FR2663341A1 - Systeme pour l'expression d'une sequence polypeptidique et pour l'exposition de cette sequence a la surface d'un hote cellulaire. - Google Patents
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Abstract
L'invention se rapporte à des vecteurs et à des systèmes pour la synthèse et pour l'exposition à la surface d'un hôte cellulaire, d'une séquence polypeptidique choisie, ce vecteur et ce système comprenant: 1) un insérat nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique choisie, 2) une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène PulA de la pullulanase, recombinée en aval avec l'insérat dans le sens de la transcription pour former un fragment d'ADN hybride dans les conditions suivantes: a) le produit d'expression du fragment d'ADN hybride est exposé à la surface de la cellule hôte avec une efficacité supérieure à 30 %, b) le fragment d'ADN hybride formé est incorporé dans un vecteur d'expression sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi. Les séquences codantes des gènes de sécrétion de la pullulanase dans un ou plusieurs vecteurs d'expression, sous le contrôle d'au moins un promoteur permettant leur expression dans l'hôte cellulaire choisi et dans des conditions compatibles avec la synthèse simultanée dans cet hôte, du susdit fragment d'ADN hybride. L'invention concerne l'utilisation des vecteurs et systèmes de l'invention pour la production de séquences polypeptidiques.
Description
SYSTEME POUR L'EXPRESSION D'UNE SEQUENCE
POLYPEPTIDIQUE ET POUR L'EXPOSITION DE CETTE
SEQUENCE A LA SURFACE D'UN HOTE CELLULAIRE.
POLYPEPTIDIQUE ET POUR L'EXPOSITION DE CETTE
SEQUENCE A LA SURFACE D'UN HOTE CELLULAIRE.
L'invention concerne l'expression d'une séquence polypeptidique et l'exposition de cette séquence à la surface d'un hôte cellulaire, au moyen d'un système faisant appel aux éléments impliqués dans l'expression et le transport suivi de l'exposition à la surface de son hôte naturel de la pullulanase.
Différentes données sont disponibles sur la pullulanase, qui est une protéine habituellement exprimée et spécifiquement relarguée par la bactérie Gram-négative
Klebsiella pneumoniae et par des espèces voisines dans son milieu de culture (Bender et al, 1966, Methods
Enzymol., 3, 555-559 ; d'Enfert et al., 1987, Mol.
Klebsiella pneumoniae et par des espèces voisines dans son milieu de culture (Bender et al, 1966, Methods
Enzymol., 3, 555-559 ; d'Enfert et al., 1987, Mol.
Microbiol., 1, 107-116).
Comme l'ont montré Michaelis et al (1985, J.
Bacteriol., 164, 633-638), la pullulanase se présente comme une protéine totalement exposée à la surface de la cellule qui la produit naturellement, avant d'être relarguée dans le milieu de culture. L'ancrage de la pullulanase à la surface cellulaire serait accompli par l'intermédiaire d'une modification d'un acyle dérivé d'un acide gras N-terminal (désigné par acyl- "gras") (Pugsley et al, 1986, J. Bacteriol 166,1083-1088).
L'exposition & la surface de son hôte cellulaire naturel et la sécrétion de la pullulanase (polypeptide de 116 kDa) dépendent de la présence dans l'hôte cellulaire des gènes de secrétion dont certains ont été décrits par d'Enfert et Pugsley, (1989, J Bacteriol., 171, 3673-3679), d'Enfert et al, (1989, J. Biol. Chem., 264, 17462-17468), et Pugsley et Reyss, Mol Microbiol (4) 365-379). Ces gènes de secrétion sont localisés de part et d'autre du gène de structure de la pullulanase désigné par pulA dans le chromosome de K. Pneumoniae (Kornacker et al, 1989, J. Gen. Microbiol., 135, 397-408 d'Enfert et al, 1987,EMBO J 6, 3531-3538).Le produit des gènes de secrétion ci-dessus définis forme un complexe qui permet la translocation de la pullulanase à travers la membrane externe, après l'exportation du précurseur de pullulanase à travers la membrane cytoplasmique au troyen du système d'exportation de protéine impliquant le peptide signal (Pugsley et al, 1986, J. Bacteriol 166 1033-1088, d'Enfert et Pugsley, 1987, Mol. Microbiol., 1, 159-168).
Cette étape est suivie d'une étape de maturation du peptide signal par la peptidase des lipoprotéines (Pugsley et al, 1986, J Bacteriol, 166, 1083-1088).
On a déjà montré dans l'art antérieur (Kornacker et al., 1990, Molecular Microbiology, 4, 73-85) que l'exportation et la secrétion de la pullulanase impliquent une interaction directe entre l'enzyme et entre un ou plusieurs produits des gènes de secrétion--de la pullulanase. Cette interaction semble due à la présence de tout ou partie de la région N-terminale de la pullulanase. L'ensemble des gènes nécessaires à l'exposition et à la sécrétion, dont certains sont localisés sur un unique opéron, l'un d'entre eux restant extérieur à cet opéron, sont désignés dans la suite du texte par le terme "gènes de sécrétion".
L'objet de la présente invention est de fournir des moyens permettant de réaliser la synthèse et le transport puis l'exposition à la surface d'un hôte cellulaire défini et éventuellement la sécrétion dans le milieu extérieur de l'hôte, de séquences polypeptidiques particulières. Les moyens proposés par les inventeurs sont en partie dépendants d'un système qui serait propre à l'hôte cellulaire et nécessaire pour transloquer toute protéine non cytoplasmique au travers de la membrane cytoplasmique, auquel on ajouterait des fonctions spécifiques, qui permettraient dans certaines conditions d'exposer & la surface de l'hôte la séquence polypeptidique voulue, et le cas échéant de la relarguer dans le milieu.
Dans ce but, les inventeurs ont déterminé quelles parties de la séquence N-terminale du gène pulA codant pour la pullulanase s'avèrent nécessaires à la synthèse et à l'exposition voire la sécrétion d'une séquence polypeptidique hétérologue donnée.
L'invention concerne à cet égard un fragment d' ADN hybride comprenant au moins une partie de la séquence Nterminale du gène pulA ainsi qu'un insérat codant pour la séquence polypeptidique que l'on souhaite obtenir, un vecteur et un système pour l'expression d'une séquence polypeptidique et pour son exposition à la surface d'un hôte cellulaire déterminé.
Le fragment d'ADN hybride, le vecteur d'expression selon l'invention comprennent des éléments du gène pulA, notamment de la partie N-terminale du gène pulA, nécessaires à la synthèse par un hôte et a l'exposition & BR< sa surface, d'une séquence polypeptidique donnée. Le système de l'invention comprend, outre les éléments cidessus qui sont utilisés pour forger un vecteur recombinant,les gènes de sécrétion qui ont été présentés plus haut.
Le système selon l'invention permet d'obtenir des produits d' expression exposés à la surface d'un hôte cellulaire, que ce soit transitoirement ou de façon permanente. Dans le cas d'une exposition transitoire, les produits synthétisés sont relargués dans le milieu de culture de l'hôte, soit naturellement après un temps déterminé d'exposition à la surface de la cellule hôte, soit par l'action d'une substance donnée, par exemple une enzyme.
L'invention vise également un hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur ou système d'expression et d'exposition répondant à la définition précédente. Le système d'expression et d'exposition et/ou de sécrétion selon l'invention peut être utilisé pour la production de séquences polypeptidiques.
L'expression "séquence polypeptidique" concerne dans le contexte de l'invention les séquences peptidiques, polypeptidiques, protéiques ou toute séquence d'acides aminés, le cas échéant modifiée par l'addition de résidus non protéiques, dont on souhaite obtenir l'expression.
Des séquences polypeptidiques particulièrement avantageuses pour la réalisation de l'invention sont des séquences présentant des propriétés ilmunologiques ou immunogènes par exemple des antigènes protecteurs ou encore des séquences ayant un intérêt clinique et/ou thérapeutique telles que des séquences d'hormones ou de facteurs de croissance.
L'invention permet également l'application du système ci-dessus à la purification de séquences polypeptidiques intéressantes.
Font également l'objet de l'invention, des procédés pour l'obtention de séquences polypeptidiques déterminées.
L'invention concerne donc un vecteur pour la synthèse d'une séquence polypeptidique et pour 1'exposition de cette séquence synthétisée à la surface d'un hôte cellulaire déterminé, cette exposition pouvant être transitoire, ce vecteur étant caractérisé en ce que sa séquence est modifiée par la combinaison des éléments suivants 1) un insérat nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique choisie, 2) une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale (séquence 5') codante du gène pulA de la pullulanase, recombinée en aval avec 1'insérat nucléotidique ci-dessus dans le sens de la transcription, pour former un fragment d'ADN hybride dans les conditions suivantes
a) Le fragment d'ADN hybride foré est incorporé dans le vecteur d'expression choisi sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi,
b) le produit d'expression du fragment d'ADN hybride est exposé à la surface de la cellule hôte avec une efficacité supérieure à 30 %.
a) Le fragment d'ADN hybride foré est incorporé dans le vecteur d'expression choisi sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi,
b) le produit d'expression du fragment d'ADN hybride est exposé à la surface de la cellule hôte avec une efficacité supérieure à 30 %.
La "partie de la séquence N-terminale (séquence 5') codante du gène pulA de la pullulanase" est encore désignée par "région N-terminale". La taille de cette région, utilisée pour réaliser le fragment d'ADN hybride est déterminée par la capacité que confère la présence de cette région N-terminale à synthétiser la séquence polypeptidique choisie dans les conditions ci-dessus.
La région N-terminale correspond à cet égard à toute séquence nécessaire et/ou suffisante pour la mise en oeuvre de l'invention dans les conditions ci-dessus.
L'effacicité d'exposition de 30 % signifie que 30 % de la quantité totale de protéine hybride synthétisée est exposée à la surface de la cellule.
De façon particulièrement avantageuse, 1'exposition de la protéine hybride est supérieure à 30 % et est pratiquement égale à la quantité de protéine hybride exprimée dans l'hôte cellulaire.
Un tel vecteur, adapté à l'expression et à l'exposition d'une séquence polypeptidique selon l'invention, peut par exemple être un plasmide ou encore un chromosome.
Des promoteurs avantageusement utilisés pour construire les vecteurs de l'invention, sont par exemple des promoteurs de E.coli tels que mal, tat, lac Z ou des promoteurs d'origine bactériophagique tels que A ou T7.
Par exposition transitoire du produit d'expression de l'insérant codant pour la séquence polypeptidique choisie ou pour le produit d'expression de 1'ADN hybride on entendra l'exposition suivie par la sécrétion dans le milieu extracellulaire.
L'invention vise aussi un système pour l'expression d'une séquence polypeptidique et pour l'exposition de cette séquence polypeptidique synthétisée, & la surface d'un hôte cellulaire déterminé, cette exposition pouvant être transitoire, ce système étant caractérisé par la combinaison des éléments suivants 1) un insérat nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique choisie, 2) une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène pulA de la pullulanase recombinée en aval avec 1'insérat nucléotidique ci-dessus placé dans le sens de la transcription, pour former un fragment d'ADN hybride dans les conditions suivantes
a) Le fragment d'ADN hybride foré est incorporé dans un vecteur d'expression sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi,
b) le produit d'expression du fragment d'ADN hybride est exposé à la surface de la cellule hôte avec une efficacité supérieure à 30 %, 3) les séquences codantes des gènes de sécrétion de la pullulanase insérées dans un ou plusieurs vecteurs d'expression, sous le contrôle d'au moins un promoteur permettant leur expression dans l'hôte cellulaire choisi et dans des conditions compatibles avec l'expression simultanée dans cet hôte du fragment d'ADN hybride, et avec l'exposition du produit synthétisé à la surface de cet hôte, l'exposition étant le cas échéant suivie de la sécrétion du produit synthétisé dans le milieu extracellulaire.
a) Le fragment d'ADN hybride foré est incorporé dans un vecteur d'expression sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi,
b) le produit d'expression du fragment d'ADN hybride est exposé à la surface de la cellule hôte avec une efficacité supérieure à 30 %, 3) les séquences codantes des gènes de sécrétion de la pullulanase insérées dans un ou plusieurs vecteurs d'expression, sous le contrôle d'au moins un promoteur permettant leur expression dans l'hôte cellulaire choisi et dans des conditions compatibles avec l'expression simultanée dans cet hôte du fragment d'ADN hybride, et avec l'exposition du produit synthétisé à la surface de cet hôte, l'exposition étant le cas échéant suivie de la sécrétion du produit synthétisé dans le milieu extracellulaire.
Le système selon l'invention offre avantageusement la possibilité d'exposer å la surface d'une cellule hôte des séquences polypeptidiques de tailles très variables et avantageusement des séquences polypeptiques de grande taille.
Selon une variante de l'invention, le vecteur et/ou le système ci-dessus sont tels que le fragment d'ADN hybride qu'ils comportent répond aux conditions suivantes
a) le fragment d'ADN hybride forne est incorporé dans un vecteur d'expression sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi,
b) la région N-terminale a une longueur d'au moins 2119 nucléotides comptés & partir du nucléotide 1 correspondant à la base A du codon ATG d'initiation de pulA.
a) le fragment d'ADN hybride forne est incorporé dans un vecteur d'expression sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi,
b) la région N-terminale a une longueur d'au moins 2119 nucléotides comptés & partir du nucléotide 1 correspondant à la base A du codon ATG d'initiation de pulA.
Selon une autre variante de l'invention, le vecteur et le système définis précédemment en particulier par rapport à la longueur de la séquence codante du gène pulA insérée, sont caractérisés en ce que la séquence nucléotidique codant pour au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène Pula, a une longueur inférieure à 3112 nucléotides comptés à partir du nucléotide 1.
Les positions données des différents nucléotides ci-dessus ne doivent pas être interprétées comme excluant a priori des séquences présentant des nucléotides en plus ou en moins dès lors que la région N-terminale ainsi formée permet la réalisation de l'invention.
De même l'invention comprend les fragments d'ADN hybrides comprenant une région N-terminale du gène pulA, modifiée par rapport à la séquence naturelle du gène, par exemple par délétion, insertion ou remplacement de nucléotides dès lors que la séquence ainsi formée permet la réalisation de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier du système selon l'invention, les vecteurs d'expression modifiés d'une part par le fragment d'ADN hybride et d'autre part par les gènes de sécrétion de la pullulanase sont de façon avantageuse des plasmides ou des vecteurs chromosomiques, compatibles entre eux pour permettre l'expression dans le même hôte cellulaire du fragment d'ADN hybride et des gènes de sécrétion. Un système répondant à cette définition comporte par exemple deux plasmides compatibles l'un dérivé du pEMBL8 et porteur de la "région N-terminale" ci-dessus définie du gène pulA sous le contrôle du promoteur lac Z et l'autre dérivé du pAcyc184 porteur des gènes de sécrétion de la pullulanase.
Pour la réalisation des vecteurs ou des systèmes selon l'invention, l'insérat nucléotidique codant pour la séquence polypeptidique recherchée, peut être soit substitué à tout ou partie de la séquence codante du gène pulA en dehors de la région désignée ci-dessus par "région N-terminale" ou encore peut être inséré dans la susdite séquence codante.
Ainsi selon un premier mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique comprenant la région N-terminale, conformément à la définition cidessus est exempte de tout ou partie de la séquence du gène pulA située en aval de cette région N-terminale dans le fragment d'ADN hybride formé avec l'insérat codant pour une séquence polypeptidique choisie.
A titre d'exemple l'insérat nucléotidique codant pour la séquence polypeptidique recherchée peut être substitué à un fragment d'ADN de longueur correspondant de la séquence du gène pulA en aval de la région Nterminale.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur ou le système ci-dessus est tel que l'insérat est inséré en aval de la région N-terminale de la séquence nucléotidique du gène pulA, le fragment d'ADN hybride formé comprenant également en aval de l'insérat, 1' enchaînement nucléotidique habituellement présent dans le gène pulA en aval de la région N-terminale ci-dessus.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur ou le système précédemment décrit pour l'expression et l'exposition d'une séquence polypeptidique prédéterminée est tel que la région Nterminale codante du gène pulA de la pullulanase correspond à l'enchaînement nucléotidique entre la position 1 et la position 2500 de cet ADN codant. De façon particulièrement avantageuse, l'insérat nucléotidique est substitué à la région immédiatement en aval de la position 2500 de 1'ADN codant du gène pulA ou inséré dans cette région.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on peut intégrer entre la région N-terminale définie cidessus du gène pulA et l'insérat codant pour la séquence polypeptidique recherchée, une séquence supplémentaire (séquence cible) qui possède un site adapté au clivage enzymatique ou chimique, après la synthèse et l'exposition de la protéine hybride selon l'invention à la surface d'un hôte cellulaire.
Des exemples de séquences supplémentaires susceptibles d'être ainsi intégrées sont dans le fragment d'ADN hybride sont données ci-après avec les agents capables d'induire le clivage entre la séquence protéique recherchée et la séquence porteuse. Dans les exemples donnés x représente un acide aminé quelconque et s représente le site de clivage site Agent
Mets X Bromure de cyanogène Asp4 Pro Acide formique Asn4 Gly hydroxylamine Trips X bromosuccinimide Cys4 X nitro-thiocyanobenzoate
Ala signal (leader)
peptidase gly Ala Ser-X-Gly#X
Leu Ser
Val
Ile Gly-Pro-ArgX Thrombine Gly-Asp-Asp-Asp+X enterokinase Ile-Glu-Gly-Arg#X facteur X Pro-ValzGly-Pro collagenase Lys+X Protease Ps-l de
pseudomonas
Pro-Phe-ArgsX kallekreine de plasma Thr-Pro-ProsThr- Proteases IgA
Pro-Ser-ProsSer Thr-Pro-ProsThr-
Pro-Ser-Pro-Ser Arg-Lys 4X Protease de levure
KEX2
Les fragments d'ADN, les vecteurs ou systèmes selon l'invention peuvent être de façon intéressante, exprimés dans un hôte cellulaire de type bactérien, en particulier une bactérie Gram-négative par exemple dans E. coli ou
Salmonella.
Mets X Bromure de cyanogène Asp4 Pro Acide formique Asn4 Gly hydroxylamine Trips X bromosuccinimide Cys4 X nitro-thiocyanobenzoate
Ala signal (leader)
peptidase gly Ala Ser-X-Gly#X
Leu Ser
Val
Ile Gly-Pro-ArgX Thrombine Gly-Asp-Asp-Asp+X enterokinase Ile-Glu-Gly-Arg#X facteur X Pro-ValzGly-Pro collagenase Lys+X Protease Ps-l de
pseudomonas
Pro-Phe-ArgsX kallekreine de plasma Thr-Pro-ProsThr- Proteases IgA
Pro-Ser-ProsSer Thr-Pro-ProsThr-
Pro-Ser-Pro-Ser Arg-Lys 4X Protease de levure
KEX2
Les fragments d'ADN, les vecteurs ou systèmes selon l'invention peuvent être de façon intéressante, exprimés dans un hôte cellulaire de type bactérien, en particulier une bactérie Gram-négative par exemple dans E. coli ou
Salmonella.
Les fragments d'ADN hybrides, vecteurs et systèmes selon l'invention sont particulièrement intéressants lorsque l'insérat nucléotidique dont on souhaite obtenir l'expression code pour une séquence d'acides aminés ayant des propriétés immunologiques ou immunogènes. D'autres insérats nucléotidiques avantageux sont ceux qui codent pour une séquence d'acides aminés d'intérêt thérapeutique et/ou clinique.
Un fragment d'ADN hybride, un vecteur ou un système particulier selon l'invention est caractérisé en ce que la région N-terminale correspond i 1'ADN codant du gène pulA de la pullanase, entre la position 1 et la position 2500, cet ADN comportant en position 2500 un site ApaI permettant la liaison avec un insérat nucléotidique déterminé, le cas échéant au moyen d'un linker, et en ce que cette région N-terminale et cet insérat sont incorporés dans un plasmide , sous le contrôle d'un promoteur, par exemple le promoteur lac.
A titre d'exemple, un plasmide utilisable est le plasmide pCHAP. Un vecteur ainsi réalisé est le plasmide pCHAP808 déposé à la Collection Nationale des Cultures de Nicroorganismes de Paris le 8 juin 1990 sous le numéro I-955.
L'invention vise aussi le fragment d'ADN hybride utilisé dans la construction des vecteurs et des systèmes ci-dessus. Un fragment d'ADN hybride est ainsi défini par la recombinaison de la région N-terminale codante de la séquence du gène pulA, selon les définitions données précédemment avec un insérat nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique choisie.
L'invention vise aussi un hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il contient un vecteur ou un système selon l'invention, tels qu'ils ont été définis dans les pages précédentes.
Cet hôte cellulaire recombinant est de préférence une bactérie Gram-négative en particulier E. coli ou
Salmonella.
Salmonella.
Selon une variante de l'invention, l'hôte cellulaire est caractérisé en ce que la séquence polypeptidique initialement exposée à la surface cellulaire est ensuite sécrétée dans le milieu externe sous forme de produit hybride avec la partie de la protéine PulA synthétisée, ou sous forme de séquence polypeptidique isolée, après clivage de l'hybride.
Entre également dans le champ de l'invention, une protéine hybride caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence polypeptidique insérée en un site de la pullulanase ou substituée à une partie de la pullulanase,de façon à être exposée à la surface d'un hôte cellulaire l'exprimant, préalablement modifié par un système d'expression et d'exposition selon l'invention.
L'invention se rapporte également aux applications des fragments d'ADN hybrides, vecteurs ou systèmes, pour la production et la purification de séquences polypeptidiques données. Elle vise aussi les séquences polypeptidiques purifiées telles qu'obtenues par la mise en oeuvre des techniques de l'invention.
Est également compris dans le cadre de l'invention un procédé pour l'obtention d'une séquence polypeptidique, caractérisé en ce que l'on transforme un hôte cellulaire déterminé avec un système tel que défini précédemment, en ce que l'on cultive l'hôte cellulaire ainsi transformé, dans des conditions permettant la synthèse de la séquence polypeptidique recherchée et son exposition à la surface de l'hôte transformé et le cas échéant sa sécrétion dans le milieu de culture, et en ce que l'on récupère l'hybride ainsi formé.
La production de la séquence polypeptidique recherchée peut également comporter une étape de purification par exemple par protéolyse aménagée si la séquence polypetidique est exposée à la surface de l'hôte cellulaire, ou par exemple par centrifugation si la séquence polypeptidique est sécrétée dans le milieu.
L'invention concerne aussi un procédé pour l'obtention d'un système pour la synthèse d'une séquence polypeptidique et pour l'exposition de cette séquence à la surface d'un hôte cellulaire déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- la ligation d'un insérat nucléotidique codant pour la séquence polypeptidique dont on recherche la synthèse et 1'exposition avec une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène pulA de la pullulanase ("région Nterminale") de préférence en un site unique de restriction présent ou formé sur cette séquence nucléotidique, de façon à former un fragment d'ADN hybride répondant aux définitions précédentes pour obtenir la synthèse et l'exposition de l'insérat nucléotidique ci-dessus.
- la ligation d'un insérat nucléotidique codant pour la séquence polypeptidique dont on recherche la synthèse et 1'exposition avec une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène pulA de la pullulanase ("région Nterminale") de préférence en un site unique de restriction présent ou formé sur cette séquence nucléotidique, de façon à former un fragment d'ADN hybride répondant aux définitions précédentes pour obtenir la synthèse et l'exposition de l'insérat nucléotidique ci-dessus.
- la modification d'un premier vecteur d'expression déterminé, par le fragment d'ADN hybride formé, ledit vecteur étant muni d'un promoteur d'expression adapté à la synthèse de 1'ADN hybride dans un hôte cellulaire choisi, dans des conditions permettant l'expression de ce fragment d'ADN hybride,
- la modification par les gènes de sécrétion de la pullulanase, d'un vecteur d'expression compatible avec le susdit premier vecteur d'expression dans l'hâte cellulaire choisi, dans des conditions permettant l'expression de ces gênes.
- la modification par les gènes de sécrétion de la pullulanase, d'un vecteur d'expression compatible avec le susdit premier vecteur d'expression dans l'hâte cellulaire choisi, dans des conditions permettant l'expression de ces gênes.
Un procédé pour la production d'un fragment d' ADN hybride selon l'invention comprend l'étape ci-dessus de ligation. Un procédé d'obtention d'un vecteur de l'invention, comprend les étapes de ligation et de modification du premier vecteur définies ci-dessus.
L'invention vise en outre une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un hôte cellulaire exprimant à sa surface une séquence polypeptidique déterminée, conformément aux moyens de l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Une telle composition peut être administrée chez des patients pour provoquer la formation d'anticorps et notamment d'anticorps neutralisants contre la séquence polypeptidique qu'elle contient.
D'autres caractéristiques et avantages de 1'invention apparaissent dans les figures et dans les exemples qui suivent
Figure 1 : carte de restriction de pulA, et les segments de pulA qui sont présents dans les genes de fusion pulA-blaN et pulA-phoA et les résultats d'immunofluorescence obtenus avec la souche E. coli MC4100 produisant des hybrides PulA et reproduisant les fonctions de sécrétion de la pullulanase. L'ADN codant pour le plus petit segment N-terminal de la pullulanase identifié nécessaire à l'exportation est indiqué par la partie de pulA montrée dans le cadre noir. Les sites de restriction qui ont été convertis en sites Apal pendant la construction des gènes de fusion pulA sont indiqués par '(apax)'.
Figure 1 : carte de restriction de pulA, et les segments de pulA qui sont présents dans les genes de fusion pulA-blaN et pulA-phoA et les résultats d'immunofluorescence obtenus avec la souche E. coli MC4100 produisant des hybrides PulA et reproduisant les fonctions de sécrétion de la pullulanase. L'ADN codant pour le plus petit segment N-terminal de la pullulanase identifié nécessaire à l'exportation est indiqué par la partie de pulA montrée dans le cadre noir. Les sites de restriction qui ont été convertis en sites Apal pendant la construction des gènes de fusion pulA sont indiqués par '(apax)'.
Figure 2 :test d'immunoempreintes (immunoblot de proteines hybrides PulA-blaM et PulA-phoA associées aux cellules produites par la souche E. Coli MC4100 compatible avec les fonctions de sécrétion de la pullulanase. Les échantillons ont été preparés à partir des souches en phase de croissance exponentielle (A600 = 1). L'anticorps utilisé pour chaque empreinte est indiqué
a) protéines hybrides codées par pCHAP808 et pCHAP802 ;
b) protéine hybride codée par pCHAP833.
a) protéines hybrides codées par pCHAP808 et pCHAP802 ;
b) protéine hybride codée par pCHAP833.
Les poids moléculaires des hybrides déterminés par cette technique ont été établis à partir de la séquence d'ADN. Les positions des marqueurs des masses moléculaires sont indiquées.
Figure 3 : hybrides PulA-BlaM marqués avec le 3Hpalmitate, codés par les plasmides pCHAP802 et pCHAP808.
Les protéines des cellules marquées sont séparées par électrophorèse sur gel de 7,8 % de polyacrylamide, suivi par fluorographie. Les bandes extérieures des acyls "gras" présents dans les cellules de la souche portant pCHAP808 sont probablement dues à la dégradation protéolitique de la protéine hybride. Les positions des standards de masses moléculaires sont données.
Figure 4 : exposition à la surface des cellules des molécules hybrides PulA-BlaM, produites par les souches
E. coli MC4100 portant pCHAP808 et compatibles avec les fonctions de sécrétion de la pullulanase exprimée. Les cellules sont en culture en phase exponentielle (A600 = 1), fixées par 2 % de glutaraldéyde dans le PBSM et les molécules hybrides sont visualisées par marquage immunogold et par microscopie électronique. A) cellules traitées avec l'antisérum anti-PulA ; B) les cellules traitées avec l'antisérum anti-BlaX.
E. coli MC4100 portant pCHAP808 et compatibles avec les fonctions de sécrétion de la pullulanase exprimée. Les cellules sont en culture en phase exponentielle (A600 = 1), fixées par 2 % de glutaraldéyde dans le PBSM et les molécules hybrides sont visualisées par marquage immunogold et par microscopie électronique. A) cellules traitées avec l'antisérum anti-PulA ; B) les cellules traitées avec l'antisérum anti-BlaX.
Figure 5 : séparation des fractions iembranaires des cellules de E. coli (pCHAP808, pCHAP710). Les membranes préparées à partir de cellules lysées par ultracentrifugation (163 000 g) ont été resuspendues dans un tampon Tris-Mg et séparées par centrifugation sur gradient de sucrose. Les fractions collectées à partir du fond du gradient ont été testées pour la 8-blactamase (en utilisant la nitrocefine comme substrat), la protéine et l'acide ketodeoxy-octanoique (KDO), un carbohydrate présent exclusivement dans les lipopolysaccharides de la membrane externe. Le profil protéique obtenu sur le gradiant à partir des échantillons collectés (déterminés par SDS.PAGE) a montré une distribution normale des protéines de membranes interne et externe.
Figure 6 : relargage dans le milieu par E. coli MC4100 (pCHAP710) de la ss-lactamase et de l'acide phosphatase (normalement périplasmique) pendant la production des hybrides PulA-BlaM codés par les plasmides pCHAP808 et pCHAP810. Les activités enzymatiques dans le milieu extra-cellulaire (pourcentage de l'activité totale en culture) sont répertoriées en fonction du temps. La croissance exponentielle a commencé à diminuer lorsque les cellules sont entrées en phase stationnaire après 4 heures. Le relargage de la ss-lactamase à partir de la culture des cellules modifiées par pCHAP816 ne pouvait pratiquement pas être distingué du relargage de l'enzyme à partir des cellules modifiées par pCHAP810.
Exemple
Souche bactérienne et conditions de croissance
Les protéines hybrides PulA ont été analysées dans une souche E.coli K-12 MC4100 [#(1ac-argF) U169 araD139 relAl rpsL1501 (pAPIPSOl (F'lacq lacZNl5 pro+ Tnî0)).
Souche bactérienne et conditions de croissance
Les protéines hybrides PulA ont été analysées dans une souche E.coli K-12 MC4100 [#(1ac-argF) U169 araD139 relAl rpsL1501 (pAPIPSOl (F'lacq lacZNl5 pro+ Tnî0)).
E.coli K-12 souche PAP103 (pAPIPSO1) a été utilisé dans toutes les procédures de clonage. La souche K.pneumoniae
K21 a été décrite au préalable par Kornacker et al, (1989
Mol. Microbiol, 3, 497-503). Les milieux utilisés sont, le milieu d'agar L-broth, le milieu L-broth et le milieu minimum M63 (Miller, 1972, Experiment in Molecular
Genetics Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor
Laboratory). Les milieux minimum contiennent 0,4% d'acides casamino, 0,48 de glycerol. Le maltose était présent en proportion de 0,4% lorsque la synthèse des gènes de secrétion de la pullulanase (d'Enfert et al, 1987, EMBO J, 6, 3531-3538) était requise.
K21 a été décrite au préalable par Kornacker et al, (1989
Mol. Microbiol, 3, 497-503). Les milieux utilisés sont, le milieu d'agar L-broth, le milieu L-broth et le milieu minimum M63 (Miller, 1972, Experiment in Molecular
Genetics Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor
Laboratory). Les milieux minimum contiennent 0,4% d'acides casamino, 0,48 de glycerol. Le maltose était présent en proportion de 0,4% lorsque la synthèse des gènes de secrétion de la pullulanase (d'Enfert et al, 1987, EMBO J, 6, 3531-3538) était requise.
De 1'isopropyl-ss-thiogalactoside (IPTG) a été ulilisé à des concentrations de 1mH ou 0.15mM pour induire la production respectivement de pullulanase codée par le plasmide pCHAP656 ou la protection de protéines hybrides comprenant la pullanases. Des antibiotiques ont été utilisés dans les concentrations suivantes: ampicilline 200g/ml, chloramphénicol 25g/ml, tetracycline, 15g/ml, kanamycine 50g/ml.
Tests enzymatiques des milieux indicateurs
La ss-lactamase a été testée de la façon décrite par
O'Callaghan et al (1972, Antibiotic Agents Chemoter, 1, 283-288. La pullulanase a été testée selon la méthode de Michaelis et al (1985, J. Bacteriol, 164, 633-638) et l'amylomaltase selon la méthode de Pugsley et Dubreuil (1988, Mol. Microbiol, 2, 473-479). Les tests sur la phosphatase alcaline et la phosphatase acide ont été décrits principalement par Brockmann et Heppel (1968,
Biochemistry, 7, 2554-2562) excepté le fait que la phosphatase acide a été testée dans un tampon de Trisacétate (pH4,5). L'activité de la phosphatase alcaline sur des mileux solides a été détectée avec un substrat chromogène, le bromo-5-chloro-4-indolyl-3 phosphate (XP).
La ss-lactamase a été testée de la façon décrite par
O'Callaghan et al (1972, Antibiotic Agents Chemoter, 1, 283-288. La pullulanase a été testée selon la méthode de Michaelis et al (1985, J. Bacteriol, 164, 633-638) et l'amylomaltase selon la méthode de Pugsley et Dubreuil (1988, Mol. Microbiol, 2, 473-479). Les tests sur la phosphatase alcaline et la phosphatase acide ont été décrits principalement par Brockmann et Heppel (1968,
Biochemistry, 7, 2554-2562) excepté le fait que la phosphatase acide a été testée dans un tampon de Trisacétate (pH4,5). L'activité de la phosphatase alcaline sur des mileux solides a été détectée avec un substrat chromogène, le bromo-5-chloro-4-indolyl-3 phosphate (XP).
Constructions des plasmides
pCKAP712, pCHAP713 and pCHAP714 ont été construits suivant le mode opératoire suivant
les plasmides pCHAP 613, pCHAP 614 et pCHAP 615 qui codent pour la phosphatase alcaline (PhoA) mature dans les trois cadres de lecture ont été digérés avec PstI de façon à libérer les séquences de phoA. Cette digestion a été suivie d'une ligation au plasmide pCHAP656 qui porte le gène pulA et dont la forme linéaire a été purifée après digestion partielle avec PstI. Les transformants exprimant en phase les produits de fusion de pulA et phoA (pulA-PhoA) ont été isolés sous forme de colonies bleues sur des plaques contenant de 1'IPTG et du XP et les plasmides comportant des insérats aux sites appropriés
PstI, dans le gène pulA (Figure 1) ont été identifiés au moyen d'une analyse de restriction.Le plasmide pCHAP833 a été construit en deux étapes
1) La partie phoA de pCH40 (Hoffmann et Wright, 1985, PNAS, USA, 82, 5107-5110) a été insérée dans pSB119, un plasmide du type pUCî9 dans lequel le polylinker est entouré par des sites HindIII, dans une orientation telle que le site PstI au début de phoA est adjacent au site SalI dans le polylinker de pSBll9. Le site Hindi du polylinker a ensuite été converti en site
ApaI par insertion d'un linker (5'GGGCCC3') pour obtenir pCHAP821 ;;
2) le fragment Hindili-Apal de pCHAP821 (codant pour la phosphatase alcaline mature) a ensuite été ligué au fragment HindIII-AEaI dérivé par digestion de pCHAP656, dans lequel le site HincII a la position 2500 (Figure 1) a été éliminé par insertion d'un site Apal selon le protocole décrit ci-dessus.
pCKAP712, pCHAP713 and pCHAP714 ont été construits suivant le mode opératoire suivant
les plasmides pCHAP 613, pCHAP 614 et pCHAP 615 qui codent pour la phosphatase alcaline (PhoA) mature dans les trois cadres de lecture ont été digérés avec PstI de façon à libérer les séquences de phoA. Cette digestion a été suivie d'une ligation au plasmide pCHAP656 qui porte le gène pulA et dont la forme linéaire a été purifée après digestion partielle avec PstI. Les transformants exprimant en phase les produits de fusion de pulA et phoA (pulA-PhoA) ont été isolés sous forme de colonies bleues sur des plaques contenant de 1'IPTG et du XP et les plasmides comportant des insérats aux sites appropriés
PstI, dans le gène pulA (Figure 1) ont été identifiés au moyen d'une analyse de restriction.Le plasmide pCHAP833 a été construit en deux étapes
1) La partie phoA de pCH40 (Hoffmann et Wright, 1985, PNAS, USA, 82, 5107-5110) a été insérée dans pSB119, un plasmide du type pUCî9 dans lequel le polylinker est entouré par des sites HindIII, dans une orientation telle que le site PstI au début de phoA est adjacent au site SalI dans le polylinker de pSBll9. Le site Hindi du polylinker a ensuite été converti en site
ApaI par insertion d'un linker (5'GGGCCC3') pour obtenir pCHAP821 ;;
2) le fragment Hindili-Apal de pCHAP821 (codant pour la phosphatase alcaline mature) a ensuite été ligué au fragment HindIII-AEaI dérivé par digestion de pCHAP656, dans lequel le site HincII a la position 2500 (Figure 1) a été éliminé par insertion d'un site Apal selon le protocole décrit ci-dessus.
Les plasmides pCHAP802, pCHAP808, pCHAP810 et pCHAP816 ont été construits par ligation des fragments EcoRI-ApaI des dérivés de pCHAP656 qui portent respectivement des linkers ApaI au site PvuII en position 919, au site HincII en position 2500, au site PvuII en position 3112 et au site EcoRV en position 2119 du gène
PulA, à un dérivé EcoR-ApaI obtenu par digestion du plasmide pJBS633 (Broome-Smith and Spratt, 1986, Gene 49, 341-349) dans lequel le site PvuII au début de la séquence codant pour la protéine ss-lactamase mature BlaM a été convertie en un site ApaI. Afin d'obtenir la synthèse du produit de fusion des gènes pulA-blaM, un fragment d'ADN EcoRI de place (Vidal-Ingigliardi and et
Raibaud, 1985, Nucl.Acids Res., 13, 5919-5926) a été inséré dans l'unique site EcoRI de chacun des plasmides résultants dans l'orientation appropriée.
PulA, à un dérivé EcoR-ApaI obtenu par digestion du plasmide pJBS633 (Broome-Smith and Spratt, 1986, Gene 49, 341-349) dans lequel le site PvuII au début de la séquence codant pour la protéine ss-lactamase mature BlaM a été convertie en un site ApaI. Afin d'obtenir la synthèse du produit de fusion des gènes pulA-blaM, un fragment d'ADN EcoRI de place (Vidal-Ingigliardi and et
Raibaud, 1985, Nucl.Acids Res., 13, 5919-5926) a été inséré dans l'unique site EcoRI de chacun des plasmides résultants dans l'orientation appropriée.
Protocoles généraux
Les techniques de biologie moléculaire générale utilisées ont essentiellement été décrites par Perbal (1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, Wiley, New
York, USA). Le marquage de la protéine avec le 3Hpalmitate, l'analyse en immunofluorescence et l'immunoblot, ainsi que l'électrophorèse des protéines sur gel d'électrophorèse SDS ont été réalisés selon les protocoles décrits (Pugsley et al 1986, J. Bacteriol 166, 1083-1088 ; d'Enfert et al 1989, J. Biol chem264 17462-17468, d'Enfert et Pugsley 1987, mol microbiol 1, 159,168 ]. "Amplify" (Amersham) a été utilisé pour la fluorographie. La colonne de tamisage moléculaire des hybrides extracellulaires pulA-blaM et de la pullulanase était réalisée selon la méthode de Kornacker et al (Mol.
Les techniques de biologie moléculaire générale utilisées ont essentiellement été décrites par Perbal (1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, Wiley, New
York, USA). Le marquage de la protéine avec le 3Hpalmitate, l'analyse en immunofluorescence et l'immunoblot, ainsi que l'électrophorèse des protéines sur gel d'électrophorèse SDS ont été réalisés selon les protocoles décrits (Pugsley et al 1986, J. Bacteriol 166, 1083-1088 ; d'Enfert et al 1989, J. Biol chem264 17462-17468, d'Enfert et Pugsley 1987, mol microbiol 1, 159,168 ]. "Amplify" (Amersham) a été utilisé pour la fluorographie. La colonne de tamisage moléculaire des hybrides extracellulaires pulA-blaM et de la pullulanase était réalisée selon la méthode de Kornacker et al (Mol.
Micorobiol, 3, 497-503). Le fractionnement cellulaire a été décrit par Pugsley et al (Mol Nicrobiol 4, 59-72).
Les études de l'accessibilité par la protéase ont été conduites en incubant une partie aliquote de îml de cultures poussées en phase exponentielle (A600=1) pendant 1 heure à 37'C en présence de 0,1mg/ml de protéase. Après le traitement avec la protéase, les cellules ont été lavées abondamment avec un milieu de culture frais. Des procédures de microscopie électronique utilisées ont été celles décrites par d'Enfert et al, 1987, EMBO J., 6, 3531-3538).
Résultats
Localisation à la surface cellulaire de la protéine hybride PulA-blam
Le vecteur pBGS633 décrit par Broome-Smith et Spratt (1986, Gêne, 49, 341-349) qui permet la construction de gène de fusion à l'extrêmité 5' d'un gène blaM tronqué qui code pour la p-lactamase mature a été utilisé. Ce vecteur a permis la construction des gènes hybrides PulA-blaN (plasmides pCHAP802, pCHAP808, pCHAP810 et pCHAP816) qui codent pour des longueurs différentes de la région N-terminale de la pullulanase (pulA). La figure 1 montre la carte de restriction de pulA et indique pour chaque fusion la localisation de la jonction de fusion avec pulA.Pour l'analyse, les plasmides codant pour les quatre protéines de fusion ont été introduits dans
E.coliMC4100 portant un plasmide pCHAP710, un dérivé de pACYC184 portant tous les gènes de sécrétion de la pullulanase clonés à partir de K.pneumoniae UNF5023 (d'Enfert et al, 1987, précités et Kornacker et Pugsley 1990 Mol Microbiol 4 : 79-85). Des immuno-empreintes (immunoblot) avec des anticorps polynoclonaux dirigés contre les protéines PulA et blam purifiées ont montré que tous les produits de fusion PulA-blaM ont été exprimés et qu'une grande proportion de chaque protéine hybride était apparemment présente dans sa longueur complète (Fig. 2A).Toutes les protéines hybrides ont une activité ss-lactamase (les clones les produisant étaient résistants à l'ampiciline en quantité très supérieure à 1 mg/ml) mais aucun ne présente d'activité pullulanase.
Localisation à la surface cellulaire de la protéine hybride PulA-blam
Le vecteur pBGS633 décrit par Broome-Smith et Spratt (1986, Gêne, 49, 341-349) qui permet la construction de gène de fusion à l'extrêmité 5' d'un gène blaM tronqué qui code pour la p-lactamase mature a été utilisé. Ce vecteur a permis la construction des gènes hybrides PulA-blaN (plasmides pCHAP802, pCHAP808, pCHAP810 et pCHAP816) qui codent pour des longueurs différentes de la région N-terminale de la pullulanase (pulA). La figure 1 montre la carte de restriction de pulA et indique pour chaque fusion la localisation de la jonction de fusion avec pulA.Pour l'analyse, les plasmides codant pour les quatre protéines de fusion ont été introduits dans
E.coliMC4100 portant un plasmide pCHAP710, un dérivé de pACYC184 portant tous les gènes de sécrétion de la pullulanase clonés à partir de K.pneumoniae UNF5023 (d'Enfert et al, 1987, précités et Kornacker et Pugsley 1990 Mol Microbiol 4 : 79-85). Des immuno-empreintes (immunoblot) avec des anticorps polynoclonaux dirigés contre les protéines PulA et blam purifiées ont montré que tous les produits de fusion PulA-blaM ont été exprimés et qu'une grande proportion de chaque protéine hybride était apparemment présente dans sa longueur complète (Fig. 2A).Toutes les protéines hybrides ont une activité ss-lactamase (les clones les produisant étaient résistants à l'ampiciline en quantité très supérieure à 1 mg/ml) mais aucun ne présente d'activité pullulanase.
Afin de déterminer si l'un des hybrides PulA- BlaM a été transporté à la surface cellulaire, les activités ss- lactamase ont été mesurées en utilisant un substrat de nitrocéfine (tableau 1). La nitrocéfine ne pénètre membrane externe de E.coli et elle rend ainsi possible la distinction entre les hybrides PulA-BlaM qui sont exposés à la surface cellulaire et les hybrides qui n'ont pas traversé la membrane cellulaire. Les cultures cellulaires produisant le plus court produit de fusion (pCHAP802) qui ne contient pas les séquences de PulA essentielles pour l'exposition et la sécrétion à la surface cellulaire (Fig. 1) ne présentent ni l'activité ss-lactamase de la surface cellulaire, ni l'activité ss-lactamase extracellulaire.Au contraire, jusqu'à 70 % de l'activité p- lactamase associée dans des cultures de cellule produisant le produit de fusion pulA-blaM du plasmide pCHAP808, qui contient toutes les séquences essentielles pour l'exposition à la surface d'une cellule, a été localisée à la surface cellulaire (tableau 1). De plus, la protéine hybride (comme celle codée par le plasmide pCHAP802) a subi une acylation des acides gras détectée par incorporation métabolique de 3H-palritate (Fig. 3).
Des quantités significatives de 1'activité p-lactamase ont également été détectées dans le milieu de culture.
Aucune activité ss-lactamase à la surface cellulaire ou dans le milieu extra-cellulaire n'a été détectée dans les souches qui ne présentaient pas les gènes de sécrétion portés par le plasmide pCHAP710. On a donc montré qu'une grande proportion de cet hybride PulA-BlaM a été spécifiquement, efficacement et complètement transportée à la surface cellulaire puis relarguée dans le milieu.
Des tests d'immunofluorescence avec des anticorps contre
PulA et BlaM ont confirmé que seulement la protéine hybride codée par pCHAP808 était localisée sur la surface cellulaire. De même les hybrides PulA-BlaN de la surface cellulaire codés par pCHAP808 ont été visualisés directement par microscopie électronique après marquage des cellules avec des anticorps anti-PulA et anti-BlaM et une réaction ultérieure avec de l'or couplé à des anticorps antiIgG. La surface cellulaire uniformément marquée a été observée à la fois avec les anticorps anti-PulA et les anticorps anti-BlaH(Fig. 4). Aucun marquage n'a été observé avec la souche isogénique qui ne portait pas le plasmide pCHAP710 ou avec les souches portant pCHAP710 et produisant les hybrides codés par pCHAP802, 810 ou 816.L'amplitude de la localisation à la surface cellulaire de l'hybride codé par pCHAP808 a été mesurée par les effets des protéases exogènes sur l'activité ss-lactamase (tableau 2). Plusieurs protéases ont entraîné une perte de l'activité ss-lactamase de surface alors que l'activité ss-lactamase non exposée n'était pas affectée. De plus, le traitement par les protéases a invariablement aboli le signal d'immunofluorescence obtenu avec des anticorps contre la ss-lactamase (tableau 1).Le signal d'iumunofluorescence obtenu avec les anticorps anti-PulA était cependant aboli après le traitement avec la pronase E et la protéinase K mais pas avec la protéinase N ou la chymotrypcine. Ces dernières protéases n'ont probablement pas dégradé toute la partie PulA de la protéine hybride exposée.
PulA et BlaM ont confirmé que seulement la protéine hybride codée par pCHAP808 était localisée sur la surface cellulaire. De même les hybrides PulA-BlaN de la surface cellulaire codés par pCHAP808 ont été visualisés directement par microscopie électronique après marquage des cellules avec des anticorps anti-PulA et anti-BlaM et une réaction ultérieure avec de l'or couplé à des anticorps antiIgG. La surface cellulaire uniformément marquée a été observée à la fois avec les anticorps anti-PulA et les anticorps anti-BlaH(Fig. 4). Aucun marquage n'a été observé avec la souche isogénique qui ne portait pas le plasmide pCHAP710 ou avec les souches portant pCHAP710 et produisant les hybrides codés par pCHAP802, 810 ou 816.L'amplitude de la localisation à la surface cellulaire de l'hybride codé par pCHAP808 a été mesurée par les effets des protéases exogènes sur l'activité ss-lactamase (tableau 2). Plusieurs protéases ont entraîné une perte de l'activité ss-lactamase de surface alors que l'activité ss-lactamase non exposée n'était pas affectée. De plus, le traitement par les protéases a invariablement aboli le signal d'immunofluorescence obtenu avec des anticorps contre la ss-lactamase (tableau 1).Le signal d'iumunofluorescence obtenu avec les anticorps anti-PulA était cependant aboli après le traitement avec la pronase E et la protéinase K mais pas avec la protéinase N ou la chymotrypcine. Ces dernières protéases n'ont probablement pas dégradé toute la partie PulA de la protéine hybride exposée.
Localisation des protéines hybrides PulA-BlaM codées par
PCHAP802 et pCHAP808
La localisation de l'hybride non exposé codé par pCHAP802 et de la fraction de l'hybride codé par pCHAP808 qui reste associé à la cellule, a été analysée par des expériences de fractionnement dans lesquelles les cellules ont été lysées par passage à travers une cellule de presse de French et la membrane de pression et les fractions solubles ont été séparées par ultracentrifugation. La plus grande partie de l'activité
B-lactamase a été récupérée à partir de la fraction membranaire (tableau 3). De même, la pullulanase codée par pCHAP656 était également présente dans la fraction membranaire alors que la ss-lactamase codée par pCHAP656 et l'amylomaltase cytoplasmique codée par le chromosome était prédominante dans la fraction soluble (tableau 3).
PCHAP802 et pCHAP808
La localisation de l'hybride non exposé codé par pCHAP802 et de la fraction de l'hybride codé par pCHAP808 qui reste associé à la cellule, a été analysée par des expériences de fractionnement dans lesquelles les cellules ont été lysées par passage à travers une cellule de presse de French et la membrane de pression et les fractions solubles ont été séparées par ultracentrifugation. La plus grande partie de l'activité
B-lactamase a été récupérée à partir de la fraction membranaire (tableau 3). De même, la pullulanase codée par pCHAP656 était également présente dans la fraction membranaire alors que la ss-lactamase codée par pCHAP656 et l'amylomaltase cytoplasmique codée par le chromosome était prédominante dans la fraction soluble (tableau 3).
L'activité p-lactamase qui était présente dans la fraction soluble correspondait à l'activité d'une protéine soluble naturellement. I1 semble que les hybrides PulA-BlaM présentent le même comportement que la pullulanase complète.
Localisation à la surface cellulaire des produits de fusion PulA-PhoA
Des protéines hybrides PulA-PhoA (codées par pCHAP712 et pCHAP713, Fig. 1) qui contenaient le segment N-terminal utile pour la sécrétion de PulA fusionné directement avec la protéine PhoA mature. L'hybride le plus court (codé par pCHAP714) dépourvu de la plus grande partie de la région N-terminale PulA nécessaire à la sécrétion est resté entièrement intracellulaire.
Des protéines hybrides PulA-PhoA (codées par pCHAP712 et pCHAP713, Fig. 1) qui contenaient le segment N-terminal utile pour la sécrétion de PulA fusionné directement avec la protéine PhoA mature. L'hybride le plus court (codé par pCHAP714) dépourvu de la plus grande partie de la région N-terminale PulA nécessaire à la sécrétion est resté entièrement intracellulaire.
Des tests d'immunofluorescence effectués sur les souches portant pCHAP710 et pCHAP833 ont donné des signaux d'immunofluorescence forts avec des anticorps contre PulA et PhoA. Ceci indique qu'au moins une partie des séquences PulA et PhoA codées par pCHAP833 ont pu être transportées à la surface cellulaire.
Relargage dans le milieu extracellulaire des hybrides
PulA-BlaM et pulA-phoA codés par pCHAP808/810/816 et pCHAP833 respectivement
L'activité B-lactamase a été détectée dans un milieu de culture des souches portant pCHAP808, pCHAP810 ou pCHAP816 ainsi que pCHAP710 (tableau 1). Pour distinguer entre le relargage spécifique et non spécifique dû à une lyse cellulaire et/ou à un clivage périplasmique, l'activité associée à la cellule et l'activité extracellulaire de la ss-lactamase et de la phosphatase acide ont été testées. Comme le montre la figure 6, la proportion de ss-lactamase extracellulaire a augmenté de façon constante dans les cultures de 3 souches lorsque la croissance approchait la phase stationnaire.Dans des cultures en phase stationnaire précoce, jusqu'à 40 % de l'activité ss-lactamase était présente dans le milieu extracellulaire. Au contraire, le milieu de culture ne contenait pas plus de 5 % de l'activité de la phosphatase acide totale. Ceci montre que les 3 protéines hybrides sont spécifiquement relarguées dans le milieu comme c'est également le cas de la pullulanase.
PulA-BlaM et pulA-phoA codés par pCHAP808/810/816 et pCHAP833 respectivement
L'activité B-lactamase a été détectée dans un milieu de culture des souches portant pCHAP808, pCHAP810 ou pCHAP816 ainsi que pCHAP710 (tableau 1). Pour distinguer entre le relargage spécifique et non spécifique dû à une lyse cellulaire et/ou à un clivage périplasmique, l'activité associée à la cellule et l'activité extracellulaire de la ss-lactamase et de la phosphatase acide ont été testées. Comme le montre la figure 6, la proportion de ss-lactamase extracellulaire a augmenté de façon constante dans les cultures de 3 souches lorsque la croissance approchait la phase stationnaire.Dans des cultures en phase stationnaire précoce, jusqu'à 40 % de l'activité ss-lactamase était présente dans le milieu extracellulaire. Au contraire, le milieu de culture ne contenait pas plus de 5 % de l'activité de la phosphatase acide totale. Ceci montre que les 3 protéines hybrides sont spécifiquement relarguées dans le milieu comme c'est également le cas de la pullulanase.
La cynétique du relargage de l'hybride codé par pCHAP808 n'a pu être distinguée de celle de la pullulanase même.
Tableau 1 : Distribution des activités
ss-lactamase phosphatase acide dans
des cultures de souches présentant
des fonctions de sécrétion de la
pullulanase.
ss-lactamase phosphatase acide dans
des cultures de souches présentant
des fonctions de sécrétion de la
pullulanase.
PLASMIDE ENZYME ACTIVITE % d'activité totale obtenue
SPECIFIQUE Extracell. Surface Cell. Intracell.
SPECIFIQUE Extracell. Surface Cell. Intracell.
PCHAP802 B-lactamase 2,5 3 2 95
phosphatase acide 0,44 5 NA 95 pCHAP808 E-lactamase 2,9 20 60 20
Phosphatase acide 0,59 3 NA 97 pCHAP810 B-lactamase 2.1 25 6 69
Phosphatase acide 0.52 4 NA 96 pCHAP816 B-lactamase 1.9 23 4 73
phosphatase acide 0.53 4 NA 96
Les activités spécifiques des enzymes sont en unités/109 d'équivalents
en cellules, par volume de culture.
phosphatase acide 0,44 5 NA 95 pCHAP808 E-lactamase 2,9 20 60 20
Phosphatase acide 0,59 3 NA 97 pCHAP810 B-lactamase 2.1 25 6 69
Phosphatase acide 0.52 4 NA 96 pCHAP816 B-lactamase 1.9 23 4 73
phosphatase acide 0.53 4 NA 96
Les activités spécifiques des enzymes sont en unités/109 d'équivalents
en cellules, par volume de culture.
Tableau 2 : Effets d'une protéase sur
l'immunofluorescence de surface
cellulaire et activités ss-lactamase
de Ecoli (pCHAP710, pCHAP808).
l'immunofluorescence de surface
cellulaire et activités ss-lactamase
de Ecoli (pCHAP710, pCHAP808).
Protease <SEP> (U/ml) <SEP> Immunofluorescence <SEP> Avtivité <SEP> ss-lactamase <SEP> spécifique
<tb> <SEP> antiPulA <SEP> antiBla <SEP> Total <SEP> Exposé
<tb> Proteinase <SEP> N <SEP> (0,3) <SEP> + <SEP> - <SEP> 3,03 <SEP> 0,242
<tb> Pronase <SEP> E <SEP> (0,74) <SEP> - <SEP> - <SEP> 3,00 <SEP> 0,266
<tb> Proteinase <SEP> K <SEP> (2) <SEP> - <SEP> - <SEP> 3,42 <SEP> 0,278
<tb> Chymotrypsine <SEP> (5,3) <SEP> + <SEP> - <SEP> 3,56 <SEP> 0,291
<tb> <SEP> + <SEP> + <SEP> 4,6 <SEP> 1,85
<tb>
Tableau 3 : Distribution des activités ss-lactamase
pullulanase et amylomaltase dans la membrane et dans les fractions solubles des cellules de E.coli (Cytoplasmique + periplasmique) produisant des hybrides PulA-Bla ou la pullulanase avec ou sans les fonctions de sécrétion codées par pCHP710.
<tb> <SEP> antiPulA <SEP> antiBla <SEP> Total <SEP> Exposé
<tb> Proteinase <SEP> N <SEP> (0,3) <SEP> + <SEP> - <SEP> 3,03 <SEP> 0,242
<tb> Pronase <SEP> E <SEP> (0,74) <SEP> - <SEP> - <SEP> 3,00 <SEP> 0,266
<tb> Proteinase <SEP> K <SEP> (2) <SEP> - <SEP> - <SEP> 3,42 <SEP> 0,278
<tb> Chymotrypsine <SEP> (5,3) <SEP> + <SEP> - <SEP> 3,56 <SEP> 0,291
<tb> <SEP> + <SEP> + <SEP> 4,6 <SEP> 1,85
<tb>
Tableau 3 : Distribution des activités ss-lactamase
pullulanase et amylomaltase dans la membrane et dans les fractions solubles des cellules de E.coli (Cytoplasmique + periplasmique) produisant des hybrides PulA-Bla ou la pullulanase avec ou sans les fonctions de sécrétion codées par pCHP710.
Plasmid pCHAP710 Enzyme % % Récuperatio
membrane soluble pCHAP808 Bla(pulA-bla) 81 19
amylomaltase 6 94
+ Bla (pulA-bla) 85 15
amylomaltase 4 96 pCHAP802 - Bla (pulA-bla) 92 8
amylomaltase 3 97
+ Bla (pulA-bla) 82 18
amylomaltase 6 94 pCHAP656 - pullulanase 83 17
Bla (bla) 8 92
amylomaltse 7 93
+ pullulanase - 94 6
Bla (bla) 10 90
amylomaltase 4 9 96
Les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase exponentielle (OD600nm = O,75 dans un milieu minimum contenant 0,4 % de maltose pour induire l'expression des gênes de sécrétion de la pullulanase sur pCHAP710
membrane soluble pCHAP808 Bla(pulA-bla) 81 19
amylomaltase 6 94
+ Bla (pulA-bla) 85 15
amylomaltase 4 96 pCHAP802 - Bla (pulA-bla) 92 8
amylomaltase 3 97
+ Bla (pulA-bla) 82 18
amylomaltase 6 94 pCHAP656 - pullulanase 83 17
Bla (bla) 8 92
amylomaltse 7 93
+ pullulanase - 94 6
Bla (bla) 10 90
amylomaltase 4 9 96
Les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase exponentielle (OD600nm = O,75 dans un milieu minimum contenant 0,4 % de maltose pour induire l'expression des gênes de sécrétion de la pullulanase sur pCHAP710
Claims (22)
1. Fragment d'ADN hybride, caractérisé en ce qu'il comprend 1) un insérat nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique choisie, 2) une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène pulA de la pullulanase (cette partie est désignée par "région Nterminale"), recombinée en aval avec l'insérat nucléotidique ci-dessus dans le sens de la transcription.
2. Vecteur pour la synthèse d'une séquence polypeptidique et pour 1'exposition de cette séquence polypeptidique synthétisée, à la surface d'un hôte cellulaire déterminé, cette exposition pouvant être transitoire, ce vecteur étant caractérisé en ce que sa séquence est modifiée par un fragment d'ADN hybride selon la revendication 1, dans les conditions suivantes
a) le fragment d'ADN hybride formé est placé sous le
contrôle d'un promoteur permettant son expression
dans l'hôte cellulaire choisi,
b) le vecteur formé permet l'exposition du produit
d'expression du fragment d'ADN hybride à la surface
de la cellule hôte avec une efficacité supérieure à
30 %.
3. Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide ou un chromosome.
4. Système pour la synthèse d'une séquence polypeptidique et pour l'exposition de cette séquence polypeptidique synthétisée, à la surface d'un hôte cellulaire déterminé, cette exposition pouvant être transitoire, ce système étant caractérisé par la combinaison des éléments suivants - un vecteur d'expression selon l'une quelconque des
revendications 2 ou 3, - les séquences codantes des gènes de sécrétion de la
pullulanase insérées dans un ou plusieurs vecteurs
d'expression, sous le contrôle d'au moins un promoteur
permettant leur expression dans l'hôte cellulaire
choisi et dans des conditions compatibles avec la
synthèse simultanée dans cet hôte, du susdit fragment
d'ADN hybride et avec l'exposition du produit
synthétisé à la surface de cet hôte, l'exposition
étant le cas échéant suivie de la sécrétion du produit
synthétisé dans le milieu extracellulaire.
5. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que les conditions auxquelles répond le fragment d'ADN hybride formé sont les suivantes
a) la région N-terminale a une longueur d'au moins 2119 nucléotides comptés & partir du nucléotide 1
b) le fragment d'ADN hybride foré est incorporé dans un vecteur d'expression sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'hôte cellulaire choisi.
6. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système pour la synthèse d'une séquence polypeptidique et pour 1'exposition de cette séquence polypeptidique à la surface d'un hôte cellulaire déterminé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence nucléotidique a une longueur infèrieure & 3112 nucléotides comptés à partir du nucléotide 1.
7. Système pour la synthèse et l'exposition d'une séquence polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les vecteurs d'expression modifiés d'une part par le fragment d'ADN hybride et d'autre part par les gènes de secrétion de la pullulanase sont des plasmides ou des vecteurs chromosomiques, compatibles entre eux pour permettre l'expression dans le même hôte cellulaire du fragment d'ADN hybride et des gènes de sécrétion.
8. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 a 6 pour la synthèse dans un hôte cellulaire et l'exposition à sa surface dlune séquence polypeptidique dans lequel la séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la région N-terminale codante du gène pulA de la pullulanase (désignée par région N-terminale), est exempte de tout ou partie de la séquence du gène pulA située en aval de la région N-terminale, dans le fragment d'ADN hybride formé avec l'insérat codant pour une séquence polypeptidique choisie.
9. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la synthèse dans un hôte cellulaire et l'exposition d'une séquence polypeptidique, dans lequel l'insérant est inséré en aval de la région N-terminale de la séquence nucléotidique, ce fragment d'ADN hybride formé comprenant également en aval de cet insérat, l'enchaînement nucléotidique habituellement présent dans le gène pulA, en aval de la région N-terminale ci-dessus.
10. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la synthèse et l'exposition d'une séquence polypeptidique dans lequel la région N-terminale correspond à l'enchaînement nucléotidique entre la position 1 et la position 2500 de 1'ADN codant du gène pulA de la pullulanase.
11. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la synthèse et l'exposition d'une séquence polypeptidique dans un hôte cellulaire déterminé , caractérisé en ce que l'hôte cellulaire est une bactérie, en particulier une bactérie Gram-négative, par exemple E.coli ou Salmonella.
12. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 & 11, pour la synthèse et l'exposition d'une séquence polypeptidique dans un hôte cellulaire déterminé , dans lequel l'insérat code pour une séquence d'acides aminés inunogénique.
13. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la synthèse et l'exposition d'une séquence polypeptidique dans un hôte cellulaire déterminé , dans lequel l'insérat code pour une séquence d'acides aminés d'intérêt thérapeutique et/ou clinique.
14. Fragment d'ADN hybride, vecteur ou système, pour la synthèse et l'exposition d'une séquence polypeptidique dans un hôte cellulaire déterminé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la région N-terminale correspond à l'ADN codant du gène pulA de la pullulanase, entre la position 1 et la position 2500, cet ADN comportant en position 2500 un site ApaI permettant la liaison avec un insérat nucléotidique déterminé, le cas échéant au moyen d'un linker, et en ce que cette séquence nucléotidique et cet insérat sont incorporés dans un plasmide, sous le contrôle d'un promoteur, par exemple le promoteur lac.
15. Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide, pCHAP 808 déposé à la CNCX sous le N I-955, le 8 juin 1990.
16. Hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il comporte un système pour la synthèse d'une séquence d'acides aminés hétérologue et pour l'exposition de cette séquence d'acides aminés à sa surface comprenant un fragment d'ADN hybride, un vecteur ou un système selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et en particulier en ce qu'il s'agit d'une bactérie, notamment une bactérie Gram-négative, en particulier de E.coli ou
Salmonella.
17. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence polypeptidique initialement exposée & la surface cellulaire, est ensuite secrétée dans le milieu externe.
18. Protéine hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence polypeptidique insérée ou substituée en un site de la pullulanase de façon & être exposée à la surface d'un hôte cellulaire, la synthétisant lorsqu'il est modifié par fragment d'ADN hybride, un vecteur, ou un système d'expression et d'exposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
19. Procédé pour l'obtention d'une séquence polypeptidique déterminée, caractérisé en ce que 1'on transforme un hôte cellulaire déterminé avec un fragment d'ADN hybride, un vecteur ou un système selon l'une quelconque des revendications 1 & 13, en ce que l'on cultive l'hâte cellulaire ainsi transformé dans des conditions permettant la synthèse de la séquence polypeptidique recherchée et son exposition à la surface de l'hôte transformé et le cas échéant, sa sécrétion dans le milieu de culture.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'on purifie la séquence polypeptidique obtenue, par exemple par protéolyse aménagée si la séquence polypeptidique est exposée à la surface de l'hôte cellulaire ou par exemple par centrifugation si la séquence polypeptidique est secrétée dans le milieu.
21. Procédé pour l'obtention d'un système pour la synthèse d'une séquence polypeptidique et pour l'exposition de cette séquence à la surface d'un hôte cellulaire déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- la ligation d'un insérat nucléotidique codant pour la séquence polypeptidique dont on recherche la synthèse et l'exposition avec une séquence nucléotidique comprenant au moins une partie de la séquence N-terminale codante du gène pulA de la pullulanase ("région Nterminale") de préférence en un site unique de restriction présent ou formé sur cette séquence nucléotidique, de façon à former un fragment d'ADN hybride pour obtenir la synthèse et l'exposition du susdit insérat,
- la modification d'un premier vecteur d'expression déterminé, par le fragment d'ADN hybride formé, ledit vecteur étant muni d'un promoteur d'expression adapté à la synthèse dans un hôte cellulaire choisi, dans des conditions permettant l'expression de ce fragment d'ADN hybride,
- la modification par les gènes de sécrétion de la pullulanase d'un vecteur d'expression compatible avec le susdit premier vecteur d'expression dans l'hôte cellulaire choisi, dans des conditions permettant l'expression de ces gènes.
22. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un hôte cellulaire exprimant à sa surface une séquence polypeptidique déterminée selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9007445A FR2663341A1 (fr) | 1990-06-14 | 1990-06-14 | Systeme pour l'expression d'une sequence polypeptidique et pour l'exposition de cette sequence a la surface d'un hote cellulaire. |
| PCT/FR1991/000480 WO1991019804A1 (fr) | 1990-06-14 | 1991-06-14 | Systeme pour l'expression d'une sequence polypeptidique et pour l'exposition de cette sequence a la surface d'un hote cellulaire |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9007445A FR2663341A1 (fr) | 1990-06-14 | 1990-06-14 | Systeme pour l'expression d'une sequence polypeptidique et pour l'exposition de cette sequence a la surface d'un hote cellulaire. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2663341A1 true FR2663341A1 (fr) | 1991-12-20 |
Family
ID=9397617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9007445A Withdrawn FR2663341A1 (fr) | 1990-06-14 | 1990-06-14 | Systeme pour l'expression d'une sequence polypeptidique et pour l'exposition de cette sequence a la surface d'un hote cellulaire. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2663341A1 (fr) |
| WO (1) | WO1991019804A1 (fr) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0094797A2 (fr) * | 1982-05-14 | 1983-11-23 | The Research Foundation Of State University Of New York | Vecteurs de clonage pour l'expression de polypeptides dans des hôtes microbiologiques |
| JPS63245676A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Suntory Ltd | プルラナ−ゼ遺伝子 |
| EP0335567A2 (fr) * | 1988-03-30 | 1989-10-04 | Biogen, Inc. | Libération contrôlée des protéines périplasmiques dans le milieu |
-
1990
- 1990-06-14 FR FR9007445A patent/FR2663341A1/fr not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-06-14 WO PCT/FR1991/000480 patent/WO1991019804A1/fr unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0094797A2 (fr) * | 1982-05-14 | 1983-11-23 | The Research Foundation Of State University Of New York | Vecteurs de clonage pour l'expression de polypeptides dans des hôtes microbiologiques |
| JPS63245676A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Suntory Ltd | プルラナ−ゼ遺伝子 |
| EP0335567A2 (fr) * | 1988-03-30 | 1989-10-04 | Biogen, Inc. | Libération contrôlée des protéines périplasmiques dans le milieu |
Non-Patent Citations (8)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991019804A1 (fr) | 1991-12-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |