CN104031862A - 一种高产γ-氨基丁酸菌株及其应用 - Google Patents
一种高产γ-氨基丁酸菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于水产品生物加工技术领域，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸菌株及其应用。菌株为肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年5月20日，保藏编号为：CGMCC No.9184。本发明利用扇贝及其加工下脚料筛选高产GABA菌株，相较于目前普遍应用的MRS培养基和GYP培养液，大大节约了生产成本，极大简化了培养基、培养液的配制过程，更适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于水产品生物加工技术领域，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸菌株及其应用。
背景技术
我国是扇贝养殖大国，资源极为丰富，从北到南的整个沿海地区都大量盛产。这些扇贝不但营养丰富，味道鲜美，而且还有很多保健功能，具有重要食用价值和经济价值。随着扇贝养殖业的快速发展，扇贝已出现供过于求和价格下跌的趋势。随着现代分离技术和生物技术的发展使人们对扇贝综合利用价值的重视程度不断提高，对于扇贝的利用已不再局限于海水养殖业，已经从广度和深度上不断拓展，研究内容涉及生态、养殖、医药、毒理、遗传和分子生物学等诸多领域。扇贝含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等营养成分，每100g扇贝柱中含蛋白质63.7g、脂肪3g、醣类15g、钙47mg、磷886mg和铁2.9mg。扇贝下脚料中的性腺、裙边等组织亦富含丰富蛋白质，可作为蛋白源利用；扇贝群边的酶解液氨基酸组成齐全，其中必需氨基酸的含量达45.74％。扇贝这些特性使其在食品开发、医疗保健、疾病防治以及化工等领域都有很好的应用和开发前景。对这些扇贝资源进行高值化开发利用，为人类提供理想的海洋食品及海洋药物，并创造出宏观的经济效益，将有助于推动我国海洋产业的迅速发展。
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutiric acid,GABA)是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。少数植物中含有这种非蛋白质氨基酸。γ-氨基丁酸也称氨酪酸，是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸，广泛存在于自然界中，是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产γ-氨基丁酸菌株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种高产γ-氨基丁酸菌株，其特征在于：菌株为肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年5月20日，保藏编号为：CGMCC9184。
一种高产γ-氨基丁酸菌株的应用，所述肠球菌属鸟肠球菌应用于制备γ-氨基丁酸(GABA)中。
一种高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，将原料稀释液涂布于固体培养基上获得菌株单菌落，菌株单菌落分别接种于扇贝培养液中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％-4％比例接种于谷氨酸扇贝培养液中，35℃-40℃，发酵培养2-14天，发酵液稀释后紫外照射处理，处理后于GABA培养基中培养即得肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)。
所述固体培养基，将原料磨成匀浆在100-110℃下烘干，得扇贝干肉粉，扇贝干肉粉中加入其质量40-60倍体积的清水，混合后每升中加入葡萄糖10-15g，无水醋酸钠1-2g，吐温-800.5-1ml，琼脂15-20g，得扇贝溶液A，再将扇贝溶液A的pH值调节至6.5-7.0，灭菌冷却凝固后得固体培养基。
所述扇贝培养液为，将原料磨成匀浆，匀浆中再添加其质量5-10倍体积的清水，混匀后每升中加入葡萄糖5-10g，得扇贝溶液B，再将扇贝溶液B的pH值调节至6.5-7.0，灭菌冷却后活化即得扇贝培养液。
所述谷氨酸扇贝培养液为，将原料磨成匀浆，匀浆中再添加其质量5-10倍体积的清水，混匀后每升中加入葡萄糖5-20g，谷氨酸钠10-20g，得扇贝溶液C，再将扇贝溶液C的pH值调节至6.0-7.0，灭菌冷却后即得谷氨酸扇贝培养液。
所述GABA培养基为，将50℃-60℃扇贝溶液A，降至室温凝固待用；再向扇贝溶液A中加入5％-10％GABA(w/v)，灭菌后待温度降至60℃-70℃时倒入上述降至室温凝固的扇贝溶液A中，冷却凝固后得GABA培养基。
所述原料稀释液为，将原料磨成匀浆，匀浆中在添加其质量5-10倍体积清水得混合液Ⅰ，混合液Ⅰ室温静置自然发酵，发酵液稀释106-107倍，待用。
所述发酵液稀释后紫外照射处理为，发酵液稀释10-6-10-7倍，以250w-320w功率紫外灯照射10-30秒，照射距离20-50cm。
所述原料为扇贝边、扇贝内脏、扇贝柱中的一种或几种的混合。
本发明所具有的优点
1.本发明利用扇贝及其加工下脚料筛选高产GABA菌株，相较于目前普遍应用的MRS培养基和GYP培养液，大大节约了生产成本，极大简化了培养基、培养液的配制过程，更适合于工业化生产。
2.本发明加工过程中采用的大量的裙边、内脏等下脚料基本未被加工利用；进而高值利用上述扇贝及其加工下脚料，提高了水产业的经济效益，同时也减少了加工废料随意丢弃所带来的环境污染问题。
3.采用本发明获得高产γ-氨基丁酸菌株的方法低能耗，低成本，无污染，可广泛应用于产GABA菌株进而提高GABA能力2-3倍。
附图说明
图1为本发明实施例提供的筛选菌株16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明实施例提供的筛选菌株系统发育树图谱。
具体实施例
下面对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
菌株为肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年5月20日，保藏编号为：CGMCC9184。
该菌株兼性厌氧。化能异养，发酵代谢；可发酵的碳水化合物范围广泛，主要产L(+)-乳酸，广泛出现于环境中，是人类和动物肠道正常菌群的一部分。同时，将菌株16S rDNA全序列分析，碱基测序后，根据系统发育树图谱确定菌株类型(参见图1和图2)。
实施例2
(1)0.1kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积的清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅰ。混合液Ⅰ室温静置7天，自然发酵，得菌种源。
(2)将菌种源液以去离子水稀释10-7倍，得稀释液Ⅰ。
(3)固体培养基：0.2kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，在100℃烘箱中烘干水分，得扇贝干肉粉。扇贝干肉粉中添加其质量40倍体积清水(w/v)，得扇贝-水混合液Ⅱ。1L混合液Ⅱ中加入葡萄糖10g，无水醋酸钠1g，吐温-800.5ml，琼脂15g，配制成扇贝溶液A，调节溶液ⅠpH值6.5。120℃条件下灭菌15分钟。取20ml扇贝溶液A，倒入50ml培养皿中，冷却凝固后得固体培养基。
(4)扇贝培养液：0.4kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，配制成扇贝溶液B，调节扇贝溶液B的pH值6.5。120℃条件下灭菌15分钟。取50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得活化菌株的扇贝培养液。
(5)谷氨酸扇贝培养液为：0.4kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量10倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，谷氨酸钠10g，配制成扇贝溶液C，调节溶液BpH值6.5。120℃条件下灭菌15分钟。取50ml扇贝溶液C，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得谷氨酸扇贝培养液。
(6)菌株分离：将0.1ml稀释液Ⅰ涂布于扇贝菌株固体培养基上，33℃培养2天，获得不同菌株单菌落。
(7)菌株活化培养：将不同菌株单菌落分别接种于50ml扇贝培养液中，33℃培养1天，得菌株种子培养液。
(8)筛选高产GABA菌株：取菌株种子培养液按1％(v/v)比例接种于谷氨酸扇贝培养液中，35℃发酵培养3天，HPLC法测定(详见：GABA含量检测方法Q/LJS0006S-2013)不同菌株发酵液中GABA含量，取产GABA最高的菌株，待用；
(9)菌株诱变：将上述获得的产GABA最高的菌株菌悬液稀释10-6-10-7倍，以250w功率紫外灯照射10秒，照射距离30cm。取0.1ml稀释液涂布于GABA培养基上，35℃培养2d，挑取在高浓度GABA处生长的菌株，活化培养后，接种于谷氨酸扇贝培养液中，以HPLC法检测诱变菌株产GABA能力，得到高产GABA诱变菌株B2c(菌株B2c为肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年5月20日，保藏编号为：CGMCC9184。)，发酵液中GABA含量为4.13g/L，GABA的生产能力约为诱变前的两倍左右。
实施例3
(1)将上述筛选高产GABA诱变菌株B2c送与宝生物工程(大连)有限公司做16S rDNA扩增及序列测定。
(2)变性：在培养基中挑取菌体于50μl TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中变性后离心取上清作为模板，再使用TaKaRa16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)，进行PCR扩增目的片段，扩增条件如下：
(3)进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。
(4)测序：以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse为引物进行DNA测序。根据基因序列及系统发育树图谱(图2)鉴定筛选菌株为鸟肠杆菌(Enterococcus.avium)。
实施例4
与实施例2不同之处在于：
(1)0.2kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量8 倍体积清水(w/v)，制成扇贝-水混合液Ⅰ。混合液Ⅰ室温静置5天，自然发酵，得菌种源。
(2)稀释菌种源液：将菌种源液以去离子水稀释10-7倍，得稀释液Ⅰ。
(3)固体培养基：0.3kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，在100℃烘箱中烘干水分，得扇贝干肉粉。扇贝干肉粉中添加其质量50倍体积清水(w/v)，得扇贝-水混合液Ⅱ。1L混合液Ⅱ中加入葡萄糖10g，无水醋酸钠1g，吐温-801ml，琼脂15g，配制成扇贝溶液A，调节溶液ⅠpH值6.8。120℃条件下灭菌20分钟。取25ml扇贝溶液A，倒入50ml培养皿中，冷却凝固后得固体培养基。
(4)扇贝培养液：0.5kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量8倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，配制成扇贝溶液B，调节扇贝溶液B的pH值6.8。120℃条件下灭菌20分钟。取50ml扇贝溶液B，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得活化菌株的扇贝培养液。
(5)谷氨酸扇贝培养液为：0.5kg新鲜扇贝肉用匀浆机研磨成匀浆，匀浆中添加其质量8倍体积清水(w/v)，制成扇贝水混合液Ⅲ。1L混合液Ⅲ中加入葡萄糖10g，谷氨酸钠15g，配制成扇贝溶液C，调节溶液BpH值6.8。120-125℃条件下灭菌20分钟。取50ml扇贝溶液C，倒入100ml锥形瓶中，冷却后得谷氨酸扇贝培养液。
(6)GABA培养基制备：60℃扇贝溶液A10ml，倒入50ml培养皿中，20°倾斜培养皿，降至室温凝固待用。另取10ml扇贝溶液A加入10％GABA(w/v)，120℃灭菌20min，待温度降至60℃时倒入之前装有扇贝固体培养基的培养皿中，冷却凝固后得GABA培养基。
(7)菌株分离：将0.2ml稀释液Ⅰ涂布于扇贝菌株固体培养基上，30℃培养2天，获得不同菌株单菌落。
(8)菌株活化培养：将不同菌株单菌落分别接种于50ml扇贝培养液中，30℃培养1天，得菌株种子培养液。
(9)筛选高产GABA菌株：取菌株种子培养液按1％(v/v)比例接种于谷氨酸扇贝培养液中，35℃发酵培养3天，HPLC法测定(详见：GABA含量检测方法Q/LJS0006S-2013)不同菌株发酵液中GABA含量，取产GABA最高的菌株，待用。
Claims (10)
1.一种高产γ-氨基丁酸菌株，其特征在于：菌株为肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年5月20日，保藏编号为：CGMCC9184。
2.一种权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸菌株的应用，其特征在于：所述肠球菌属鸟肠球菌应用于制备γ-氨基丁酸(GABA)中。
3.一种权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：将原料稀释液涂布于固体培养基上获得菌株单菌落，菌株单菌落分别接种于扇贝培养液中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％-4％比例接种于谷氨酸扇贝培养液中，35℃-40℃，发酵培养2-14天，发酵液稀释后紫外照射处理，处理后于GABA培养基中培养即得肠球菌属鸟肠球菌(Enterococcus avium)。
4.按权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述固体培养基，将原料磨成匀浆在100-110℃下烘干，得扇贝干肉粉，扇贝干肉粉中加入其质量40-60倍体积的清水，混合后每升中加入葡萄糖10-15g，无水醋酸钠1-2g，吐温-800.5-1ml，琼脂15-20g，得扇贝溶液A，再将扇贝溶液A的pH值调节至6.5-7.0，灭菌冷却凝固后得固体培养基。
5.按权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述扇贝培养液为，将原料磨成匀浆，匀浆中再添加其质量5-10倍体积的清水，混匀后每升中加入葡萄糖5-10g，得扇贝溶液B，再将扇贝溶液B的pH值调节至6.5-7.0，灭菌冷却后活化即得扇贝培养液。
6.按权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述谷氨酸扇贝培养液为，将原料磨成匀浆，匀浆中再添加其质量5-10倍体积的清水，混匀后每升中加入葡萄糖5-20g，谷氨酸钠10-20g，得扇贝溶液C，再将扇贝溶液C的pH值调节至6.0-7.0，灭菌冷却后即得谷氨酸扇贝培养液。
7.按权利要求4所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述GABA培养基为，将50℃-60℃扇贝溶液A，降至室温凝固待用；再向扇贝溶液A中加入5％-10％GABA(w/v)，灭菌后待温度降至60℃-70℃时倒入上述降至室温凝固的扇贝溶液A中，冷却凝固后得GABA培养基。
8.按权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述原料稀释液为，将原料磨成匀浆，匀浆中在添加其质量5-10倍体积清水得混合液Ⅰ，混合液Ⅰ室温静置自然发酵，发酵液稀释106-107倍，待用。
9.按权利要求3或7所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述发酵液稀释后紫外照射处理为，发酵液稀释10-6-10-7倍，以250w-320w功率紫外灯照射10-30秒，照射距离20-50cm。
10.按权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸菌株的筛选方法，其特征在于：所述原料为扇贝边、扇贝内脏、扇贝柱中的一种或几种的混合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140910 |