligase und Selektion der gegenüber Tetracyclin sensitiven Transformanten.

Das Gemisch aus der linearisierten pKEN014 Plasrnid-DNA und 0,95 Kb Barn HI-SaI I-Fraginenten wird, mit Phenol extrahiert, worauf man die DMAs mit 2,5 Volumina Ethanol fällt, zentrifugiert und in..200 μΐ 0,3 Mol Natriumacetat löst. Die DNAs werden dann erneut mit 0,5 ml Ethanol gefällt , zentrifugiert und unter Vakuum getrocknet. iMan anelliert kohäsive Enden der DNA-Fragmente mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 60 ul Ligasepuffer, der 0,4 mMol ATP ·. enthält, 7 Stunden bei 12,5°C. 12 ul des ligierten Gemisches verwendet man dann zur Transformation des Stammes

JE5519 von Escherichia coli, NRRL B-I5013,.wobei man 12 der gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten über Nacht in 1 ml einer L-Brühe wachsen läßt, die 50 μg Ampicillin pro ml enthält. Die Plasmid-DNAs werden aus 0,5 ml der Kulturen durch die alkalische Sehnelldenatürierungsmethode isoliert und durch Elektrophorese mit Agarosegel analysiert. Hierbei zeigt sich, daß fünf der Plasmid-DNAs das 0,95 Kb Bam HI-SaI I-Fragment tragen, und eines dieser Plasmide wird als pKEN018 bezeichnet. Eine DNA-Sequenzierung der pKENOlS Plasmid-DNA ergibt die in Fig. 9 bei

122 angegebene Struktur, und daraus geht vor allem hervor, ' daß der Barn HI-Linker an der Pvu II-Stelle im lpp-Gen an der korrekten Stellung gebunden ist.

5. Konstruktion_des_Plasinids_DKEN0 21

Die nächste Stufe bei der Konstruktion der Klonierungsträger des Ipp-Gens in Α-Stelle besteht in einer Vereinigung des lpp-Promotorfragments mit dem Transkriptionsterminatorfragment in gleicher Orientierung. Zur Durchführung dieser Stufe ersetzt man ein 630 bp Pvu I-Eco RI-Fragment von pKEM018 durch ein 1,1 Kb Pvu I-Eco RI-Fragment von pKENOlO, wie dies schematisch aus Fig. 10 hervorgeht.

Zur Bewerkstelligung dieses Ergebnisses unterzieht man 2 0 μg pKENOlO Plasmid-DNA einer vollständigen Verdauung (wie dies in Fig. 10 bei 123 gezeigt ist) mit Pvu I-Restriktionsendonuclease in 100 μΐ Bam HI-Puffer bei 37°C über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden. Nach Inaktivierung des Pvu I-Enzyms durch 10 Minuten langes Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 60°C versetzt man das Ganze mit. 5 2 μΐ Wasser, 40 μΐ 0,5 Mol Tris:HCl (pH 7,5), 4 μΐ 0,1 Mol MgCl_? und 40 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert, und die Verdauung wird durch Extraktion mit Phenol beendet. Dia DNA-Fragmente werden mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt, unter Vakuum getrocknet, in 100 μΐ Gelpuffer gelöst und über 5 % Polyacrylamidgel fraktioniert. Nach Slution der abge-

' ' trennten DNA-Fragmente vom Gel erhält man 4 μg eines gereinigten 1,1 Kb Pvu I-Eco RI-Fragments.

Das gereinigte Fragment (0,75 μg) vermischt man mit 0,6 μg 5- pKEN018 Plasmid-DNA, die man vorher einer Doppelverdauung mit Pvu I-Restriktionsenzym und Eco RI-Restriktionsenzym unterzogen und dann mit BAP behandelt hat, wie dies in. Fig. 10 bei 124 gezeigt ist. Die Pvu I-kohäsiven Enden und die Eco Rl-kohäsiven Enden ligiert man durch Behandlung mit 0,4 Einheiten T4 DMA-Ligase in 50 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 miMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 7 Stunden bei 12,5⁰C. Unter Verwendung von 25 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man dann den-Stamm JE5519 von Escherichia coli, NRRL B-15013, und selektiert entsprechende Transformanten bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin. Die Plasmid-DNAs werden aus den gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten isoliert und durch Elektrophorese mit Agarosegel analysiert.. Eine Restriktionsenzymkartographie zeigt, daß eines der Plasmide die in Fig. 10 bei 125 angegebene Struktur hat, und dieses .Plasiiiid wird als pKEN021 bezeichnet.

6. Konstruktion_des_Plasmids_DKEN037

,25 Dj__e Fig. 11 zeigt die letzte Stufe bei der Konstruktion des ersten Ipp-Genexpressionsplasmids an einer A-Stalle.-Wie in Fig. 11 bei 126 gezeigt ist, trägt pKEN021 sowohl das Ipp-Promotorfragment als auch das Ipp-Transkriptionsterminatorfragment, und beide sind über ein 3 2 bp-Frag—

^ου ment voneinander getrennt, das von pBR322 stammt. Durch Auslöschung des letztgenannten Fragments und Insertion einer DNA-Sequenz, die für ein gewünschtes Polypeptid codiert, erhält man ein funktionelles Bruchstück zur Expression des gewünschten Polypeptids. An den Enden des 32 bp- ° Fragments gibt es"jedoch Eco RI- und Barn H±-Spaltstellen,

so daß die Struktur des Plasmids pKEN021 lediglich die .- Insertion exogener DNA-Insertfragmente erlaubt, die : Eco RJ-Eco RI, Barn HI-Barn HI oder Eco RI-3am HI kohäsive

Enden haben. Zur Erweiterung der Klasse an exogenen Genen, die durch Insertion so umgewandelt werden können, daß sie auch andere Kombinationen an kohäsiven Enden umfassen, wird die DNA-Sequenz in dieser Region daher unter Anfügung einer Hind Ill-Spaltstelle zwischen den vorhandenen Stellen Eco RI und Bam HI abgewandelt.

Zur Erzielung dieses Ergebnisses ist zuerst eine Verringerung der Größe des Plasmids durch Eliminierung des 200 bp Hind III-CIa I-Fragments in pKEN0 21 wünschenswert, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man unterzieht 5 μg PKEN021 Plasmid-DNA einer Teilverdauung mit einer Einheit CIa I-Restriktionsenzym in 100 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 10 mMol Tris:HCl (pH 8,0), 10 mMol MgCl₂ und 100 μΐ/ml BSA über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C. Nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol entfernt man die CIa I-kohäsiven Enden durch Behandlung mit 600 Einheiten Sl-Nuclease in 200 μΐ Sl-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 20⁰C. Die Reaktion wird durch Zusatz von 20 μΐ 0,5 Tris;HCl (pH 8,0) und 20 μΐ an 0,25 Mol EDTA beendet. Das Gemisch wird mit Phenol extrahiert und 4 Stunden gegen 0,01 χ SSC dialysiert. Die DNAs werden mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 100 μΐ 0,3 Mol Natriumacetat resuspendiert.

Die DNAs v/erden erneut mit 250 μ! Ethanol gefällt, zentrifugiert und unter Vakuum getrocknet.

1 \x'q der mit Sl behandelten DNA vermischt man dann mit 70 pMol phosphoryliertem Hind III-Linker (^D CCAAGCTTGG , von Collaborative Research erhalten und nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben phosphoryliert) und unterzieht das Ganze einer Blunt-Endenligation mit 4 Einheiten T4-DNA-Ligase in 2 0 μΐ Ligasapuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von

16 Stunden bei 12,5 C. Das Gemisch wird dann mit Hind Ill-Puffer auf 100 μΐ verdünnt und 10 Minuten auf 6O⁰C erwärmt. Man gibt 20 Einheiten Hind III-Restriktionsendonuclease zu und inkubiert das Gemisch 1 Stunde bei 37⁰C, um hier-

durch überflüssige Linkermoleküle zu entfernen und. Hind Ill-kohäsive Enden zu bilden.Sodann extrahiert man das Reaktionsgemisch mit Phenol und fällt die DNAs mit Ethanol. Die Plasmid-DNAs (0,5 μΐ) werden zur Rezirkularisation mit 0,8 Einheiten T4'DNA-Ligase in 15 μΐ Ligasepuffer, der 0,4.mMol ATP enthält, 7 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Unter Verwendung von 8 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man dann den Stamm JA221 von Escherichia coli, NRRL B-I5014 (recA-, hr-, h~, trpE5, thr,

^ leu, thi, lacY-, der von. Dr. J. Carbon vom Department of Biological; Sciences, University of California, Santa' Barbara, V.St.A. stammt). Dieser Stamm ist in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, . US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A.,' hinterlegt und von dort frei beziehbar. Unter den Plasmid-DNAs, die von den .gegenüber Ampicillin resistenten Trans-, formanten gereinigt werden, ist eines, das die in Fig/ Il bei 127 angegebene. Struktur hat, und dieses Plasmid wird

als pKEN030 bezeichnet. .

Zur Eliminierung der Hind Ill-Spaltstelle von ρΚΞΝ0 3Ό· unterzieht man' 2,5 pg pKEN030 Plasmid-DNA einer Verdauung mit 5 Einheiten Hind III-Restriktionsenzym in 50 μΐ Hind HI-Puffer bei 37⁰C über eine Zeitdauer von 1 Stunde. Nach

Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol entfernt man die Hind III-kohäsiven Enden durch Behandlung mit 400 Einheiten S1-NuClease in 200 μΐ Sl-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 20°C. Nach Gewinnung der DNA rezirkuliert man 0,75 μg der mit Sl behandelten Plasmid-DNAs durch Be-

'

handlung mit 2 Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 μΐ Ligase-'puffer,, der 0,6 mMol ATP enthält, bei 12,5⁰C über eine Zeitdauer von 16 Stunden. Unter Verwendung von 3 μ Γ des ligierten Gemisches transformiert man dann den Stamm

JA221 von Escherichia coli, NRRL 3-15014, und durch Iso-.

lierung aus den gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten ergibt sich ein Plasmid, das die in Fig. 11 bei .128 gezeigte Struktur hat. Dieses Plasmid wird als pKEN0 bezeichnet und enthält keine Hind Ill-Spaltstellen.

Wie in Fig. 11 bei 129 und im einzelnen- in Fig.'12 schematisch gezeigt ist, ergibt sich durch Abwandlung der DNA-Sequenz des Plasmids pKEN033 eine Hind Ill-Spaltstel-Ie zwischen den Stellen Eco RI und Bam HI, und hierzu wird wie folgt vorgegangen: Man verdaut 5 μg pKEN033-Plasmid DNA,(die über die interessierende DNA-Sequenz verfügt, welche in Fig. 12 durch die Linie a gezeigt ist) mit 10 Einheiten Barn HI-Restriktionsendonuclease in 50 μΐ Bam HI-Puffer bei 37⁰C über eine Zeitdauer von 1 Stunde.

]0 Nach Inaktivierung des Bam HI-Enzyms durch 10 Minuten langes Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 60⁰C verdaut man die linearisierten DNA-Fragmente weiter mit 10 Einheiten Eco RI-Enzym in 100 μΐ Eco RI-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37°C (siehe Linie b von Fig.

12). Nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol behandelt man die DNAs (3,6 μg) mit 3 Einheiten T4 DNA-Polymerase (von Bethesda-Research Laboratories)- in 2 0 μΐ eines Reaktionsgemisches, das 50- mMol Tris:HCl (pH 8,0), 100 mMol KCl, 6 mMol MgC1« und 6 mMol Dithiothreit enthält (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden als PoIymerasepuffer bezeichnet), in Anwesenheit von jeweils 0,1 mMol dATP, dGTP, dCTP und dTTP über eine Zeitdauer von 45 Minuten bei 12,5⁰C. Bei diesem Verfahren werden die Bam HI- und die Eco RI-Sticky-Enden vollständig eingefüllt, wie dies die Linie c von Fig. 12 zeigt.

Nach Gewinnung der DNAs gibt man zuerst 300 pMol phosphorylierten Hind III-Linker zu und unterzieht das Ganze dann einer Blunt-Endenligation mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 15 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C. Hierauf wird das Gemisch mit Hind HI-Puffer auf 100 μΐ verdünnt und mit 100 Einheiten Hind III-Restriktionsenzym verdaut. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert, um hierdurch überflüssige Linkermoleküle zu entfernen und Hind III-kohäsive Enden zu bilden (siehe Linie d bei Fig. 12), die dann (unter gleichzeitiger Rezirkularisierung der Plasmid-DNAs) miteinander verbunden werden, indem man

0,8. μ9 der DNA mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ. Ligasepuf f er , der 0,4 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 7 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Nach Transformation des Stammes JA221 von Escherichia coli, NRRL B-15014, 5 mit einem Teil des ligierten Gemisches isoliert man aus den gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien Plasmid-DNAs, und eines dieser Plasmide hat die in Fig. 11 bei 130 angegebene Struktur und wird als pKEN037 bezeichnet. Eine· >Analyse der DNA-Nucleotidsequenz von pKEN037 ergibt die in der Linie e von Fig. 12 gezeigte DNA-Sequenz, bei welcher ein G-C-Paar zwischen'der Hind Ill-Spaltstelle und der Barn HI-Spaltstelle ausgelöscht ist (wobei die Gründe hierfür bisher nicht bekannt sind), und hierdurch wird bestätigt, daß pKEN037 der konstitutive A-1-Klonierungsträger ist.

7. Konstruktion_des_Plasmide_p_KEN039_und_p_KEN040

Zur Akkomodierung von DNA-Insertfragmenten am Leserahmen,

die sich vom Leserahmen von pKEN037 unterscheiden, konstruiert man A-2- und A-3-lpp-Genklonierungsträger durch An- ' passung des Leserahmens von pKEM030 an der Eco RI-Spaltstelle.Sowohl die Linie a von Fig. 13 als auch die Linie a von Fig. 14 zeigen die DNA-Secuenz, die die Translations-

" ' '

initiationssteile des Prolipoproteins im pKENlll umgibt.

Diese Sequenz enthält, wie ersichtlich, eine Alu I-Spaltstelle zwischen den Stellungen + 4 5 und +4 6. Zur Bildung von Plasmid pKEN0 0 8 wird ein Eco RI-Linker am Alu I-Ende befestigt, wodurch sich die in Fig-. 13 mit der Linie b und in Fig. 14 ebenfalls mit der Linie., b gezeigte DNA-Sequenz in den Plasmideη pKEN0 08, .pKENOlO, pKEN0 21 und pKEN0 30 ergibt, und wodurch zwischen den Stellungen +4 7 und +48 eine Eco Rl-Spaltsteile gebildet wird. Die DNA-Sequenz von pKEN030 wird an der Eco Rl-Stelle so abgewandelt, wie dies die Linie c von Fig. 13 und auch die Linie c von Fig. 14 zeigen, wodurch sich ihr Leserahmen um eine Base bzw. um zwei Basen verschiebt.

-SJ-

Zur Erzielung dieses Ergebnisses im ersten Falle einer Bildung eines Plasmids mit einem A-2-Leserahmen verdaut man 5 μg pKEN030 Plasmid DNA vollständig mit Eco RI-Restriktionsenzym in 100 μΐ Eco RI-Puffer über eine Zeitdauer von 60 Minuten bei 37⁰C. Nach Extraktion mit Phenol, und Fällung mit Ethanol behandelt man die DNAs mit 3 Einheiten T4 DNA-Polymerase in 30 μΐ Polymerasepuffer in Anwesenheit von 0,1 mMol dGTP und 0,1 rruMol dATP über eine Zeitdauer von 45 Minuten beil2,5°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mMol beendet, worauf sich eine Extraktion mit Phenol anschließt. Durch dieses Verfahren wird die Hälfte des 4-Basen Eco Rl-klebrigen Endes mit zwei Resten A auf"· • gefüllt. Die verbleibenden zwei einzelsträngigen Reste Ά werden durch Behandlung mit Sl-Nuclease in 200 μΐ Sl-Puffer bei 20⁰C über eine Zeitdauer von 1 Stunde entfernt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 μΐ 0,5 Mol .Tris:HCl (pH 8,0) und 20 μΐ 0,2 5 Mol EDTA beendet. Das Gemisch wird mit Phenol extrahiert und über Nacht gegen 0,01 χ SSC dialysiert. Die DNAs werden mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt, zentrifugiert und erneut in 100 μΐ 0,3 Mol Natriumacetat suspendiert. Die DNAs werden wieder mit 250 μΐ Ethanol gefällt-, zentrifugiert und unter Vakuum getrocknet.

Zur" Wiederherstellung der Eco Rl-Spaltstelle vermischt man 1 μg der mit Sl behandelten DNA zuerst mit 7.0' pMol phosphoryliertern Eco RI-Linker und unterzieht das Ganze einer Blunt-Endenligation mit 3,2 Einheiten T4 DNA-Ligase in 11 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5 ⁰C. Das Gemisch wird dann mit Eco RI-Puffer auf 5 0 μΐ verdünnt und IQ Minuten auf 6O⁰C erwärmt. Das Gemisch wird mit 20 Einheiten an Eco RI-Restriktionsendonuclease versetzt und .1 Stunde bei 37⁰C inkubiert, um auf diese weise überflüssige Linkermo-

¹^ leküle zu entfernen und Eco RI-kohäsive Enden zu bilden. Sodann extrahiert man das Reaktionsgemisch mit Phenol und fällt die DNAs mit Ethanol. Die Plasmid-DNAs (0,5 μg) werden zur Rezirkularisierung mit 0,8 Einheiten T4 DNA-

Ligase in 15 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 mMol ATP enthält, 7 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Unter Verwendung von 8 μΐ des ligiertert Gemisches transformiert man dann den Stamm JA221' von Escherichia coli, NRRL B-15014. Die Plasmid-DNAs werden von drei gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten gereinigt, die über Nacht in 100 ml einer L-Brühe gewachsen sind, die 50 μg Ampicillin/ml enthält und die DNA-Sequenzen an .ihren Eco Rl-Spaltstellen werden bestimmt. Eine davon hat die der Linie c in Fig. 13 entsprechende Sequenz und wird als pKEN0 2 4 (A-2) bezeichnet.

Zur Konstruktion eines Plasmids mit dem A-3-Leserahmen unterzieht man 5 μg pKEN030 Plasmid-DNA einer vollständigen Verdauung mit Eco RI-Restriktionsenzym in 100 μΐ' Eco RI-Puffer bei 37⁰C über eine Zeitdauer von 60 Minuten. Nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol entfernt man die Eco RI-Sticky-Enden durch Behandlung der DNA (4,4 μg) mit 500 Einheiten Sl-Nuclease in 150 μΐ Sl- :Puffer über eine Zeitdauer von·!'Stunde bei 2O⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 μΐ 0,5 Tris:HCl (pH 8,0) und. 15. μΐ 0,25 Mol EDTA beendet. Das Gemisch wird mit Phenol extrahiert und 4 Stunden gegen 0,01 χ SSC dialysiert. Die DNAs werden mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt, zentrifugiert und¹ wieder in 10.0 μΐ 0,3 Mol Natriumacetat suspen- diert. Die DNAs werden erneut mit 250 μΐ Ethanol gefällt, zentrifugiert und unter Vakuum getrocknet.

Zur Wiederherstellung der Eco RI-Spaltstelle vermischt man 1 ug der mit Sl behandelten DNA zuerst mit 240 pMol phosphoryliertem Eco RI-Linker und unterzieht das Ganze dann einer Blunt-Endenligation mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 15 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, bei 12,5°C über eine Zeitdauer von 16 Stunden. Das Gemisch wird dann mit Eco Rl-Puffer auf 250 μΐ verdünnt und 10 Mi-. nuten auf 6 0⁰C erwärmt. Das Gemisch wird mit 100 Einheiten Eco RI-Restriktionsendonuclease versetzt und dann - 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert, um hierdurch überflüssige Linkermoleküle zu entfernen und Eco Rl-kohäsive Enden zu bilden. .

Ί Sodann extrahiert man das Reaktionsgemisch mit Phenol und fällt die DNAs mit Ethanol. Die Plasmid-DNAs (0,3 μg) werden zur Rezirkularisation mit 0,8 Einheiten T4 DNA-Ligase in 15 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 mMol ATP enthält, 7 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Unter Verwendung von 8 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man dann den Stamm¹ JA221 von Escherichia coli, NRRL-B-15014. Die Plasmid-DNAs werden von drei gegenüber Ampicillin resistenten Transforiti.anten gereinigt, die über Nacht in 100 ml L-Brühe gewachsen sind, die 50 μg Ampicillin/ml enthält, und die DNA-Sequenzen an ihren Eco RI-Spaltstellen werden bestimmt. Eine davon hat die in der Linie c von Fig. 14 angegebene Sequenz und wird als pKEN036 (A-3) bezeichnet.

zur Veränderung des translationalen Leserahmens von pKEN037 (A-I) in die beiden anderen Leserahmen (A-2 und A-3) ersetzt man das kleinere Xba I-Eco Rl-Fragment von pKEN037 durch die kleineren Xba I-Eco RI-Fragmente von pKEN024 (A-2) oder pKEN036 (A-3), wie dies schematisch in Fig. 15 gezeigt ist, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man verdaut 3 μg pKEN037 (wie dies in Fig. 15 bei . 131 gezeigt ist) mit 6 Einheiten Xba I-Restriktionsenzym in 50 μΐ Bam HI-Puffer bei 37°C über eine Zeitdauer von 1 S'tunde, worauf man nach Inaktivierung des Xba I-Enzyms die linearisierten DNA-Fragmente einer weiteren Verdauung mit 6 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 100 .ul Eco RI-Puffer bei 37°C über eine Zeitdauer von 1 Stunde unterzieht. Das größere Xba I-Eco RI-Fragment wird vom kleineren Fragment durch Elektrophorese mit Agarosegel,abge-

¹^ trennt. Hierzu färbt man die DNA-Fragmente im Agarosegel mit Sthidiumbromid (1 μg/ml) an und schneidet die dem größeren Fragment entsprechende Bande heraus. Die in dieser 3ande befindlichen DNA-Fragmente werden nach Einfrieren vom Gel eluiert. Das Ethidiumbromid wird von den DNA-

^OJ Fragmenten durch Extraktion mit phenol entfernt, und die DNAs werden durch Fällung mit Ethanol gewonnen.

Die getrockneten DNA-Fragmente werden in 2 0 μΐ Wasser ge-

' löst, und 1 μΐ dieses pKEN037 DNA-Fragmentgemisches vereinigt man mit 0,1 μg eines jeden der kleineren Xba I-Eco RI-Restriktionsfragmente (wie dies in Fig. 15 bei 132 gezeigt ist), das: man vorher aus pKEN024 oder pKEN036 durch Doppelverdauung eines jeden Plasmids mit Xba I-Restriktionsenzym und Eco RI-Restriktionsenzym und anschließende Gelreinigung erhalten hat, wie dies in Fig. 15 bei 133 angegeben ist. Die Sticky-Enden der Xba I-Eco. RI-Fragmente verbindet man durch Behandlung mit 0,2 Einheiten T4 DNA-Ligase in

10. 20 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 mMol ATP enthält, über eine .Zeitdauer von 7 Stunden bei 12,5°C, worauf man einen Teil des ligierten Gemisches zur Transformation des Stammes JA221 von Escherichia coli, NRRL B-15.014, verwendet.. Unter den gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten erhält man auch Plasmid-DNAs mit den A-2- und A-3-Leserahmen, und diese werden als pKEN039 bzw. als pKEN040 bezeichnet, und sie haben jeweils die in Fig. 15 bei 134 gezeigte Struktur.

Die obigen:Ausführungen zeigen das experimentelle Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pKEN039 (A-2) und pKENQ40 (A-3) im erstgenannten Fall. Selbstverständlich gibt es jedoch auch noch eine andere Methode, durch die sich solche Plasmide konstruieren lassen. Vor allem kann die DNA-Sequenz in der Nachbarschaft der Eco Rl-Spaltstelle des ^ Plasmids ρΚΞΝ037 (A-I) selbst abgewandeit werden, wia dies die Linien b und c des Reaktionsschemas von Fig. 13 oder auch die Linien b und c des Reaktionsschemas von Fig. 14 zeigen, und auf diese Weise gelangt man direkt zur Struktur der Plasmide pKEN0 39 (A-2) oder ΟΚΞΝ040 (A-3). 30

B. Konstruktion von B-Stellen-Plasmiden (pIN-I)

Die Fig. 16 bis 21 zeigen schematisch die Art und weise, in der sich rekombinante Plasmide, die die B-Insertionsstelle enthalten, konstruieren lassen-, und auf sie kann . im Zusammenhang mit der folgenden spezielleren Diskussion Bezug genommen werden.

Die erste Stufe bei der Konstruktion der B-Stellen-Expressionsplasmide besteht in einer Konstruktion eines Plasmids, das als Quelle für lpp-Fragmente dient/ die eine Restriktionsenzymspaltstelle an oder in der Nähe der Signalpeptidspaltstelle haben. Das hierzu ausgewählte Gen codiert für das Lipoprotein von Serratia marcescens und hat eine Fnu4H-I-Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz am 3'-Ende des Signalpeptids. Als Plasmid zum Empfang des lpp-Gens von Serratia marcescens wird pBR322 ausgewählt.

Wie in Fig. 16 bei 135 schematisch gezeigt, unterzieht man hierzu 2 μg Plasmid pBR322-DMA einer vollständigen Verdauung mit 2 Einheiten der Restriktionsendonuclease Bam HI in 50 μΐ Barn HI-Puf.fer über eine Zeitdauer von 60 Minuten bei 37⁰C. Nach Inaktivierung des Bam HI-Enzyms durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 6 0⁰C gibt man 2 Einheiten Eco RI und 100 μΐ Eco RI-Puxfer zu. Das Gemisch wird weitere 60 iMinuten bei 37°C inkubiert und die Umsetzung dann durch Extraktion mit Phenol beendet, wodurch man durch Fällung mit Ethanol zu den linearisierten DNA-Fragmenten gelangt.

Wie in Fig. 16 bei 136 .gezeigt ist, erhält man getrennt davon von einem hybriden λ-Phagen, das das ipp-'Geri von Serratia marcescens trägt (welches als /\lppSm-l bezeichnet wird) ein 8,5 Kb DNA-Fragment, das das lpp-Gen von Serratia marcescens enthält. Das lpp-Gen ist vorher in einen X-Phagenvektor Charon 14 (Science 196, 161 bis 169 (1977))' kloniert worden, wozu man wie folgt vorgeht: Man unterzieht Gesamt-DNA (200 μg), die aus Serratia marcescens isoliert worden ist, einer Verdauung mit 200 Einheiten des Restriktionsenzyms Sco RI. Die DNA-Fragmente 'werden auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt, wobei man Fraktionen von DNA-Fragmenten mit etwa 8,5 Kb, die

32

. mit 5' P-Lipoprotem mRMA eine positive Hybridisierung zeigen, unter Anwendung der Hybridisierungstechnik von Southern sammelt. Ein Gemisch aus 8,5 Kb Eco RI-Fragmen-

' ten (die etwa 20-fach angereichert sind) und mit Eco RI gespaltener Charon 14 Vektor-DNA wird mit T4 DNA-Ligase umgesetzt. Unter Verwendung von ligierter DNA transfiziert man dann Escherichia coLi K802, NRRL B-15016.

Rekombinante Phagan, die das Ipp-Gen tragen, werden durch die Fleckenhybridisierungstechnik von Benton und Davis

32 unter Verwendung von 5'- P-Lipoprotein mRNA ausgesucht.

Einer der.untersuchten Flecken, der eine positive Hybridisierung ergibt, wird als XlppSm-l bezeichnet. 1.0

2 \xq AlppSm-l DNA unterzieht man dann einer vollständigen Verdauung mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Eco RI in der oben im Zusammenhang mit der Linearisierung von PBR322 beschriebenen Weise , indem man 0,5 μg der AlppSm-l DNA-Fragmente mit 0,5 μg der-zuvor linearisierten Plasmid-pBR322-DNA in 40 μΐ .Ligasepuffer vereinigt. Das Gemisch wird 5 Minuten auf 37⁰C erwärmt, und die Eco RI-und Barn Hl-kohasiven Enden werden zur Anellierung zuerst 16 Stunden bei 4⁰G und dann eine Stunde bei 0⁰C inkubiert. Nach Zugabe von ATP (Endmenge 0,4 mMol) und 0/4 Einheiten T4. DNA-Ligase wird das Gemisch 7 Stunden bei 12,5⁰C inkubiert.

Ein-Viertel des Ligationsgemisches verwendet man dann zur Transformation des Escherichia coli lpp-Deletionsmutantenstamms JE5527, NRRL Β-15012.·ϋίβ Transformation wird wie in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110 bis. 2114 (1972) beschrieben durchgeführt, wobei man die gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten über Nacht auf 3MMFiI- ^ou terpapieren von Whatman wachsen läßt, die man auf die Oberfläche' einer L-Brühenplatte gegeben hat, welche 50 μα Ampicil1 in/ml enthält, und diese Transformanten dann hinsichtlich der Ipp-Klone durch Koloniehybridisierung heraussucht.. Ein 0,9 5 Kb Msp I-Fragment von AlppEc-l, das ^^u das Ipp-Gen enthält, unterzieht man einer Kerbentranslation mit /σο.-3 2p7dATP und /et -32p7dCTP unter Anwendung des in Proc. Natl. Acad. Sei USA 72, 1184 bis 1138 (1975) be- schriebenen Verfahrens, und dieses wird als ?-Probe ver-

wendet. Einer der Transformanten, der eine positive Hybridisierung ergibt, enthält das Plasmid mit der in Fig. 16 bei 137 angegebenen Struktur, und dieses Plasmid wird als pKEN2 21 bezeichnet.

2. Konstruktion_des_Plasmids_pKEN00 9_

Zur Konstruktion der B-Stellen-Klonierungsträger kloniert man ein 329 bp Fnu4H-I-Fragment, das den lpp-Promotor und die 5'-untranslatierte Region sowie die Signalpeptidregion des Ipp-Gens von Serratia marcescens enthält (dieses Fragment ist in Fig. 5 bei 105B schematisch gezeigt) zuerst in pKEN005, wie dies in Fig. 17 bei 138 gezeigt ist, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man unterzieht

]5 80 μg pKEN221 Plasmid-DNA einer vollständigen Verdauung mit 100' Einheiten der Restriktionsendonuclease Fnu4H-I (New England Biolabs) in 400 μΐ Hae III-Puffer, und reinigt ein 324 bp Fnu4H-I-Fragment durch Elektrophorese mit Acrylamidgel.

Die Verdauung mit Fnu4H-I-Restriktionsenzym führt zur Bildung von Fragmenten mit Sticky-Enden ah beiden Enden, und diese Sticky-Enden werden daher durch Auffüllen mit T4 DNA-Polyrnerase so abgewandelt, daß sich Blunt-Enden ergeben.

2 μg des gereinigten 324 bp Fnu4H-I-Frägments behandelt man mit 3 Einheiten T4 DNA-Polymerase in 20 μΐ Polymerasepuffer in. Anwesenheit von jeweils 0,1 mMol dATP, dGTP, dCTP und dTTP über eine Zeitdauer von 4 5 Minuten bei 12,5⁰C. Mach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol vermischt man die DNA-Fragmente mit 400 pMol phosphoryliertem Eco. RI-Linker und behandelt das Ganze mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C. Das Gemisch wird mit Eco RI-Puffer auf 300 μΐ verdünnt und mit 150 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym verdaut, um hierdurch Eco RI-kohäsive Enden zu bilden.

Man vermischt 1 μg der mit Eco RI verdauten Fragmente

] dann mit 0,5 μg der mit Eco RI verdauten pKEN005 Plasmid-DNA und behandelt das Ganze hierauf mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 40 μι Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C. Unter Verwendung von 20 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man dann den Stamm JE5519 von Escherichia coli, NRRL B-15013. Nach Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNAs, die man aus gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten durch das alkalische SchneiIdenaturierungsverfahren er-

]0 halt, wird ein Plasmid gefunden, das ein 334 bp Eco RI-Fragment trägt, welches von dem 329 bp Fnu4H-I-Fragment abgeleitet ist, und dieses Plasmid (das in Fig. 17 bei 139 schematisch gezeigt ist) wird als pKEN009 bezeichnet. Durch DNA-Nucleotidsequenzanalyse der pKEN009-Plasmid-DNA

;]5 ergibt sich,, daß die Eco RI-Stelle im pKEN009 an der B-Insertionsstelle liegt und dem Leserahmen, von B-I entspricht. Dieses Plasmid hat die in der Linie b von Fig. 19 und auch in der Linie b von Flg. 20 gezeigte DNA-Sequenz. Aus bis heute unverständlichen Gründen sind drei Basenpaare in' die Region der Stellung +90 inseriert worden (was mit einer Addition eines zusätzlichen Aminosäurerests an dieser Stellung verbunden ist), wobei zudem auch ein zusätzliches G-C-Paar ah der Stellung +99 inseriert worden ist-. Der überraschende kumulative Effekt dieser Veränderungen liegt in einer Umwandlung der Aminosäuresequenz in der Region der Signalpeptidspaltstelle vom Ipp-Gen von Serratia.marcescens in das Ipp-Gen von Escherichia coli.

Zur Konstruktion von B-Stellen-Expressionsplasmiden, die den B-2- und B-3-Leserahmen entsprechen, ist zuerst eine Eliminierung einer der beiden Eco RI-3paltstellen von pKEN009 erforderlich. Die Strategie zur Entfernung der Sco RT-Stelle, die oberhalb des Ipp-Promotors liegt, geht schematisch aus Fig. 18 hervor. Dieses Verfahren besteht in einer Übertragung eines 80 bp Xba I-Eco RI-Fragments (das das Signalpeptid und einen Teil der 5'-untranslatier-

- bi -

ten Region des Ipp-Gens von Serratia marcescens enthält) von pKEN009 in die Xba I-Eco RI-Stellen von pKENOlO.

Zur Erzielung dieses Ergebnisses verdaut man zuerst 5 μg pKENOlO Plasmid-DNA mit 5 Einheiten Xba I-Restriktionsendonuclease in 5 μΐ Bam HI-Puffer, und unterzieht das Ganze dann einer nachfolgenden Verdauung mit 5 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 100 μΐ Eco RI-Puffer.'Hierauf behandelt man die linearisierte DNA mit 5 μΐ BAP in 100 μΐ 10 mMol Tris:HCl (pH 8,0) und 0,1 mMol EDTA über eine Zeitdauer von 30 Minuten bei 37°C. Die Plasrnid-DNAs werden mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, worauf man 0,5 μσ der DNA mit 0,2 μg eines 80 bp Xba I-Eco RI-Fragments vermischt, das vorher durch Verdauung von 50 μg pKEN009 Plasmid-DNA mit Sco RI-und Xba I-Restriktionsenzymen unter anschließender Elektrophorese mit Polyacrylamidgel gebildet worden ist. Das DNA-Gemisch wird mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 40 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 iruMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5³C behandelt·. 20 μΐ des ligierten Gemisches verwendet man dann zur Transformation des Stammes JE5519 von Escherichia coli, NRRL B-15013. Nach Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNAs, die man durch die alkalische Schneildenaturierungsmethode aus gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten erhalten hat, wird ein Plasmid gefunden, das das gewünschte 8 0 bp Xba I-Eco RI-Fragment enthält, welches die Signalpeptidregion des Ipp-Gens von Serratia marcescens im 3-1-Leserahmen trägt, wie dies aus Fig. 18 bei 140 gezeigt ist, und dieses Plasmid wird als ΡΚΞΝ017 bezeichnet.

Der Leserahmen an der 3-Insertionsstelle im ρΚΞΝ017 wird dann so modifiziert, daß sich Plasmide mit den B-2- und

3-3-Leserahmen ergeben, wozu man sich der oben beschriebe ° benen Methoden zur Veränderung des A-I-Leserahmens in den A-2-Leserahmen oder den A-3-Leserahmen bedient. Diese Verfahren sind in Fig. 18 schematisch bei 141 und 142 gezeigt, und die entsprechenden Abwandlungen der DMA-Sequenz

um die Eco Rl-Spaltstelle gehen aus'den Fig. 19 und 20 hervor. Das gleiche Verfahren, wie es zur Bildung der Plasmide pKEN024 (A-2) und pKEN036 (A-3) aus dem Plasmid pKEN030 (A-I) verwendet worden ist, das oben in Verbindung mit den Fig. 13 und 14 beschrieben worden ist, kann natürlich auch zur Bildung der Plasmide pKENO'2 6 (B-3) und pKEN027 (B-2) aus dem Plasmid pKEN017 (B-I) herangezogen werden.

4. Konstruktion_der Plasmide_pKEN041_i_pKEN047_und_gKEN048

Die Fig. 21 zeigt schematisch die letzte Stufe bei der ,Konstruktion der B-Stellen-Klonierungsträger, bei der es sich um einen Ersatz des Xba I-Eco RI-Stellenfragmsnts von pKEN037 durch jedes der drei verschiedenen Xba I-Eco RI-B-Stellenfragmente von pKEN017, pKEN026 und pKEN027 handelt. Dies ist notwendig, damit sich 3-Stellenplasmide mit der gleichen Sequenz an Eco Rl-, Hind III- und Bam HI- Restrik.tionsenzym-ErkennungsSequenzen an der exogenen DNA-Insertionsstelie ergeben, wie sie auch bei den A-Stsllenplasrniden enthalten ist. Wie in Fig. 21 bei 143 schematisch gezeigt ist, enthält jedes der drei von pKEN017, pKEN0 2 6 und pKEN027 abgeleiteten B-Stellenfragmente die DNA-Sequenz unter Einschluß des Signalpeptids, wie sich dies aus dem Fnu4H-I-Fragment des Ipp-Gens von Serratia marcescens ergibt.

Zur Erzielung dieses Ergebnisses bedient man sich für die Bildung des größeren Xba I-Eco. RI-Fragments des Plasmids pKEN0 37 des gleichen Verfahrens, wie es oben irrv Zusammenhang mit der Fig. 15 beschrieben worden ist. Hierzu vereinigt man Mengen von jeweils 1 μΐ des wäßrigen pKEN037-DNA-Fragmer.tgemisches jeweils mit einem kleineren unterschiedlichen Xba I-Eco RI-Fragment (jeweils etwa 0,1 ug), das man vorher aus pKEN017, pKEN026 und pKEN027 durch Doppel verdauung mit Xba I- und Eco RI-Restriktionsenzymen und anschließende Gelreinigung gebildet hat. Jedes'DNA-Gemisch wird mit 0,2 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Li-

' gasepuffer, der 0,4 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5°C behandelt. 10 μΐ eines jeden ligierten Gemisches verwendet man dann zur Transformation des Stammes JA221 von Escherichia- coli, NRRL B-15014. Von den gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten werden die Plasmid-DNAs mit den B-I-, B-2- und B-3-Leserahmen gereinigt, und diese werden als pKEN041, pKEN047 und pKEN048 bezeichnet, wobei jedes dieser Plasmide die in Fig. 21 bei 144 angegebene Struktur hat. 10

C. Konstruktion von C-Stellen-Plasmiden (pIN-I)

Die Fig. 22 bis 26 zeigen schematisch die Art und Weise, in.welcher rekombinante Plasmide, die die C-Insertions-•5 stelle enthalten, konstruiert werden, und auf diese Figuren wird im Zusammenhang mit der folgenden eingehenderen Diskussion Bezug genommen.

Zur Konstruktion der C-Stellen-Klonierungsträger kloniert man ein 19 3 bp Sau 3A-Fragment, das den lpp-Promotor und die 5'-untranslatierte Region sowie ferner auch die Signalpeptidregion und die ersten acht Strukturcodone des ipp-

^5 Gens von Escherichia coli (dieses Fragment ist in Fig. 5 schematisch bei 10 5C gezeigt) enthält, zuerst in pKENOOS, wie dies in Fig. 22 bei 145 gezeigt ist, wozu man wie folgt vorgeht: Man unterzieht 200 ug pKSNl.l 1 Plasmid-DNA, die in herkömmlicher Weise aus Escherichia coli CC620/

^ou pKEMlll, NRRL 3-15011, gebildet wird, einer vollständigen Verdauung mit 200 Einheiten Sau 3A-Restriktionsendonuclease in 400 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 10 mMol Tris:HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₉, 6 0 mMol MaCl und 100 μσ/ml BSA über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C. Nach

beendeter Verdauung extrahiert man mit Phenol und gewinnt die DNAs durch Fällung mit Ethanol, worauf man ein 193 bp Sau 3A-Fragment durch Elektrophorese mit Acrylamidgel reinigt.

Eine Verdauung mit Sau 3A-Restriktionsenzym führt zur Produktion von Fragmenten mit Sticky-Enden an beiden Enden, und diese Sticky-Enden werden daher durch Auffüllen mit T4 DNA-Polymerase abgewandelt, so daß Blunt-Enden gebildet werden. 2 ^g des gereinigten 193 bp Sau 3A-Fragments behandelt man mit 3 Einheiten T4 DNA-Polymerase in 20 μΐ Polymerasepuffer in Anwesenheit von 0,1 mMol von jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP über eine Zeitdauer von 45 Minuten bei 12,5⁰C. Nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol vermischt man die DNA-Fragmente mit 400 pMol phosphoryliertem Eco RI-Linker und behandelt das Ganze mit 4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer, der. 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C. Das Gemisch wird mit Eco RI-Puffer auf 300 μΐ verdünnt und mit -150 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym verdaut, um so Eco RI-kohäsive Enden zu bilden.

1^g der mit Eco RI verdauten Fragmente vermischt man • dann mit 0,5. μg der mit Eco·RI verdauten pKEMOOS Plasmid-DNA und behandelt das Ganze dann mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase In 40 μΐ Ligasepuf f er ,. der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 1.6 Stunden bei 12,5°C. Unter Verwendung von 20 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man hierauf den Stamm JE5519 von' Escherichia coli, NRRL

3-15013. Nach Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNAs, die man aus gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten durch die alkalische SchneiIdenaturierungsmethode erhalten hat, wird ein Plasmid gefunden, das ein Eco RI-Fragment tragt, das von dem 19 3 bp Sau 3a-Fragment stammt, und dieses Plasmid (welches in Fig. 22 bei 146 schematisch gezeig~ ist) wird als pKENOOö bezeichnet. Eine DNA-Nucleotidsequenzanalyse der ρΚΞΝΟΟβ Plasmid-DNA zeigt, daß die Eco RI-Stelle im ρΚΕΝΟΟβ an der C-Insertionsstelle liegt

und dem C-1-Leserahmen entspricht

35

Zur Konstruktion von C-Stellen-Exoressionsplasmiden mit

den C-2- und C-3-Leserahmen ist zuerst eine Eliminierung einer der beiden Eco RI-Spaltstellen von ρΚΕΝΟΟβ erforderlich. Die Strategie zur Entfernung der vor dem lpp-Promotor liegenden Eco RI-Stelle geht schematisch aus Fig. 23 hervor. Dieses Verfahren beinhaltet eine Übertragung eines .106 bp Xba I-Eco RI-Fragments (das das Signalpeptid, einen Teil der 5'-untranslatierten Region und einen Teil der Struktursequenz des Ipp-Gens von Escherichia coli enthält) vom ρΚΕΝΟΟβ in die Xba I-Eco. RI-Stellen von pKENOlO.

Zur Ez^zielung dieses Ergebnisses unterzieht man zuerst. 5 μg pKENOlO Plasmid-DNA einer Verdauung mit 5 Einheiten Xba I-Restriktionsendonuclease in 50 μΐ Bam HI-Puffer und verdaut das Ganze dann mit 5 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 100 μΐ Eco RI-Puffer. Die linearisierte DNA wird anschließend mit 5 ul 3AP in 100 μΐ 10 nuMol Tris:HCl (pH 8,0) und 0,1 mMol SDTA über eine Zeitdauer von 3 0 LMinuten bei 37⁰C behandelt. Die Plasmid-DNAs werden mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, worauf man 0,5 ug der DNA mit 0,2 ug der DNA mit 0 , 2 ug eines 106 bp Xba I-Eco RI-Fragments vermischt, das hergestellt worden ist durch Verdauung von 5 0 μg ρΚΞΝΟΟβ Plasmid-DNA mit Eco RI- und Xba I-Restriktionsenzymen und anschließende Elektrophorese mit Poiyacrylamidgel. Das DNA-Gemisch wird mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 4 0 μΐ Ligas'epuffer, der 0,4 iT-Mol ATP enthält, über eine Zeitdauer-,von 7 Stunden bei 12,5⁰C verdaut. 20 ul des ligierten Gemisches verwendet man dann zur Transformation des Stammes JE5519 von Escherichia coli, MRRL 3-15013. Nach Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNAs, die man aus gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten durch die alkalische SchneiIdenaturierungsmethode erhalten hat, wird ein Plasmid gefunden, das das gewünschte 106 bp Xba I-Eco RI-Fragment enthält, welches die Signalpeptidregion des Ιρρ-Gens von Escherichia coli im C-I-Leserahmen trägt, wie dies in Fig. 23 bei 147 gezeigt ist, und dieses Plasmid wird als

- bb -

Der Leserahmen an der C-Insertionsstelle im pKENQ07 wird dann zur Bildung von Plasmiden mit den C-2- und C-3-Lese- rahmen modifiziert, wozu man sich der oben beschriebenen Methoden zur Veränderung des A-1-Leserahmens in die A-2- oder A-3-Leserahmen bedient. Diese Verfahren gehen schematisch aus Fig. 23 bei 148 und 149 hervor, und entsprechende Abwandlungen der DNA-Sequenz um die Eco RI-SpaltstelIe sind in den Fig. 24 und 25 angegeben. Die gleichen Verfahren, wie sie zur Bildung von Plasmiden pKEN024 (A-2) und pKEN036 (A-3).aus Plasmid pKEN030 (A-I) verwendet und.oben im Zusammenhang mit den Fig. 13 und 14 beschrieben wurden, lassen sich natürlich auch zur Bildung von Plasmiden pKEN046 (C-2) und pKEN019 (C-3) aus Plasmid pKENOO? (C-I) verwenden.

Die letzte Stufe bei der Konstruktion der C-Stellen-Expressionsplasmide besteht in einem Ersatz jedes der drei verschiedenen Xba I-Eco RI-Stellenfragmente von pKENOOT, pKEN046 und pKEN019 für das Xba I-Eco RI-A-Stellenfragment von pKEN037, wie dies in Fig. 2 6 gezeigt ist. Dies wird so gemacht, daß die C-Stellenplasmide die gleiche Se quenz an Eco RI-, Hind III- und Barn HI-Restriktionsenzym-

ⁱ⁰" Erkennungssequenzen an der exogenen DNA-Insertionsstelle . enthalten wie bei den A- und 3-Stellenplasmiden. Wie in Fig. 26 bei 150 schematisch gezeigt ist, enthält jedes der drei von pKZN00 7, pKEN04o und pKEN019 abgeleiteten

C-Stellenfragmente die DMA-Sequenz unter Einschluß <des on ^oU Signaipeptids, das man vom Sau 3A-Fragment des lpp-Gens

von Escherichia coli erhalten hat.

Zur Erzielung dieses Ergebnisses bedient man sich des gleichen Verfahrens zur Herstellung des größeren Xba I-

Eco RI-Fragments von pKEN03/, wie dies oben im Zusammenhang mit Fig. 15 beschrieben worden ist. Man vereinigt jeweils Teilmengen von 1 μΐ des wäßrigen pKEN037 DMA-Fragmentgemisches jeweils mit einem unterschiedlichen

kleineren Xba I-Eco RI-Fragment (jeweils etwa 0/1 μg), das man vorher aus pKEN0 07, ρΚΞΝ0 4β und pKEN019 durch Doppe1-verdauung mit Xba I- und Eco -RI-Restriktionsenzymen und anschließende Gelreinigung erhalten hat. Jedes DNA-Gemisch wird mit 0,2 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 nuMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C behandelt. Unter Verwendung von 10 μΐ eines jeden der ligierten Gemische transformiert man dann den Stamm JA221 von Escherichia coli, NRRL B-15014. Unter den gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten reinigt man die Plasmid-DNAs, die die C-I-, C-2- und C-3-Leserahmen haben, und diese werden als pKEN042, pKEN043 und pKEN044 bezeichnet, wobei jede dieser DNAs die in Fig. 26 bei 151 gezeigte Struktur hat.

D. Konstruktion von induzierbaren Expressionsplasiniden

(pIN-II )

Die Fig. 27 zeigt schematises die Art und Weise, in weleher ein induzierbarer Plasmidklonierungsträger aufgebaut wird, der eine A-InsertionsstelIe im A-1-Leserahmen (und dem konstitutiven Plasmid pKEN037 entsprechend) enthält. Der Iac ÜV5-Promotor-Operator ist abgeleitet vom Plasmid pOp203-3 (erhalten von Dr. F. Fuller vom Department of Biochemistry and Molecular 'Biology, Harvard University, V.St.A.). Der lacUVS-Promotor-Operator ist erhältlich von Escherichia coli 4283-recA/ρΚΜΟΟβ, NRRL 3-15017, nämlich einem bei der ständigen Kulturensammiung des Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegten und von dort frei beziehbaren Stamm. Der Iac UV5-Promotor-Operator wird auf einem 95 bp Xba I-Fragment des Plasmids pKM006 getragen. Das Plasmid kann in herkömmlicher Weise aus NRRL B-15017 gebildet werden, und das dabei entstandene 95 bp Xba I-Fragment kann man dann unter Anwendung üblicher Techniken isolieren .

Der iac üV5-Promotor-Operator wird an der Xba I-Soaltstel-

le von pKEN037 (innerhalb der 5'-untranslatierten Region des lpp-Gens) eingesetzt, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man unterzieht 200 μg pOP203-3-Plasmid DNA einer vollständigen Verdauung mit 200 Einheiten Alu I-. Restriktionsenzym, in 400 μΐ Hind HI-Puffer und reinigt ein 95 bp Alu I-Fragment, das den Iac UV5-Promotor und die Operatorregion trägt (wie dies in Fig. 27 bei 152 schematisch durch das diagonal kreuzschraffierte Segment gezeigt ist)- durch Elektrophorese mit Polyacrylamidgel.

1 ug des 9 5 bp Alu I-Fragments vermischt- man mit 400 pMol

5 ' 3 ' phosphorlyiertem Xba I-Linker ( CTCTAGAG , erhalten vom,Collaborative Reserach und genauso wie oben beschrieben phosphoryliert) und unterzieht das Ganze einer Blunt-Endenligation mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C. Das ligierte Gemisch wird mit 3am HI-Puffer auf 300 μΐ verdünnt und 10 Minuten auf 6O⁰C erwärmt. Das Gemisch wird dann mit 100 Einheiten Xba I-'Restriktionsenzym 1 Stunde bei 37°C behandelt, um hierdurch Xba I-kohäsive Enden zu bilden. Das Gemisch wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und lyophilisiert. Die DNA-Fragmente werden anschließend in 10 μΐ Wasser gelöst, worauf man 0,3 μg des so gebildeten lac-Fragments mit 0,5 ug pKEN037 Plasmid-DNA vermischt, die vorher mit Xba I-Restriktionsenzym verdaut worden ist. Das Gemisch wird mit 0,4 Einheiten T4 DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer, der 0,4 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5°C behandelt, um hierdurch die Xba I-kohäsiven Enden zu anellieren und das Plasmid zu rezirkularisieren« Unter Verwendung von 10 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man dann Sscnerichia coli

JA221/F'lacl^q, MRRL B-15015, zu dessen Konstruktion man den F'-Faktor von X90/F'lacl^g Iac+ pro+ (erhalten von Dr. J. Beckwith vom Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard university, V.St.A.) in Escherichia coli Stamm JA221, NRRL B-15014, überträgt. Der Stamm JA221/ F²IaCl^ von Escherichia coli ist in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory,

US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. · hinterlegt und von dort frei beziehtbar. Nach Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNAs, die aus gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten durch die alkalische Schnelldenaturierungsmethode isoliert worden sind, wird ein Plasmid gefunden, das eine Kopie des 95 bp Alu I-Fragments enthält, v/elches in korrekter Orientierung an der . Xba I-Stelle von pKEN037 inseriert ist, wie dies in Fig., 27 bei 153 gezeigt ist, und dieses Plasmid wird als pKEN0 3 8 bezeichnet.

Zur Vereinfachung der Konstruktion induzierbarer Plasmide, die die 'B- und C-Insertionsstellen enthalten, muß man zuerst eine der beiden Xba I-Spaltstellen im pKEN038 entfernen, die das lac-Promotor-Operator-Fragment umgeben.

Die oberhalb des lac-Promotor-Operator-Fragments liegende Xba I-Spaltstelle wird in einer Weise eliminiert, wie dies schematisch in Fig. 27 bei 154 gezeigt ist. Hierzu bedient man sich der Tatsache, daß eine Befestigung des Xba I-Linkers am 95 bp lac-Promotor-Operator-Fragment, wie dies im vorherigen Absatz beschrieben worden ist, zur Bildung einer neuen Sst I-Spaltstelle führt, die sich nur am unteren Ende des lac-Promotors befindet, nicht jedoch an seinem oberen Ende. Wie in Fig. 27 bei 155 gezeigt ist, überläppt sich die Erkennungssequenz des Sst I-Restriktionsenzyms mit der des Xba I-Enzyms. Die Deletion des 4-3asen-Sticky-Endes der Sst I-Spaltstelle unter Verwendung von Sl-Nuclease sollte daher auch zur Deletion eines Teils der Xba I-ErkennungssteiIe führen, und somit eine wirksame Eliminierung der Xba I-Spaltste]. Ie ergeben.

Zur Erzielung dieses Ergebnisses unterzieht man 5 ,ug pKEN0 3 8 Plasmid-DNA einer Verdauung mit 10 Einheiten Sst I-Restriktionsendonuclease in 50 μ 1. Barn HI-Puffer und behandelt das Ganze mit 500 Einheiten 51-Nuclease in 200 μΐ 31-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 20⁰C. Die Blunt-Enden werden durch Behandlung von 0,5 μg der mit Sl behandelten DNA mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 μΐ Li-

' gasepuffer, der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C verbunden. Unter Verwendung von 5 μΐ des ligierten Gemisches transformiert man dann den Stamm JA221/F'lacl^q von Escherichia coli, NRRL B-15015. Ein Plasmid, das die in Fig. 27 bei 156 schematisch gezeigte Struktur hat, wird nach Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNAs isoliert, die man aus gegenüber Ampicillin - resistanten Transformanten durch die alkalische Schneildenaturierungsmethode erhält, und dieses Plasmid wird als pKEN045 (pIN-II A-I) bezeichnet.

Es gibt mehrere Methoden zur Konstruktion von pIN-II-Plasmiden, die den A-2- und A-3-Leserahmen entsprechen. Unter' der Voraussetzung der Verfügbarkeit der Plasmide pIN-I A-2 und A-3 würde eine dieser Methoden in einer gleichen Insertion des lac-Promotor-Operator-Fragments in die Plasmide pKEN0 3 9 und pKEN040 .bestehen, wie dies in Fig. 27 gezeigt und oben im Zusammenhang mit dem Plasmid pKEN037 beschrieben worden ist. Eine andere und bevorzugte Methode erfordert eine Übertragung der kleineren Xba I-Eco RI- Fragmente von pKEN039 und pKEN040 in die Xba I-Eco RI-Stelle von pKEN045 in analoger Weise,wie dies oben im Zusammenhang mit der Fig. 15 beschrieben ist, wodurch man zu. den Piasmiden pKEN049 (pIN-II, A-2) und pKENOSQ (pIN-II,

25 a-3) gelangt.

Unter der Annahme, daß die entsprechenden konstitutiven Plasmide nicht schon konstruiert sind, lassen sich andererseits induzierbare Plasmide pKENQ49 (A-2) und pKEN050 (A-3) direkt aus dem Plasmid pKEN045 (A-I) bilden. Die DNA-Sequenz kann nämlich in der Nachbarschaft der Eco RI-Spaltstelle von pKEN045 selbst abgewandelt werden, wie dies die Linien b und c. des Reaktionsschemas von Fig. 13 und auch die Linien b und c des Reaktionsschemas von Fig.'

° 14 zeigen, wodurch sich direkt die Struktur der Plasmide pKEN-0 4 9 (A-2) oderpKEN05G (A-3.) ergibt. Dies stellt die bevorzugteste Methode zur Konstruktion dieser Plasmide dar, da man hierbei nicht vorher die entsprechenden kon-

stitutiven Plasmide konstruieren muß.

Zu-r Konstruktion von pIN-II-Plasmiden, die die B- und C-Insertionsstellen enthalten, sind ebenfalls mehrere Möglichkeiten verfügbar. Wiederum unter der Voraussetzung, daß die entsprechenden pIN-I-Plasmide bereits konstruiert worden sind, ließe sich jedes dieser Plasmide abwandeln durch Insertion des lac-Promotor-Operator-Fragments unter Anwendung des in Fig. 27 gezeigten Verfahrens, oder vorzugsweise durch aufeinanderfolgenden Ersatz des kleineren Xba I-Eco"RI-Fragments von pKEN045 (pIN-II, A-I) mit den kleineren Xba I-Eco RI-Fragmenten' von jeweils dem konstitutiven B-Stellen-Plasmid und C-Stellen-Plasmid, wodurch man jeweils pIN-II-Plasmide erhält, wie sie aus der folgenden Tabelle I hervorgehen.

TABELLE I

Insertions-	Leserahmen	pIN-I-P-lasmide	pIN-II-Plasmide
stelle
B	1	pKEN0 41	ΡΚΞΝ0 51
	2	PKEN0 4 7	pKEN0 5 2
	3	PKEN0 4 8	pKEN0 5 3
C	1	pKSN0 4 2	PKEN0 5 4
	2	ΡΚΞΝ0 4 3	PKEN0 5 5
	3	pKEN0 4 4	pKEN0 5 6

Am besten konstruiert man die pIN-II-Expressionsplasmida jedoch ohne vorherige Bildung der entsprechenden pIN-I-Plasmide. Im-Falle der B-Insertionsstelle läßt sich das Plasmid pKEN0 51 (pIN-II, B-I) aus dem Plasmid pKEN221 bilden, indem man 'pKEN221-Plasmid-DMA zuerst mit Fnu4K-I-Restriktionsenzym verdaut und an den Enden des erhaltenen Fragments dann Eco RI-kohäsive Enden befestigt, wie dies im folgenden näher beschrieben wird und ' in Fig. 17 bei 138 schematisch gezeigt ist. Das auf diese Weise erhaltene Eco RI-Fragment kann dann mit Xba I-Restriktionsenzym verdaut werden, wodurch das Fragment an der Xba I-Spaltstel-

' le, die innerhalb der 5'-untranslatierten Region liegt, in zwei Teile gespalten wird. Durch Reinigung des dabei erhaltenen kleineren Xba I-Eco RI-Fragments und dessen Austausch gegen das kleinere Xba I-Eco RI-Fragment bei pKEN04 5 (pIN-II, A-I) erhält man den induzierbaren B-I-Klonierungsträger. Das dabei erhaltene Plasmid pKENOSl (pIN-Ii, B-I) kann dann weiter abgewandelt werden, wie dies in. den Fig. 18 und 19 bei 141 oder in den Fig. 18 und 20 bei 142 schematisch gezeigt ist, wodurch man die pIN-II-Plasmide erhält, die den 3-2- und B-3-Leserahmen entsprechen, nämlich die Plasinide pKEN052 und pKEN053.

In analoger Weise lassen sich auch die pIN-II-C-Stellenplasmide direkt herstellen, ohne daß man zuerst die entsprechenden pIN-I-Plasmide konstruieren muß. Das hierdurch nach Verdauung von pKENlll.Plasmid-DNA mit Sau 3A-Restriktionsenzym und Befestigung von Eco RI-kohäsiven Enden an den Enden des erhaltenen Fragments (unter Anwendung des oben beschriebenen und in Fig. 22 bei 145 gezeigten Verfahrens) erhaltene Eco RI-Fragment wird dann mit Xba I-Restriktionsenzym verdaut, wodurch das Fragment an der Xba I-Spaltstelle (die innerhalb der 5'-untranslatierten Region liegt) in zwei Teile gespalten wird. Das Xba I-RI-Fragment, das die Signalpeptidregion trägt, kann dann in die Xba I-Eco RI-Stelle von pKEN045 inseriert werden, wodurch sich das Plasmid pKEN054 (pIN-II, C-I) ergibt. Durch weitere Abwandlung der pKEN0 54 DNA unter An-. wendung des in den Fig. 23 und 24 bei 148 schematisch gezeigten Verfahrens oder des in den Fig. 23 und 25 bei

^ου schematisch dargestellten Verfahrens gelangt man zu den pIN-II-Plasmiden, die den C-2- und C-3-Leserahmen entsprechen, nämlich den Plasrniden pK"£N0 5 5 und pKENQ56.

-E. Konstruktion auto-gesteuerter induzierbarer Sxpres- 3$ sionsplasmide (pIN-III)

Aus den Fig. 28 und 29 geht schematisch die Art und Weise hervor, in der sich das lacI-Gen an den induzierbaren A-I-

' Plasmidklonierungsträger der pIN-II-Reihe binden läßt, so daß man zum entsprechenden auto-gesteuerten induzierbaren Expressionsplasmid der pIN-III-Reihe gelangt. Die speziellen Stufen dieses Verfahrens werden im folgenden näher beschrieben.

1. Konstruktion^des_Plasmids_pYM051

Die erste Stufe bei der Konstruktion des A-1-Expressions-'0 plasrnids der pIN-III-Reihe besteht in einer Klonierung des lacI-Gens in pBR322. Zur Erzielung dieses Ergebnisses bildet man zuerst ein 5,1 Kb DNA-Fragment, das das lacl-Gen enthält, aus dem Plasmid pFB140 (erhalten von Monica Riley vom Department of Biochemistry, State University of '5 New York, Stony Brook, V.St.A.), wozu man wie folgt vorgeht: Man unterzieht 15 ug pF3l40-Plasmid-DNA einer Verdauung mit 80 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 200 μΐ Eco Rl-Puffer über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37⁰C.

Das Reaktionsgemisch' wird mit Phenol extrahiert, worauf

^zu man die DNA-Fragmente mit 2,5 Volumina Ethanol fällt und unter Vakuum trocknet. Die DNAs unterzieht man dann einer vollständigen Verdauung mit 12 Einheiten Pst I-Restriktionsendonuclease in 300 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 6 üuMol Tris:HCl (pH 7,5), 6 riuMol MgCl₉, 50 nuMol NaCl,

nc *

^ZJ 6 rruMoi ß-Mercaptoethanol und 100 μς/ΐηΐ BSA (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden als Pst I-Puffer bezeichnet) über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37⁰C. Das 5,1 Kb Pst I-Eco RI-Fragment, das das lacI-Gen trägt (welches in Fig. 28 schematisch bei 157 gezeigt ist), wird durch Elektrophorese mit Agarosegel in folgender Weise gereinigt: Die DNA-Fragmente werden im Agarosegel mit Ethidiumbromid (1 ug/rnl) angefärbt, worauf man die Bande herausschneidet, die dem 5,1 Kb-Fragment entspricht. Die

in dieser Bande enthaltenen DNA-Fraamente werden nach Ein-35

frieren vom Gel eluiert. Das Ethidiumbromid wird von den DNA-Fragmenten durch Extraktion mit Phenol entfernt, und die DNAs werden durch Fällung mit Ethanol gewonnen.

Zur Klonierung des 5,1 Kb Pst I.-Eco RI-Fragments,'das das lacI-Gen enthält, in pBR322 löscht man zuerst das kleinere DNA-Fragment, das. zwischen den Pst I- und Eco Rl-Spaltstellen des pBR322 liegt, aus, wie dies schematisch in Fig. bei 158 gezeigt ist, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man unterzieht 10 μg pBR322 DNA einer Verdauung' mit 2 Einheiten Pst I-Restriktionsenzym in 100 μΐ Pst I-Puffer über eine Zeitdauer von 3 Stunden bei 37⁰C. Nach Extraktion mit' Phenol und Fällung' mit Ethanol werden die DNAs unter Vakuum getrocknet, worauf man sie zur Verdauung mit 80 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 200 μΐ Eco Rl-Puffer 2 Stunden bei 37⁰C behandelt. Die größeren Pst I-Eco RI-Fragmente, die aus etwa 3,7 Kb bestehen, werden dann durch Elektrophorese mit

Agarosegel gereinigt. - .

Die gereinigten Fragmente (0,07 jig) vermischt man hierauf mit 0,L μg der vorher gebildeten 5,1 Kb pFBl40-Fragmente, und die Pst I- und Eco RI-kohäsiven: Enden behandelt man zur Ligation mit 20 Einheiten T4 DNÄ-Ligase (von New England Biolabs) in 25 μ1·- Ligasepuf f er, der 0,48 rtuMol ΆΤΡ enthält, 16 Stunden bei 12,5°C Unter Verwendung von.15 μΐ des---Iigierten Gemisches transformiert man dann Escherichia coli-Stamm W620 recA, NRRL 3-15024 (F-, thi-1, pyrD36, g'ltA'6, galK30, strÄl2'9A-, supE44). Dieser Stamm ist in der ständigen Kulturerisammlung des Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und von dort frei beziehbar. Sr wurde erhalten vom Stamm W620 von Escherichia coli, der vom Department of Human Genetics, Yale University, School of Medicine,- V.St.A. erhalten wurde. Eine der Plasmid-DNAs, die aus den gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten gereinigt worden ist, hat die in Fig. 28 bei 150 gezeigte Struktur. Dieses Plasmid wird als pYM051, NRRL B-

.35 15025 bezeichnet. Es ist in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und von dort freibeziehbar. Das Plasmid kann unter Anwendung

herkömmlicher Methoden aus NRRL B-I5025 erhalten werden. 2. Konstruktion_der_Plasmide_pYM052_und_gYM053

Das Plasmid ρYMO51 trägt ein 5,1 Kb Pst I-Eco RI-DNA-Fragment, das nicht nur das lacI-Gen, sondern auch einen wesentlichen Teil des lacZ-Gens enthält. Dieses Fragment enthält, wie in Fig. 28 bei 160 gezeigt ist, drei Hinc II-Spaltstellen in.der Nachbarschaft des lacI-Gens, von denen zwei das lacI-Gen umgeben oder einklammern und eine in das lacI-Gen selbst fällt. Zur Verkürzung dieses .5,1 Kb DNA-Fragments und gleichzeitigen Intakthaltung des lacI-Gens für einen späteren Gebrauch bedient man sich des folgenden Verfahrens: Man unterzieht 5 μg ρYMO51 Plasmid-DNA einer Teilverdauung mit 0,32 Einheiten Hinc II-Restriktionsenzym in 75 μΐ Hind HI-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C. Nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol werden die DNAs unter Vakuum-getrocknet. Dieses Verfahren führt zu DNA-Fragmenten verschiedener Län-.20" gen, von denen eines (mit einer Länge von 1,7 Kb, das in

Fig. 28 bei 160 schematisch durch vertikale und horizonta-. Ie Querschraffierung angegeben ist) ein intaktes lacI-Gen trägt. _ '

Zur Herstellung eines Trägers., der das verkürzte DNA-Fragment trägt, welches das lacI-Gen enthält, wird ein Pias- . · mid mit der Bezeichnung ρYMl11 konstruiert. Dieses Plasmid ist erhältlich von Escherichia coli JA221/F'lacl^/ pYMlll, NRRL B-15038, das bei der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory,. üS-Department of Agriculture, Peoria, Illinois,- V.St.A. hinterlegt und von dort frei beziehbar ist. Das Plasmid läßt sich unter Anwendung üblicher Methoden aus NRRL 3-15038 erhalten.

wie in Fig. 28 bei 161 schematisch gezeigt ist, enthält ρYMl11 eine Hpa I-SpaltstelIe, die in verhältnismäßig enger Nachbarschaft von zwei Eco Rl-Spaltstel1 en umgeben ist. Dieses Plasmid ist ein brauchbarer Rezipient für das

] lacI-Gen-Fragment, weil es ein Vertreter aus der Klasse der Plasmide ist, der folgende Eigenschaften aufweist: Er enthält (I)- eine seltene Restriktions.enzymspaltstelle (nämlich eine Stelle, die lediglich einmal im Plasmid vorkommt), die vorzugsweise Blunt-Enden ergibt, wie Hpa I, Hinc II oder Pvu II. Er ist (2) von pBR322 abgeleitet, und seine seltene Spaltstelle liegt nicht innerhalb der DNA-Sequenz, die für die Replikation des Plasmids selbst verantwortlich ist. Er enthält (3) zwei Spaltstellen·, die

]0 von der seltenen Spaltstelle umgeben sind und innerhalb von etwa 400 bis 700 Basenpaaren der seltenen'SpaltstelIe liegen,- wobei die beiden umgebenden Spaltstellen Vorzugs-· weise vom gleichen leicht verfügbaren Restriktionsenzym erkennbar sind, wie von Eco RI, Hind III, Bam HI oder

]5 Pst I, sofern sich nicht gleichzeitig auch eine der beiden umgebenden Spaltstellen im lacI-Gen wiederholt.

Das Plasmid ρYMl11 ist deshalb geeignet, weil es nur eine Hpa I-Spaltstelle enthält, die innerhalb der 400 bis 700 Basenpaare von zwei Eco RI-Spaitstellen umgeben ist, und weil das lacI-Gen selbst keinerlei Eco RI-Spaltstellen enthält,- Zur Aufnahme des lacI-Genfragments und als Quelle für dieses Fragment kann bei den nachfolgenden Stufen des Verfahrens jedoch selbstverständlich jedes geeignete Plasmid eingesetzt werden, das die oben beschriebenen Eigenschaften aufweist.

Das DNA-Fragment, das das lacI-Gen trägt, wird in das Plasmid pYMlll inseriert, wie dies in Fig. 28 schematisch bei 162 gezeigt ist, wozu man sich des folgenden Verfahrens bedient: Man unterzieht 4 μα ρYMl11 Plasmid-DNA einer Verdauung mit 4 Einheiten Hpa I-Restriktionsendonuclease in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ Hpa I-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37°C. -Nach-Extraktion mit Phenol werden die DNAs durch Fällung mit Ethanol gewonnen und unter Vakuum getrocknet. Zur Verhinderung einer Selbstligation der mit Hpa I behandelten DNA-Fragmente unterzieht man die getrockneten. DNAs einer Behandlung mit 0,15 Ein-

-U-

' heiten BAP in einem Gesamtvolumen von 100 μΐ eines Reaktionsgemisches aus 10 mMol Tris:HCl (pH 8,0) und 0,1 mMol EDTA (dieses Reaktionsgemisch wird im folgenden als BAP-Puffer bezeichnet) über eine Zeitdauer von 45 Minuten bei 37⁰C. Nach vollständiger Entfernung von BAP durch dreimalige Extraktion mit Phenol werden die DNAs durch- Fällung mit Ethanol gewonnen und unter Vakuum getrocknet.

Zur Insertion des 1,7 Kb DNA-Fragments, das das intakte lacI-Gen trägt, in ρYMl11 vermischt man 0,1 μg der mit Hpa I behandelten pYMl11-Plasmid-DNA mit 0,275 μg der DNA-Fragmente, die man bei der Teilverdauung' von ρYMO51 mit Hinc II erhalten hat, und unterzieht diese DNAs dann einer Ligation mit 320 Einheiten T4 DNA-Ligase (von New '-> England Biolabs) in Ligasepuffer (Gesamtvolumen 20 μΐ), der 0,6 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5⁰C. Die Hälfte des Ligationsgemisches verwen-' det man dann zur -Transformation von Escherichia coli-Stamm W6 20 recA, NRRL B-I50 24. Entsprechende Transfermannt' ten werden auf die Oberfläche einer L-Platte gegeben, die 50 μg Ampici11 in/ml und 40 μg 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-3-D-galactosid pro ml enthält (welches im folgenden als X-gal bezeichnet wird). Die weiße Kolonien ergebenden

Transformanten werden selektiert, und dies ist ein Anzeige _

^Z-^J chen für eine insertion des 1,7 Kb Hinc II-Fragments, das das intakte lacI-Gen trägt, in das Plasmid ρYMl11. Diese Transformation führt zu Plasmiden, die das lad-Gen in zwei verschiedenen Orientierungen tragen, und die erhaltenen Plasmide werden daher als pYM05 2 und pYM053 bezeichnet.

Die Struktur dieser beiden Plasmide ist in Fig. 28 bei angegeben.

³ - Konstruktion_aes_?lasmids_DYM0_58

Zur weiteren Begrenzung der Größe des Expressionsplasmids und auch zur Eliminierung irgendeines möglichen Inhibierungseffekts auf die lacI-Genexpression, die vom kleinen Anteil des im Plasmid immer noch vorhandenen lacZ-Gens

ausgeht, löscht, man das lacZ-Genfragment unter Intakthaltung des lacI-Gens aus. Die zur Entfernung dieses Fragments vom Plasmid pYM'0 5 3 angewandte Strategie geht schematisch, aus Fig. 29 hervor.

·

Aus Fig. 29 geht bei 164 eine Darstellung eines Teure- striktionsenzymspaltplans der Region zwischen den beiden Eco. RI-Spaltstellen des Plasmids pYM053 hervor, das das lacI-Gen enthält. Diese Region beinhaltet die oben im Zu-

10. sammenhang mit der Fig. 28 besprochenen drei Hinc II-Spaitste.llen, wie sie in Fig. 28 bei 157 und 160 gezeigt sind. Zwei dieser Hinc Il-Spaltstellen werden, wie aus Fig. 29 hervorgeht, auch von der Hpa I-Restriktionsendonuclease erkannt. Wie sich aus Fig. 29 im einzelnen weiter ergibt, gibt es in dieser Region drei Msp I-Spaltstellen, von denen zwei innerhalb des lacZ-Genfragments lokalisiert sind, während eine innerhalb der DNA-Sequenz lokalisiert ist, die das 3'-Ende des lacI-Gens vom 5'-Ende des lacZ-Genfragments trennt.

Die obige Anordnung ermöglicht eine leichte Isolierung des- 789 bp-Fragments, das zwischen den beiden Hpa I-Spaltstellen liegt. Durch unterteilung dieses Fragments gelangt man zu einem Gemisch aus Msp I-Fragmenten, von denen eines die 3'-Region des lacI-Gens enthält, jedoch keinen Anteil des lacZ-Gens. Dieses letztgenannte Fragment läßt sich dann in geeigneter Orientierung so inserieren, daß wieder ein intaktes lacI-Gen entsteht.

°0 Zur Erzielung dieses Ergebnisses unterzieht man 100 ;jg pYM053 Plasmid-DNA einer Verdauung mit 60 Einheiten Hpa I-Restriktionsenzym in 800 ul Hpa I-Puffer über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37⁰C. Ein 7 89 bp-Fragment wird durch Elektrophorese mit 5 % Polyacrylamidgei in folgen-

^³ der Weise gereinigt: Man färbt die DNA-Fragmente im Poly-' acrylamidgel mit Ethidiumbromid (1 μg/ml) an und schneidet dann die Bande heraus, die dem 789 bp-Fragment entspricht. Die in dieser Bande befindlichen DNA-Fragmente werden

durch Elektrophorese vom Gel eluiert. Man entfernt das Ethidiumbromxd von den DNA-Fragmenten durch Extraktion mit Phenol und gewinnt die DNAs durch Fällung mit Ethanol.

Die gereinigten 789 bp-DNA-Fragmente (1,1 μg) unterzieht man dann einer Verdauung mit 12 Einheiten Msp I-Restriktionsenzym in 75 μΐ Hpa I-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C. Nach Extraktion mit Phenol werden die DNAs durch Fällung mit Ethanol gewonnen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA-Fragmente werden dann mit,2000 Einheiten Sl-Nuclease in einem Gesamtvolumen von 150 μΐ Sl-Puffer 1 Stunde bei 20⁰C behandelt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 μΐ 500 mMol Tris:HCl (pH 8,0) und 15 μΐ 250 mMol EDTA unterbrochen, wobei man anschließend mit Phenol extrahiert. Zur Entfernung von Phenol und Zinkionen wird das Gemisch dann mit Ether extrahiert und zweimal ge-, gen 0,01 χ SSC über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden bei 4⁰C dialysiert, worauf man die DNAs durch Fällung mit Ethanol gewinnt. .

Anschließend unterzieht man 10 μg pYM053 Plasmid-DNA einer getrennten Verdauung mit 12 Einheiten Hpa I—Restriktionsenzym in 100 μΐ Hpa I-Puffer über eine Zeitdauer von einer Stunde bei 37⁰C. Ein 8 Kb-Fragment wird durch Elektropho-.25 rese mit 0,7 % Agarosegei gereinigt, und die dabei erhaltenen DNAs (1,1 μΐ) unterzieht man dann einer Behandlung mit 0,12 EinheitenBAP in 75 μΐ' BAP-Puffer über eine Zeitdauer von einer Stunde bei 37⁰C, um so eine Selbstligation der Hpa I-Blunt-Enden zu unterbinden. Mach dreimaliger Extraktion mit Phenol zur vollständigen Entfernung von BAP werden die DNAs durch Fällung mit Ethanol gewonnen und dann unter Vakuum getrocknet.

Im Anschluß daran vermischt man die von pYM053 abgeleite-3^ ten 8 Kb Hpa I-Fragmente (0,4 ug) mit 0,05^g der Fragmente, die man bei der Verdauung des von pYM0 5 3 abgeleiteten 7 89 bp-Fragments mit Msp I erhalten hat, und unterzieht die DNAs einer Ligation mit 400 Einheiten' T4 DNA-Li-

' gase (von New England Biolabs) in Ligasepuffer (Gesamtvolumen 15 μΐ), der 0,8 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5°C. Unter Verwendung von 10 μΐ des Ligationsgemisches transformiert man dann Escherichia coli-Stamm W.620. recA, NRRL B-15024, und gibt hierauf die Transformanten auf die Oberfläche einer L-Platte, die 50 pg Ampicillin/ml und 40 μg X-gal/ml enthält. Die weiße Kolonien ergebenden und gegenüber Ampicillin resistenten Transformanten werden selektiert, und dies zeigt, daß wie-'0 der ein intaktes lacI-Gen konstruiert worden ist. Eine der Plasmid-DNAs, die aus- selektierten Transformanten gereinigt worden^ ist, hat die. in Fig. 29 bei 165 gezeigte Struktur, und dieses Plasmid wird als pYM058 bezeichnet.

'5 4. Konstruktion des Plasmids ρYMO61 und weiterer auto-ge-

Die letzte Stufe bei der Konstruktion des ersten auto-gesteuerten induzierbaren Expressionsplasmids der .pIN-III-Serie besteht in einer Insertion des lacI-Gens in p.KENQ45 (pIN-II,.; A-I). Hierzu bedient man sich des folgenden Verfahrens: Man unterzieht 30 ^g pYM0 58 Plasmid-DNA einer Verdauung- mit 100 Einheiten Eco RI-Restriktionsenzym in 250 μΐ Eco RI-Puffer über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden bei 37°e. In der"gleichen Weise wie oben beschrieben reinigt man dann ein 2,4 Kb Eco RI-Fragment durch Elektrophorese über Agarosegel. Die DNA-Fragmente (0,2 μg) unterzieht man dann einer Behandlung mit 600 Einheiten Sl-Nuclease in einem Gesamtvolumen von 150 μΐ an Sl-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 2O⁰C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 μΐ.500 mMol Tris:HCl (pH 8,0). und 15 ul 250 rnMol EDTA beendet, worauf sich .eine Extraktion mit Phenol anschließt. Zur Entfernung von Phenol und Zinkionen'wird das Gemisch mit Ether extrahiert und zweimal bei 4°C über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden gegen 0,01 χ SSC diarysiert, worauf man die DNAs durch Fällung mit Ethanol gewinnt.

Sodann unterzieht man 10 μg pKEN045 Plasmid-DNA einer Teilverdauung mit einer Einheit Hine II-Restriktionsenzym in 751 μΐ Hind HI-Puffer über eine Zeitdauer von 30 Minuten bei 37⁰C. pKEN045 enthält, wie in Fig. 29 bei 166 schematisch gezeigt ist, zwei Hinc II-Spaltstellen, von denen eine auch eine SaI I-Spaltstelle ist. Durch Teilverdauung mit Hinc II-Restriktionsenzym gelangt man zu einem Gemisch aus linearen DNA-Fragmenten, dessen längstes lediglich an einer der Hinc II-Stellen gespalten worden ist. Diese Fragmente (die jeweils etwa 5,0 Kb lang sind) werden durch Elektrophorese mit 0,7 % Agarosegel in der gleichen Weise wie oben beschrieben isoliert.

Die linearisierten DNAs (2,5 μg) unterzieht man dann ein.er Behandlung mit 0,15 Einheiten BAP in 50 μΐ BAP-Puffer über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C, um hierdurch eine Selbstligation der Hinc II-Blunt-Enden zu unterbinden. Zur vollständigen Entfernung von BAP wird das Ganze dreimal mit Phenol extrahiert. Die DNAs werden durch Fällung mit Ethanol gewonnen und unter Vakuum getrocknet. Sodann vermischt man die vom pYM0 58 abgeleite- - ten 2,4 Kb Eco RI-Fragmente (0,15 μg) mit 0,3 μg der 5,0 Kb pKEN045-Fragmente und unterzieht das Ganze einer Behandlung mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (von New England Biolabs) in 15 μΐ Ligase-Puffer, der 0,8 mMol ATP enthält, über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 12,5°C. Unter Verwendung von 10 μΐ des Ligationsgemisches transformiert man dann Escherichia coli Stamm W620 recA, NRRL 3-15024. Die gegenüber Ampicillin resistanten Transformanten werden in der oben beschriebenen Weise unter Einsatz von X-gal selektiert. Die weißen Kolonien bestätigen die Insertion des lacI-Gens an der Hinc II-Stelle nach dem Amp^r-Gen. Diese Transformation führt zu Plasmiden, die das lacI-Gen in zwei unterschiedlichen Orientierungen tragen, wobei.eine Struktur hiervon in Fig. 29 bei 157 schematisch gezeigt ist. Die Plasmide mit dieser Struktur werden als pYMOSl. (pIN-III, A-I) bezeichnet.

Zur Konstruktion von pIN-III-Plasmiden, die den A-2- und A-3-Leserahmen entsprechen, gibt es mehrere Methoden. Unter der Voraussetzung, daß die entsprechenden A-2- und A-3-Plasmide der pIN-I- und pIN-II-Reihen verfügbar sind, würde eine Methode in einer Insertion des lacI-Genfragments in die Plasmide pKEN049 (pIN-II, A-2) und pKEN050 (pIN-II, A-3) bestehen, wozu man genauso vorgehen würde wie dies in Fig. 29 gezeigt und oben im Zusammenhang mit dem Plasmid pKEN045 beschrieben worden ist. Ein anderes und bevorzugtes Verfahren besteht lediglich in einem Ersatz der kleineren Xba I-Eco RI-Fragmente von pKEN049 und pKENOSO (oder. pKEN03 9 (pIN-I, A-2) und pKEN040- (pIN-I, A-3)) durch das kleinere Xba I-Eco RI-Fragment von pYMOöl in entsprechender Weise wie es oben im Zusammenhang mit der.Fig. 15 beschrieben worden ist, wodurch man zu den A-2- und Ä-3-Plasmiden der pIN-III-Serien gelangt.

Unter der Annahme, daß die entsprechenden konstitutiven (pIN-T) und induzierbaren (pIN-II) Plasmide nicht bereits konstruiert worden sind, lassen sich andererseits autogesteuerte induzierbare A-2- und A-3-Plasrnide direkt aus Plasmid ρYMO61 (A-I) erhalten. Die DNA-Sequenz in der Nachbarschaft der Eco Rl-Spaltstelle von pYMOöl kann nämlich selbst unter Anwendung der in Fig. 13 bei den Linien b und c, oder in Fig. 14 ebenfalls bei den Linien b und c, gezeigten Reaktionsschemen abgewandelt werden, wodurch man direkt die Struktur der A-2- und A-3-Plasmide von pIN-III erhält. Dieses Verfahren wird zur Konstruktion dieser Plasmide besonders bevorzugt, da es keine vorherige Konstruktion der entsprechenden pIN-I- und pIN-II-Plasmide erforderlich macht.

.Zur Konstruktion von pIN-III-Plasmiden, die die 3- und C-Insertionsstellen enthalten, gibt es ebenfalls mehrere Möglichkeiten. Unter der Voraussetzung der bereits erfolgten Konstruktion der entsprechenden pIN-I- und pIM-II-Plasmide könnte man jedes dieser Plasmide modifizieren, durch Insertion des Iac!-Gens nach dem in Fig. 29 be-

T schriebenen Verfahren oder man könnte vorzugsweise auch das kleinere Xba I-Eco RI-Fragment von pYMOöl (pIN-III, A-I) der Reihe nach durch die kleineren Xba I-Eco RI-Fragmente eines jeden der konstitutiven und induzierbaren B- und C-Stellenplasrnide ersetzen, wodurch man jeweils zu pIN-III-B- und C-Stellenplasmiden gelangen würde.

Am besten werden die pIN-III-Expressionsplasmide jedoch ohne vorherige Bildung der entsprechenden pIN-I- oder· pIN-II-Plasmide konstruiert. Im Falle der B-Insertionsstelle kann man das B-I pIN-III-Plasmid aus Plasmid ' pKEN221 bilden, indem man pKEN221 Plasmid-DNA zuerst mit Fnu4H-l-Restriktionsenzym verdaut und an die Enden des erhaltenen Fragments dann Sco RI-kohäsive Enden bindet, wozu man nach dem oben beschriebenen und in Fig. 17 bei 138 schematisch gezeigten Verfahren vorgeht. Das auf diese Weise erhaltene Eco RI-Fragment kann man dann einer Verdauung mit Xba I-Restriktionsenzym unterziehen,.wodurch das Fragment an der innerhalb der 5'-untranslatierten Region liegenden Xba I-Spaltstelle in zwei Teile gespalten wird. Durch Reinigung des dabei erhaltenen kleineren Xba I-Sco RI-Fragments und dessen Austausch für. das kleinere Xba I-Eco RI-Fragment von ρYMO61 (pIN-III, A-I) gelangt man zum 3-1 auto-gesteuerten' induzierbaren Klonierungsträger. Das erhaltene Plasmid läßt sich dann nach dem in Fig. 18 und Fig.- 19 bei 141 gezeigten Reaktionsschema oder nach dem in Fig. 18 und in Fig. 20 bei 142 gezeigten Reaktionsschema weiter abwandeln, wodurch man die pIN-III-Plasmide erhält, die den B-2- und 3-3-Lese-

^ou ranmen entsprecnen.

In analoger Weise lassen sich auch die pI'N-III-C-Stellenplasmide direkt herstellen, ohne daß man hierzu zuerst die entsprechenden pIN-I- oder pIN-II-Plasmide konstruieren ^⁰ muß. Das nach Verdauung von ρΚΞΝΐ11 Plasmid-DNA mit Sau ' 3A-Restriktionsenzym und Befestigung von Eco Rl-kohäsiven Enden an den Enden des dabei erhaltenen Fragments (Anwendung des oben-beschriebenen und in Fig. 22 bei 145 ge-

zeigten Verfahrens) erhaltene Eco RI-Fragment kann man .

dann mit Xb'a I-Restriktionsenzym verdauen, wodurch das Fragment an der Xba I-SpaltstelIe (die innerhalb der 5'-untranslatierten Region liegt) in zwei Stücke .gespalten wird. Das Xba I-Eco RI-Fragment, das die Signalpeptidregio'n trägt, kann dann in die Xba I-Eco Rl-Stel.le von ρΥΜΟβΙ inseriert werden, wodurch man das C-I Plasmid von pIN.-III erhält. Durch weitere Abwandlung der Plasmid-DNA nach dem in den Fig. 23 und 24 bei 141 schematisch gezeigten Verfahren oder nach dem in den Fig. 23 und 25 bei 149 schematisch angegebenen Verfahren gelangt man zu den .pIN-III-Plasmiden, die den C-2- oder C-3-Leserahmen entsprechen.

Ein Struktürgen, das für ein Humangen oder ein anderes gewünschtes Polypeptid codiert, läßt sich in transformierten Bakterienwirten unter Einsatz eines erfindungsgemäß konstruierten rekombinanten Plasmid-Klonierungsträgers exprimieren, und auf diese Weise lassen sich beträchtliehe Mengen des gewünschten Polypeptids produzieren. Die oben beschriebenen Ausführungsformen stellen jedoch selbstverständlich nur Beispiele dar, so daß sie. in keiner Weise beschränkend aufzufassen sind. Es lassen sich daher auch andere rekombinante Piasmid-Klonierungsträger, durch welche exogene Gene exprimiert werden können, verwenden, ohne daß hierdurch vom Gedankengut und Umfang der vorliegenden Erfindung abgewichen wird, wie dies aus den Ansprüchen hervorgeht.

Claims (5)

Erfindungsansprüche:.

1 19. Verfahren nach Punkt 18, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Polypeptid ein Säugetierhormon umfaßt.

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten

Plasmids, das sich als Kionierungsträger zur Expression . wenigstens eines Polypeptids in einem transformierten Bakterienwirt verwenden läßt, dadurch gekennzeichnet , daß man eine erste DNA-Sequenz, die für wenigstens ein funktionelles Fragment codiert-, das von einem Proteingen aus der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums stammt, in Lesephase verknüpft mit

(a) einer zweiten DNA-Sequenz, die für einen induzierbares Promotorsignal codiert, und

(b) einer dritten DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz des obigen wenigstens einen· Polypeptids codiert, oder einer Insertionsstelle, die in Lesephase mit einem Translationscoaon verknüpft und zur Aufnahme dieser dritten DNA-Sequenz befähigt ist,

und mit einer vierten DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz eines Repressorproteins codiert, das zu einer Bindung an das induzierbare Promotorsignal unter selektiver Verhinderung einer Transkription befähigt ist.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch, ge-

kenn, zeichnet, daß das wenigstens eine funktionelle Fragment ein Promotorsignal enthält.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das wenigstens eine funktioneile Fragment ein Promotorsignal und eine 5'-untranslatierte Region enthält.

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das wenigstens eine funk-

^5 tionelle Fragment eine 3'-untranslatierte Region und ein Transkriptionsterminationssignal enthält.

5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, da-

durch gekennzeichnet, daß das Promotorsignal konstitutiv ist.

6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e -

kennzeichnet, daß der induzierbare Promotor nach dem konstitutiven Promotorsignal verknüpft ist.

7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, d a durch gekennzeichnet, daß die dritte DNA-Sequenz nach dem konstitutiven Promotorsignal und nach dem induzierbaren Promotorsignal sowie nach der 5 ' untranslatierten Region und vor der 3'-untranslatierten Region und vor dem Transkriptionsterminationssignal verknüpft ist.

8. Verfahren.nach einem der Punkte 1 bis δ, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertionsstelle nach dem konstitutiven Promotorsignal und nach dem induzierbaren Promotorsignal sowie nach der 5'-untranslatierten Region und vor der 3'-untranslatierten Region und vor dem Transkriptionsterminationssignal verknüpft ist.

9. Verfahren nach Punkt 7 oder 8, dadurch

gekennzeichnet, daß die erste DNA-Sequenz weiter codiert für eine Peptidextension, die zu einer Lenkung der Translokation des wenigstens einen Polypeptids durch die Cytoplasmamembran des Bakterienwirts befähigt ist. .

10. Verfahren nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet , daß die dritte DNA-Sequenz oder die Insertionsstelle- innerhalb der DNA-Sequenz liegt, die für die Peptidextension codiert.

11:. Verfahren nach Punkt 9, dadurch g e -

k e η .η ζ e i c h η e t , daß die dritte DNA-Sequenz oder

die Insertionsstelle am 3'-Ende der DNA-Sequenz liegt,

- 87 -
die für die Peptidextension codiert.

12. Verfahren nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste DNA-Sequenz weiter auch codiert für höchstens die gesamte Aminosäurese-' quenz eines Proteins aus der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums.

13. Verfahren nach Punkt 9, dadurch g e "IO kennzeichnet, daß die dritte DNA-Sequenz oder die Insertionsstelle innerhalb der DNA-Sequenz liegt, die für höchstens die gesamte Aminosäuresequenz eines Proteins aus der äußeren Zellmembran eines gramnegativen Bakteriums codiert.

T5 '

14. Verfahren nach- einem der Punkte' 1' bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das gramnegative Bakterium Escherichia coli ist.

15. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet , daß das Proteingen aus der äu-'ßeren Zellmembran das Lipcproteingen von Escherichia coli und. das Protein aus der äußeren Zellmembran das Lipoprotein von Escherichia coli umfaßt.

16. Verfahren nach Punkt 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet ,' daß die zweite DNA-Sequenz für den lac-Promotor-Operator von Escherichia coli codiert.

17. Verfahren nach Punkt 14, 15, oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die vierte DNA-Sequenz für das lacI-Gen von Escherichia coli codiert.

18. Verfahren nach Punkt 17, dadurch σ e kennzeichnet, daß die Insertionsstelle eine DNA-Sequenz umfaßt, die die Erkennungssequenzen für die Eco Rl—, Hind III- und Bam HI-Restriktionsendonucleasen enthalten.

5 20. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Plasmid-

ρΥΜΟβΙ, dadurch gekennzeichnet, daß man das 2,4 Kb Eco RI-Fragment von Plasmid-pYM058 an das mit Hind III teilverdaute pKEN045 knüpft.

kten Zeicimyngao