CN115736092A

CN115736092A - 一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法

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Publication number: CN115736092A
Application number: CN202211619171.3A
Authority: CN
Inventors: 任小杰; 李军训; 徐启民; 吕明霞; 马正阳
Original assignee: Shandong Taishan Shengliyuan Group Co ltd
Current assignee: Shandong Taishan Shengliyuan Group Co ltd
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2042-12-14

Abstract

本发明公开了一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法。将米曲霉菌种子接种至含有L‑谷氨酸钠和西红柿‑胡萝卜酶解物的发酵基料中培养得到米曲发酵物；将解淀粉芽孢杆菌种子液接种至米曲发酵物中培养得到两步法发酵物；将两步法发酵物干燥粉碎得到富含谷氨酰胺的发酵产物。西红柿‑胡萝卜酶解物是向西红柿和胡萝卜中添加果胶酶、纤维素酶、抗坏血酸与焦亚硫酸钠进行酶解得到的。本发明通过酶解胡萝卜和西红柿，将其添加到固态发酵基中，不仅提高发酵产物中的酶含量，促进谷氨酸向谷氨酰胺的转化，同时改善发酵物的适口性，进一步提高了猪仔的免疫力。与正常发酵制备谷氨酰胺相比，谷氨酰胺的含量提高了32～47％。

Description

一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法。

背景技术

L-谷氨酰胺是哺乳动物非必需氨基酸，是在动物体内含量最高的游离氨基酸，也是细胞工程化培养的主要氮源。谷氨酸和氨在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺，是动物体内重要的解氨毒方式。谷氨酰胺具有维持机体酸碱平衡，调节机体免疫功能等诸多的生理作用，在医药领域谷氨酰胺可用于治疗消化道溃疡、胃肠炎并促进肠道发育。

谷氨酰胺在单胃动物中的研究主要集中在断奶仔猪上，谷氨酰胺作为重要的游离氨基酸，对缓解断奶应激综合征具有重要作用。Brosnan等研究表明断奶仔猪饲粮中添加L-谷氨酰胺会增加十二指肠和空肠的黏膜谷氨酸草酰乙酸转氨酶的活性、谷氨酰胺合成酶、空肠黏膜紧密连接蛋白和紧密连接蛋白-1的mRNA表达水平。家禽在养殖中抗应激能力差，因此谷氨酰胺在家禽中的应用主要是完善机体的屏障功能，提高家禽的抗应激能力，进一步缓解家禽的应激。李文立等研究表明日粮中添加谷氨酰胺可显著提高热应激条件下血清和肠道的抗氧化能力，在热应激条件下，添加1.6％的谷氨酰胺效果最佳。由于谷氨酰胺重要的生理作用及其在营养学、生理学、免疫学等方面的重要价值，国内外学者对其进行了深入研究。日本早在1977年就开始采用发酵法生产谷氨酰胺，但我国利用微生物发酵生产谷氨酰胺的技术还不成熟，且主要集中在利用液体发酵生产谷氨酰胺的方式上，发酵工艺落后。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法。本发明通过酶解胡萝卜和西红柿，将其添加到固态发酵基中，不仅提高发酵产物中的酶含量，促进谷氨酸向谷氨酰胺的转化，同时改善发酵物的适口性，增加仔猪的采食量，进一步提高了猪仔的免疫力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法，包括以下步骤：

(1)将含有L-谷氨酸钠和西红柿-胡萝卜酶解物的发酵基料调节至含水量为45-50wt％，调节初始pH为7.0-7.2，灭菌处理，得到固体发酵培养基；

(2)将米曲霉菌种子接种至固体发酵培养基中培养得到米曲发酵物；

(3)将解淀粉芽孢杆菌种子液接种至米曲发酵物中培养得到两步法发酵物；

(4)将步骤(3)得到的两步法发酵物干燥直至水分含量为10-12wt％，粉碎得到富含谷氨酰胺的发酵产物。

优选的，步骤(1)中，所述发酵基料包括以下重量百分数的原料：麸皮50-56％、豆粕35-40％、NaCl 0.8-1.2％、L-谷氨酸钠4-6％、西红柿-胡萝卜酶解物4％、玉米浆0.5-1.0％、MnSO₄0.02％-0.04％、ZnSO₄0.01％-0.02％、FeSO₄0.5-0.8％。

优选的，所述西红柿-胡萝卜酶解物由以下方法制备：

1)将西红柿和胡萝卜分别去皮后，切成小块，加水打浆，得到混合浆料；

2)向混合浆料中分别添加0.1wt％的果胶酶、纤维素酶、抗坏血酸与焦亚硫酸钠，间断搅拌进行酶解处理；

3)酶解完毕后灭酶，离心去掉上清液，浓缩后得到西红柿-胡萝卜酶解物。

优选的，步骤1)中，所述西红柿和胡萝卜的质量比为1：1，打浆的料液比为1：1。

优选的，步骤2)中，所述酶解的温度50℃，酶解的pH值为3.5，酶解的时间为1h。

优选的，步骤3)中，浓缩至相对密度为1.1～1.2(50℃下测)。

优选的，利用制备西红柿-胡萝卜酶解物得到的上清液对发酵基料进行含水量调节。

优选的，步骤(2)中，所述米曲霉种子采用固态培养法培养米曲霉菌得到；所述米曲霉种子中米曲霉的孢子数为60亿个/g、中性蛋白酶活性达到2000u/g；所述米曲霉菌的菌种保藏号：CICC 2013；

所述培养为：28-30℃好氧培养30-32h；所述米曲霉种子的接种量为1.0-2.0wt％。

优选的，步骤(3)中，所述解淀粉芽孢杆菌种子液采用摇瓶培养法培养解淀粉芽孢杆菌得到，培养至解淀粉芽孢杆菌的菌数为1×10⁹cfu/mL；所述解淀粉芽孢杆菌的菌种保藏号：CICC 20518。

所述培养为：37-39℃好氧培养24-36h；所述解淀粉芽孢杆菌种子液的接种量为1-5wt％。

本发明的第二方面，提供上述的方法制备得到的富含谷氨酰胺的发酵产物。

本发明的第三方面，提供富含谷氨酰胺的发酵产物在提高仔猪免疫力中的应用。

优选的，富含谷氨酰胺的发酵产物在如下1)～3)至少一项中的应用：

1)提高断奶仔猪的生长性能；

2)提高仔猪血清中的细胞因子含量；

3)提高仔猪肠道中的乳酸菌含量、降低大肠杆菌数量。

富含谷氨酰胺的发酵产物的添加量占饲料总质量的1～5wt％。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用曲霉和解淀粉芽孢杆菌分别好氧发酵，丰富发酵产物中的酶系，提高发酵产物中的酶含量，促进谷氨酸向谷氨酰胺的转化。同时，通过向培养基中添加西红柿-胡萝卜酶解物，不仅改善发酵物的适口性，还进一步促进谷氨酸向谷氨酰胺的转化，提高了发酵产物中谷氨酰胺的含量，应用在仔猪料中具有提高猪仔免疫力的功效。

(2)本发明制备方法简单，采用固态培养基两步发酵法得到富含谷氨酰胺的发酵产物，谷氨酰胺的含量提高了32～47％。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

说明：米曲霉菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CICC2013；

解淀粉芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CICC20518；

嗜热链球菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CICC 20378；

保加利亚乳杆菌为市售菌粉，购自山东中科嘉亿生物工程有限公司；

玉米浆购自鲁洲生物科技有限公司。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：

1)将500g西红柿和500g胡萝卜分别去皮后，切成小块，加1kg去离子水打浆，得到混合浆料；

2)向混合浆料中分别添加0.1wt％的果胶酶、纤维素酶、抗坏血酸与焦亚硫酸钠，每30min搅拌一次进行酶解，酶解温度50℃，pH值为3.5，酶解1h；

3)酶解完毕后加热到85℃保持2min灭酶，离心收集上清液备用，剩余物质浓缩至相对密度为1.15(50℃下测)后得到西红柿-胡萝卜酶解物。

实施例2

(1)将530g麸皮、375g豆粕、10gNaCl、50g L-谷氨酸钠、40g实施例1制备的西红柿-胡萝卜酶解物、7.5g玉米浆、0.3g MnSO₄、0.15g ZnSO₄、6.5g FeSO₄混合，得到发酵基料。

将发酵基料与实施例1步骤1)收集的上清液混合至含水量为47.5wt％，用20％的氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌处理30min，得到固体发酵培养基。

(2)将米曲霉菌种以6‰的接种量接种至纯麸皮中，30℃固态培养米曲霉菌种，使米曲霉达到孢子数60亿个/g，中性蛋白酶活性达到2000u/g，得到米曲霉菌种子。

将固体发酵培养基接种米曲霉菌种子，米曲霉菌种子的接种量为1.5wt％，29℃好氧培养31h，得到米曲发酵物。

(3)将解淀粉芽孢杆菌菌种以2wt％的接种量接种至液体培养基中，38℃培养解淀粉芽孢杆菌菌数至1×10⁹cfu/mL，得到解淀粉芽孢杆菌发酵种子液。

液体培养基的组成为：葡萄糖2g/L，氯化钠5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，水1000mL，pH7.0。

将解淀粉芽孢杆菌发酵种子液以3wt％的接种量接种至米曲发酵物中，38℃好氧培养20h，发酵结束后得到两步法发酵物。

(4)将步骤(3)得到的两步法发酵物干燥直至水分含量为11wt％，粉碎得到发酵料。

实施例3

(1)将500g麸皮、400g豆粕、8gNaCl、60gL-谷氨酸钠、40g实施例1制备的西红柿-胡萝卜酶解物、5g玉米浆、0.4g MnSO₄、0.1g ZnSO₄、8g FeSO₄混合，得到发酵基料。

将发酵基料与实施例1步骤1)收集的上清液混合至含水量为45wt％，用20％的氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌处理30min，得到固体发酵培养基。

(2)将米曲霉菌种以5‰的接种量接种至纯麸皮中，32℃固态培养米曲霉菌种，使米曲霉达到孢子数60亿个/g，中性蛋白酶活性达到2000u/g，得到米曲霉菌种子。

将固体发酵培养基接种米曲霉菌种子，米曲霉菌种子的接种量为2.0wt％，28℃好氧培养32h，得到米曲发酵物；

(3)将解淀粉芽孢杆菌菌种以2wt％的接种量接种至液体培养基中，37℃培养解淀粉芽孢杆菌菌数至1×10⁹cfu/mL，得到解淀粉芽孢杆菌发酵种子液。

液体培养基为葡萄糖2g/L，氯化钠5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，水1000mL，pH7.0。

将解淀粉芽孢杆菌发酵种子液以1wt％的接种量接种至米曲发酵物中，39℃好氧培养36h，发酵结束后得到两步法发酵物。

(4)将步骤(3)得到的两步法发酵物干燥直至水分含量为10wt％，粉碎得到发酵料。

实施例4

(1)将560g麸皮、350g豆粕、12gNaCl、40gL-谷氨酸钠、40g实施例1制备的西红柿-胡萝卜酶解物、10g玉米浆、0.2g MnSO₄、0.2g ZnSO₄、5g FeSO₄混合，得到发酵基料。

将发酵基料与实施例1步骤1)收集的上清液混合至含水量为50wt％，用20％的氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌处理30min，得到固体发酵培养基。

(2)将米曲霉菌种以7‰的接种量接种至纯麸皮中，28℃固态培养米曲霉菌种，使米曲霉达到孢子数60亿个/g，中性蛋白酶活性达到2000u/g，得到米曲霉菌种子。

将固体发酵培养基接种米曲霉菌种子，米曲霉菌种子的接种量为1.0wt％，30℃好氧培养32h，得到米曲发酵物；

(3)将解淀粉芽孢杆菌菌种以2wt％的接种量接种液体培养基中，39℃培养解淀粉芽孢杆菌菌数至1×10⁹cfu/mL，得到解淀粉芽孢杆菌发酵种子液。

将解淀粉芽孢杆菌发酵种子液以5wt％的接种量接种至米曲发酵物中，37℃好氧培养24h，发酵结束后得到两步法发酵物。

(4)将步骤(3)得到的两步法发酵物干燥直至水分含量为12wt％，粉碎得到发酵料。

对比例1

与实施例2的区别在于：

步骤(1)中不添加实施例1制备的西红柿-胡萝卜酶解物；最终制备得到发酵料。

对比例2

与实施例2的区别在于：

步骤(2)～(3)中，只接种米曲霉菌种子，不接种解淀粉芽孢杆菌发酵种子液。最终制备得到发酵料。

对比例3

与实施例2的区别在于：

步骤(2)～(3)中，只接种解淀粉芽孢杆菌发酵种子液，不接种米曲霉菌种子。最终制备得到发酵料。

对比例4

与实施例2的区别在于：

步骤(1)中将西红柿-胡萝卜酶解物替换成20g胡萝卜汁和20g西红柿汁；最终制备得到发酵料。

对比例5

1)将1kg西红柿和1kg胡萝卜分别去皮后打浆，混合后静置6h，收集上清液，剩下的为混合浆料；

2)向混合浆料中添加保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行发酵，发酵完毕进行灭菌处理，然后浓缩得到西红柿-胡萝卜乳酸发酵物。

3)与实施例2的区别在于：

将实施例1制备的西红柿-胡萝卜酶解物替换成步骤2)制备的西红柿-胡萝卜乳酸发酵物；最终制备得到发酵料。

对比例6

2)向混合浆料中分别添加0.1wt％的果胶酶、纤维素酶，每30min搅拌一次进行酶解，酶解温度50℃，pH值为3.5，酶解1h；

3)酶解完毕后加热到85℃保持2min灭酶，离心去掉上清液备用，剩余物质浓缩至相对密度为1.15(50℃下测)后得到西红柿-胡萝卜酶解物。

4)与实施例2的区别在于：

将发酵基料与蒸馏水混合至含水量为47.5wt％。最终制备得到发酵料。

试验例1

对实施例2～4和对比例1～6制备的发酵料进行常规营养成分和谷氨酰胺含量的检测，谷氨酰胺水解产生等量的谷氨酸，因此分析谷氨酰胺水解产生的谷氨酸就可以获得谷氨酰胺溶液的浓度。采用SBA-4生物传感器分析仪(山东省科学院生物研究所)测定发酵料中谷氨酸的浓度。所得结果见表1。

表1

由表1可知，实施例2～4制备得到的发酵料中，常规营养成分及谷氨酰胺含量最高，与对比例1，谷氨酰胺含量提高了32％-47％。

试验例2

选取100头35日龄体况良好、体重相近(8.60±0.52)的杜长大三元杂交断奶仔猪，随机分成10组，每组10头。试验所用饲粮参考NRC(2012)猪营养需要进行配制，营养水平满足仔猪所需，基础饲粮见表2。对照组仔猪饲喂基础饲粮，试验组仔猪在基础饲粮的基础上分别添加1wt％实施例2～4或对比例1～6制备的发酵料。预试期3d，正试期28d。试验期间，按照常规饲养管理，自由采食和饮水，饲粮配制成粉状进行饲喂。饲喂结束后，每组选择4头仔猪称重后对其进行前腔静脉采血，分别采集血液5mL，常规方法分离血清样品。然后将仔猪处死，快速移除结肠肠断，挤出结肠内容物置于5mL冻存管中。利用ELISA检测试剂盒(南京奥青生物有限公司)依次检测血清样品中的TNF-α、IL-2和IL-6指标。采用平板计数法测定结肠内容物中的微生物。所得结果见表3～5。

表2基础饲粮组成和营养水平(风干基础)

1)预混料每千克饲料提供：VA,3300IU；VD₃,330IU；VE,24IU；VK₃,0.75mg；VB₁,1.50mg；VB₂,5.25mg；VB₁₂,0.02625mg；泛酸15.00mg；尼克酸22.50mg；生物素0.075mg；叶酸0.45mg；Mn,6.00mg；Fe,150mg；Zn,150mg；Cu,9.00mg；I,0.21mg；Se,0.45mg。

2)粗蛋白为实测值，其他为计算值。

表3发酵料对断奶仔猪生长性能的影响

项目	平均日增重,g/d	平均日采食量,g/d	料重比	死淘率,％	腹泻率,％
						对照组	231.95	457.65	1.97	60	80
实施例2	544.43	774.51	1.44	0	0
						实施例3	549.70	778.98	1.52	0	0
实施例4	534.10	768.84	1.53	0	10
						对比例1	440.11	709.34	1.58	40	50
对比例2	272.61	434.15	1.59	40	60
						对比例3	281.47	448.99	1.60	40	70
对比例4	473.35	728.53	1.57	20	30
						对比例5	435.82	746.57	1.57	20	20
对比例6	464.65	723.58	1.59	10	20

由表3数据可知，实施例2～4制备得到的发酵料可以显著提高断奶仔猪的日增重和采食量。仔猪的死淘率和腹泻率也显著低于对比例1～3制备得到的发酵料。

表4发酵料对仔猪血清炎性指标的影响

项目	TNF-α,ng/mL	IL-2,pg/mL	IL-6,pg/mL
				对照组	40.95	56.24	50.95
实施例2	79.33	109.69	110.32
				实施例3	86.27	118.51	115.87
实施例4	85.77	113.36	113.49
				对比例1	48.96	63.27	58.96
对比例2	43.04	64.42	52.02
				对比例3	42.53	60.74	52.81
对比例4	57.67	75.94	62.32
				对比例5	66.90	88.91	67.68
对比例6	70.76	93.67	76.90

由表4数据可知，实施例2～4制备得到的发酵料可以显著提高血清炎性因子的含量，进而提高仔猪的免疫力。

表5发酵料对仔猪粪便菌群的影响单位：lg(CFU/g)

项目	总需氧菌	大肠杆菌	乳酸菌
				对照组	3.28	7.79	5.01
实施例2	7.61	5.37	8.27
				实施例3	8.56	5.15	8.89
实施例4	7.30	5.80	8.33
				对比例1	4.11	7.06	5.54
对比例2	4.35	7.41	5.44
				对比例3	3.75	7.21	6.06
对比例4	5.63	6.67	6.29
				对比例5	6.54	6.59	6.94
对比例6	7.02	6.30	7.42

由表5数据可知，实施例2～4制备得到的发酵料可以显著提高仔猪肠道中的乳酸菌含量，降低大肠杆菌数量。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种固态发酵提高饲料中谷氨酰胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵基料包括以下重量百分数的原料：麸皮50-56％、豆粕35-40％、NaCl 0.8-1.2％、L-谷氨酸钠4-6％、西红柿-胡萝卜酶解物4％、玉米浆0.5-1.0％、MnSO₄0.02％-0.04％、ZnSO₄0.01％-0.02％、FeSO₄0.5-0.8％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述西红柿-胡萝卜酶解物由以下方法制备：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述西红柿和胡萝卜的质量比为1：1，打浆的料液比为1：1。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述酶解的温度50℃，酶解的pH值为3.5，酶解的时间为1h。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用制备西红柿-胡萝卜酶解物得到的上清液对发酵基料进行含水量调节。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述米曲霉种子采用固态培养法培养米曲霉菌得到；所述米曲霉种子中米曲霉的孢子数为60亿个/g、中性蛋白酶活性达到2000u/g；所述米曲霉菌的菌种保藏号：CICC 2013；

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述解淀粉芽孢杆菌种子液采用摇瓶培养法培养解淀粉芽孢杆菌得到，培养至解淀粉芽孢杆菌的菌数为1×10⁹cfu/mL；所述解淀粉芽孢杆菌的菌种保藏号：CICC 20518。

9.权利要求1～8所述的方法制备得到的富含谷氨酰胺的发酵产物。

10.权利要求9所述的富含谷氨酰胺的发酵产物在提高仔猪免疫力中的应用。