CA3169644A1

CA3169644A1 - Bacteries gram-positives de l'espece lactococcus lactis ou streptococcus thermophilus ayant une tres faible proteolyse de surface, leurs methodes d'obtention et leurs utilisations

Info

Publication number: CA3169644A1
Application number: CA3169644A
Authority: CA
Inventors: Vincent JUILLARD; Rozenn Gardan; Mylene Boulay; Veronique Monnet
Original assignee: Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Current assignee: Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement; Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2021-09-10
Also published as: FR3107902A1; US20230101904A1; EP4114987A1; WO2021176039A1

Abstract

La présente invention concerne une bactérie dans laquelle l'expression et/ou l'activité de protéases de surface est inhibée, son procédé de préparation ainsi que les utilisations de cette bactérie.

Description

BACTERIES GRAM-POSITIVES DE L'ESPECE LACTOCOCCUS
LACTIS OU STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS AYANT UNE TRES FAIBLE
PROTEOLYSE DE SURFACE, LEURS METHODES D'OBTENTION ET LEURS
UTILISATIONS
La présente invention concerne des bactéries Gram-positives de l'espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus présentant une très faible protéolyse de surface ; elle se rapporte également à l'utilisation de ces bactéries, notamment pour la production de protéines d'intérêt.
Une analyse des peptides produits par la bactérie Lactococcus lactis et accumulés dans son milieu de culture a mis en évidence une forte accumulation de peptides d'origine bactérienne (Guillot et al., 2016). Cet ensemble de peptides définit le peptidome exocellulaire ou exopeptidome de la bactérie. L'analyse de ces peptides montre qu'approximativement la moitié d'entre eux provient de la dégradation de protéines de surface qui ne sont ni cytopl asmi ques ni tran smembran aires .
Cette dégradation serait due à la présence de plusieurs protéases localisées en surface de la bactérie. Deux protéases ainsi localisées ont déjà été
caractérisées chez les bactéries lactiques. L'une, une serine protéase de la famille des subtilisines, appelée PrtS chez Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) et PrtP chez Lactococcus lactis (L. lactis), ancrée de façon covalente à la paroi est capable d'hydrolyser les caséines du lait (Fernandez-Espla et al., 2000 et Siezen et al., 1999). La seconde, également une protéase à sérine, appelée HtrA, a été caractérisée chez L. lactis (Poquet et al., 2000) ; une homologue chez S. thermophilus est également présente. Cette protéase hydrolyse des protéines anormales et/ou mal repliées et intervient dans la maturation des protéines exportées (Poquet et al..
2000).
L'un des principaux inconvénients de cette protéolyse de surface est rencontré
lors de la production de protéines d'intérêt par des bactéries, notamment des bactéries Gram-positives. En effet, la protéolyse de surface entraîne une dégradation de ces protéines pendant et/ou après leur exportation, conduisant à une baisse du rendement et/ou une altération de la structure et de l'activité de la protéine d'intérêt.
Il apparaît donc souhaitable d'obtenir des souches de bactéries présentant une très faible protéolyse de surface par rapport aux souches sauvages.
Dans ce contexte, les Inventeurs ont construit des simples et doubles mutants pour PrtS et HtrA dans la souche LMD9 de S. thermophilus (voir exemple 1) et sont arrivés à la

2 conclusion que la délétion des deux protéases PrtS et HtrA n'abolit pas la protéolyse de surface chez S. thermophilus LMD9 puisqu'une protéolyse résiduelle est observée (voir exemple 2). Les mêmes résultats ont été obtenus pour les souches MG1363 et IL1403 de L.
lactis (Guillot et al., 2016) et confirment donc que les protéases de surface HtrA et PrtS/PrtP
ne sont pas responsables à elles seules de l'ensemble de l'activité
protéolytique de surface de ces souches. Hafeez et al. (2013 et 2015) ont créé un double mutant JprtS-LIhtrA chez S.
thermophilus et ont conclu à la présence possible d' exopeptidases ayant des activités carboxypeptidase, peptidyl peptidase, aminopeptidase et X-prolyl-dipeptidyl peptidase, la possible présence de telles exopeptidases n'explique toutefois pas l'activité
protéasique résiduelle observée par les Inventeurs, les enzymes étant de nature différente. En effet, les exopeptidases agissent sur les extrémités de chaines peptidiques, tandis que la protéolyse résiduelle observée résulte de clivages internes de protéines.
L'hypothèse formulée par les Inventeurs est alors qu'une ou plusieurs protéases responsables de cette activité résiduelle sont présentes chez chacune des trois souches. C'est ainsi qu'ils ont identifié la protéase Ster-1612 (ou STER_RS07910 dans la nouvelle annotation NCBI) dans la souche sauvage LMD9 de S. thermophilus ; cette protéase est dénommée YwdF (ou EFV54_RS11495 dans la nouvelle annotation NCBI) pour la souche IL1403 de L. lactis subsp. lactis et llmg-2442 (ou LLMG_RS 12255 dans la nouvelle annotation NCBI) pour la souche MG1363 de L. lactis subsp. crernoris (voir exemple 3). Cette protéase appartient à la famille S16 des protéases LonA (Gottesman et al., 1978 et Charrette et al., 1981) qui sont des protéases à serine, caractérisées par la présence d'une dyade catalytique Serine ¨ Lysine conservée en région C-terminale de la protéine (Botos et al..
2004).
Les Inventeurs ont ensuite construit des souches dérivées de S. thermophilus LMD9 dans lesquelles tout ou partie des trois protéases endogènes PrtS, HtrA
et Ster-1612 ont été inactivées (voir exemple 1) ; l'inactivation des trois protéases conduit à une protéolyse de surface quasiment abolie chez cette bactérie (voir exemple 4). En outre, ils ont construit la souche de S. thermophilus LMD9 dans laquelle les trois protéases PPS, HtrA et Ster-1612 ont été inactivées et produisant les protéines hétérologues IL-10 ou élafine (voir exemple 6) et ont confirmé que l'inhibition de ces trois protéases n'entrainait plus de dégradation de protéines hétérologues permettant ainsi l'amélioration du rendement de production de protéines hétérologues, par rapport à la bactérie parente sauvage (voir exemple 7). Ces résultats ont également été observés chez Lactococcus lactis (voir exemple 11).

3 La présente invention a donc pour objet une bactérie Gram-positive de l'espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus, telle que la protéase de surface endogène homologue à la protéine désignée Ster-1612 chez Streptococcus thermophilus LMD9 et Ywdf ou llmq 2442 respectivement chez Lactococcus lactis IL1403 et MG1363 a une expression et/ou une activité diminuée ou abolie ; plus particulièrement, elle a pour objet une bactérie Gram-positive de l'espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus, telle que la protéase de surface endogène comprenant un motif d'acides aminés présentant au moins 80%
d'identité avec la séquence SEQ ID N 1, a une expression et/ou une activité
diminuée ou abolie, où SEQ ID N 1 est définie comme suit :

avec X1 est l'histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l'alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l'isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l'acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l'alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l'acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ;
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
La protéase de surface endogène est une protéase à sérine dont l'activité
enzymatique peut être caractérisée par l'évaluation de la dégradation d'un substrat chromogénique par dosage colorimétrique, ou d'un substrat protéique par électrophorèse SDS-PAGE ou encore par analyse en chromatographie liquide HPLC.
De préférence, le motif d'acides aminés compris dans ladite protéase possède au moins 80% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d'identité avec la séquence d'acide aminés SEQ ID N 1 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie Gram-positive est de l'espèce Streptococcus thermophilus et la protéase de surface endogène possède au moins 70%
d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, et de manière particulièrement préférée au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N 2 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. En particulier, la protéase de surface endogène est Ster-1612 de séquence

4 SEQ ID N 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, la bactérie Gram-positive est de l'espèce Lactococcus lactis et la protéase de surface endogène possède au moins 70%
d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, et de manière particulièrement préférée au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID N 3 ou avec la séquence SEQ ID N
4 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. En particulier, la bactérie Gram-positive peut être Lactococcus lactis subsp. lactis et la protéase de surface endogène est YwdF de séquence SEQ ID N 3 ou la bactérie Gram-positive peut encore être Lactococcus lactis subsp.
cremoris et la protéase de surface endogène est llmg 2442 de séquence SEQ ID N
4.
Sauf indication contraire, les pourcentages d'identité sont calculés à partir d'un alignement global des séquences d'acides aminés effectué à l'aide de l'algorithme needle (Needleman et Wunsch, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : Matrix :
EBLOSUM62, Gap penalty : 10,0 et Extend penalty : 0,5.
La séquence nucléotidique du gène codant Ster-1612 est représentée par la séquence SEQ ID N 5. La séquence nucléotidique du gène codant YwdF est représentée par la séquence SEQ ID N 6. La séquence nucléotidique du gène codant 11mg 2442 est représentée par la séquence SEQ ID N 7.
L'analyse de 102 génomes de la sous-espèce L. lactis subsp. lactis, a permis de définir un degré de conservation de YwdF supérieur à 80% pour 100 souches, les 2 dernières n'ayant apparemment pas le gène codant YwdF. La conservation de séquence est également forte au sein de la sous-espèce L. lactis subsp. cremoris, puisque parmi les 56 génomes analysés, 51 ont un gène codant une protéine identique à plus de 80% à la protéine Ilmg_2442 de L. lactis subsp. cremoris MG1363, 5 ne semblant pas posséder le gène codant cette protéine.
A titre d'illustration et sans caractère limitatif, la bactérie Gram-positive selon l'invention peut être obtenue à partir d'une souche de S. thermophilus LMD9.
de S.
thermophilus CNRZ1066, de Lactococcus lactis subsp. lactis 1L1403. de Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363.
La bactérie selon l'invention présente une protéolyse de surface significativement diminuée par rapport à la bactérie parente dont elle dérive (voir le protocole de quantification de la protéolyse dans l'exemple 2).

Par l'expression d'une protéase de surface endogène dans une bactérie est diminuée , on entend la diminution de quantité de la protéase produite par la bactérie de l'invention en comparaison avec la bactérie parente dont elle dérive et dans laquelle l'expression de ladite protéase n'est pas diminuée, quelle qu'en soit la cause (diminution du

5 niveau d'expression du gène codant la protéase, réduction du nombre d'ARNs messagers, dégradation de la protéase).
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l'expression d'une protéase dans une bactérie comprennent par exemple la RT PCR quantitative pour évaluer le niveau d'expression du gène codant la protéase ou le dosage de la protéine par Elisa pour quantifier la protéine synthétisée.
Par l'activité d'une protéase de surface endogène dans une bactérie est diminuée , on entend la diminution de l'activité de la protéase produite par la bactérie selon l'invention en comparaison avec une bactérie parente dont elle dérive et dans laquelle l'activité de ladite protéase n'est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l'activité d'une protéase dans une bactérie comprennent par exemple le comptage des peptides de surface identifiés par spectrométrie de masse suivant une double séparation chromatographique (Guillot et al., 2016), l'évaluation de la dégradation d'un substrat chromogénique permettant de quantifier aisément l'activité par dosage colorimétrique, ou d'un substrat protéique par électrophorèse SDS-PAGE ou analyse en chromatographie liquide HPLC....
Par l'expression et/ou une activité d'une protéase de surface endogène dans une bactérie est abolie , on entend l'absence d'expression et/ou d'activité de la protéase voire également en l'absence d'expression et/ou d'activité d'au moins une des autres protéases connues (HtrA et/ou PrtS chez Streptococcus therrnophilus,HtrA et/ou PrtP chez Lactococcus lactis, comme décrit ci-après) ; c'est le cas lorsque la protéolyse de la bactérie considérée représente, par ordre de préférence, moins de 60%, 50%, 40%, 30% encore préférentiellement moins de 10% et tout préférentiellement, moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive, selon le protocole de quantification de la protéolyse de l'exemple 2. Une telle abolition de l'expression et/ou de l'activité de la protéase de surface endogène peut être obtenue par diminution totale de l'expression et/ou de l'activité de la protéase (au sens défini ci-dessous) ou encore survenir lorsque le gène de structure de la protéase n'est pas naturellement présent dans le génome de la bactérie, ou présent sous une forme tronquée (p seudo gène).

6 Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l'invention ayant une activité et/ou l'expression de sa protéase de surface endogène diminuée présente en outre une activité et/ou une expression diminuée d'au moins une autre protéase de surface endogène qui peut être HtrA et/ou PrtS chez Streptococcus thermophilus, HtrA et/ou PrtP
chez Lactococcus lactis.
De préférence, la bactérie de l'espèce S. thermophilus selon l'invention est en outre telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité
avec la séquence SEQ ID N 8 (HtrA) ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID N 9 (PrtS) a une expression et/ou l'activité diminuée ou abolie.
De préférence, la bactérie de l'espèce L. lactis selon l'invention est en outre telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
N 10 (HtrA) ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité
avec la séquence SEQ ID N 11 (PrtP) aune expression et/ou l'activité diminuée ou abolie.
La protéase de surface, dénommée HtrA chez Streptococcus thermophilus, possède au moins 70% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité avec la séquence d'acides aminés SEQ ID N 8, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La protéase de surface, dénommée HtrA chez Lactococcus lactis, possède au moins 70% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité avec la séquence d'acides aminés SEQ ID N 10, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
La séquence nucléotidique du gène codant HtrA est représentée par la séquence SEQ ID N 12 dans le cas d'une souche de S. thermophilus, et par la séquence dans le cas d'une souche de Lactococcus lactis.
La protéase de surface, dénommée PrtS chez Streptococcus thermophilus, possède au moins 70% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité avec la séquence d'acides aminés SEQ ID N 9, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La protéase de surface, dénommée PrtP chez Lactococcus lactis, possède au moins 70% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité avec la séquence d'acides aminés SEQ ID N 11, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.

7 La séquence nucléotidique du gène codant PrtS est représentée par la séquence SEQ ID N 14 dans le cas d'une souche de S. thertnophilus, par la séquence SEQ

dans le cas d'une souche de Lactococcus lactis.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la bactérie de l'espèce S. therrnophilus selon l'invention est telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 8 (HtrA) et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 9 (PrtS) ont une expression et/ou une activité diminuée ou abolie.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la bactérie de l'espèce L.
lactis selon l'invention est telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité
avec la séquence SEQ ID N 10 (HtrA) et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 11 (PrtP) ont une expression et/ou une activité
diminuée ou abolie.
Dans le cas présent, la diminution de l'expression de chacune des trois protéases de surface endogènes dans une bactérie selon l'invention est mesurée par exemple par RT
PCR quantitative pour évaluer le niveau d'expression de chacun des gènes codant les protéases, ou par dosage ELISA pour quantifier chacune des protéines synthétisées, et est comparée à l'expression des protéases de surface d'une bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l'ensemble de l'activité des trois protéases de surface endogènes dans une bactérie selon l'invention peut être mesurée par comptage des peptides de surface identifiés par spectrométrie de masse suivant une double séparation en chromatographie liquide (HPLC) et est comparée à l'ensemble de l'activité des protéases de surface d'une bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l'expression et/ou de l'activité des protéases peut être totale ou partielle. La diminution de l'expression et/ou de l'activité est considérée comme totale au sens de l'invention lorsqu'elle représente moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive, selon le protocole de quantification de la protéolyse de l'exemple 2 et comme cela est observé avec les bactéries n'exprimant aucune des trois protéases de surface endogènes (voir l'exemple 4). Elle est considérée comme partielle lorsqu'elle est significativement inférieure à celle de la bactérie parente dont elle dérive. La significativité
de la différence est estimée par un test statistique adapté aux échantillons de petits effectifs (test non paramétrique de Kruskal-Wallis) avec une probabilité P inférieure à 0.05. La diminution significative de cette protéolyse de surface observée pour une bactérie selon l'invention conduit à une

8 protéolyse, par ordre de préférence, de moins de 60%, 50%, 40%, 30% encore préférentiellement moins de 10%, par rapport à la protéolyse de surface de la bactérie parente dont elle dérive. Une diminution partielle de l'expression et/ou de l'activité
des protéases est observée avec des bactéries n'exprimant pas une ou deux des trois protéases de surface endogènes précitées (voir les exemples 2 et 4).
La diminution de l'expression et/ou de l'activité de protéases de surface endogènes telles que définies ci-dessus dans une bactérie, peut être obtenue de différentes manières détaillées ci-après.
Cette diminution de l'expression et/ou de l'activité de protéases de surface endogènes peut être obtenue par mutagenèse des gènes codant ces protéases.
Cette mutagénèse peut alors intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression de ces gènes, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction des protéases. Par exemple, l'introduction d'une ou plusieurs mutations ponctuelles à l'intérieur de la séquence codante d'un gène ou de ses séquences de régulation d'expression peut induire, en fonction de la nature de la mutation, un déplacement du cadre de lecture et/ou l'introduction d'un codon stop dans la séquence et/ou l'inhibition de la transcription ou de la traduction des gènes codant ces 3 protéases et/ou une substitution d'un des acides aminés du site actif de l'enzyme et conduire à l'expression d'une protéase inactive, ou d'une protéase avec une activité diminuée. Enfin, lorsque le gène codant l'une des protéases de surface est organisé en opéron (cas de ster-1612 chez S.
thermophilus, et probablement de YwdF et 11mg2442 chez L. lactis), l'introduction d'une ou plusieurs mutations ponctuelles à l'intérieur de la séquence codante d'un gène de l'opéron autre que celui codant la protéase peut induire, en fonction de la nature de la mutation, un déplacement du cadre de lecture et/ou l'introduction d'un codon stop dans la séquence et ainsi abolir l'expression de la protéase (mutation polaire). 11 en va de même pour la séquence régulant l'expression de l'ensemble de l'opéron.
La bactérie selon l'invention peut être obtenue par délétion, insertion et/ou substitution d'un ou de plusieurs nucléotides, par exemple par délétion de tout ou partie de la séquence codante du gène codant la protéase ou de son promoteur, par l'insertion d'une séquence exogène à l'intérieur de la séquence codante du gène codant la protéase ou de son promoteur, par la substitution d'un ou plusieurs nucléotides de la séquence codante du gène codant un des acides aminés du site actif de la protéase ou de son promoteur, ou par introduction d'une mutation polaire dans le cas d'un gène organisé en opéron.
Des méthodes

9 permettant de déléter, d'insérer et/ou substituer une séquence génétique donnée chez la bactérie, en particulier chez S. thennophilus et Lactococcus lactis, sont bien connues de l'homme du métier (Gardan et al., 2009 et Biswas et al., 1993). Par exemple, l'insertion d'une séquence exogène à l'intérieur de la séquence codante du gène codant la protéase peut être réalisée en utilisant des transposons d'origine naturelle ou artificielle.
La mutagenèse peut être mise en oeuvre par l'induction de mutations aléatoires, par exemple en utilisant des agents physiques, tels que les radiations ou chimiques tels que l'EMS (Ethyl Methane Sulfonate) ou de manière ciblée par transfection, transduction, transformation naturelle ou par électroporation (Bron et al., 2019).
Alternativement, la mutagénèse peut être mise en uvre par des méthodes utilisant des nucléases (TALEN, CR1SPR/Cas9, Wei et al., 2013).
La diminution de l'activité des protéases peut être obtenue par l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine (PMSF [PhenylMethaneSulfonyl Fluoride], DFP [DiisopropylFluoroPhosphate], triterpenoïde, coumarine, serpines, peptidomimetics..., Shamsi et al., 2016 ; Soualmia et El Amri, 2018). Enfin, la diminution de l'expression des protéases peut être obtenue par modification de la séquence promotrice du gène selon par exemple l'une des méthodes utilisées pour substituer une séquences nucléotidique citées ci-dessus, ou par une technique d'interférence ARN (RNAi), par expression d'un ARN antisense ou encore par des aptamères.
Les gènes mutés codant les protéases telles que définies précédemment peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques desdits gènes, PCR
éventuellement suivie d'un séquençage du fragment PCR dans le cas de mutations n'affectant pas la taille dudit gène (substitutions, par exemple).
Les Inventeurs ont recherché la présence des gènes codant ces trois protéases de surface, STER_1612, HtrA et PrtS, dans 61 génomes de S. thennophilus, et la conservation des séquences protéiques correspondantes a été analysée. La variabilité de la présence de la protéase PrtS au sein de l'espèce S. therrnophilus était déjà connue (Delorme et al., 2010). A
l'inverse, les deux protéases HtrA et STER_1612 sont présentes chez toutes les souches, et leurs séquences protéiques sont très bien conservées (hormis une souche, N4L, dont le gène codant HtrA serait un pseudogène).
Ainsi, on peut distinguer deux groupes de souches de S. thermophilus sur la base de leur équipement en protéases de surface : un groupe A de 24 souches qui possèdent les trois protéases PrtS, HtrA et STER_1612, auquel appartient la souche LMD9 et un groupe B

de 37 souches qui possède les deux protéases HtrA et STER_1612 et ne possède pas la protéase PrtS, auquel appartient la souche CNRZ1066.
Les Inventeurs ont évalué le rôle des deux protéases de surface HtrA et STER_1612 sur la protéolyse de surface des souches de S. thermophilus du groupe B et ont montré que la protéolyse de surface résiduelle du double mutant est comparable à celle obtenue avec le triple mutant de la souche LMD9 (voir exemple 5).
Que la souche S. thermophilus possède deux ou trois protéases de surface.
l'inactivation des gènes codant respectivement pour ces deux ou trois protéases de surface suffit à réduire de plus de 90% la protéolyse de surface de la bactérie.

10 Une bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Streptococcus thertnophilus, dans laquelle l'expression ou l'activité des 3 protéases de surface endogènes, Ster-1612 de séquence SEQ ID N 2, HtrA de séquence SEQ
ID N 8, et PrtS de séquence SEQ ID N 9, de ladite bactérie est inhibée.
Une autre bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Streptococcus thermophilus, en particulier une souche de Streptococcus thermophilus qui ne posséderait pas PrtS, dans laquelle l'expression ou l'activité de la protéase de surface endogène, Ster-1612 de séquence SEQ ID N 2 ou dans laquelle l'expression ou l'activité des 2 protéases de surface endogènes, Ster-1612 de séquence SEQ
ID N 2 et HtrA de séquence SEQ ID N 8 de ladite bactérie est inhibée.
De façon similaire, certaines souches de L. lactis n'expriment naturellement pas la protéase PrtP. Là encore, les Inventeurs ont pu montrer que de telles souches modifiées pour que les deux protéases de surface endogènes YwdF ou 11mg2442 (ou leurs homologues) et HtrA aient une activité ou une expression réduite présentent une très faible protéolyse de surface (voir exemple 9).
Une bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Lactococcus lactis, dans laquelle l'expression ou l'activité des 3 protéases de surface endogènes, YwdF ou 11mg27142 (ou leurs homologues) de séquence respective SEQ
ID N 3 ou 4, HtrA de séquence SEQ ID N 10, et PrtP de séquence SEQ ID N 11, de ladite bactérie est inhibée.
Une autre bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Lactococcus lactis, en particulier une souche de Lactococcus lactis qui ne posséderait pas PrtP, dans laquelle l'expression ou l'activité de la protéase de surface endogène. YwdF ou I1mg2442 (ou leurs homologues) de séquence respective SEQ ID
N 3 ou

11 4 ou dans laquelle l'expression ou l'activité des 2 protéases de surface endogènes, et YwdF
ou 11mg2442 de séquence respective SEQ ID N 3 ou 4 et HtrA de séquence SEQ ID
N 10 de ladite bactérie est inhibée.
Ainsi la présente invention se rapporte à:
- des bactéries n'exprimant pas la protéase de surface endogène définie par son identité avec la SEQ. ID. N 1 ; c'est-à-dire Ster-1612 (ou son homologue) chez Streptococcus thermophilus et Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue) chez Lactococcus lactis;
- des bactéries n'exprimant pas deux protéases de surface endogènes : Ster-(ou son homologue) et HtrA chez Streptococcus thermophilus ; Ster-1612 (ou son homologue) et PrtS chez Streptococcus thermophilus ; Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue) et HtrA chez Lactococcus lactis ; et Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue) et PrtP chez Lactococcus lactis ; et - des bactéries n'exprimant pas trois protéases de surface endogènes : Ster-(ou son homologue), HtrA et PrtS chez Streptococcus thertnophilus ; et Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue), HtrA et PrtP chez Lactococcus lactis.
La présente invention a également pour objet une bactérie telle que définie précédemment, modifiée pour exprimer une protéine d'intérêt, par exemple une protéine hétérologue ou recombinante d'intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d'expression contenant un fragment d'ADN codant pour la protéine d'intérêt, ou par intégration du fragment d'ADN d'intérêt dans le chromosome de ladite bactérie.
Par protéine hétérologue, on entend une protéine qui n'est ni produite naturellement par la souche bactérienne, ni nécessaire à sa croissance.
La présente invention présente donc comme avantage l'expression par la bactérie selon la présente invention de protéines présentant un intérêt industriel, qui seront secrétées dans le milieu de culture de ladite bactérie et dans lequel les protéines d'intérêt pourront être facilement récupérées, ou associées à la surface bactérienne et exerçant leur activité
enzymatique sur la face externe de la bactérie. Par protéine associée à la surface bactérienne, on entend une protéine ancrée de façon covalente à la paroi bactérienne via un motif d'ancrage spécifique de la sortase, une protéine insérée la membrane plasmique via une ancre membranaire localisée à l'extrémité N- ou C-terminale de sa séquence aminée, une protéine liée de façon covalent à la membrane via un motif d'ancrage lipidique situé à
l'extrémité N-terminale de sa séquence aminée ou une protéine possédant des motifs d'association non covalents à la paroi de type LysM, par exemple (Cossart et Joncquières, 2000;
Desvaux et

12 al., 2018).
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une bactérie Gram-positive de l'espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus therrnophilus faiblement protéolytique, comprenant la diminution ou l'abolition dans ladite bactérie, de l'expression et/ou de l'activité d'une protéase de surface endogène de ladite bactérie, ladite protéase comprenant un motif d'acides aminés présentant au moins 80%, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d'identité avec la séquence SEQ ID
N 1, où SEQ ID N 1 est définie comme suit :

avec X1 est l'histidine (H) ou la lysine (K) X2 est la serine (S), l'alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l'isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l'acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l'alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l'acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ;
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
De préférence, la protéase de surface endogène chez Streptococcus therrnophilus a au moins 70% et encore préférentiellement 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N 2 et la protéase de surface endogène chez Lactococcus lactis a au moins 70% et encore préférentiellement 80% d'identité avec la séquence SEQ ID N 3 ou avec la séquence SEQ ID
N 4.
De préférence, le procédé de préparation d'une bactérie Streptococcus thermophilus faiblement protéolytique selon l'invention comprend en outre la diminution ou l'abolition dans ladite bactérie, de l'expression et/ou de l'activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 8 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence (PrtS).
De préférence, le procédé de préparation d'une bactérie Lactococcus lactis faiblement protéolytique selon l'invention comprend en outre la diminution ou l'abolition dans ladite bactérie, de l'expression et/ou de l'activité de la protéase de surface endogène

13 ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 10 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 11 (PrtP).
Par bactérie faiblement protéolytique , on entend bactérie présentant une très faible protéolyse de surface par rapport à la bactérie parente dont elle dérive, c'est-à-dire estimée à moins de 10% et préférentiellement moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l'expression et/ou de l'activité de ces protéases peut être réalisée comme décrit ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé pour diminuer ou abolir l'activité protéolytique de protéases dans une bactérie Gram-positive de l'espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus, comprenant la diminution ou l'abolition dans ladite bactérie, de l'expression et/ou de l'activité d'une protéase de surface endogène de ladite bactérie, ladite protéase comprenant un motif d'acides aminés présentant au moins 80%, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100%
d'identité avec la séquence SEQ ID N 1, où SEQ ID N 1 est définie comme suit :

avec X1 est l'histidine (H) ou la lysine (K) X2 est la serine (S), l'alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l'isolcucinc (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l'acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l'alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l'acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ;
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
De préférence, la protéase de surface endogène chez Streptococcus thermophilus a au moins 70% et encore préférentiellement 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N 2 et la protéase de surface endogène chez Lactococcus lactis a au moins 70% et encore préférentiellement 80% d'identité avec la séquence SEQ ID N 3 ou avec la séquence SEQ ID
N 4.
De préférence, le procédé pour diminuer ou abolir l'activité protéolytique de protéases dans une bactérie Streptococcus thermophilus comprend en outre, la diminution ou l'abolition dans ladite bactérie, de l'expression et/ou dc l'activité de la protéase de surface

14 endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 8 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence (PrtS).
De préférence, le procédé pour diminuer ou abolir l'activité protéolytique de protéases dans une bactérie Lactococcus lactis comprend en outre, la diminution ou l'abolition dans ladite bactérie, de l'expression et/ou de l'activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 10 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence (PrtP).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie selon la présente invention pour la production de protéine hétérologue d'intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d'expression contenant un fragment d'ADN codant pour la protéine hétérologue d'intérêt ou par intégration du fragment d'ADN d'intérêt dans le chromosome de ladite bactérie.
Parmi les protéines hétérologues d'intérêt, on peut citer l'élafine qui est un inhibiteur d'activité protéolytique. Cette activité est particulièrement recherchée, notamment pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, dans lequel l'activité
de protéases humaines doit être inhibée (Bermudez-Humaran et al., 2015). Plus généralement, on peut citer des protéines anti-inflammatoires ciblant le système immunitaire mucosal (cytokines, facteur trefoil humain TFF-1...), des protéines vaccinales (fragment C de la toxine tétanique, antigène E7 du papillomavirus humain, ), des peptides antibactériens ciblant des déséquilibres de la flore intestinale (défensines, cathelidicines, protéine PAP associée aux pancréatites), des enzymes palliant des déficiences ou des carences (superoxyde dismutase, phénylalanine hydroxylase, glutamate décarboxylase), etc (Neirynck et Steidler, 2006;
Bermudez-Humaran et al., 2013, Bermudez-Humaran et Langella, 2018). On peut également envisager des protéines ayant un intérêt en santé animale (protéines vaccinales antivirales, par exemple) ou des protéines d'intérêt technologique (estérase, aminotransférase...).
Parmi les souches de bactéries utilisées pour la production de protéines hétérologues d'intérêt, on peut citer les souches L. lactis et S.
thermophilus.
Lactococcus lactis est considérée comme la bactérie de référence pour la production de molécules d'intérêt thérapeutique. Son utilisation présente plusieurs avantages:
il s'agit d'une bactérie alimentaire dont l'innocuité est reconnue (bactérie labellisée GRAS et QPS), elle est manipulable génétiquement et un mutant de délétion du gène codant la protéase HtrA est disponible. 11 a alors été démontré que la production d'élafine par ce mutant était supérieure à celle de la souche sauvage, et que le traitement de souris présentant une colite par administration orale de la souche mutée était plus efficace qu'avec la souche sauvage (B ermudez-Humaran et al., 2015).

Par ailleurs, Streptococcus therrnophilus selon l'invention présente également de nombreux avantages : elle est thermophile, son optimum de température correspond à la température du corps humain de 37 C, elle est facilement transformable et totalement dépourvue d'activité protéolytique de surface, ce qui évite la dégradation de la protéine hétérologue d'intérêt au fur et à mesure de sa production.

Une bactérie particulièrement avantageuse pour la production de protéines hétérologues d'intérêt est une bactérie de S. therntophilus telle que définie dans la présente invention.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine hétérologue, mettant en oeuvre une bactérie de l'invention, telle que définie

15 précédemment.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie selon la présente invention comme ferment de pré-maturation du lait.
Un des problèmes qui se pose en technologie laitière est la variation de la composition des laits en azote non protéique (acides aminés libres et peptides). Ceci est particulièrement marqué lors des changements de régime alimentaire des animaux, aboutissant aux laits d'été et d'hiver de compositions très différentes. Ces variations de composition en azote non protéique sont à l'origine de variations de croissance des bactéries lactiques dans le lait, cette croissance étant étroitement dépendante de l'utilisation de ces sources azotées non protéiques. Ces variations de croissance aboutissent à un défaut de reproductibilité des temps de fermentation, ce qui constitue une difficulté
pour les industries laitières.
L'utilisation d'une bactérie selon la présente invention comme ferment de pré-maturation du lait permet d'abolir ces variations. En effet, dans un premier temps qui correspond à l'étape de pré-maturation, les sources d'azote non protéique utilisables seraient consommées, sans que des protéases de surface puissent hydrolyser les protéines du lait et générer de nouvelles sources d'azote non protéiques. Dans un second temps, la croissance du levain servant à fermenter le lait ne reposerait plus que sur son aptitude à
hydrolyser les caséines, portée par les proteases PrtP et PrtS, selon la bactérie considérée.
Une telle opération

16 a donc pour effet de standardiser la croissance du levain, en abolissant les variations de croissance dues aux variations de composition du lait en azote non protéique.
Une bactérie particulièrement avantageuse en tant que ferment de pré-maturation du lait est une souche de S. thermophilus telle que définie dans la présente invention.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux exemples non-limitatifs illustrant la très faible activité
protéolytique de surface d'une bactérie selon l'invention dans laquelle les 2 (souche CNRZ10663htrAàster_1612) ou 3 protéases (souche LMD9AhtrAAprtSAster 1612) telles que définies dans l'invention est inhibée, par rapport à la souche de bactérie parente dont elle dérive (souche CNRZ1066 ou souche LMD9), ainsi que des figures annexées :
Figure 1 : Effet de l'inactivation des deux protéases de surface PrtS et HtrA
sur la présence dans le milieu de culture de peptides issus de la dégradation de protéines de surface de S. thermophilus LMD9, présents dans le milieu de culture. Moyenne de 3 expériences (en noir), avec écart-type de la moyenne (en gris).
Figure 2: Alignement des séquences des trois protéines STER_1612, YwdF et 11mg_2442. L'alignement multiple a été réalisé avec MUSCLE (v3.8) disponible sur le serveur de l'EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). Les caractères blancs sur fond noir indiquent les acides aminés localisés à l'intérieur de la cellule, les caractères italiques correspondent au fragment transmembranaire et les noirs sont localisés à
l'extérieur de la cellule (prédictions HMMTOP). Les acides aminés constituant potentiellement la diade catalytique sont surlignés en gris.
Figure 3 : Croissance de S. thermophilus LMD9 souche sauvage et souche mutée pour les trois protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612 (triple mutant) dans un milieu chimiquement défini (MCD) ne contenant que des acides aminés libres comme source d'azote aminé.
Figure 4: Effet de l'inactivation des 3 protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612 sur le nombre de peptides issus de la dégradation de protéines de surface de S.
thermophilus LMD9. Moyenne de 3 expériences (en noir), avec écart-type de la moyenne (en gri s).
Figure 5: Couverture des protéines IL-10 et élafine par les fragments de dégradation (peptides) identifiés dans les milieux de culture correspondants de S.
thermophilus LMD9 (Souche sauvage produisant respectivement l'IL-10 ou l'élafine). En fond grisé, figurent les régions des protéines IL-10 et élafine correspondant aux peptides

17 identifiés dans les milieux de culture de S. thermophilus LMD9. Ces régions regroupent l'ensemble des peptides identifiés. Les cystéines (C) sont indiquées en caractères gras.
Figure 6: Immunodétection de l'élafine dans le surnageant de culture de S.
thermophilus CNRZ1066 (souche sauvage et double mutant AhtrAASTER 1612).
Figure 7 : Effet de l'inactivation de la protéolyse de surface sur l'activité
élafine produite par S. thermophilus CNRZ1066 (souche sauvage en noir et double mutant AhtrAASTER_1612 en gris).
Figure 8 : Immunodétection de l'élafine produite par S. thermophilus CNRZ1066 (souche sauvage et double mutant AhtrAASTER 1612) et L. J ctis IL1403 (souche sauvage et mutant AhtrA).
Figure 9: Comparaison des activités élafine produites par L. lactis IL1403AhtrA
(notée IL1403D) et S. thermophilus CNRZ1066AhtrAASTER_1612 (notée CNRZ1066DD).
Figure 10: Immunodétection de l'élafine produite par L. lactis 111403 (souche sauvage et double mutant AhtrAàywc1F).
Figure 11 : Immunodétection de l'élafine produite par L. lactis MG1363 (souche sauvage et double mutant AhtrAAllmg-2442).
EXEMPLE 1: CONSTRUCTIONS DES MUTANTS DE LA SOUCHE DE BACTERIE

1) Construction des simples mutants AhtrA, AprtS et ASTER 1612 de la souche S.
thermophilus LMD9 Principe général Les mutants simples AhtrA, AprtS et ASTER_1612 sont construits à partir de la souche sauvage S. thermophilus LMD9 par remplacement de gène. La technique utilisée consiste à produire un fragment PCR associant trois amplicons :
- un amplicon amont correspondant à une région située au début du gène à
remplacer, - une cassette de résistance à un antibiotique et - un amplicon aval correspondant à une région située en fin du gène à
remplacer.
Les trois amplicons sont produits séparément puis associés via une PCR
supplémentaire finale. Cette association est rendue possible grâce à l'ajout d'extensions aux oligonucléotides utilisés pour amplifier les régions amont et aval qui permettent une liaison à
la cassette de

18 résistance à l'antibiotique (PCR overlap). Ce fragment PCR final est ensuite introduit dans la souche par compétence naturelle (W02010/125091). L'homologie entre les fragments amont et aval du gène et du fragment PCR permet la recombinaison au site du gène à
remplacer. Les colonies dont le gène ciblé a été remplacé par le gène de résistance peuvent facilement être isolées sur un milieu contenant l'antibiotique correspondant.
Mutant AhtrA
Une cassette de résistance à la kanamycine est utilisée. Les régions amont et aval du gène htrA sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN
chromosomique de S. thermophilus LMD9; la cassette de résistance à la kanamycinc est amplifiée à partir du plasmide pKa (Trieu-Cuot et al., 1983) à l'aide des couples d'oligonucléotides htrA-amont-F/htrA- amont-R, htrA-aval-F/htrA-aval-R et aphA3-F/aphA3-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 1.
[Table 1]
Oligonucléotides Séquence SEQ ID NT' htrA-amont-F GTA ATC ACG GTC ACC AAC C

htrA-amont-R GAC ATC TAA TCT TTT CTG AAG TAC ATC CGC

AAC AGT AAA CCA CCT AGT AAG CC
htrA-aval-F ATA ATC TTA CCT ATC ACC TCA AAT GGT TCG

CTG GGT AGT GTT CAG AAA GGT ATG CC
htrA-aval-R GGA TTG AGA TTT GAT CGT TG

19 aphA3-R GTT GCG GAT GTA CTT CAG

20 aphA3-F CCA GCG AAC CAT TTG AG

21 Tableau 1 Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne avec le kit PCR Clean-Up (Promega) et les tailles attendues (480 pb, 580 pb et 1350 pb) sont vérifiées par électrophorèse sur gel d'agarosc. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides htrA-amont-F et htrA-aval-R
pour obtenir un fragment de 2410 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole de transformation naturelle suivant. Une première pré-culture est réalisée pendant la journée en milieu M17 avec 1% de lactose (M171ac) (Terzagui et al., 1975) à partir d'un stock congelé de la souche; à partir de laquelle une deuxième pré-culture en milieu chimiquement défini (MCD) (Letort et al., 2001) est réalisée pendant la nuit.
Cette deuxième pré-culture est utilisée pour ensemencer une culture en MCD à une densité
optique à 600 nm (D0600) de 0,05. Après lh d'incubation à 42 C, le produit PCR associant les trois fragments est ajouté à un aliquot de la culture. Après incubation à 42 C, l'aliquot de culture est étalé sur boites de M171ac gélosé contenant lmg/m1 de kanamycine. Les boites sont incubées 48h à
42 C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR
sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
Mutant 21prtS
Une cassette de résistance à l'érythromycine est utilisée. Les régions amont et aval du gène ptrS ont été amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN
chromosomique de S. thermophilus LMD9; la cassette de résistance à l'érythromycine est amplifiée à partir du plasmide pG+host9 (Biswas et al., 1993) à l'aide des couples d'oligonucléotides prtS-amont-F/prtS-amont-R, prtS-aval-F/prtS-aval-R et erm-F/erm-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 2.
[Table 2]
Oligonucléotides Séquence SEQ ID N
prtS-amont-F TGG TAA GCA CGT AGA CC

22 prtS-amont-R CTA CTG ACA GCT TCC AAG GAG CTA AAG AGG

23 TCC CAG GCT TGT CAA TTC ATC TG
prtS-aval-F GCA AGT CAG CAC GAA CAC GAA CCG TCT TAT

24 CTC CGA AAG CCA ACT TAG ATG G
prtS-aval-R CGT ATG CTT ACC AAC AGA G

25 erm-F GGG ACC TCT TTA GCT CCT TGG

26 erm-R GGA GAT AAG ACG GTT CGT GTT CG

27 Tableau 2 Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne et les tailles attendues (660 pb. 650 pb et 1060 pb) vérifiées. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides prtS-amont-F et prtS-aval-R pour obtenir un fragment de 2370 pb qui est purifié sur colonne et utilisé
pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole décrit ci-dessus. Cette culture est ensuite étalée sur boîtes de M171ac gélosé contenant de l'érythromycine (5 pg/m1) qui sont incubées 48h à 42 C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
Mutant ASTER_1612.

Une cassette de résistance à à la spectinomycine est utilisée. Les régions amont et aval du gène STER 1612 sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN
chromosomique de S. thertnophilus LMD9; la cassette de résistance à la spectinomycine est amplifiée à partir du plasmide pAT28 (Trieu-Cuot et al., 1990) à l'aide des couples 5 d'oligonucléotides S
TER 1612-amont-F/STER 1612-amont-R, STER 1612-aval-F/
STER_1612-aval-R et spec-F/spec-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 3.
[Table 3]
Oligonucléotides Séquence SEQ ID N
STER_1612-amont-F CCC AAC AAC ACC AGG CTC ATT

28 STER_1612-amont-R GAA AAA TTC TAT AGA AAC TTC TCT CAA

29 TTA GGC TAA GGC TGA TCC GGA TGC CAA
STER_1612-aval-F TAC AGA TTA ATA ATT ATT CTT TAT TAT

30 ACA GAT CCA GAG TAA TTT CCA GTT GCC
STER 1612-aval-R TTC GAG GCC TAC GCA ATG CG

31 spec-F GAT CTG TAT AAT AAA GAA TA

32 spec-R AGC CTA ATT GAG AGA AGT TTC

33 Tableau 3 Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne et les tailles attendues (596 pb, 957 pb et 566 pb) vérifiées. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides STER_1612-amont-F et STER_1612-aval-R pour obtenir un fragment de 2050 pb qui est purifié sur colonne et utilisé
pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole décrit ci-dessus. Cette culture est ensuite étalée sur boîtes de M171ac gélosé contenant de la spectinomycine (150 g/m1) qui sont incubées 48h à 42 C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
2) Construction du double mutant AhtrAAprtS de la souche S. thermophilus Le double mutant AhtrAAprtS est construit à partir du mutant simple AprtS par transformation naturelle à l'aide d'ADN chromosomique du mutant AhtrA. Après cassage des cellules aux billes de verre, l'ADN chromosomique du mutant AhtrA est extrait au phénol-chloroforme, puis précipité à l'éthanol. Le mutant AprtS est transformé avec l'ADN
chromosomique purifié du mutant AhtrA, suivant le même protocole de transformation naturelle que décrit précédemment. Les transformants sont sélectionnés par étalement sur milieu gélosé contenant de la kanamycine (1 mg/mi). Quelques clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie.
3) Construction des doubles mutants AhtrA ASTER_1612, AprtS ASTER_1612 et du triple mutant AhtrA.àprtSASTER_1612 de la souche S. thermophilus LMD9 Les doubles mutants AhtrA ASTER_1612, AprtS ASTER_1612 et le triple mutant AhtrAAprtSASTER 1612 sont obtenus par transformation naturelle des souches LMD9AhtrA.
LMD9AprtS et LMD9AhtrAAprtS avec le fragment PCR contenant les régions amont et aval du gène STER_1612 fusionnées à la cassette de résistance à la spectinomycine utilisé pour construire le simple mutant ASTER 1612 suivant le protocole décrit ci-dessus.
Le protocole de sélection et de contrôle des mutants est celui décrit pour l'obtention du simple mutant LMD9ASTER_1 612 .
4) Construction des mutants de la souche S. thermophilus CNRZ1066 Le principe général de la construction des différents mutants est identique à
celui décrit ci-dessus, de même que le protocole utilisé. Seules les différences sont indiquées ci-après.
Dans le cas des mutants simples, de l'ADN chromosomique de la souche CNRZ1066 est utilisé comme matrice pour amplifier les régions amont et aval du gène à
muter. Lors de la transformation naturelle de la souche CNRZ1066, la compétence de la souche est stimulée en ajoutant du peptide de compétence ComS (LPYFAGCL) à une concentration de liaM pendant 10 minutes avant l'ajout du fragment PCR dans la culture.
Le double mutant CNRZ1066 AhtrAASTE,R 1612 est obtenu par transformation naturelle de la souche CNRZ1066ASTER_1612 avec de l'ADN chromosomique de la souche CNRZ1066 AhtrA. Quelques mutants ont été contrôlés par PCR sur colonie.
EXEMPLE 2: LA DELETION DES DEUX PROTEASES PRTS ET HTRA N'ABOLIT
PAS LA PROTEOLYSE DE SURFACE CHEZ LA SOUCHE DE BACTERIE

La souche LMD9 produit naturellement les deux protéases de surface PrtS et 1-WA. Pour évaluer leur rôle respectif dans la formation de l'exopeptidome de la souche LMD9, deux mutants simples AprtS et AhtrA et un double-mutant AhtrAAprtS ont été
construits par transformation naturelle (W02010/125091), suivant le protocole décrit dans l'exemple 1.

1) Matériel et méthodes : Détermination de l'exopeptidome des souches L'exopeptidome des souches ainsi obtenues est déterminé dans les mêmes conditions expérimentales que celui de la souche sauvage LMD9, tel que décrit ci-après.
Culture de la souche 50 ml de MCD dont la concentration en acides aminés aromatiques (Phenylalanine, Tryptophane et Tyrosine) a été réduite d'un facteur 10 sont ensemencés avec 500 pl de préculture de nuit en MCD standard et incubés à 42 C jusqu'à D0600 =
1,0. Les cellules sont alors éliminées par centrifugation (5 000 rpm, 4 C; 10 minutes), le surnageant est filtré sur membrane PVDF de porosité 0,22 m.
Isolement et concentration des peptides Le surnageant de culture filtré est acidifié avec de l'acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration de 0,1% finale (470 pl d'une solution de TFA à 10% dans 47 ml de surnageant de culture), et conservé une nuit à 4 C.
Les peptides présents dans le surnageant acidifié sont extraits par extraction en phase solide (SPE) sur cartouche StrataX (Phenomenex) contenant 200mg de phase, à un débit d'environ 0,3 ml /min, suivant les préconisations du fabriquant. La cartouche est tout d'abord activée avec 3 ml de méthanol, puis équilibrée avec 6m1 d'une solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. 1,75 ml d'acétonitrile sont ajoutés à 35 ml de surnageant acidifié, de façon à avoir une concentration finale d'acétonitrile de 5% dans le surnageant. 35 ml du surnageant ainsi préparé sont chargés sur la cartouche activée et équilibrée, à un débit de 0,3 ml/min. La cartouche est ensuite lavée avec 5 ml de la solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA, puis les peptides sont élués avec 1,5 ml d'une solution aqueuse contenant 50% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. L'éluat est séché pendant 16 à 18h par évaporation sous vide (système speed vac) puis conservé à -20 C.
L'éluat séché contenant les peptides est repris avec 350 pl d'une solution aqueuse contenant 0,1% de TFA (concentration finale), ce qui correspond à un facteur de concentration de 100. La solubilisation des peptides est obtenue par agitation au vortex et passage 5 minutes dans une cuve à ultrasons. La solution concentrée de peptides est ultrafiltrée à travers une membrane de porosité 3kDa, par centrifugation lh à 13000 rpm.
Les peptides sont alors séparés par HPLC sur une colonne de phase inverse (colonne Kinetex C18 (Phenomenex), porosité 100 A, granulométrie 2,6 !am, dimension 150 x 4,6 mm) avec un gradient linéaire (pente 1,6%) d'acétonitrile dans du formate d'ammonium (20 mM, pH 6,2) à un débit de 0,7 ml/min et à une température de 40 C.
L'équivalent de 20 ml de culture (soit 200 lui de suspension concentrée) est injecté sur la colonne.
Les fractions éluées entre 3,2% et 53,3% d'acétonitrile sont collectées et séchées au speed vac.
Identification des peptides L'identification des peptides est faite par spectrométrie de masse. Les fractions séchées sont reprises dans 300 d'une solution aqueuse contenant 0,1% de TFA et 2%
d'acétonitrile, et une fraction de 41..11 est chargée sur une colonne Pepmap C18 (150 x 0.075 mm, granulométrie 2 !Jim, porosité 100 Å). Les peptides sont élués avec un gradient d'acétonitrile dans de l'acide formique (0,1%), et analysés en ligne par spectrométrie de masse (LTQ-Orbitrap Discovery, Thermo Fisher). L'ionisation des peptides est faite par électrospray (1,3kV), et les paramètres d'analyse des peptides ionisés sont les suivants :
mesure des rapports masse/charge (m/z) de 300 à 1600 avec une résolution de 15000 sur l'analyseur de masse Orbitrap, et fragmentation des 6 ions parents les plus abondants sur la trappe linéaire LTQ. Les peptides doublement chargés sont soumis à fragmentation, avec une fenêtre d'exclusion de 40 secondes et les paramètres classiques de fragmentation (énergie de collision : 35%).
L'identification des peptides et des protéines desquels ils dérivent est faite avec le moteur de recherche X!Tandem (version 2017.2.1.4) et la suite logicielle X!Tandem pipeline (version 3.4.3, www.pappso.fr) en utilisant la séquence protéique de la souche S. therinophilus LMD9 associée à une base protéique de contaminants adaptée à l'activité
d'analyse de la platefoime d'analyses (peptides trypsiques d'un échantillon de protéines eucaryotes contenant en particulier les kératines humaines, des protéines bovines et murincs). Les paramètres de recherche de X!Tandem pipeline incluent l'absence de clivage trypsique pour l'identification des peptides, un peptide minimum par protéine, identifié avec une E-value inférieure ou égale à 0,01 et une tolérance de masse de 10 ppm.
Pour chaque contexte bactérien (souche sauvage, mutants simples et double), l'ensemble des peptides identifiés comme peptides de surface (c'est-à-dire, peptide issu de la dégradation d'une protéine de surface) est comptabilisé. Lorsqu'un peptide est identifié
plusieurs fois (redondance d'identification), chaque identification est considérée (comptage des spectres). Ainsi un peptide identifié une fois aura un compte de 1, un peptide identifié
trois fois un compte de trois. L'ensemble du nombre de peptides de surface est totalisé. Ces peptides étant issus des protéines de surface, ils résultent de l'activité
protéolytique de surface de la souche. Le nombre de peptides comptabilisés est donc un indicateur de l'intensité de protéolyse de surface : plus le décompte est élevé, plus l'activité de dégradation, donc la protéolyse de surface, est importante.
2) Résultats Les résultats montrent que les deux protéases HtrA et PrtS interviennent dans la formation de l'exopeptidome de S. thermophilus LMD9. Chez le double mutant, une réduction de plus de moitié du nombre de peptides issus de l'hydrolyse de protéines de surface est observée (Figure I). Un test statistique adapté aux échantillons de petits effectifs (test non paramétrique de Kruskal-Wallis) indique que cette diminution est statistiquement significative (P = 0.049).
3) Conclusion Les protéases de surface HtrA et PrtS ne sont pas responsables à elles seules de l'ensemble de l'activité protéolytique de surface de ces souches.
EXEMPLE 3: IDENTIFICATION D'UNE NOUVELLE PROTEASE DE SURFACE

D'après la base de données spécifique des protéases et peptidases MEROPS, le génome de S. thermophilus LMD9 contiendrait 45 enzymes protéolytiques (http://merops .s anger. ac .uk/cgi-bin/speccards?sp=sp000991;type=peptidase;
strain=498).
L'analyse de l'annotation du génome de cette souche (haps ://w w w.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/420?) suggère la présence de protéases supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 52 protéines qui pourraient contenir un domaine protéolytique.
Parmi celles-ci, 11 sont prédites comme étant localisées à la surface de la cellule d'après la hase de données LocateP (http://www.cmbi.ru.nl/locatep-db/cgi-bin/locatepdb.py) ou SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dldservices/SecretomeP/). Y figurent PrtS
(STER_0846) (STER_RS04165) et HtrA (STER_2002) (STER_RS09790). L'hypothèse poursuivie est que l'une au moins des 9 protéases restantes est impliquée dans la protéolyse de surface de S.
thermophilus.
Parmi ces neuf protéases, six sont présentes chez L. lactis subsp. lactis IL1403 et L. lactis subsp. cremoris MG1363 (Tableau 4).
[Table 4]

Taille Protéine Protéine Taille % Identité Protéine Taille %
Identité
(AAs) STER_0113 415 DacA 435 DacA 434 (42%) (39%) STER_0159 265 DacB 248 DacB 248 (54%) (52%) STER_0260 775 Pbp2A 743 Pbp2A 743 (57%) (55%) STER_1255 762 SitA 287 SrtA 250 (53%) (53%) STER_1612 345 YwdF 342 Llmg_2442 343 (50%) (46%) STER_1741 207 SipL 208 SipL 208 (53%) (48%) Tableau 4 Des peptides issus de la dégradation de trois de ces 6 protéases (STER_0260.
STER_1612 et STER_1741) ont été identifiés dans l'exopeptidome de S.
thennophilus LMD9, indiquant que ces protéases putatives ont été synthétisées dans ces conditions de 5 croissance. Parmi ces trois protéines, STER_0260 est annotée comme une D-Ala-D-Ala carboxypeptidase et STER_1741, comme signal peptide peptidase.
La protéase STER_1612 (STER_RS07910) (annotée respectivement YwdF chez IL1403 et 11mg_2442 chez MG1363) apparaît donc comme la protéine candidate pour participer àla protéolyse de surface de L. lactis et S. thennophilus. La présence d'un fragment 10 transmembranaire en région N-terminale (www.enzim.hu/hmmtop/) est prédite pour la protéine des 3 souches (Figure 2).
La synthèse de ces prédictions aboutit à l'hypothèse que la protéine STER_1612 serait une protéase ancrée à la membrane cytoplasmique dont le site actif serait orienté vers la face externe de la membrane.
15 EXEMPLE 4: LA DELETION DES TROIS PROTEASES PRTS, HTRA ET
STER_1612 ABOLIT LA DEGRADATION DES PROTEINES DE SURFACE
ENDOGENES
Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que la protéase STER_1612 dans la souche de S. thermophilus LMD9 et ses homologues dans les souches de L. lactis, IL1403 et 20 MG1363, étaient impliquées dans la formation de l'exopeptidome de S. thennophilus et L.
lactis.
1) Matériels et Méthodes La validation de cette hypothèse a été entreprise dans la souche LMD9, en construisant l'ensemble des mutants simples, doubles et triple par transformation naturelle, suivant le protocole décrit dans l'exemple 1.
Dans les souches LMD9 sauvage, LMD9AHtrA, LMD9APrtS et LMD9AHtrAAPrtS déjà construites, le gène ster 1612 a été remplacé par une cassette de résistance à la spectinomycine.
2) Résultats La croissance de la souche mutée pour les gènes de synthèse des trois protéases de surface n'est pas significativement affectée dans le milieu de culture utilisé, un milieu chimiquement défini ne contenant que des acides aminés comme source d'azote aminé (voir figure 3), de sorte que d'éventuelles différences observées entre la souche sauvage et les mutants ne pourront être imputées à une différence de croissance entre les souches.
L'inactivation d'une seule des trois protéases de surface réduit d'un facteur environ le nombre de peptides issus de la protéolyse des protéines de surface accumulés dans le milieu de culture (peptides de surface de l'exopeptidome). Lorsque les trois protéases sont inactivées, cette réduction atteint un facteur 25, avec seulement 24 peptides accumulés (moyenne de trois expériences indépendantes; voir figure 4). Si on compare le nombre de peptides accumulés par le double mutant htrA_prtS et par le triple mutant prtS_htrA_ster_1216, l'inactivation supplémentaire de la protéase STER_1612 le réduit d'un facteur 9.
3) Conclusion La protéolyse de surface est quasiment abolie chez le triple mutant de S.
thennophilus, ne représentant plus que 5% de celle de la souche sauvage, sur la base du nombre de peptides présents dans l'exopeptidome.
EXEMPLE 5: EXTENSION AUX AUTRES SOUCHES DE STREPTOCOCCUS
THERMOPHILUS NE POSSEDANT PAS LA PROTEASE PRTS
1) Matériels et Méthodes Le rôle des deux protéases de surface HtrA et STER 1612 sur la protéolyse de surface des souches de S. thermophilus ne possédant pas la protéase PrtS a été
évalué en utilisant la souche CNRZ1066 comme représentant.
Le double mutant CNRZ1066AhtrAAprtS est construit par transformation naturelle en suivant le protocole expérimental décrit dans l'exemple 1.
L'exopeptidome de la souche sauvage CNRZ1066 et du mutant ainsi obtenu sont déterminés dans les mêmes conditions expérimentales que celles décrites pour la souche LMD9 et ses mutants (exemple 2).
2) Résultats L'exopeptidome de la souche sauvage CNRZ1066 contient 240 spectres (décomptes de peptides) issus de protéines de surface. Celui du double mutant ne contient plus que 15 spectres provenant de protéines de surface. Sur cette base du nombre de spectres identifiés, on peut estimer la protéolyse de surface résiduelle du double mutant de CNRZ1066 à 6% de celle de la souche sauvage, soit une réduction comparable à celle obtenue avec la souche LMD9.
3) Conclusion Même si la souche ne possède que les deux protéases de surface HtrA et STER_1612, l'inactivation des gènes codant ces deux protéases suffit à réduire de plus de 90% la protéolyse de surface de la bactérie.
EXEMPLE 6: OBTENTION DE SOUCHES DE STREPTOCOCCUS
THERMOPHILUS PRODUISANT UNE PROTEINE HETEROLOGUE
1) Obtention des souches de S. thermophilus produisant 1'IL-10 et l'élafine Les souches L. lactis LL-pLB350 et LBH832 contiennent respectivement les plasmides pLB350 (Hossain et al., 2012) et pLB386, qui portent les gènes codant respectivement FIL-10 et l'élafine, placés sous le contrôle d'un promoteur inductible aux sels biliaires (pGroEL). Les plasmides sont extraits de ces souches et purifiés en utilisant un kit commercial (Midikit, Quiagen).
Les deux plasmides pLB350 et pLB386 sont ensuite introduits chez la souche sauvage S. thernwphilus LMD9 et son triple mutant par compétence naturelle, en suivant le protocole expérimental décrit dans l'exemple 1.
Le plasmide pLB386 est introduit dans la souche sauvage CNRZ1066 et son mutant de protéases de surface par compétence naturelle.
Les transformants sont sélectionnés par étalement sur milieu M17 gélosé
contenant 5 pg/m1 de chloramphénicol.
La présence du plasmide pLB350 est alors vérifiée par PCR sur colonies en utilisant les deux couples d'oligonucléotides pGroEL-F (ATAATGCCGACTGTACTTT de séquence SEQ ID N 34) / IL-10-R (GGCCTTGTAGACACCTTGGTCTT de séquence SEQ
ID N 35) générant une bande de 690 paires de bases. Celle du plasmide pLB386 l'est avec les deux couples d' oligonucléotides pGroEL-F et Elafin-R

(TCACTGGGGAACGAAACAGGC de séquence SEQ ID N 36) donnant une bande de 572 bp et celle du plasmide vide en utilisant les deux oligonucléotides Cm-F
(GTTCAACAAACGAAAATTGG de séquence SEQ ID N 37) et Cm-R
(TTATAAAAGCCAGTCATTAG de séquence SEQ ID N 38) donnant une bande de 807 bp.
EXEMPLE 7: UNE SOUCHE DE BACTERIE NON-PROTEOLYTIQUE
AMELIORE LE RENDEMENT DE PRODUCTION DES PROTEINES
HETEROLOGUES
1) L'inactivation des protéases de surface réduit la dégradation des protéines hétérologues * Souche LMD9 Matériels et Méthodes Deux modèles de protéines hétérologues ont été choisis, l'interleukine 10 (IL-10) et l'élafine. Ces deux protéines sont des protéines candidates dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (Benbouziane et al., 2013 et Bermudez-Humaran et al., 2015). Le plasmide portant le gène codant 1'IL-10 est extrait de la souche de lactocoque qui le contenait et introduit dans la souche S. therntophilus LMD9 et son triple mutant dépourvu d'activité protéolytique de surface par transformation naturelle, suivant le protocole décrit dans l'exemple 6. La même opération a été réalisée pour le plasmide codant l'élafine.
Sont ainsi obtenues 4 souches, deux sauvages produisant l'une l'IL-10, l'autre l'élafine et deux mutants de protéases produisant les deux mêmes protéines hétérologues.
Pour évaluer la stabilité de l'IL-10 et de l'élafine, les deux couples de souches sauvage et mutante portant respectivement le plasmide pLB350 et le plasmide pLB386 sont cultivées 4h dans du MCD à 42 C. Un mélange équipondéral d'acide cholique et d'acide désoxycholique est alors ajouté au milieu de culture, à une concentration finale de 150 g/ml.
Cet ajout a pour objectif d'induire l'expression des gènes contrôlés par le promoteur pGroESL.
Après 15 minutes d'induction à 42 C, les cellules sont éliminées par centrifugation et les peptides présents dans le surnageant de culture sont identifiés comme indiqué
dans l'exemple 2. La seule différence consiste en la modification de la banque d'interrogation, à laquelle la séquence de l'IL-10 ou de l'élafine ont été ajoutées, selon le couple de souches considéré.
Résultats Plusieurs fragments de dégradation des protéines hétérologues sont détectés dans le milieu de culture des souches sauvages, recouvrant au total plus de 30% de leur séquence respective (voir tableau 5 et figure 5). Dans les mêmes conditions expérimentales, aucun fragment n'est détecté chez les triples mutants. Donc, l'inactivation des trois protéases de surface abolit la dégradation des deux protéines hétérologues chez S.
thermophilus LMD9.
[Table 5]
Souche Sauvage Triple mutant protéase Nombre de peptides issus 9 0 de IL-10 Nombre de peptides issus 43 0 de l'élafine Tableau 5 : Nombre de peptides issus de la dégradation de l'1L-10 ou de l'élafine.
présents dans le milieu de culture de S. thermophilus LMD9 et de son mutant des trois protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612.
Les résultats obtenus avec les deux modèles protéiques étant de même nature, la suite des travaux n'a porté que sur un seul modèle, l'élafine.
* Souche CNRZ1066 Les mêmes expériences ont été conduites sur la souche CNRZ1066.
Matériels et Méthodes Le plasmide codant l'élafine est extrait de la souche de lactocoque le contenant, et introduit dans les souches sauvage et mutante de CNRZ1066 par compétence naturelle.
Pour évaluer la stabilité de l'élafine, leurs fragments de dégradation sont recherchés dans le milieu de culture après 4 h de croissance, en suivant la même approche que celle développée pour la souche LMD9.
Résultats Trente-six spectres provenant de l'élafine sont identifiés dans le surnageant de la souche sauvage. La région de l'élafine couverte par les produits de dégradation est la même que dans le cas de la souche LMD9, et représente 40% de la séquence totale (voir figure 5).
Dans les mêmes conditions expérimentales, aucun fragment de dégradation de l'élafine n'est détecté chez le double mutant.
Conclusion Aucun fragment de dégradation de protéine hétérologue n'est retrouvé dans le surnageant d'une souche de S. thermophilus mutée pour ses protéases de surface, que cette souche possède ou pas la protéase PrtS.
2) La réduction de dégradation des protéines hétérologues est corrélée à une augmentation de la production de la protéine intacte Puisque les résultats sont comparables que la souche de S. thermophilus possède deux ou trois protéases de surface, la suite des travaux ne porte que sur une seule souche, CNRZ1066. Puisque plus aucun fragment de dégradation de l'élafine n'est détecté dans le surnageant du double mutant, il convient de s'assurer que la protéine est bien produite dans 5 cette souche, et à un niveau plus important que chez la souche sauvage.
Matériels et Méthodes Cette vérification a été effectuée par immunodétection de l'élafine entière dans le surnageant (puisque la protéine est sécrétée dans le milieu extérieur par la souche de streptocoque), en suivant le protocole expérimental suivant.

La culture et l'induction de la production de l'élafine par les souches portant le plasmide pLB386 sont réalisées comme décrit dans l'exemple 6. Après 15 min d'induction, les cellules sont éliminées par centrifugation, elle surnageant contenant l'élafine est filtré sur filtre de porosité 0,22 pm (membrane PVDF à faible adsorption protéique). Dix ml de surnageant sont concentrés d'un facteur 20 par ultrafiltration sur membrane de seuil de 15 coupure de 3 kDa (Amicon ultracell 3k, MerckMillipore). Cinq 1 de rétentat sont déposés sur gel de polyacrylamide (gel pré-coulé NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, Invitrogen). Après migration pendant lh à 110 mA et 200V, les protéines sont transférées sur une membrane de transfert en PVDF (Trans-Bot Turbo Mini transfert pack, Bio-Rad). L'élafine, après avoir été
marquée par un anticorps anti-élafine monoclonal de souris (SantaCruz Biotechnology), est 20 détectée par chimioluminescence (kit ECL Plus Western, Pierce).
Résultats Plusieurs souches sont utilisées dans ces expériences, réalisées à plusieurs reprises et donnent systématiquement les mêmes résultats ; illustrés pour l'un d'entre eux dans la figure 6:

Les souches sauvage et mutée de S. therrnophilus CNRZ1066 ne produisant pas l'élafine (puits 3 et 4, notés pls vide). On n'observe aucune bande, signe qu'aucune des souches ne produit l'élafine (ni de protéine présentant une réaction croisée avec l'anticorps dirigé contre l'élafine), -La souche CNRZ166 sauvage produisant l'élafine (puits 5, noté WT pls élafine). On 30 observe deux bandes, dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l'élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure, et serait une forme tronquée de l'élafine en cours de dégradation.

-La souche CNRZ1066 mutée pour ses protéases de surface produisant l'élafine (puits 6, noté mutant pis élafine). La bande inférieure correspondant à la forme tronquée de l'élafine n'est plus détectée, seule la bande correspondant à l'élafine mature est révélée.
Conclusion L'inactivation de la protéolyse de surface abolit la dégradation de l'élafine chez S. thermophilus.
3) L'inactivation des protéases de surface induit une augmentation de l'activité
enzymatique portée par l'élafine Matériels et Méthodes L'activité de l'élafine accumulée dans les surnageants des souches CNRZ1666 sauvage et mutant est évaluée en déterminant le pouvoir d'inhibition de l'activité d'une protéase humaine témoin (l'élastase), suivant le protocole décrit ci-dessous.
Les souches de S. thermophilus portant le plasmide pLB386 sont cultivées en MCD à 37 C jusqu'à une D0600 de 1Ø
Les souches de L. litais portant ce même plasmide sont cultivées à 30 C dans un MCD spécifique des lactocoques (Otto et al., 1983) jusqu'à une D0600 de 1Ø
A ce stade de croissance, les cultures sont centrifugées, et les cellules resuspendues dans du MCD frais à une D0600 de 2Ø
La production d'élafine est obtenue par induction aux sels biliaires (15 ng/ml) et incubation sur la nuit à 37 C. Les cellules sont alors centrifugées, et l'élafine contenue dans le surnageant est concentrée par d'ultrafiltration d'un facteur 300 environ.
L'élafine est un inhibiteur de protéase. Elle est donc dosée selon le principe suivant. L'activité d'une protéase humaine (élastase) est mesurée par fluorescence en utilisant un substrat marqué (kit EnzCheck0 Elastae assay, Molecular Probes), en présence et en absence de surnageant contenant l'élafine. L'intensité d'inhibition (reflétant la concentration d'élastase) est mesurée par la différence de fluorescence entre la mesure sans et avec élafine au cours du temps en suivant le protocole livré avec le kit de dosage (Molecular Probes).
Résultats L' activité élafine produite par la souche dépourvue d'activité protéolytique augmente approximativement deux fois plus vite que celle produite par la souche sauvage (figure 7).
Conclusion L'inactivation de la protéolyse de surface induit un doublement de l'activité
élafine produite par la souche.
EXEMPLE 8: LA PRODUCTION D'ELAFINE PAR DES SOUCHES DE BACTERIE
NON-PROTEOLYTIQUE DE L'INVENTION
La production d'élafine est évaluée pour la souche L. lactis IL1403AHtrA et la souche S. therrnophilus CNRZ1066AHtrAAster_1612.
Matériels et Méthodes Les deux souches sont cultivées jusqu'à un niveau de population identique, et l'induction de la production d'élafine est réalisée dans les conditions optimales pour chacune des souches (voir exemple 7 point 3)).
Résultats Les résultats obtenus par immunodétection de l'élafine produite par chacune de ces souches montrent pour la souche CNRZ1066, la présence d'une bande correspondant à la protéine intacte détectée chez le mutant de protéases et la souche sauvage, et une forme tronquée détectée chez la souche sauvage uniquement. Pour la souche IL1403, on observe toujours des formes tronquées de l'élafine chez le simple mutant AHtrA (figure 8).
Donc, l'absence de dégradation de l'élafine n'est constatée que chez S.
thermophilus AHtrAASter_1612.
Par ailleurs, les résultats relatifs à l'activité élafine produite par chacune de ces souches montrent que cette activité élafine est 5 à 10 fois plus importante chez S. therrnophilus CNRZ1066AHtrAAster_1612 que chez L. lactis 1L1403AlltrA (figure 9).
EXEMPLE 9: CONSTRUCTIONS DES MUTANTS DE LA SOUCHE DE BACTERIE
LACTOCOCCUS LACTIS
Les souches L. lactis IL1403 et L. lactis MG1363 étant dépourvues de plasmide, elles ne produisent pas la protéase de paroi PrtP (dont le gène est porté par un plasmide, Gasson.
1983). Les deux autres protéases de surface produites sont donc HtrA (Poquet et al., 2000) et YwdF chez IL1403 (ou son homologue Ilmg-2442 chez MG1363). Le double mutant IL1403AhtrAAywdF, dépourvu des trois activités protéasiques de surface PrtP, HtrA et YwdF, a été construit à partir de la souche 1L1403AhtrA (Ciuillot et al., 2016) par double recombinaison homologue en utilisant le plasmide thermosensible pGhost9 selon le protocole établi (Biswas et al., 1993).

Le double mutant L. lactis MG13633,htrA3,11mg-2442, dépourvu des trois activités protéasiques de surface PrtP. HtrA et llgm-2442, a été construit en deux étapes à partir de la souche sauvage L. lactis MG1363. La première étape a consisté à inactiver le gène htrA par double recombinaison homologue, la seconde à inactiver le gène llgm-2442 chez le simple mutant préalablement obtenu MG1363AhtrA, en suivant une stratégie identique à
celle décrite ci-dessus pour L. lactis IL1403.
EXEMPLE 10: OBTENTION DE SOUCHES DE LACTOCOCCUS LACTIS
PRODUISANT L'ELAFINE
Le plasmide pLB386 a été purifié à partir de la souche L. lactis LBH832, comme décrit dans l'exemple 6. Il a été introduit dans la souche L. lactis IL1403, dans son double mutant L. lactis IL1.403AhtrAAywdf et dans le double mutant L. lactis MG1363AhtrAàlfing-2442 par électroporation. La souche L. lactis LBH832 n'est autre que la souche sauvage L. lactis MG1363 portant le plasmide pLB386.
La sélection des transformants et la présence du plasmide pLB386 ont été
réalisées comme décrit dans l'exemple 6.
En parallèle, des souches contrôles portant un plasmide sans elafine dit plasmide vide (pLB44) ont été construites.
Le plasmide pLB44 a été purifié à partir de la souche L. lactis LBH68, comme décrit dans l'exemple 6. Il a été introduit dans la souche L. lactis IL1403, son double mutant L. lactis IL1403AhtrAAywdf et dans le double mutant L. lactis MG1363AhtrAAllrng-2442 par électroporation. La souche L. lactis LBH68 n'est autre que la souche sauvage L. lactis MG1363 portant le plasmide pLB44.
EXEMPLE 11 : L'INACTIVATION DES PROTEASES DE SURFACE AUGMENTE
LA QUANTITE DE PROTEINE HETEROLOGUE PRODUITE PAR
LACTOCOCCUS LACTIS
Matériels et Méthodes La vérification que l'inactivation des protéases de surface de L. lactis se traduit par une augmentation de la quantité de protéine hétérologue produite a été faite par immunodétection de l'élafine entière. Les deux couples de souches sauvage et mutant (donc ne synthétisant ni PrtP, ni HtrA, ni YwdF/11mg-2442) portant le plasmide pLB386 ou pLB44 sont cultivées à
30 C dans du milieu chimiquement défini (Otto et al., 1983). L'induction de la production d'élafine et son immunodétection ont été réalisées comme décrit dans l'exemple 7. Il convient de préciser que les mêmes quantités de surnageant sont déposées pour chaque souche, de sorte

34 que des différences d'intensité de bande révèleront des différences de concentration de protéine dans le surnageant de culture.
Résultats Plusieurs souches sont utilisées dans ces expériences, réalisées à deux reprises et donnant systématiquement les mêmes résultats, illustrés respectivement pour L. lactis 1L1403 et L.
lactis MG1363 par les figures 10 et 11:
Les souches sauvages et mutées de L. lactis IL1403 et MG1363 ne produisant pas l'élafine (puits 4 et 6, notés respectivement WT pls vide et Mutant pls vide). On n'observe aucune bande, signe qu'aucune des souches ne produit d'élafine (ni de protéine présentant une réaction croisée avec l'anticorps dirigé contre l'élafine), La souche sauvage de L. lactis 1L1403 produisant l'élafine (Figure 10, puits 3, noté WT pls élafine). On observe deux bandes de faible intensité dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l'élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure (6 kDa), et serait une forme tronquée de l'élafine en cours de dégradation, La souche sauvage de L. lactis MG13633 produisant l'élafine (Figure 11, puits 3, noté WT pls élafine). On devine deux bandes de très faible intensité dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l'élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure (10 kDa), et serait une forme tronquée de l'élafine en cours de dégradation. La faible intensité des bandes reflète une forte activité de dégradation de l'élafine, La souche mutée de L. lactis IL1403 produisant l'élafine (Figure 10, puits 5, noté Mutant pls élafine). La bande inférieure correspondant à la forme tronquée de l'élafine n'est pratiquement plus détectable, la bande correspondant à l'élafine mature est révélée de façon majoritaire, avec une intensité beaucoup plus importante que chez la souche sauvage, ce qui traduit une très faible protéolyse de l'élafine chez le double mutant, La souche mutée de L. lactis MG1363 produisant l'élafine (Figure 11, puits 5, noté Mutant pls élafine). On observe trois bandes, dont l'une de très faible intensité (6 kDa) correspondant à la forme tronquée de l'élafine également perceptible chez le mutant de L.
lactis IL1403. La bande supérieure (sous forme de doublet) est la même que celle retrouvée chez la souche sauvage, mais avec une intensité beaucoup plus importante, traduisant une concentration nettement plus forte de l'élafine non dégradée dans le surnageant de la souche mutée.
Conclusion L'inactivation de la protéolyse de surface réduit fortement la dégradation de l'élafine, ce qui a pour conséquence une plus forte concentration de la forme intacte de l'élafine dans le surnageant d'une souche de L. lactis ne produisant pas de protéase de surface que dans celui d'une souche sauvage de L. lactis.

REFERENCES
Benbouziane B. et al., J. Biotechnol., 2013, 168: 120-129 Bermudez-Humaran L. G. et al.. Cun-. Opin. Microbiol., 2013, 16:278-283 Bermudez-Humaran L. G. et al.. Microb. Cell Fact., 2015, 14:26 10 Bermudez-Humaran L. G. et Langella P., Nat. Biotechnol., 2018, 36:816-818 Biswas 1. et al., J. Bacteriol., 1993, 175:3628-3635 Bobos I. et al., J. Biol. Chem., 2004, 279:8140-8148 Bron P. A. et al.. Cur. Opin. Biotechnol., 2019, 56:61-68 Charrette M.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, 87:4728-4732 15 Cossart P. et Joncquières R., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:5013-5015.
Delorme C. et al., Appl. Environ. Microbiol., 2010, 76:451-460 Desvaux M. et al., Front. Microbiol., 2018, 9:100 Fernandez-Espla M. D. et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66:4772-4778 Gardan R. et al., J. Bacteriol., 2009, 191:4647-4655 20 Gasson M., J. Bacteriol., 1983, 154:1-9 Gottesman S. et al., J. Bacteriol., 1978, 133:844-851 Guillot A. et al., J. Proteome Res., 2016, 15:3214-3224 Hafeez et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2013, 97, 9787-9799 Hafeez et al., J. Agri. Food Chem., 2015, 63, 7522-7531 25 Hossain M. S. et al., J. Bacteriol., 2012, 194:5886-5896 Letort C. et al., J. Appl. Microbiol., 2001, 91:1023-1029 Motta J.P. et al., Sci. Transl. Med., 2012, 4:158ra144 Neirynck S. et Steidler L., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2006, 22:253-266.
Otto R. et al., FEMS Microbiol. Lett., 1983, 16: 69-74.
30 Poquet I. et al., Mol. Microbiol., 2000, 35:1042-1051 Shamsi T.N et al., Int. J. Biol. Macromol., 2016, 91:1120-1133.
Siezen R. et al., Ant. Leeuwenhoek., 1999, 76:139-155 Soualmia et El Amri, 2018. Expert Opin. Ther. Pat. 28:93-110 Terzagui B. E. et al., Appl. Microbiol., 1975, 29:807-813 Trieu-Cuot P. et al., Gene, 1983, 23:331-341 Trieu-Cuot P. et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18: 4296 Wei C. et al., J. Genet. Genomics, 2013, 40:281-289

Claims

REVENDICATIONS

1. Bactérie Gram-positive de l'espèce Streptococcus thertnophilus ou Lactococcus lactis telle que la protéase de surface endogène comprenant un motif d'acides aminés et présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID N 1, a une expression et/ou une activité
diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d'une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée, où la SEQ ID N 1 est définie comme suit :

avec X1 est l'histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l'alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est 1 'i soleucine (1), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l'acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l'alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l'acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ;
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).

2. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie Gram-positive est un Streptococcus thermophilus et la protease de surface endogène possède au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID N 2 de Ster_1612 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.

3. Bactérie selon la revendication 2, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 8 de HtrA ou en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ
ID N 9 de PrtS a une expression et/ou l'activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d'une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.

4. Bactérie selon la revendication 2, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 8 de HtrA et en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
N 9 de PrtS a une expression et/ou l'activité diminuée ou abolie par mutagenèse ou par utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d'une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.

5. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en outre en ce que la bactérie Gram-positive est un Lactococcus lactis et la protéase de surface endogène possède au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID N 3 de Ywdf ou avec la séquence SEQ ID N 4 de llmq 2442 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.

6. Bactérie selon la revendication 5, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 10 de HtrA ou en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ
ID N 11 de PrtP a une expression et/ou l'activité diminuée ou abolie par mutagenèse ou par utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à serine ou par utilisation d'une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.

7. Bactérie selon la revendication 5, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 10 de HtrA et en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ
ID N 11 de PrtP a une expression et/ou l'activité diminuée ou abolie par mutagenèse ou par utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d'une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.

8. Bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, modifiée pour exprimer une protéine hétérologue d'intérêt, ladite bactérie contenant un vecteur d'expression contenant un fragment d'ADN codant la protéine hétérologue d'intérêt ou par un fragment d'ADN
codant la protéine hétérologue d'intérêt inséré dans son chromosome.

9. Procédé de préparation d'une bactérie faiblement protéolytique, comprenant une étape de mutagenèse ou d'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de protéases à serine ou d'utilisation d'une souche telle que le gène codant ladite protease est absent ou présent sous une forme tronquée pour l'abolition ou la diminution dans ladite bactérie, de l'expression et/ou de l'activité de la protéase de surface endogène de ladite bactérie comprenant un motif d'acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID N 1 ;
où la SEQ ID N 1 est définie comme suit :
I-A G TGT I-E-Xl-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K
avec X1 est l'histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la serine (S), l'alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l'isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l'acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l'alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l'acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ;
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).

10. Utilisation d'une bactérie telle que définie dans la revendication 8, pour la production de protéine hétérologue d'intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d'expression contenant un fragment d'ADN codant la protéine hétérologue d'intérêt ou par un fragment d'ADN codant la protéine hétérologue d'intérêt inséré dans son chromosome.

11. Utilisation d'une bactérie telle que définie dans l' une quelconque des revendications 1 à
7, comme ferment de pré-maturation du lait.