CN103865865B

CN103865865B - 一种海参肠道产碱性蛋白酶菌株及其应用

Info

Publication number: CN103865865B
Application number: CN201410113530.7A
Authority: CN
Inventors: 朴美子; 陈勇; 王莹
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Fujian Shen Lu Biological Technology Co ltd
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2034-03-26
Also published as: CN103865865A

Abstract

本发明提供一种分离于海参肠道的产碱性蛋白酶菌株（Thalassobacillus sp.），已于2013年10月18日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8366。该菌株为芽孢杆菌，其菌落特征为较湿润、淡黄色、中央凸起且边缘为齐整的圆形。本发明公开了产酶发酵培养基的主要成份、质量浓度以及培养工艺。本发明应用于发酵法酶解海参加工废料制备生物活性多肽，具有很好的推广应用前景。

Description

一种海参肠道产碱性蛋白酶菌株及其应用

技术领域

本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种海参肠道产碱性蛋白酶菌株及其应用。

背景技术

海参(Sea cucumber)富含大量生物活性成分，如黏多糖、皂苷、β-胡萝卜素、海胆紫酮、牛磺酸等，具有极高的营养和药用价值。国际市场上海参消费需求的不断增加引起海参价格一路攀升，大大刺激了海参捕捞业的发展。但海参的过度捕捞使许多商业品种资源遭到不同程度的破坏。而且在海参产品加工过程中，海参肠等下脚料直接作为废料扔掉，这样不仅污染环境，而且海参下脚料中的营养价值没有得到很好的开发。

海参蛋白质的营养价值以多肽含量为标准，而多肽活性是决定其保健功能的核心指标。海参多肽具有良好的溶解性和稳定性，易消化吸收，食用安全，具有降血压、预防心脑血管疾病、提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳和抗氧化等生物活性。因此，肽制品已成为海参深度开发的重要方向。研究发现海参中蛋白质含量占干重的55%，海参下脚料中的蛋白质含量也非常高。因此，采用高效的蛋白酶水解海参下脚料制备海参活性肽，可以实现“变废为宝”的目标。例如，用自溶法和商业用酶法酶解鲭鱼蛋白，得到了3种活性多肽，它们能抑制亚油酸的自动氧化，对DPPH也表现出很好的清除效果。

而在海参多肽制备过程中，获得高效的产酶菌种是制备蛋白酶的关键。因此，从海洋生物体内筛选具有特殊功能的微生物就成为酶解制备海参多肽的关键因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种海参肠道产碱性蛋白酶菌株，及其在发酵海参下脚料制备海参多肽中的应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种分离于海参肠道的产碱性蛋白酶菌株（Thalassobacillussp.QDHF-1）,所述菌株为Thalassobacillus sp.于2013年10月18日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8366。

本发明的菌株用于发酵生产海参多肽，一种工艺如下：将海参加工下脚料绞碎后按料水比1：5配制发酵培养基，121℃灭菌15分钟，按8%接种量接种菌株，在180r/min、30℃下发酵36小时，发酵液经离心过滤后，得上清液为海参多肽溶液。

为了提高发酵效率，在培养基中还加入硫酸铁，硫酸铁的质量浓度为0.01%；

本发明从海参肠道内筛选的产碱性蛋白酶菌株Thalassobacillus sp.QDHF，该菌种能够高效生产碱性蛋白酶，还可以有效地发酵海参加工下脚料制备海参多肽，实现了废物再利用的目的。

附图说明

图1：不同碳源对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶的影响；

图2：不同氮源对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶的影响；

图3：培养基初始pH值对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶的影响；

图4：培养温度对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶活力的影响；

图5：培养时间对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶活力的影响。

图6：接种量对发酵海参下脚料制备多肽的影响；

图7：发酵时间对发酵海参下脚料制备多肽的影响

图8：料水比对发酵海参下脚料制备多肽的影响；

图9：不同浓度的海参肠发酵多肽清除·OH能力图；

图10：不同浓度的海参肠发酵多肽清除DPPH·能力图；

图11：不同浓度的海参肠发酵多肽清除O₂ ^-·能力图；具体实施方式

以下结合具体试验例对本发明作进一步的说明。

实施例1：Thalassobacillus sp.QDHF菌株的筛选：

一、材料与培养基：

1、材料海参

2、培养基

选择培养基：2216E培养基和VNSS培养基（见文献Christer O.IntestinalColonization Potential of Turbot(Scophthalmus maximus)and Dab(Limandalimanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against Vibrioanguillarum[J].Applied and enviromental microbiology,1992(58):551-556）。

酪蛋白培养基：酪蛋白1%，酵母膏0.1%，琼脂1.5%，pH7.2，海水配制，以上为质量浓度，即酪蛋白为1g/100mL。

发酵培养基：蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，磷酸高铁0.01%，培养基起始pH8.0，海水配制。

固体培养基：称取3.3g LB营养琼脂培养基溶解于100ml海水中。

二、海参肠道产蛋白酶菌的筛选：

选用酪蛋白培养基作为筛选培养基的主要原理是该菌种在酪蛋白培养基中生长时，利用自己产生的蛋白酶来水解培养基中的酪蛋白，在培养基上产生透明圈。可以根据酪蛋白水解透明圈的大小来进行产蛋白酶菌株的筛选。

1、初筛

将活海参解剖，取其肠道，用无菌海水冲洗数次，去掉肠道杂物，将肠道剪碎，加入无菌海水研磨，得到菌液原液，将原液稀释成10^-1，10^-2浓度梯度，分别涂布于2216E培养基和VNSS培养基上，25℃下恒温培养箱中培养。

挑取培养基上的单菌落，稀释划线法接种于固体培养基上，在25℃下培养1天，将单菌落点种于酪蛋白培养基上，观察各菌株产透明圈情况。

通过初筛获得2株产蛋白酶的菌株，分别为命名QDHF和HS。

表1：肠道产蛋白酶菌株初筛结果

2、复筛

将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于25℃摇瓶培养3天，在4℃，10000r/min下离心15min，取上清液，测定其蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株。

三、蛋白酶活力测定方法

参照Ranilson的偶氮酪蛋白法(Ranilson S.B.Alkaline protease from intestineof Nile tilapia[J].Process Biochemistry,2005,40:1829-1834)，采用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液配制质量分数为0.1%偶氮酪蛋白溶液为底物，准确吸取50μl样品与50μl偶氮酪蛋白溶液充分混合，37℃下水浴震荡反应1小时。反应结束后，向混合液中加入10%（w/v）三氯乙酸溶液终止反应。常温静置15min后，在10000r/min条件下离心5min，取100μl的上清液加入100μl1mol/L的NaOH，充分混匀，在波长为450nm下测定吸光度，计算酶活力。

一个单位的酶活力定义为每分钟蛋白酶水解底物偶氮酪蛋白使吸光度改变0.001个单位所需的酶量。

公式(一)：

式中，A为450nm下的吸光值；

400为反应的总体积；

100为反应后所取上清液的量；

50为所加样品的量；

1000为从微升转化为毫升的转化系数；

60为反应时间。

将初筛得到的2株菌株分别接种到液体发酵培养基上进行摇瓶培养后，测定各发酵液的蛋白酶活力。结果表明，QDHF菌株产的蛋白酶活性最高。

四、QDHF菌株的理化性质

QDHF菌株为革兰氏阳性菌，杆状，两端钝圆，有芽孢；菌落为淡黄色、圆形、凸起、边缘整齐、湿润的光滑型小菌落。

1.生理生化鉴定

表2：菌种生理生化鉴定结果

2.16S rRNA全序列分析

Thalassobacillus sp.QDHF菌株的16SrRNA的全序列测定步骤如下：

(1)基因组的提取；(2)PCR反应；(3)DNA琼脂糖切胶纯化；(4)目的片断TA克隆；(5)质粒提取；(6)DNA测序；

经PCR扩增获得菌株16S rRNA基因片段的长度为1450bp左右，在GeneBank中通过Blast分析表明，Thalassobacillus sp.QDHF菌株为Thalassobacillus属。通过MEGA5.0软件分析表明，Thalassobacillus sp.QDHF菌株与Thalassobacillus sp.LY18的16S rRNA基因片段具有最高的同源性。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年10月，保藏编号为CGMCC No.8366。

实施例2：Thalassobacillus sp.QDHF菌株最适发酵条件

一、不同碳源对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶的影响

在实施例1中的液体培养基中采用质量浓度为0.5g/100mL的不同碳源即酵母膏、乳糖、蔗糖、淀粉、果糖和葡萄糖。培养条件为25℃，180r/min摇瓶培养3天，发酵液在4℃，6000r/min条件下离心15min，除去菌体，得上清液，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法”测定上清液的蛋白酶活力。结果表明，以酵母膏为碳源时酶活力最高（701.8U/mL），同时发现糖明显抑制菌株的生长和产酶水平（见图1）。

二、不同氮源对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶的影响

在实施例1中的液体培养基中采用质量浓度为0.5g/100mL的不同氮源即酪蛋白、蛋白胨、牛肉膏、硝酸钠和硫酸铵。培养条件为25℃，180r/min摇瓶培养3天，结束后在4℃，6000r/min条件下离心15min，除去菌体，得上清液。依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法”测定上清液的蛋白酶活力。结果表明，蛋白胨作为氮源时菌株所产蛋白酶活力最高（738.1U/mL）（见图2）。

三、培养基初始pH值对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶的影响

将实施例1中的液体培养基起始pH值分别调为5、6、7、8、9、10和11。在25℃、180r/min条件下摇瓶培养3天。在4℃、6000r/min条件下离心15min去除菌体，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法”测定上清液的蛋白酶活力。培养基的起始pH值为8.0时，粗酶液中蛋白酶活力达715.4U/mL（见图3）。Thalassobacillus sp.QDHF菌株可以在较广的pH值范围内产蛋白酶。

四、培养温度对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶活力的影响

将菌株接于实施例1中的液体培养基中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃的条件下摇瓶培养。发酵液在4℃、6000r/min条件下离心15min去除菌体。

图4表明，Thalassobacillus sp.QDHF菌株可在25℃～40℃范围内生长。最适培养温度为30℃，属于中温菌。

五、培养时间对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶活力的影响

将菌株接种于实施例1中的液体培养基中，在25℃、180r/min条件下摇瓶培养5天。发酵液于4℃、6000r/min离心15min去除菌体，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法”测定上清液的蛋白酶活力。结果如图5所示，发酵前24小时为QDHF菌株生长期，合成蛋白酶较慢；发酵24小时后菌株开始迅速产蛋白酶；60小时酶活力最高；60小时后酶活趋于稳定。因此，Thalassobacillus sp.QDHF菌株的最适培养时间为60小时。

六、金属离子及表面活性剂对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶活力影响

在液体发酵培养基中分别添加Fe³⁺、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺离子及表面活性剂吐温-80和聚乙二醇，考察金属离子和表面活性剂对菌株及蛋白酶活力的影响。发酵结束后在4℃、6000r/min条件下离心15min去除菌体，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法”测定上清液的蛋白酶活力。

金属离子及表面活性剂对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶活力的影响如表3所示。Mn²⁺与Ba²⁺对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶有促进作用。适量的Mn²⁺可促进菌体的生长和酶的生成。表面活性剂对Bacillus sp.QDV-3菌株产蛋白酶无明显影响。Zn²⁺和Cu²⁺对Thalassobacillus sp.QDHF菌株产蛋白酶有显著抑制作用。

表3金属离子及表面活性剂对QDHF菌株产蛋白酶活力的影响

综上，Thalassobacillus sp.QDHF菌株的产酶培养基成份为酵母膏、蛋白胨、磷酸高铁。培养基初始pH8.0；发酵培养温度30℃，培养时间为60小时。Fe³⁺对菌株产蛋白酶有促进作用。

实施例3：Thalassobacillus sp.QDHF菌株发酵海参下脚料制备海参多肽

将Thalassobacillus sp.QDHF接种于2216E液体培养基（初始pH8.0），于30℃，180r/min条件下培养12小时，作为种子液。

一、肽含量的测定

采用蛋白质定量试剂盒(BCA法)测定多肽含量。

将试剂盒中的工作液A、工作液B以50:1的比例制备成200μL混合液。取20μL样品加入到上述混合液并充分混匀，37℃下水浴1小时后，测定该溶液在562nm处的吸光值。用牛血清蛋白为标准品获得肽含量与吸光值的标准曲线为：肽含量（mg/mL）=0.53×A_562nm—0.0017。

二、接种量对发酵海参下脚料制备多肽的影响

将海参下脚料研磨至肉糜状，称取5.0g置于100ml海水中（料水比为1:10），调pH8.0后为发酵培养基。按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量分别接种于发酵培养基。在30℃，180r/min发酵2天后，将发酵液在4℃，6000r/min条件下离心15min，得上清液。用BCA法测定上清液中的多肽含量，结果如图6所示。在接种量为8%时，上清液肽含量最高，达10mg/mL。

三、发酵时间对发酵海参下脚料制备多肽的影响

将海参下脚料研磨至肉糜状，称取5.0g置于100ml海水中（料水比为1:10），调pH8.0后为发酵培养基。按照8%的接种量接种于发酵培养基。在30℃，180r/min发酵12，24，36，48，60小时，将发酵液在4℃，6000r/min条件下离心15min，得上清液。用BCA法测定上清液中的多肽含量，结果表明培养时间为36小时，上清液中肽含量最高，达10mg/mL（见图7）。

四、料水比对发酵海参下脚料制备多肽的影响

称取5.0g已研磨至肉糜状的海参下脚料，按照料水（海水）比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:15、1:30配制成溶液，调pH8.0后为发酵培养基。接种量为8%。在30℃，180r/min发酵36小时后，将发酵液在4℃，6000r/min条件下离心15min，得上清液。用BCA法测定上清液中的多肽含量，结果如图8所示。在料水比为1:5时，上清液肽含量最高，达14mg/mL。

在海参肠道内筛选的菌株具有高效合成碱性蛋白酶的能力，蛋白酶活达700U/ml。以海参下脚料为原料制备海参多肽主要利用菌株生产高效降解海参下脚料的碱性蛋白酶。由于该菌株分离于海参肠道，所以更容易分解海参下脚料（如海参肠）中的蛋白质。此外，发酵法制备海参多肽的比较简单，直接将菌种接种至海参下脚料即可。

五、制备海参肽粉流程及抗氧化实验

下脚料研磨→按1:5料水比配制QDHF发酵培养基→121℃灭菌15min→接种8%种子液→30℃，180r/min发酵36h→离心得上清液→上清液冷冻干燥的肽粉→肽粉抗氧化实验。

清除·OH能力测定

采用水杨酸法测定。在试管中分别加入0.5mL10mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5mL样品、0.5mL10mmol/L FeSO4溶液、3.5mL蒸馏水，最后加入5mL100mmol/L H₂O₂，摇匀后测定510nm吸光度为A₁。取0.5mL蒸馏水代替10mmol/LFeSO₄溶液，测得的吸光度为A₂，取0.5mL蒸馏水代替样品，测得的吸光度为A₃。计算方法为：

将制备的海参肠肽粉配制成不同浓度的溶液，并测定不同海参肠多肽溶液·OH清除能力。如图9所述，海参肠多肽对·OH具有良好的清除作用。·OH清除能力随着多肽浓度的增大而上升，当肽含量为50mg/mL时，清除率可达94%。苏永昌等报道采用AS.1398中性蛋白酶酶解海参后经超滤和冷冻干燥后制得的海参多肽在50mg/mL浓度时的·OH清除率为65%。

清除DPPH·能力测定

样品管：在试管中加入0.5mL样品，2.4mL0.1mmol/L DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼）乙醇溶液，充分混匀，用去离子水补足4mL;样参管，在试管中加入0.5mL样品，2.4mL无水乙醇，充分混匀，用去离子水补足4mL；对照管：在试管中加入2.4mL0.1mmol/L DPPH，用去离子水补足4mL。各管置于室温静置暗反应30min，测定517nm吸光度，对照用样品的溶剂去离子水代替。计算方法：

A1：样品管吸光度。

A2：样参管吸光度。

A：对照管吸光度。

将制备的海参肠肽粉配制成不同浓度的溶液，并测定不同海参肠多肽溶液DPPH·清除能力。如图10所述，海参肠多肽对DPPH·具有良好的清除作用。DPPH·清除能力随多肽浓度增大而逐渐升高，当肽含量为40mg/mL时，DPPH·清除能力趋于稳定。当肽含量为50mg/mL时，DPPH·清除率为33.9%。朱蓓薇等通过对海参肽进行超滤得到小分子的海参多肽，当其浓度为2mg/mL时对DPPH·的清除率为70%。本海参肠肽粉由于未经超滤分离，故对DPPH·的清除率较低。

清除O₂ ^-·能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定清除O₂ ^-·能力。在试管中先后加入5mL0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2)，0.5mL样品，混匀，25℃预热10min，然后加入50μL25mmol/L邻苯三酚（10mmol/L HCl配制），充分混匀，迅速测定325nm处的吸光度，间隔测定为30s，测定时间为5min。空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值，即邻苯三酚的自氧化速率Δ_A。蒸馏水代替样品测得邻苯三酚的自氧化速率Δ_A0。计算方法为：

将制备的海参肠肽粉配制成不同浓度的溶液，并测定不同海参肠多肽溶液清除O₂ ^-·能力。如图11所述，海参多肽对O₂ ^-·有微弱的清除能力。当多肽浓度低于40mg/mL时，不显示对O₂ ^-·的清除能力。当多肽浓度为90mg/mL时，O₂ ^-·清除率达到16.5%。苏永昌等报道采用AS.1398中性蛋白酶酶解海参后经超滤和冷冻干燥后制得的海参多肽在50mg/mL浓度时对O2-·的清除率约为75%。

以上结果表明，采用筛选菌株制备的海参多肽粉具有明显的抗氧化能力，因此具有良好的应用价值。此外，虽然采用超滤操作可去除大分子量的多肽或蛋白，进而提升抗氧化能力，但是超滤去除的多肽或蛋白具有较高的营养价值，因此，制备的海参多肽不需要超滤操作。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种产碱性蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株为Thalassobacillussp.，其保藏编号为CGMCC No.8366。

2.权利要求1所述的菌株在发酵生产海参多肽中的应用。

3.一种发酵生产海参多肽的方法，其特征在于，所述的方法是将海参加工下脚料绞碎后与水按质量比1：5混合后配制成发酵培养基，将发酵培养基在121℃灭菌15分钟，按8％接种量接种权利要求1所述的菌株，在180r/min、30℃下发酵36小时，发酵液经离心过滤后，得上清液为海参多肽溶液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基中还加入了金属离子Fe³⁺，加入的浓度为0.01％。