CN116218711B

CN116218711B - 一株乳酸乳球菌pz1及其在制备富硒低聚肽中的应用

Info

Publication number: CN116218711B
Application number: CN202211651028.2A
Authority: CN
Inventors: 卢美欢; 仝泽方; 马英辉; 李利军
Original assignee: Microbiology Institute Of Shaanxi
Current assignee: Microbiology Institute Of Shaanxi
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2042-12-21
Also published as: CN116218711A

Abstract

本发明公开了一株乳酸乳球菌PZ1及其在制备富硒低聚肽中的应用，涉及微生物技术领域，所述乳酸乳球菌PZ1的保藏编号为CCTCCNO：M2022398。本发明以无机硒和大豆蛋白为原料，利用该菌株，通过微生物发酵同时实现对硒元素的生物富集和大豆蛋白的酶解，进行生物转化，一步法生产富硒低聚肽。制备的富硒低聚肽，具有生产周期短、无污染、富硒量高等优点。富硒低聚肽既有补硒的功效，也发挥了低聚肽的生理功能，具有很好的抗氧化性作用，是理想的补硒产品。

Description

一株乳酸乳球菌PZ1及其在制备富硒低聚肽中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株乳酸乳球菌PZ1及其在制备富硒低聚肽中的应用。

背景技术

硒(Se)是人和动物的必需微量营养元素，具有重要的生理功能，大量资料证实或提示，硒具有广泛的生物学作用，在预防克山病、某些癌症治疗和延缓衰老中发挥着重要作用。

但是，自然界中硒的形态多样，只有科学的补硒才能促进人体健康。在生物体内，硒的生物学功能主要是以硒蛋白形式和无机硒形式表现，有机硒主要以硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等形式存在，无机硒则主要以硒酸盐、亚硒酸盐等形式存在。不同硒化合物在人体内利用率也不一样，硒代蛋氨酸最高，其次是硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸，再次为亚硒酸盐。可见，以硒蛋白为代表的有机硒是人体补硒的最佳来源。与无机硒相比，有机硒尤其是蛋白硒及氨基酸硒具有毒性小、吸收利用率高、生物活性强及安全性高等优点，目前日本、美国等国家已经禁止在食品中添加亚硒酸钠等无机硒。另外富硒食品多是通过施硒肥种植富硒植物，硒肥特别是无机硒肥的使用容易造成环境污染，并且生产周期较长，产品硒含量不均衡，探索高效生产富硒产品的新途径显得尤为迫切。因此，开发以蛋白硒为有机硒源的功能产品是补硒最佳选择。

我国是世界大豆主产国，大豆具有很高的营养价值，蛋白含量在豆类中居前列，大豆也成为了富硒效果较好的农产品。大豆蛋白肽是大豆蛋白质经酸法或酶水解作用后，经分离、精制等特殊过程处理而得到的蛋白质水解产物，通常是由3～6个氨基酸组成的相对分子质量低于1000的低肽混合物。大豆蛋白肽的氨基酸组成几乎与大豆蛋白质完全一样，但在体内的消化吸收却要明显优于游离氨基酸，它不仅营养丰富，而且还具有调整血糖浓度、降低血压和抑制胆固醇、抗氧化、抗血栓、调节免疫功能等生物活性和生理功能。

目前，大豆蛋白肽在生产上普遍应用酶水解法，但微生物发酵法要比酶水解法的成本低，而且通过微生物发酵法生产的大豆蛋白肽在溶解性和口感方面也要优于酶水解法。而富硒大豆低聚肽主要采用两种方法生产，一是对富硒大豆进行酶解后，进行分离提纯，获得富硒大豆低聚肽。二是采用化学反应合成富硒低聚肽，福州大学张馨元等以大豆分离蛋白为原料，对蛋白酶解获得蛋白肽后，与亚硒酸钠进行螯合反应，制备出富硒大豆蛋白肽。但酶解工艺中的低聚肽水解度的严格控制条件和水解时的苦味不能完全抑制，化学合成工艺的硒还是无机硒形式，毒性较大。

因此，如何实现大豆蛋白肽的安全富硒是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株乳酸乳球菌PZ1及其在制备富硒低聚肽中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株乳酸乳球菌PZ1，所述乳酸乳球菌PZ1的保藏编号为CCTCCNO：M2022398。该菌株分类命名为Lactococcuslactis，于2022年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072。

本发明乳酸乳球菌PZ1，包含了多种肽酶、蛋白酶，酶活高，可以快速的分解大豆分离蛋白，并对硒具有很好的耐受和转化能力，可用于高效生产健康、安全、高效的富硒大豆低聚肽功能产品。

本发明的又一目的是，提供一种工程菌株，以上述乳酸乳球菌PZ1为初发菌株构建而得。

本发明的又一目的是，提供一种微生物菌剂，包含上述乳酸乳球菌PZ1和/或上述工程菌株。

本发明的又一目的是，提供上述乳酸乳球菌PZ1或上述工程菌株或上述微生物菌剂在制备富硒低聚肽中的应用。

本发明的又一目的是，提供一种制备富硒低聚肽的方法，以大豆分离蛋白和无机硒为原料，利用上述乳酸乳球菌PZ1或上述工程菌株或上述微生物菌剂发酵培养，所得发酵液冷冻、解冻后超声破壁，离心取上清液，进一步超滤收集300～1000Da的组分，得富硒低聚肽。

本发明方法以无机硒和大豆蛋白为原料，通过微生物发酵同时实现对硒元素的生物富集和大豆蛋白的酶解，进行生物转化，一步法生产富硒低聚肽。制备的富硒低聚肽，具有生产周期短、无污染、富硒量高等优点。富硒低聚肽既有补硒的功效，也发挥了低聚肽的生理功能，具有很好的抗氧化性作用，是理想的补硒产品。

作为优选的技术方案，所述大豆分离蛋白的初始浓度为2～5％，所述无机硒的初始浓度为10～30mg/L。。

作为优选的技术方案，所述发酵培养的温度为32～35℃，时间为36～48h。

作为优选的技术方案，所述离心10000r/min，10min。

作为优选的技术方案，还包括将所述发酵液在离心前进行冷冻-解冻-超声破壁步骤；所述冷冻温度为-18～-20℃，时间12-24h，所述解冻为室温解冻，所述超声破壁超声功率为800W，超声时间15min。

本发明的又一目的是，提供一种富硒低聚肽，由上述方法制备而得。

本发明富硒低聚肽既有补硒的功效，也发挥了低聚肽的生理功能，具有很好的抗氧化性作用，是理想的补硒产品。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株乳酸乳球菌PZ1，利用该菌株发酵大豆分离蛋白和无机硒，可以同时实现对硒元素的生物富集和大豆蛋白的酶解；且制备所得富硒低聚肽既有补硒的功效，也发挥了低聚肽的生理功能，具有很好的抗氧化性作用，是理想的补硒产品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为乳酸乳球菌PZ1的菌落形态；

图2为乳酸乳球菌PZ1革兰氏染色显微图片(×1000)；

图3为乳酸乳球菌PZ1的Nr同源物种分布；

图4为乳酸乳球菌PZ1在富硒大豆蛋白培养基的发酵状态，其中左为发酵后，右为发酵前；

图5为四肽的标准曲线；

图6为富硒低聚肽对DPPH自由基的清除能力；

图7为富硒低聚肽对对羟基自由基的清除能力；

图8为富硒低聚肽对超氧阴离子自由基的清除能力。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

菌株的筛选与鉴定

乳酸乳球菌PZ1分离自陕西省微生物研究所自制泡菜。从泡菜中收集液体，对液体进行梯度稀释，分别将10²、10³、10⁴倍稀释液100μL，涂布于LB培养基中，32℃恒温培养2天，挑取单菌落继续在LB培养基中划线纯化，获得一株纯菌株，命名为PZ1。

(1)菌落形态

PZ1菌株在LB平板上培养，观察菌落形态，参照周德庆《微生物实验教程》进行革兰氏染色等。菌落形态如附图1所示，菌落凸起，乳黄色，表面光滑，湿润。革兰氏染色如附图2所示，为阳性菌，菌株形态为圆球状，大小约0.5μm。

(2)16SrDNA鉴定

提取PZ1菌株DNA，以该DNA为模板，采用16SrDNA通用引物(7F:5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，SEQ ID NO.1和1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，SEQ IDNO.2)进行PCR扩增，PCR产物进行测序，16SrDNA序列大小为1441bp，通过核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对，显示菌株PZ1为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。与乳酸乳球菌Y2-G-3基因序列同源性达100％，确定菌株PZ1为乳酸乳球菌。

乳酸乳球菌PZ1的16SrDNA序列如下：

TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGG，SEQ ID NO.3。

将乳酸乳球菌PZ1保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072；本发明菌株的信息为：乳酸乳球菌PZ1(Lactococcuslactis)，保藏号为CCTCCNO.M2022398，保藏日期为2022年04月08日。

实施例2

乳酸乳球菌PZ1的全基因组分析

提取乳酸乳球菌PZ1的总DNA，利用Nanopore测序技术平台进行全基因组测序。共得到4,083,885,878bpCleanData，组装后完整基因组总长2136240bp，GC含量为34.86％。对乳酸乳球菌PZ1的全基因组序列进行Nr同源物种分布分析，结果显示与乳酸乳球菌的同源性最高，达98.34％(参见附图3)。通过Nr数据库注释(参见表1)，搜索和肽酶、蛋白酶相关基因，发现肽酶Peptidase、内肽酶Endopeptidase、氨肽酶Aminopeptidase、二肽酶Dipeptidase、羧肽酶Carboxypeptidase等肽酶基因，未发现蛋白酶基因。通过Swissprot数据库注释(参见表2)，除了存在多种肽酶基因，还发现了多种蛋白酶protease基因。说明乳酸乳球菌PZ1具备很好的蛋白酶解体系，其中蛋白酶将外源蛋白进行降解，生成大分子肽，肽酶、二肽酶、氨基肽酶、内肽酶则将大分子肽水解为小分子肽和氨基酸，满足乳酸菌自身的生长代谢。

表1 Nr数据库注释

表2 Swissprot数据库注释

实施例3

乳酸乳球菌PZ1的酶活力测定

1、蛋白酶活力测定

参照《GB/T23527-2009蛋白酶制剂》中蛋白酶活力测定的福林法，其中福林试剂为Sigma公司购买。将乳酸乳球菌PZ1接种于富硒大豆蛋白培养基中，培养36h，取发酵上清液测定蛋白酶活力，测得蛋白酶活力为56.13U/mL。

2、氨肽酶活力测定

采用LNA法测定乳酸乳球菌PZ1的氨肽酶活力。取上述发酵上清液测定，测得氨肽酶活力为2537U/mL。

实施例4

乳酸乳球菌PZ1发酵生产富硒低聚肽

1、乳酸乳球菌PZ1发酵

富硒培养基：大豆分离蛋白2～5％，葡萄糖0.5～1％，亚硒酸钠10～30mg/L。115℃灭菌15min，备用。

乳酸乳球菌PZ1转接至MRS斜面活化24h，接种至灭菌的富硒培养基中，32-35℃培养36-48h，得富硒大豆蛋白发酵液(参见附图4)。

2、富硒低聚肽的分离纯化

将富硒大豆蛋白发酵液放置在-20℃冰箱冷冻12-24h，取出室温解冻，超声破碎15min，超声功率为800W，用离心管装超声后的溶液在离心机中以10000r/min，离心10min。取上清液在超滤装置中进行超滤，分别过5000Da、1000Da和300Da的有机膜，收集300～1000Da之间的滤液，得富硒低聚肽；也可进一步浓缩后冷冻保存(-20℃)备用。

实施例5

效果测定

1、富硒低聚肽成分含量测定

(1)标准曲线的制作

称取20mg的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽，用10mL5％的TCA溶解，即为四肽标准溶液。按照下表用5％TCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准。标准溶液分别取0.75mL，加双缩脲试剂0.5mL，在漩涡混合器振荡混合均匀，静置10min，2000r/min，离心10min，取上清液在540nm下测定以第一管为空白对照吸光度值，每个浓度做2个平行。以肽的浓度作横坐标X(mg/mL)，吸光度(OD值)作纵坐标Y，制作标准曲线。

表3溶液的添加量

(2)低聚肽的含量测定

四肽的标准曲线参见附图5。低聚肽含量测定参照双缩脲法测定多肽的含量。低聚肽溶液取1.0mL，加入10％三氯乙酸(TCA)溶液1.0mL，在漩涡混合器上振荡混合均匀，静置10min，以4000r/min离心15min，将0.75mL上清液转移至2mL离心管中，加入0.5mL双缩脲试剂，在漩涡混合器上振荡混合均匀，静置10min，以2000r/min离心10min，取上清液，在540nm下测定吸光度值，与标准曲线对照，得到样品溶液中的肽浓度C(mg/mL)，即可得到样品中的低聚肽含量。计算得出富硒低聚肽的多肽含量为0.23mg/mL。

(3)硒含量测定

采用氢化物原子荧光光谱法(GB5009.93.2017)测定富硒低聚肽中有机硒的含量为278μg/L。

2、富硒低聚肽抗氧化活性测定

分组：大豆分离蛋白组、大豆低聚肽组和富硒低聚肽组。大豆分离蛋白购自山东禹王集团；大豆低聚肽采用实施例4工艺制备，区别为发酵料中不含有硒；富硒低聚肽为实施例4制备所得。

样品溶液的处理：大豆分离蛋白、大豆低聚肽和富硒低聚肽分别用蒸馏水稀释，配成蛋白浓度梯度为0.2mg/mL、0.16mg/mL、0.12mg/mL、0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.01mg/mL。

测定方法：

(1)DPPH自由基的清除试验

用无水乙醇配制0.02mmo1/L的DPPH溶液，避光保存(0℃～4℃)。

试管中加入待测液和DPPH溶液各2mL，摇匀，在黑暗中放置30min，以无水乙醇为空白，517nm测定其吸光度A1，同时测定DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度A0，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度A2，并用以下公式计算其清除率：

清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

式中：A₀为未加待测液时DPPH溶液的吸光度；A₁为加待测液时DPPH溶液的吸光度；A₂为待测液在517nm的吸光度。

(2)对羟自由基(·OH)的清除实验

试管中加入9mmol/LFeSO4溶液、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液各2mL，不同浓度的待测溶液2mL。最后加2mL9.8mmol/LH2O2溶液启动反应，37℃反应30min，以超纯水为参比，在510nm下测量各浓度的吸光度。考虑到待测溶液本身的吸收光值，以FeSO4溶液2mL，水杨酸-乙醇溶液2mL，不同浓度的待测溶液2mL和2mL超纯水作为本底吸收。

清除率计算公式为：

清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

式中：A₀为空白对照液的吸光度；A₁为加入色素溶液后的吸光度；A₂为不加显色剂H2O2色素溶液本底的吸光度。

(3)对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除实验(邻苯三酚自氧化法)

取5mLpH8.2，50mmol/LTris-HCl缓冲液，2mL超纯水，混匀后在25℃水浴中保温20min。取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.1mL(以10mmol/LHCl配制，空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚的HCl溶液)，迅速摇匀后倒入比色杯，420nm下每隔30s测定吸光度值，控制4min内邻苯三酚自氧化速率为每分钟光吸收值0.07，记录4min时的吸光值。

样品活性测定：在加入邻苯三酚前，先加入一定体积的待测溶液，蒸馏水减少，然后按采用邻苯三酚自氧化法测定的方法操作。

抑制率计算公式为:

抑制率(％)＝[1-(A₃-A₄)/(A_l-A₂)]×100％

式中：A₁为不含样品的吸光度值；A₂为不含样品和邻苯三酚的吸光度值；A₃为含有样品的吸光度值；A₄为含样品，但不含邻苯三酚的吸光度值。

结果显示，不同样品清除DPPH自由基、对羟基自由基和超氧阴离子自由基能力均为：富硒低聚肽﹥大豆低聚肽﹥大豆分离蛋白(参见附图6～8)。随着蛋白溶液浓度的增大，清除率也逐渐增大。浓度为0.2mg/mL时，富硒低聚肽、大豆低聚肽、大豆分离蛋白清除DPPH自由基能力分别达到63.20％、43.63％和27.23％，清除对羟基自由基能力分别达到76.3％、45.53％和29.72％，清除超氧阴离子自由基能力分别达到74.35％、69.61％和49.22％。可见富硒低聚肽的抗氧化活性优于大豆低聚肽，而大豆低聚肽又优于大豆分离蛋白，说明富硒低聚肽具有更好的保健功效。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）PZ1，其特征在于，所述乳酸乳球菌PZ1的保藏编号为CCTCC NO：M2022398。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述乳酸乳球菌PZ1。

3.权利要求1所述乳酸乳球菌PZ1或权利要求2所述微生物菌剂在制备富硒低聚肽中的应用。

4.一种制备富硒低聚肽的方法，其特征在于，以大豆分离蛋白和无机硒为原料，利用权利要求1所述乳酸乳球菌PZ1或权利要求2所述微生物菌剂发酵培养，所得发酵液离心取上清液，进一步超滤收集300～1000Da的组分，得富硒低聚肽。

5.根据权利要求4所述的制备富硒低聚肽的方法，其特征在于，所述大豆分离蛋白初始浓度为2～5％，所述无机硒初始浓度为10～30mg/L。

6.根据权利要求4所述的制备富硒低聚肽的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为32～35℃，时间为36～48h。

7.根据权利要求4所述的制备富硒低聚肽的方法，其特征在于，所述离心10000r/min，10min。

8.根据权利要求5-7任一所述的制备富硒低聚肽的方法，其特征在于，还包括将所述发酵液在离心前进行冷冻-解冻-超声破壁步骤；所述冷冻为-18～-20℃冷冻12-24h，所述解冻为室温解冻，所述超声破壁时间为15min，超声功率800w。