CN112501078B - 一株人源性产生γ-氨基丁酸的鸟肠球菌及其应用 - Google Patents
一株人源性产生γ-氨基丁酸的鸟肠球菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株人源性产生γ‑氨基丁酸(GABA)的鸟肠球菌，该菌株命名为鸟肠球菌(Enterococcusavium)MRS4‑2，菌株已于2020年11月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.20990。本发明还公开了所述鸟肠球菌在利用添加谷氨酸或谷氨酸盐的培养基或者利用添加大豆粉酶解液的MRS培养基生产γ‑氨基丁酸中的应用。实验显示本发明所述鸟肠球菌产生的GABA对肠道菌群具有调整作用，预示着其在维护肠道菌群平衡、调节机体健康等方面具有益生作用，同时也证实本发明的鸟肠球菌在开发肠道健康微生态产品、益生发酵制品中具有应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸟肠球菌及其应用，尤其涉及一株分离自健康人粪便的人源性产生γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)的鸟肠球菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，广泛存在于动植物体内，充当一种抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有降血压、降血脂、抗氧化、抗炎症、抗焦虑、利尿和改善睡眠等生理功能。随着研究的深入，GABA已作为一种新型生物活性因子应用于食品、医药和饲料工业，现已被批准为新资源食品(卫生部2009年第12号公告)。很多微生物包括霉菌、酵母菌、芽孢杆菌、大肠杆菌和乳酸菌等均可通过编码的谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸为GABA。鉴于乳酸菌自身的食品安全性，以乳酸菌为细胞工厂生产GABA报道最多。乳酸菌又是肠道正常菌群，具有调节肠道菌群平衡，提高机体免疫力等诸多益生功能。近期研究发现，肠道乳酸菌产生的GABA还能通过肠-脑轴参与调节神经性疾病，预示着产生GABA的肠道乳酸菌对肠道菌群平衡以及机体健康具有重要作用。
鸟肠球菌(Enterococcusavium)是肠球菌属一种，在肠道内大量存在，但是其对机体的生理功能报道较少。经检索，有关分离获得人源性产生γ-氨基丁酸(GABA)的鸟肠球菌及利用其在维护肠道菌群平衡、调节机体健康等方面的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决问题是提供一株分离自健康人粪便的人源性产生γ-氨基丁酸(GABA)的鸟肠球菌及其应用。
本发明所述人源性产生γ-氨基丁酸(GABA)的鸟肠球菌，其特征在于：该菌株命名为鸟肠球菌(Enterococcusavium)MRS4-2，菌株已于2020年11月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC No.20990。
上述鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990分离自一名健康成年女性的粪便样品，实验验证是一株能够产生GABA的鸟肠球菌，具有鸟肠球菌的典型特征：革兰氏阳性，兼性厌氧，触酶阴性，硝酸还原阴性，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐，乳白色；细胞呈椭球状，单个或成对存在，1.0μm×1.0-2.0μm；能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、纤维二糖，不利用棉子糖。其必须生长因子包括烟酸、叶酸、泛酸和核黄素。
上述鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990生长温度为25-42℃，最适生长温度为37℃。
上述鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990在MRS培养基中生长，静置培养12小时后，菌体密度达到2.23±0.05，pH值为4.21。
上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂15.0g，115℃灭菌30分钟。
本发明所述的鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990在利用添加谷氨酸或谷氨酸盐的培养基生产γ-氨基丁酸中的应用。
上述的应用中，所述生产γ-氨基丁酸的方法是：
将体积比2％过夜培养的鸟肠球菌转接到含有谷氨酸的MRS培养基中，该培养基命名为GMRS培养基，在37±2℃静置培养120±5小时；发酵产物经6000g离心5分钟后，收集上清液即得到含有γ-氨基丁酸的发酵液；
将含有γ-氨基丁酸(GABA)的发酵液经过0.22μm无菌滤器过滤除菌后，测定其GABA含量为1.851±0.205g/L。
上述GMRS培养基的配方是：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，10.0g谷氨酸钠，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30分钟。
本发明所述的鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990在利用添加大豆粉酶解液的MRS培养基生产γ-氨基丁酸中的应用。
上述的应用中，所述生产γ-氨基丁酸的方法是：
将体积比2％过夜培养的鸟肠球菌转接到含有体积比为5％大豆粉酶解液的MRS培养基中，37±2℃静置培养72±5小时；发酵产物经6000g离心5分钟后，收集上清液即得到含有γ-氨基丁酸的发酵液；
将含有γ-氨基丁酸(GABA)的发酵液经过0.22μm无菌滤器过滤除菌后，测定滤液中GABA含量为0.134±0.015g/L。
上述MRS培养基的配方是：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟；
上述大豆粉酶解液的制备方法：将5克大豆粉溶于10毫升0.05％的NaCl溶液中，加入胃蛋白酶至终浓度0.3％，利用5M HCl调节pH至2.5，在37℃下酶解1.5h，再加入胰蛋白酶和胆盐至终浓度0.1％，使用10M NaOH调节pH至8.0，酶解12h。
本发明从健康人粪便中分离到一株产生GABA的肠球菌MRS4-2，经鉴定为鸟肠球菌(Enterococcusavium)，并证实它产生的GABA对肠道菌群具有调整作用，预示着在维护肠道菌群平衡、调节机体健康等方面具有益生作用。
附图说明
图1：鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990转化谷氨酸钠产生GABA的液相色谱检测图。
图2：鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990转化大豆粉产生GABA的液相色谱检测图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1：鸟肠球菌(Enterococcusavium)菌株的筛选及生理生化特性鉴定
使用无菌取样器采集健康人体未接触空气的粪便样品，迅速溶入无菌生理盐水中，混匀。取100μL粪便水溶液进行10倍梯度系列稀释，然后取0.5mL稀释液涂布在MRS培养基琼脂平板上，37±1℃培养24小时，挑取过氧化氢酶阴性的白色圆形菌落，反复划线纯化后，得到一株个体形态为椭圆形的菌株，命名为MRS4-2。
其中，上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
进行生理生化反应测定和16S rRNA基因序列分析(菌株MRS4-2的16S rRNA基因核苷酸序列如SEQ ID No 1所示)，该菌株被鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。
上述鸟肠球菌(Enterococcusavium)MRS4-2革兰氏染色阳性兼性厌氧，无芽孢，不运动；细胞椭圆状，单个或成对存在，大小1.0μm×1.0-2.0μm。菌落较小，边缘整齐，乳白色；其生理生化特征为：过氧化氢酶阴性，硝酸还原阴性，能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、纤维二糖，不利用棉子糖。其必须生长因子包括烟酸、叶酸、泛酸和核黄素。
上述鸟肠球菌(Enterococcusavium)MRS4-2生长温度为25-42℃，最适生长温度为37℃。
上述鸟肠球菌(Enterococcusavium)MRS4-2在MRS培养基中生长，静置培养12小时后，菌体密度达到2.23±0.05，pH值为4.2±0.1。
上述菌株已于2020年11月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.20990。
实施例2：鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990在利用添加谷氨酸的培养基生产γ-氨基丁酸(GABA)中的应用
将2％过夜培养的鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990转接到含有1％谷氨酸的MRS培养基(即GMRS培养基)中，37℃静置培养120小时。
上述GMRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，10.0g谷氨酸钠，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30分钟。
发酵液经过6000g离心5分钟，收集上清液。上清液经过0.22μm无菌滤器过滤除菌后，测定其GABA含量为1.851±0.205g/L。
上述检测GABA的方法为高效液相色谱法，具体为：向GMRS培养基上清中加入等体积20％三氯乙酸，充分混匀后静置沉淀30分钟，12000g离心20分钟收集上清液。用0.2MNaHCO3溶液稀释后，加入等体积的丹磺酰氯-丙酮溶液，混匀后在30℃下衍生处理1小时，再经0.22μm滤器过滤，其滤液即为高效液相色谱检测的样本。
使用Xbridge BEH300 C18(4.6×150毫米)的色谱柱和紫外检测器，在540nm下检测峰面积，根据GABA标准曲线计算GABA的产量。流动相A：甲醇，流动相B：四氢呋喃：甲醇：50mM乙酸钠(pH 6.2)的比例为5:75:420。总流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序中流动相B的浓度为：0-6分钟，80％，6-20分钟，50％，20-27分钟，0％，27-40分钟，80％。结果见图1。
实施例3：鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990在利用添加大豆粉酶解液的培养基生产γ-氨基丁酸(GABA)中的应用
将2％过夜培养的鸟肠球菌(Enterococcusavium)CGMCC No.20990转接到含有体积比为5％大豆粉酶解液的MRS培养基中，37℃静置培养72小时。
上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
上述大豆粉酶解液的制备方法：将5克大豆粉溶于10毫升0.05％的NaCl溶液中，加入胃蛋白酶至终浓度0.3％，利用5M HCl调节pH至2.5，在37℃下酶解1.5h，再加入胰蛋白酶和胆盐至终浓度0.1％，使用10M NaOH调节pH至8.0，酶解12h。
发酵液经过6000g离心5分钟收集上清液。上清液经过0.22μm滤器过滤，测定滤液中GABA含量为0.134±0.015g/L。
上述GABA检测方法：采用高效液相色谱法测定培养液中GABA的含量，向GMRS培养基上清中加入等体积20％三氯乙酸，充分混匀后静置沉淀30分钟，12000g离心20分钟收集上清液，用0.2M的NaHCO3溶液稀释，然后加入等体积的丹磺酰氯-丙酮溶液在30℃下衍生处理1小时，处理后的混合物经0.22μm的滤器过滤，其滤液用于高效液相色谱检测的样本。
使用Xbridge BEH300 C18(4.6×150毫米)的色谱柱和紫外检测器，在540nm下检测峰面积，根据GABA标准曲线计算GABA的产量。流动相A：甲醇，流动相B：四氢呋喃：甲醇：50mM乙酸钠(pH 6.2)的比例为5:75:420。总流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序中流动相B的浓度为：0-6分钟，80％，6.1-20分钟，50％，20.1-27分钟，0％，27.1-40分钟，80％。结果见图2。
序列表
<110> 山东大学
<120>一株人源性产生γ-氨基丁酸的鸟肠球菌及其应用
<141> 2020-12-16
<160>1
<210> 1
<211> 1567
<212> DNA
<213>鸟肠球菌（Enterococcus avium）
<221>鸟肠球菌（Enterococcus avium）MRS4-2的16S rRNA基因核苷酸序列
<222>（1）…（1567）
<400>1
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ttggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta tcggaaggtg cggctggatc acctcctttc 1560
taaggaa 1567
Claims (1)
1.一种利用添加大豆粉酶解液的MRS培养基生产γ-氨基丁酸的方法，是将体积比2％过夜培养的鸟肠球菌转接到含有体积比为5％大豆粉酶解液的MRS培养基中静置培养，发酵产物经6000g离心5分钟后，收集上清液即得到含有γ-氨基丁酸的发酵液；
其特征在于：
所述鸟肠球菌是鸟肠球菌(Enterococcus avium)MRS4-2，该菌株已于2020年11月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNo.20990；
所述静置培养的方法是37±2℃静置培养72±5小时；
所述MRS培养基的配方是：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟；
所述大豆粉酶解液的制备方法：将5克大豆粉溶于10毫升0.05％的NaCl溶液中，加入胃蛋白酶至终浓度0.3％，利用5M HCl调节pH至2.5，在37℃下酶解1.5h，再加入胰蛋白酶和胆盐至终浓度0.1％，使用10M NaOH调节pH至8.0，酶解12h。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Gamma-Aminobutyric Acid Production from a Novel Enterococcus avium JS-N6B4 Strain Isolated from Edible Insects;Min-Ho Jo等;《J Microbiol Biotechnol.》;20190629;第29卷(第6期);第933-943页 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112501078A (zh) | 2021-03-16 |
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