JP2019054786A - 細菌発酵羽毛粉末を調製するためのバチルス・サブティリス株及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、加水分解羽毛粉末にバチルス・サブティリスを１日間添加し、ペプシンによる羽毛粉末の消化率を高めることによって、加水分解羽毛粉末を改善することである。別の目的は、プロテアーゼ及びケラチナーゼを含むバチルス・サブティリス株を提供することであり、これを動物飼料添加物に使用し、栄養価を高めることができる。【解決手段】バチルス・サブティリス５３１−７株を堆肥場から単離し、羽毛の分解性及び酵素活性試験によって比較し、商業的価値を確認した。バチルス・サブティリス５３１−７株を１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定及びｇｙｒＢ遺伝子配列決定によって整列させて、その新規性を確認した。【選択図】図１

Description

本発明は、羽毛粉末並びにケラチナーゼ及びプロテアーゼ等の活性酵素の製造方法に用いられる、堆肥場から単離されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細菌株に関する。本発明は更に、加工された発酵羽毛粉末の調製方法に関する。

羽毛の主なタンパク質は、不溶性タンパク質であるケラチンで構成されている。ケラチンは、高度に共役した不溶性ジスルフィド結合と水素結合を含み、これにより、ケラチンは加水分解酵素によって分解されにくい。しかし、ケラチナーゼは動物には不足しており、そのため、ケラチンは家畜に直接適用することができない。

先行技術では、羽毛を加水分解するのに蒸気を使用している。具体的には、図１３に示すように、湿った羽毛を用意して脱水する（Ｓ３０１）。脱水後の羽毛を精製炉に送り、蒸気を精製炉に注入し、均一に加熱攪拌する。条件は、水を蒸発させて水蒸気にするために、蒸気圧１０ｂａｒ、１８７℃に設定している。水から蒸気に置き換わると、圧力が上昇し、これが羽毛の加水分解反応を助ける。その後、羽毛を加水分解し、使用可能なタンパク質を維持するように、条件を圧力３ｂａｒ、１４５℃で５０分間に変える。羽毛を高圧下で加水分解して羽毛ペーストを形成し（Ｓ３０２）、次いで羽毛ペーストを真空乾燥させて含水率１２％未満の乾燥羽毛粉末を得る（Ｓ３０３）。乾燥した羽毛粉末を収集スロットに入れて冷却する。冷却後の乾燥羽毛粉末を振とうスクリーンに送って破片や廃棄物を濾過した後、その後の梱包及び秤量のためにメッシング機に送り、加水分解羽毛粉末を形成する（Ｓ３０４）。（非特許文献１）

しかしながら、先行技術の羽毛を加水分解する方法では、蒸気圧及び温度の制御が加水分解羽毛粉末の品質に影響を与える。過剰な加水分解は膨大な量のアミノ酸を分解し、不十分な加水分解は不完全なスルフィド結合の分解をもたらし、両方ともタンパク質の品質を悪化させる。

この先行技術は、水浴により加水分解羽毛粉末の栄養素含有量を増加させるが、リジン、メチオニン、及びトリプトファン等の必須アミノ酸の含有量が減少し、リシノアラニン及びランチオニンなどの非必須アミノ酸が増加することも確立している。温水浴で羽毛を加水分解しても、過度の加水分解は依然としてアミノ酸を分解し、タンパク質の品質に悪影響を及ぼし、得られる羽毛粉末の消化率を低下させる。

更に、異なる供給源又はバッチから製造された加水分解羽毛粉末の品質は異なる可能性がある。飼料供給業者ＦＷＵＳＯＷ ＩＮＤＵＳＴＲＹ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．からの異なる供給源又はバッチを有する８種の加水分解羽毛粉末についての分析を行った。ペプシンによる加水分解羽毛粉末の消化率は２３．５％〜９２．８％であった。粗タンパク質の含有量は７９．７％〜９３．３％であった。消化率が低いと、通常、家畜の病気を引き起こすため、ペプシンによる消化率は、供給業者によって十分に注目されていた。台湾の政府規制では、加水分解羽毛粉末製品のペプシンによる消化率が７０％又は７５％を超えるべきであると規定されている。国内又は輸入された加水分解羽毛粉末中の粗タンパク質の含有量は７９．７％〜９３．３％であるが、消化率は２３．５％〜９２．８％であり、加水分解羽毛粉末の消化率は、粗タンパク質含有量によって決定することができないことを示している。一方、加水分解羽毛粉末中のアミノ酸含有量は、添加剤によって調整することができる。従って、加水分解羽毛粉末のアミノ酸含有量は、家畜のペプシンによる消化率よりも重要ではない。

最近、魚粉の飼料価格の上昇により、廃棄羽毛から移された羽毛粉末が業界での代替品となっている。しかしながら、加水分解羽毛粉末の品質が依然として不安定であるため、蒸気プロセスによって加水分解羽毛粉末から製造された不安定な消化性を有する飼料は、動物によって消化するのが容易ではない。従って、消化の困難性を改善するために、生物分解の方法が追求されている。しかし、生物分解は時間を必要とし、また、不快な臭いを防ぐために、廃棄羽毛は直ちに処理する必要がある。

このため、先行技術は、安定した品質で迅速に調製することができ、同時に羽毛の蓄積を避けることができる羽毛粉末を提供するために改良する必要がある。

「飼料栄養雑誌」（Feed & Nutrition Magazine）ｐ．６５〜６８、許元昆（Xu Yuan-kun）、九五年（２００６）第九期

この欠点を克服するために、本発明は、前述の問題を軽減又は回避するための２つの目的を提供する。第１は、加水分解羽毛粉末にバチルス・サブティリスを１日間添加し、ペプシンによる羽毛の消化率を高めることによって、加水分解羽毛粉末の欠点を改善することである。第２は、栄養価を高めるために飼料添加物で使用されるものと同じ細菌によってプロテアーゼ及びケラチナーゼを生産することである。従って、本発明におけるバチルス・サブティリスは、商業的価値を有する。

本発明の目的を達成するために、本発明は、台湾生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に受託番号：ＢＣＲＣ９１０７９３で寄託され、中国典型培養物保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に２０１７年９月６日に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１７４９５で寄託されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）５３１−７株を提供する。

本発明は更に、バチルス・サブティリス５３１−７株由来の発酵培地を有効成分として含有する微生物製剤を提供する。

本発明は更に、飼料又は飼料添加物中におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の使用を提供する。好ましくは、飼料は、動物飼料又は魚飼料である。

本発明は更に、肥料又は肥料添加物におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の使用を提供する。肥料の有効性は、バチルス・サブティリス５３１−７株添加物によって増加する。

本発明は更に、以下の工程を含む細菌発酵羽毛粉末を調製する方法を提供する。羽毛（白肉鶏羽、黄色在来鶏羽、烏骨鶏羽）を用意し、これを切断して培地にして、その培地は、限定されるものではないが、１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖの羽毛媒体を得るために、基礎塩又は地下水（ｐＨ：７．７２、導電率：６５７μＳ／ｃｍ、塩分：３２５ｐｐｍ、全溶解固形分、ＴＤＳ：４５６ｍｇ／Ｌ）を含み；バチルス・サブティリス５３１−７株を羽毛培地に添加して、バチルス・サブティリス５３１−７株の最終濃度が１０^５〜１０^７コロニー生成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）になるまで、２０℃〜４０℃の温度で３〜８日間インキュベートする。羽毛培地を滅菌後に乾燥させた後、ホモジナイザーで破砕し、ボールミルで０．１５ｍｍ未満に粉砕して細菌発酵羽毛粉末を得る。基礎塩から地下水に変化した本発明の培地は、同様の効果を達成することができる。

好ましくは、羽毛培地の重量／容量比は、１％ｗ／ｖ〜６．５％ｗ／ｖ、より好ましくは５％ｗ／ｖ〜６．５％ｗ／ｖの範囲である。好ましくは、羽毛培地中の羽毛は、限定されるものではないが、ニワトリ羽毛を含み、より好ましくは、ニワトリ羽毛は白肉鶏の羽毛を含むが、これに限定されない。

好ましくは、羽毛培地に添加されたバチルス・サブティリス５３１−７株を用いて、羽毛培地中のバチルス・サブティリス５３１−７株を１〜８日間、より好ましくは６日間インキュベートする。

好ましくは、羽毛培地中、３７℃でバチルス・サブティリス５３１−７株をインキュベートする。

本発明は、上記の方法により調製された細菌発酵羽毛粉末を提供する。ペプシンによる消化率は８６．３％、粗タンパク質含有量は９４．７％、総アミノ酸含有量は９９．１％である。加水分解されたアミノ酸含有量（アミノ酸量を粗タンパク質量で割ったもの、ａ．ａｍｇ／ＣＰｍｇ％）の値は、メチオニン０．３％、リシン１．６％、ヒスチジン０．５％、トリプトファン０．５％、スレオニン４．６％、バリン：６．３％、シスチン６．７％、イソロイシン４．４％、ロイシン８．１％、チロシン３．３％、フェニルアラニン５．４％、アルギニン６．４％、アラニン４．５％、アスパラギン酸６．６％、グルタミン酸１０．４％、グリシン７．６％、プロリン１１．６％、セリン１０．５％を含む。

本発明は更に、飼料又は飼料添加物における、上記のような細菌発酵羽毛粉末の使用を提供する。

本発明は更に、肥料又は肥料添加物における、上記のような細菌発酵羽毛粉末の使用を提供する。

本発明は更に、加水分解羽毛粉末を調製し、この加水分解羽毛粉末を培地に入れ、培地は、これに限定されるものではないが、１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖの加水分解羽毛粉末培地を得るために基礎塩又は地下水を含有する工程と、バチルス・サブティリス５３１−７株を加水分解羽毛粉末培地に添加し、バチルス・サブティリス５３１−７株を、最終濃度が１０^５〜１０^７ＣＦＵ／ｍＬになるまで１〜３日間インキュベートする工程と、滅菌後に加水分解羽毛粉末培地を乾燥させ、次いで滅菌加水分解羽毛粉末培地を微粉砕して加工発酵羽毛粉末を得る工程と、を含む、加工発酵羽毛粉末を調製する方法を提供する。基礎塩から地下水に変化した本発明の培地も同様の効果を得ることができる。

好ましくは、加水分解羽毛粉末は、市販の加水分解羽毛粉末を含むが、これに限定されない。

「市販の加水分解羽毛粉末」とは、本発明のバチルス・サブティリス５３１−７株で処理されなかったが、高圧加水分解により製造された羽毛粉末をいう。

好ましくは、バチルス・サブティリス５３１−７株を加水分解羽毛粉末培地に添加して７２時間インキュベートする。７２時間インキュベートした後、低レベル加水分解羽毛粉末の消化率は２３．５％から８３．４％に改善された。２４時間インキュベートした後、低レベル加水分解羽毛粉末の消化率は６２．８％に改善した。７２時間インキュベートした後、高レベル加水分解羽毛粉末の消化率は７８．９％から８４．９％に改善された。

本発明は更に、上記の方法によって調製された加工発酵羽毛粉末を提供する。

本発明は更に、原材料を調製し、原材料を培地に置き、培地は、限定されるものではないが、１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の原材料培地を得るために、基礎塩又は地下水を含む工程と；原材料培地にバチルス・サブティリス５３１−７株を添加し、バチルス・サブティリス５３１−７株を最終濃度が１０^５〜１０^７ＣＦＵ／ｍＬになるまでインキュベートする工程と；バチルス・サブティリス５３１−７株を含む原材料培地を乾燥させ、酵素を得る工程と、を含む、酵素を調製する方法を提供する。

好ましくは、調製され、培地に添加された原材料は羽毛であり、原材料培地は羽毛培地であり、酵素はケラチナーゼを含む。

好ましくは、調製され、培地に添加された原材料は大豆であり、原材料培地は大豆培地であり、酵素はカゼイナーゼを含む。

本発明の利点は以下の通りである。

本発明のバチルス・サブティリス５３１−７株は、ケラチナーゼ及びカゼイナーゼを主に含むプロテアーゼを含み、細菌によって産生されたプロテアーゼを用いて肥料や動物飼料を製造することができる。更に、細菌によって分解された羽毛粉末の品質は安定であり、例えば表４に示すように、一貫したペプシン消化性を有する。この特性に基づいて、本発明の細菌は、廃棄羽毛の処理、動物飼料添加物、又は肥料に適用することができる。

本発明は、細菌発酵羽毛粉末を調製することによって酵素を回収するために使用することができる。細菌を基礎塩培地（２％の羽毛を含む）に添加し、３７℃で６日間インキュベートした。濾過により得られた粗酵素を滅菌せずにケラチナーゼを得た。プロテアーゼを回収する方法は以下の通りである。細菌を基礎塩培地（１％大豆粉末を含む）に添加し、３７℃で２日間インキュベートする。濾過により得られた粗酵素は滅菌せずにプロテアーゼを得る。本発明で得られるプロテアーゼ（主にケラチナーゼ及びカゼイナーゼ）は、動物飼料添加物において栄養価を得るために使用することができ、又は肥料に使用することができる。

本発明で製造された加工発酵羽毛粉末は、加水分解羽毛粉末に細菌を添加して、羽毛粉末の品質（即ち、ペプシンの消化率、粗蛋白質の含有量）を高め、市販の加水分解羽毛粉末の弱点を克服し、加工発酵羽毛粉末を、動物飼料添加物、又は肥料として、もっと栄養的に価値があるように、消化可能にすることによって得ることができる。

本発明の他の目的、利点、及び新規な特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

羽毛の分解レベルを示す写真である。 本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の顕微鏡検査のグラム染色図である。 本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の顕微鏡検査の内生胞子染色図である。 本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の電子顕微鏡写真の図である。 ２４時間のインキュベーションにおける本発明のバチルス・サブティリス５３１−７株のコロニー形成の図である。 ７２時間のインキュベーションにおける本発明のバチルス・サブティリス５３１−７株のコロニー形成の図である。 時間点での、本発明のバチルス・サブティリス５３１−７株のＯＤ_６００値とＣＦＵ値の細菌インキュベーションを示す線図である。 本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の系統樹であり、１６Ｓ ｒＤＮＡにより示された８つの細菌と比較したものである。 本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株の系統樹であり、ｇｙｒＢ遺伝子により示された８つの細菌と比較したものである。 本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株のタンパク質電気泳動図である。 細菌発酵羽毛粉末の製造フロー図であり、Ｓ１０１〜Ｓ１０３はそれぞれ１０１〜１０３の工程を表す。 加工発酵羽毛粉末の調製フローチャートであり、Ｓ２０１〜Ｓ２０３はそれぞれ２０１〜２０３の工程を表す。 従来技術の加水分解羽毛粉末の調製フローチャートであり、Ｓ３０１〜Ｓ３０３はそれぞれ３０１〜３０３の工程を表す。

調製例１ 細菌株の供給源及び単離
新規の羽毛を分解する細菌バチルス・サブティリス５３１−７株を堆肥場から単離し、羽毛の分解効率を試験し、台湾生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ９１０７９３）及び中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１７４９５）の両方に寄託した。寄託日はそれぞれ、２０１７年８月９日及び２０１７年９月６日である。細菌単離の方法は、３段階の工程で処理した。

工程１：カゼイン分解効力
１ｇの堆肥を９ｍＬの滅菌水に添加し、８０℃の水浴中で２０分間インキュベートし、１００倍又は１０００倍に希釈し、１％カゼイン（０．７ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１．４ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４，１０ｇ／Ｌのカゼイン、１５ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ７．２）を含む基礎塩培地に接種した。透明なゾーンを有する単一のコロニーを選択し、ＬＡブロス（アンピシリンを含む溶原培地）で２０時間活性化し、次に活性化された単一コロニーをオートクレーブした爪楊枝で浸漬してカゼイン培地に点着し、３７℃で２４時間インキュベートした。透明ゾーンを撮影し、透明ゾーンの直径を測定した。他のものよりも大きな透明ゾーンを有する単一のコロニーを、工程２に選択した。

工程２：目視観察による単一羽毛の分解効力
羽毛−リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）は、スクリューキャップ付きチューブ内に全オートクレーブされたニワトリ羽毛（約０．０５ｇ）を含む１０ｍＬのＰＢＳを添加することによって調製した。工程１で選択した細菌をＬＡブロス中で活性化し、次いでＬＢブロス中で２０時間インキュベートした後、細菌濃度をＯＤ_６００＝０．３（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）に調整し、１００μｌの調整細菌（ＯＤ_６００＝０．３）をスクリューキャップ付きチューブに入れ、３７℃で６日間インキュベートし、羽毛の完全性を観察した。細菌を含まないスクリューキャップ付きチューブ群をブランクとした。分解有効性レベル３及び４の細菌を選択し、次の工程で４ｇの羽毛の細菌分解効力試験を実施した。この工程での分解効力レベルは、図１のように５つのレベルに分類された。レベル０：明らかな羽毛の分解はない。レベル１：羽毛の一部の分解、少しの懸濁した羽毛の破片。レベル２：明らかな羽毛の分解、多くの沈降した羽毛の破片、レベル３：網目状の羽毛、羽毛の骨幹のみが残っている、レベル４：完全な羽毛の分解、破片の外観なし。

工程３：４ｇの羽毛の細菌分解効力（％）
２００ｍＬの基礎塩培地（０．７ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１．４ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、ｐＨ７．２）及び４ｇの白鶏羽を用意し、５００ｍＬフラスコ中でオートクレーブし、工程２で選択された細菌を活性化し、ＯＤ_６００を０．３（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）としてＬＢブロス中で２４時間インキュベートし、５００ｍＬフラスコ中の２％ｖ／ｖの細菌羽毛培地を得た。５００ｍＬフラスコを３７℃、１５０ｒｐｍで６日間インキュベートし、濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＮＯ．１）で濾過し、採取物は粗酵素であった。濾紙上に残った残渣を６５℃でオーブンにより乾燥させ、秤量して分解率（％）を算出した。８０％を超える分解率を有する細菌を選択して羽毛粉末の生産を行い、２種の粗酵素（ケラチナーゼ及びプロテアーゼ）の活性実験を行い、最終的に商業価値のある羽毛分解菌株及び酵素を選択した。

調製例２ 細菌生理学的特性試験
１．細菌株の基本特性
図２に示すバチルス・サブティリス５３１−７株の外見はグラム陽性菌であり、細菌の単一の大きさは約０．４μｍ〜０．６μｍ及び１．０μｍ〜１．６μｍであり、半円の終点を有する短鎖の形状である。図３に示すように、胞子は細菌の頂部に形成され、約０．６μｍ〜０．７μｍ及び１．０μｍ〜１．６μｍの大きさの卵形または円形であった。図４に示すように、電子顕微鏡により、バチルス・サブティリス５３１−７株の図中でプレ胞子が示された。図５に示すように、予備培養段階（２４時間）で、ＬＡブロス中で培養されたバチルス・サブティリス５３１−７コロニーの形状及び色は円形及び白色であり、コロニーは外観が隆起しているか、又は凸状であり、本発明において、縁部では粗いか、縁部では平滑である。図６に示すように、細菌コロニーの外観は３日目〜４日目には乾いて粗かった。

２．ｐＨ値の評価
３日間または６日間インキュベートした培地を濾過し、羽毛分解濾液のｐＨ値を評価した。結果は、羽毛分解濾液のｐＨ値が、３日目でｐＨ７．６〜７．７であり、６日目でｐＨ８．５〜８．７であることを示した。

３．細菌光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値及びＣＦＵを測定することによる増殖曲線の評価
細菌の単一コロニーを接種ループで６ｍＬ ＬＢブロスを含む１５ｍＬ遠心チューブに浸漬し、１５ｍＬ遠心チューブを３７℃で２４時間インキュベート（１５０ｒｐｍ）して細菌培地を得た。細菌培地濃度（ＯＤ_６００）を０．０６未満に調整した。１ｍＬの調整された細菌培地を５０ｍＬ ＬＢブロス（ＯＤ_６００＜０．０１）に添加し、３７℃で振とうインキュベート（１５０ｒｐｍ）した。０、１、２、４、６、８、２４、２６、２８、３０、及び３２時間の時点（増殖曲線に従って調整された後の時点）でＯＤ値及び細菌数を測定した。各時点で、２ｍＬの細菌培地を用いてＯＤ値（ＬＢ培地で固定した値）を測定し、０．１ｍＬの細菌培地を使用して細菌数を計算した（図７で示すように、３７℃で２４時間）。細菌培地は２〜６時間で対数増殖期を経て、６時間後に静止期に入った。

調製例３ 菌株の同定
１．ＢＩＯＬＯＧ株同定及び炭素利用測定の方法
ＢＩＯＬＯＧデータベースにより、本発明の細菌株を同定した。菌株の２３の化学感受性試験による７１の炭素源及びＯＤ_５９５値をＢＩＯＬＯＧデータベースに整列させ、類似性が０．５０を超えた場合、その菌株と比較した相対性識別ＩＤを得た。結果を「ＭｉｃｒｏＳｔａｔｉｏｎ」（商標）ソフトウェア（ＢＩＯＬＯＧ）によって解析し、この株の表現型は、バチルス・サブティリスと類似しており、類似性は０．７７であり、可能性は０．７７であった。よって、この株をバチルス・サブティリス５３１−７と命名した。

バチルス・サブティリス５３１−７株によって使用される炭素源の結果は、以下の通りであった。α−Ｄ−グルコース、デキストリン、Ｄ−マンノース、Ｄ−マルトース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−セロブロース、ゲンチオブロース、ショ糖、Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−グルコン酸、Ｌ−乳酸、クエン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニト、グリセロール、ミオ−イノシトール、Ｌ−ガラクトン酸ラクトン、Ｄ−サルシン、β−メチル−Ｄ−グルコシド、及びＤ−サッカリン酸を含む、２３種類の炭素源が存在した。

バチルス・サブティリス５３１−７株の化学感受性試験の結果は、１％、４％、及び８％でのＮａＣｌ塩耐性、ｐＨ５及び６での酸及びアルカリ耐性、並びに１％乳酸ナトリウム、アズトレオナム、塩化リチウム、酪酸ナトリウム、及びテルル酸カリウムに対する化学感受性を含む。バチルス・サブティリス５３１−７株の炭素源使用及び化学感受性の結果は、増分インキュベーション中に考慮することができる。

２．ＡＰＩ−５０ＣＨＢ株同定及び炭素利用測定の方法
ＡＰＩ−５０ＣＨＢキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｉｎｃ．）を用いて、本発明におけるバチルス・サブティリス５３１−７株及び炭水化物利用率を測定した。この株の炭水化物の有用性を測定するために、ＡＰＩ ５０ ＣＨストリップの穴に４９の異なる炭水化物を存在させる。接種後、炭水化物の有用性に応じて各穴のｐＨ値を変化させ、ｐＨ値に起因する色の変化によって菌株の種類を判定することができる。結果は、ミズーリ州ヘーゼルウッド（Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ、ＭＯ）によって提供されたマニュアルに記載された方法によって分析することができる。その結果、この株は、ＡＰＩ−５０ＣＨＢ（９９．９％）によりバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）として同定された。しかし、ＡＰＩ−５０ＣＨＢは、主に異なる炭水化物の有用性を分析するために使用され、従来の株同定の精度はＤＮＡ配列決定よりも悪い。

グリセロール、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−リビトール、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、ガラクチトール、イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、アーモンド、アルブチン、エスクリン／クエン酸第二鉄、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−ショ糖、Ｄ−トレハロース、シナントリン、Ｄ−ゴシポーズ、デンプン、グリコーゲン、デキストリノース、Ｄ−タラノース、Ｄ−タガトース、及びグルコン酸カリウムを含め、ＡＰＩ−５０ＣＨＢ炭素実用試験において、５３１−７株によって使用される４９種類の炭素源のうち、３４種が存在した。

３．１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）株同定の方法
細菌株の全ＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーによるＰＣＲを行い、順方向プライマーは、配列番号１であり、逆方向プライマーは配列番号２であり、１４８１塩基対（ｂｐ）配列を生成した。増幅されたＤＮＡ産物を配列決定し、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ及びＧｅｎＢａｎｋによって整列させて、株の型を同定した。結果は、菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡが増幅でき、バチルス・サブティリス（１５０４ｂｐ、配列番号３、９９％の類似性）であることを示した。

４．ｇｙｒＢ遺伝子株同定の方法
細菌株の全ＤＮＡを抽出し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に特異的な順方向プライマー配列番号４と逆方向プライマー配列番号５を含むｇｙｒＢプライマーによってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ産物をそのヌクレオチドによって整列させ、配列が長さ１．３ｋｂのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属することを確認した。配列決定の結果は、バチルス・サブティリス（１２５９ｂｐ、配列番号６及び類似性９９％）であった。

菌株の先祖関係は、１６Ｓ ｒＤＮＡ（図８）及びｇｙｒＢ遺伝子によって整列された。この株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたバチルス・サブティリス５３１−７株及び他の８つのバチルス株を含む。系統樹は近隣結合（ＮＪ）法によって分析された。ブランチ上の値はブートストラップ値である。

実施例１ 酵素活性試験

１．羽毛培地から得られた酵素からのケラチナーゼ酵素活性の分析
調製例３で得られたバチルス・サブティリス５３１−７株の細菌培地をＯＤ_６００＝０．３（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した後、調整した細菌培地４ｍＬを羽毛培地２％（２００ｍＬの基礎塩培地に羽毛４ｇを添加）２００ｍＬに添加し、２×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの細菌濃度を有する第１の全培地を形成し、第１の全培地を３７℃でインキュベートし、１５０ｒｐｍで３日間振とうした。次いで、第１の全培地を氷上で冷却し、ブフナー漏斗（ＡＤＶＡＮＴＥＣ濾紙Ｎｏ．１）で濾過して第１の粗酵素を得た。比活性（Ｕ／ｍｇ）に変換されたケラチナーゼ酵素活性（Ｕ／ｍＬ）及びタンパク質濃度を分析するために、１ｍＬの第１の粗酵素（合計約１８０ｍＬ）を直ちに採取した。主要な１−ケラチナーゼを分析した羽毛培地中のバチルス・サブティリス５３１−７株により産生される種々のプロテアーゼが存在した。残りの第１の粗酵素を滅菌し、凍結乾燥し、凍結乾燥した第１の粗酵素を形成した。滅菌の方法は濾過であった。４℃で８５００×ｇで遠心分離した後、上清（約１〜２ｍＬ）を氷上で０．４５μｍフィルター膜（混合セルロースエステル、「ＡＤＶＡＮＴＥＣ」（登録商標））で吸引濾過した。

バチルス・サブティリス５３１−７株により産生された第１の粗酵素と市販品のケラチナーゼ比活性の比較

表１より、新鮮な第１の粗酵素のケラチナーゼ比活性は凍結乾燥濃度により増加し、ケラチナーゼ比活性は、新鮮な第１の粗酵素及び凍結乾燥した第１の粗酵素の両方において、市販製品よりも３〜５倍高かった。

２．大豆培地から得られた酵素からのカゼイン酵素活性の解析
調製例３から得られたバチルス・サブティリス５３１−７株を有する細菌培地をＯＤ_６００＝０．３（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した。次いで、４ｍＬの細菌培地を２００ｍＬの１％大豆培地（２ｇの大豆粉末を２００ｍＬの基礎塩培地に添加した）に添加して、２×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの細菌濃度を有する第２の全培地を形成し、第２の全培地を３７℃でインキュベートし、１５０ｒｐｍで２日間振とうした。次に、第２の全培地を氷上で冷却し、濾過膜（ＡＤＶＡＮＴＥＣ濾紙Ｎｏ．１）で濾過して、第２の粗酵素（約１８０ｍＬ）を得た。カゼイン酵素活性（Ｕ／ｍＬ）及び比活性（Ｕ／ｍｇ）に変換されたタンパク質濃度を分析するために、第２の粗酵素を採取した。羽毛培地には、バチルス・サブティリス５３１−７株によって産生される様々な種類のプロテアーゼが存在し、主要な１つのカゼインを分析した。残りの第２の粗酵素を滅菌し、凍結乾燥し、凍結乾燥した第２の粗酵素を作成した。

バチルス・サブティリス５３１−７株により産生された第２の粗酵素と市販品のカゼイン比活性の比較

表２より、新鮮な第２の粗酵素のカゼイン比活性は凍結乾燥濃度の影響を受けず、カゼイン比活性は、新鮮な第２の粗酵素及び凍結乾燥した第２の粗酵素の両方において、市販製品よりも約２倍高かった。

３．粗酵素濃縮及びタンパク質分子量分析
実験は３つのグループに分けて行われた。
粗酵素１１５９４：菌としてバチルス・リケニフォルミス（ＢＣＲＣ１１５９４）を用い、実施例１−１と同様の方法で粗酵素を産生した。
粗酵素５３１−７：第１の粗酵素は実施例１−１のものであった。
沈殿酵素５３１−７：新鮮で希釈されていない第１の粗酵素５０ｍＬを実施例１−１から採取し、ここで細菌培地は羽毛培地の２％又は１０％のいずれかを含み、氷上で冷却した。固体硫酸アンモニウムを４０％〜８０％コンフルエンス（約１０ｍＬ）までゆっくりと第１の粗酵素に添加し、２０分間放置した後、９０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除去した。ペレットを１０ｍＬの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し、沈殿酵素５３１−７を得た。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上記３つのグループに電気泳動を行い、ゲルをクマシーブルーで染色した。

図１０に示すように、ライン１及びライン８は、プロテインラダー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ、＃２６６１６ＬＣＳ）であり、ライン２及びライン４は、わずかなバンドを有する０．２倍希釈の粗酵素５３１−７（２％羽毛培地から）であり、ライン３及びライン５は、４つの有意なバンドを有する５倍希釈の沈殿酵素５３１−７（２％羽毛培地から）であり、そのうち１つのバンドは５５〜７０ｋＤａであり、１つのバンドは５５〜４０ｋＤａであり、２つのバンドは３５〜２５ｋＤａであり、ライン６は、７つの有意なバンドを有する５倍希釈の沈殿酵素５３１−７（１０％羽毛培地から）であり、そのうち１つのバンドは１３０ｋＤａであり、１つのバンドは５５〜７０ｋＤａであり、１つのバンドは３５ｋＤａであり、２つのバンドは３５〜２５ｋＤａであり、２つのバンドは１５〜２５ｋＤａであり、ライン７は、５つの有意なバンドを有する０．２倍希釈の粗酵素１１５９４であり、そのうち１つのバンドは５５〜４０ｋＤａであり、１つのバンドは４０ｋＤａであり、１つのバンドは３５〜２５ｋＤａであり、１つのバンドは１５ｋＤａであり、１つのバンドは１０ｋＤａであった。殆どの研究は、ケラチナーゼの分子量が３０〜４０ｋＤａであることを示しており、従って、バチルス・サブティリス５３１−７株のケラチナーゼの分子量は２５〜３５ｋＤａであり、塩基性タンパク質（ｐＨ８．９）である。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、羽毛分解生成物中に多量の低分子量ペプチド（＜１３ｋＤａ）を示した。

実施例２ 細菌発酵羽毛粉末の調製

１．図１１に示すように、洗浄し、滅菌し、乾燥させたニワトリ羽毛２５ｇを切断し、５００ｍＬの基礎塩培地に添加して、最終濃度５％〜６．５％ｗ／ｖの羽毛培地を得た（工程１０１）。調製例３で得られたバチルス・サブティリス５３１−７株の細菌培地をＯＤ_６００＝０．３（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）となるように調整した後、調整した細菌培地５ｍＬを５％羽毛培地５００ｍＬに添加し、第３の全培地の細菌濃度を１０^６ＣＦＵ／ｍＬとし、第３の全培地を３７℃でインキュベートし、１５０ｒｐｍで１〜６日間振とうし（１日後に分解開始、３日後に分解が６０％）（工程１０２）、１２１℃、１５ｐｓｉ／平方インチで１５分間オートクレーブ処理し、８０℃で４８時間乾燥し、ボールミルで適切な大きさに粉砕して、細菌発酵羽毛粉末（工程１０３）を得た。好ましくは、適切なサイズは０．１５ｍｍ未満である。品質分析を表３に示す。

細菌発酵羽毛粉末の消化率、粗タンパク質量、及び粗アミノ酸量の分析

市販の羽毛粉末と比較した本発明の細菌によって産生された細菌発酵羽毛粉末の品質

細菌発酵羽毛粉末（表３）の品質は、市販の羽毛粉末（表４）よりも良好であり、市販の羽毛粉末のＳＤ値は、表４の細菌発酵羽毛粉末よりも大きく、各バッチにおける商業的な羽毛粉末の不安定な品質を示す。最も重要なのは、細菌発酵羽毛粉末のペプシン消化率が６５．６％から８６．３％に向上し、粗タンパク質量も増加し、アミノ酸量は市販の羽毛粉末よりも高かった。

２．最後の羽毛培地を１５０ｒｐｍで振とうし、３７℃で６日間インキュベートした後に得られた分解培地を静置し、上層と下層の２層に分離し、上層及び下層を濾過した。分解培地、上層及び下層は、有機肥料の添加物に使用することができるアミノ酸を多量に含んでいた（表５）。

２％又は１０％の羽毛培地のインキュベーションから得られた分解培地中のアミノ酸の分析

実施例３ 発酵羽毛加工粉末の調製

図１２に示すように、市販の加水分解羽毛粉末（Ｌ５、Ｌ６、Ｍ３、台湾ＦＷＵＳＯＷ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＣＯ．， ＬＴＤ．製）１０ｇを基礎塩培地２００ｍＬに添加し、５％の加水分解羽毛粉末培地を得た（工程２０１）。調製例３で得られたバチルス・サブティリス５３１−７株の細菌培地をＯＤ_６００＝０．３（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した後、調整した細菌培地１０ｍＬを５％加水分解羽毛粉末培地２００ｍＬに添加し、細菌濃度が５×１０^６ＣＦＵ／ｍＬである第４の全培地を形成し、第４の全培地を３７℃でインキュベートし、１５０ｒｐｍで１日間振とうした（工程２０２）。次いで、第４の全培地を１５分間オートクレーブし、８０℃で少なくとも４８時間乾燥させた。乾燥した培地を粉砕して、加工発酵羽毛粉末を得た（工程２０３）。

市販の加水分解羽毛粉末のペプシン消化性を、加工発酵羽毛粉末と比較した。ペプシン分解速度を分析する方法は以下の通りであった：０．０７５ＮのＨＣｌ中で、４５℃で予熱した５０ｍＬの新鮮な調製０．２％ペプシン（活性１：１００００）に０．３ｇの羽毛粉末を添加した。混合物を振とうし、１５０ｒｐｍ及び４５℃で１６時間インキュベートした。その後、濾紙（Ｗｈａｔｍｅｎ＃５４１）を用いて培地を濾過した。残った不溶性破片を乾燥させ、８０℃で秤量し、タンパク質濃度及びペプシン消化率により分析した。

表６に示すように、市販の加水分解羽毛粉末Ｌ５、Ｌ６、及びＭ３におけるペプシンの消化率は、それぞれ２３．５％、２９．２％、及び６８．３％であった。加工後、Ｌ５、Ｌ６、及びＭ３の消化率は、それぞれ６２．８％、６７．４％、及び７９．２％であり、それぞれ２．３倍、２．７倍、及び１．２倍上昇した。

市販の加水分解羽毛粉末及び加工発酵羽毛粉末のペプシンの消化率

表７に示すように、加工発酵羽毛粉末中の粗タンパク質量は、市販の加水分解羽毛粉末と比較して約３．５％〜１３．８％増加した。

市販の加水分解羽毛粉末及び加工発酵羽毛粉末の効果

本発明の多くの特徴及び利点が、本発明の構造及び特徴の詳細と共に前述の説明に記載されているが、開示は例示に過ぎない。添付の特許請求の範囲が表現されている用語の広範な一般的な意味によって示されるように、特に、本発明の原理内の部分の形状、サイズ、及び配置の事項に関して、細部において変更を加えることができる。

Claims (15)

1. 台湾生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託された、受託番号：ＢＣＲＣ９１０７９３であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）５３１−７株。
2. 請求項１記載のバチルス・サブティリス５３１−７株由来の発酵培地を有効成分として含有する微生物製剤。
3. 飼料又は飼料添加物中における、請求項１記載のバチルス・サブティリス５３１−７株の使用。
4. 肥料又は肥料添加物中における、請求項１記載のバチルス・サブティリス５３１−７株の使用。
5. 羽毛を用意し、切断して培地にして、１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）の羽毛培地を得る工程と、
   請求項１に記載のバチルス・サブティリス５３１−７株を前記羽毛培地に添加し、最終濃度が１０^５〜１０^７コロニー形成ユニット／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍＬ）になるように、前記バチルス・サブティリス５３１−７株をインキュベートする工程と、次いで、
   バチルス・サブティリス５３１−７株を含む羽毛培地を乾燥させ、粉砕し、細菌発酵羽毛粉末を得る工程と
   を含む、細菌発酵羽毛粉末を調製する方法。
6. 前記バチルス・サブティリス５３１−７株を前記羽毛培地に添加する工程において、前記バチルス・サブティリス５３１−７株を前記羽毛培地中で１〜８日間インキュベートする、請求項５記載の方法。
7. 請求項５又は６に記載の方法により調製される、細菌発酵羽毛粉末。
8. 飼料、肥料、又はそれらの添加物における、請求項７記載の細菌発酵羽毛粉末の使用。
9. 加水分解羽毛粉末を調製して、培地に置き、１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）の加水分解羽毛培地を得る工程と、
   請求項１記載のバチルス・サブティリス５３１−７株を前記加水分解羽毛培地に添加し、最終濃度が１０^５〜１０^７ＣＦＵ／ｍＬになるように、前記バチルス・サブティリス５３１−７株をインキュベートする工程と、
   前記バチルス・サブティリス５３１−７株を含む前記加水分解羽毛培地を乾燥させ、粉砕し、加工発酵羽毛粉末を得る工程と
   を含む、加工発酵羽毛粉末を調製する方法。
10. 前記バチルス・サブティリス５３１−７株を、前記加水分解羽毛粉末培地中で２４時間〜７２時間インキュベートする、請求項９記載の方法。
11. 請求項９又は１０に記載された方法により調製される、加工発酵羽毛粉末。
12. 飼料、肥料、又はそれらの添加物における、請求項１１記載の加工発酵羽毛粉末の使用。
13. 原材料を調製して、培地に置き、１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）の原材料培地を得る工程と、
    請求項１に記載のバチルス・サブティリス５３１−７株を前記原材料培地に添加し、最終濃度が１０^５〜１０^７ＣＦＵ／ｍＬになるように、前記バチルス・サブティリス５３１−７株をインキュベートする工程と、
    前記バチルス・サブティリス５３１−７株を含む前記原材料培地を乾燥させて酵素を得る工程と
    を含む、酵素を調製する方法。
14. 前記原材料は羽毛であり、前記原材料培地は羽毛培地であり、前記酵素はケラチナーゼを含む、請求項１３記載の方法。
15. 前記原材料が大豆であり、前記原材料培地が大豆培地であり、前記酵素がカゼイナーゼを含む、請求項１３記載の方法。