CN110607256A - 一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌jylb-131及其在食品、药品中的应用 - Google Patents

一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌jylb-131及其在食品、药品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微生物菌种及其应用，具体的说是一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB‑131及其在食品、药品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌的保藏编号为：CGMCC NO.18040，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；本发明中的罗伊氏乳杆菌JYLB‑131可以提高机体抗氧化活性，清除自由基，调整内分泌，抑制肠道有害菌的繁殖和定植，减少内毒素的产生，调整肠道菌群平衡，减轻肝细胞的损伤，提高抗病能力，提高酒后乙醇脱氢酶活力的作用、降低酒后丙二醛含量的作用、提高酒后超氧化物歧化酶活性的作用、提高酒后还原型谷胱甘肽含量的作用。从而缓解、改善酒后不适，减轻酒后头疼、呕吐、头晕、血压下降、心跳加快、大小便失禁的问题。

Description

一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB-131及其 在食品、药品中的应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌种及其应用，具体的说是一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB-131及其在食品、药品中的应用。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。具有很强的黏附能力，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病；罗伊氏乳杆菌能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。罗伊氏乳杆菌益生菌制剂可改善人体机能，提高免疫力从而促进人体健康。
酒是人们生活中必不可或缺的饮品之一，酒中含有酒精，酒精在人体内不需要经过消化系统的消化可以很快进入人体血液中，并通过血管进入人体各个器官，酒精集中分布在肝脏和大脑中，过量饮酒会改变人的情绪和行为、醉酒现象的产生。并且过量饮酒会损坏人体肝脏，轻者引发肝炎、重者酒精中毒死亡，造成肝脏受损，由于肝脏受损，造成机体免疫力下降。
在醉酒后往往会出现出现头痛、头晕、自控力差，口渴、脱水、动作不协调、语无伦次、瞳孔散大、血压下降、心跳加快、大小便失禁等现象。
过度饮酒已成为一个普遍的公共卫生问题，由过度饮酒导致的人体伤害已引起社会广泛的关注。因此研究开发解决酒后不适、解酒护肝的解酒药物成为医学领域的研究热点。
现在，西医对常采用静脉注射纳洛酮等药物来预防酒醉、治疗宿醉及酒后保健的药物，有些中药解酒制剂见效慢，价格昂贵且效果不佳。或是采用牛奶解酒、饮茶解酒等常用方法，牛奶解酒对于乳糖不耐脏人群或是对牛奶中蛋白产生抗体的人群均不能使用，饮茶解酒会使饮酒者的大脑处于长时间的兴奋期，同样也起不到很好的解酒效果，这些方法往往见效慢、起不到很好醒酒、解酒、缓解酒后不适以及保肝护肝的作用。
目前并未有关利用罗伊氏乳杆菌制剂或产品解决护肝方面的相关报道。
发明内容
本发明为解决上述饮酒后出现头痛、头晕、血压下降、心跳加快、大小便失禁、常用解酒方法见效慢、解酒药物价格昂贵，又起不到保肝护肝的作用等问题，提供了一种罗伊氏乳杆菌JYLB-131，该菌种具有很强的抗氧化性能，很好的抑菌效果、同时具有较高的ADH酶和超氧化物歧化酶的活性、降低丙二醛的生成，可以有效缓解饮酒后出现头痛、头晕、血压下降、心跳加快、大小便失禁等问题，常用解酒方法见效慢、解酒药物价格昂贵，又起不到保肝护肝的作用等问题。
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB-131及其在食品、药品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌的保藏编号为：CGMCCNO.18040，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，菌种的分类命名为JYLB-131，微生物(株)：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus.，保藏日期为2019年6月27日。
所述的罗伊氏乳杆菌JYLB-131具有对大肠杆菌、沙门氏菌具有抑制作用。
所述的罗伊氏乳杆菌JYLB-131具有降解内毒素的能力。
所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131具有强抗氧化性能。
本发明的另一个目的在于提供的所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131在制备食品或制备药品中应用。
所述食品或药品具有解酒护肝作用。
所述食品或药品具有提高酒后乙醇脱氢酶活力的作用、降低酒后丙二醛含量的作用、提高酒后超氧化物歧化酶活性的作用、提高酒后还原型谷胱甘肽含量的作用。
本发明的另一个目的在于提供一种食品，以保藏编号为：CGMCC NO.18040的罗伊氏乳杆菌JYLB-131进行制备。
进一步，所述食品包含罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉。
进一步，所述含有罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的食品的剂型为片剂、蜜膏、口服剂、颗粒剂或胶囊。
进一步，所述的一种食品，其中所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉中罗伊氏乳杆菌的活菌含量≥50亿/g。
优选，罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉中罗伊氏乳杆菌的含量为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g。
进一步，所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的制备方法，包括，包括：
1)按体积百分比，将1％的罗伊氏乳杆菌JYLB-131接种到99％的MRS液体培养基中，在37℃条件下，兼性厌氧培养18小时，吸取菌液，在2000转/分钟条件下、离心10分钟，冻干，得到沉淀物；
2)按体积份数比，在1份沉淀物中加入1份低聚异麦芽糖，混合均匀，得到罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉；
进一步，所述MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水1000mL；
所述MRS液体培养基的制备方法：在蒸馏水中加入蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、K2HPO4·7H2O、柠檬酸三铵、醋酸钠·3H2O、葡萄糖、吐温80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O，混合均匀，调节pH值至6.2～6.5，分装、115℃、灭菌15分钟，制得MRS液体培养基。
本发明的有益效果为：
本发明中的提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB-131，保藏编号为：CGMCC NO.18040，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种的分类命名为JYLB-131，微生物(株)：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus.，本发明中的罗伊氏乳杆菌JYLB-131可以提高机体抗氧化活性，有效清除自由基，调整内分泌，有效产生短链脂肪酸和抑菌素，抑制肠道有害菌的繁殖和定植，减少内毒素的产生，调整肠道菌群平衡，维护肠道菌群的完整性，同时又可以减轻肝细胞的损伤，缓解肝脏压力，当肝损伤后造成机体免疫力下降，适当补充益生菌可以增强机体免疫力，提高抗病能力。
本发明提供的含有罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的食品或药品，具有提高酒后乙醇脱氢酶活力的作用、降低酒后丙二醛含量的作用、提高酒后超氧化物歧化酶活性的作用、提高酒后还原型谷胱甘肽含量的作用，从而缓解酒后造成的各种不适症状，减轻酒后头疼、呕吐、头晕等问题。
本发明利用罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉制备的食品或药品，在服用后可以有效缓解对人体对酒精的吸收，从而缓解、改善酒后不适，减轻酒后头疼、呕吐、头晕、血压下降、心跳加快、大小便失禁的问题。
本发明中加入氨基酸复合剂、蜂蜜、麦芽，氨基酸复合剂中苏氨酸和蛋氨酸可以有效的保护肝脏，减少酒精对的损害，防止酒精在肝脏中累积，分解脂肪，促进抗体的产生，蜂蜜中的果糖、葡萄糖可促进酒精的分解吸收，加速了酒精从血液中排除的速度，从而减轻酒后不适的症状；麦芽中有含转化糖酶、维生素B等对活性成分，行气消食，健脾开胃，减小酒对胃的伤害，行气有助于酒的散发，提高心肌供氧能力，同时可阻止脂质过氧化以及某些化学物质的危害，从而改善酒后不适，减轻酒后头疼、呕吐、头晕、血压下降、心跳加快、大小便失禁的问题。
本发明制备的食品或药品，其制备方法简单，利用本发明的制备方法制备出的食品或药品，具有醒酒效果好、无副作用、价格便宜等特点。
附图说明
图1为罗伊氏乳杆菌JYLB-131的总抗氧化性能；
图2为罗伊氏乳杆菌JYLB-131对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌性能；
图3为罗伊氏乳杆菌JYLB-131对内毒素降解能力；
图4为罗伊氏乳杆菌JYLB-131对提高小鼠肝脏中乙醇脱氢酶活力的测定；
图5为罗伊氏乳杆菌JYLB-131对降低小鼠肝脏中丙二醛(MDA)生成量的测定；
图6为罗伊氏乳杆菌JYLB-131提高小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性的性能；
图7为罗伊氏乳杆菌JYLB-131提高小鼠肝脏中还原型谷胱甘肽(GSH)水平的性能测定。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明所述提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB-131的保藏编号为：CGMCC NO.18040，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，菌种的分类命名为JYLB-131，参据微生物(株)：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus.，保藏日期为2019年6月27日；
本发明中所用对照检测菌种均为市售产品；
所述低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司；
所述基因组DNA试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
所述总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；
所述肝脏乙醇脱氢酶活力(ADH)测试盒购自南京建成生物工程研究所；
所述丙二醛(MDA)生成量测试盒购自南京建成生物工程研究所；
所述超氧化物歧化酶(SOD)活性测试盒购自南京建成生物工程研究所；
所述肝脏谷胱甘肽(GSH)含量测试盒购自南京建成生物工程研究所；
所述所述MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4·7H2O2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温801mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水1000mL；
培养基的制备方法：在蒸馏水中加入蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、K2HPO4·7H2O、柠檬酸三铵、醋酸钠·3H2O、葡萄糖、吐温80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O，混合均匀，调节pH值至6.2～6.5，分装、115℃、灭菌15分钟，制得MRS液体培养基；
所述平板培养基的制备：在1000mL蒸馏水中加入蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g，混合均匀，加入琼脂15g，调节pH值至6.2～6.5，分装、温度为115℃、灭菌15分钟，制得平板培养基；
MRS液体培养基Ⅰ：在1000mL蒸馏水中加入牛肉膏10g、酵母浸膏5g、蛋白胨10g、无水醋酸钠5g、碳酸钙1g、吐温-80 1mL、K2HPO4 2g、葡萄20g、盐液A 5mL，混合均匀，调节pH值为6.8，过滤，121℃条件下灭菌20分钟，制得MRS液体培养基Ⅰ；其中盐液A为：MgSO4·7H2O11.5g，MnSO4·4H2O 2.8g，蒸馏水1000mL；
LB固体平板培养基：950mL蒸馏水加胰蛋白胨10g、酵母浸出汁5g、氯化钠10g、混合均匀，用浓度为6mol/L的氢氧化钠调节pH值至6.8，加入18g琼脂，然后用蒸馏水定容至1.0L，121℃，灭菌20分钟，制得LB固体平板培养基；
实施例1
本发明提供的一种罗伊氏乳杆菌JYLB-131
1.菌种的来源
样本来源于四川大理30岁健康男性粪便(无家族遗传病史的成年男性)；
2.菌种的分离、纯化
1)无菌条件下对样品进行10个梯度的稀释，在样本中加入去离子水，混合均匀，制得菌液；
2)取100μL菌液接种在平板培养基中，在37℃条件下、厌氧培养过夜，直至长出菌落直径为1.5mm—3mm、菌落表面光滑，呈乳白色，周边规则的特征菌落为止；
3)挑取1个直径为3mm的特征菌落，将其接种在新的平板培养基中，在37℃条件下、厌氧活化1天，既得培养物菌种，命名为JYLB-131。
3.菌种鉴定
1)选取通用引物：27F引物、1492R引物，备用；
引物序列为：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2)利用基因组DNA试剂盒提取培养物菌种的基因组DNA，然后PCR扩增16s rDNA片段，得到扩增产物，之后将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，通过测序检测16S rDNA的全长，在Eztaxon数据库进行Blast比对，进行同源性比较，该菌种属于罗伊氏乳杆菌属(Lactobacillus reuteri)，其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus.，保藏中心是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为:CGMCC NO.18040，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
实施例2
罗伊氏乳杆菌JYLB-131的抗氧化性能
1)菌种选取
选取菌种：罗伊氏乳杆菌JYLB-131、ATCC53608、ATCC55148、ATCC55739、ATCC23272、DSMZ 8535、JCM 2764、DSMZ 20056、DSMZ 20053；
2)制备检测菌液
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131为例制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间的待检测菌液
①接种量按1％的体积比计算，将1％的罗伊氏乳杆菌JYLB-131接种到MRS液体培养基，在37℃条件下，培养30小时，分别取培养12小时、18小时、24小时、30小时的发酵液，然后将培养不同时间的发酵液在转速为3500转/分钟条件下，离心20分钟，分别取上清液，调节pH值为6.0，制得培养12小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131检测菌液、培养18小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131检测菌液、培养24小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131检测菌液、培养30小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131检测菌液；
②按照制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间待检测菌液的制备方法，依次制备ATCC53608不同培养时间的待检测菌液、ATCC55148不同培养时间的待检测菌液、ATCC55739不同培养时间的待检测菌液、ATCC23272不同培养时间的待检测菌液、DSMZ 8535不同培养时间的待检测菌液、JCM 2764不同培养时间的待检测菌液、DSMZ 20056不同培养时间的待检测菌液、DSMZ 20053不同培养时间的待检测菌液；
3)检测菌种的抗氧化
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间待检测菌液为例制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间的待检抗氧化试剂
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间的待检测菌液中培养12小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131检测菌液为例，根据总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒中的制备方法，制备培养12小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131的待检抗氧化试剂，备用；
依照上述制备培养12小时的罗伊氏乳杆菌JYLB-131的待检抗氧化试剂的方法，依次制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间的待检测菌液中其他培养时间的待检抗氧化试剂；
依照上述制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131不同培养时间的待检抗氧化试剂的方法，依次制备ATCC53608不同培养时间的待检抗氧化试剂、ATCC55148不同培养时间的待检抗氧化试剂、ATCC55739不同培养时间的待检抗氧化试剂、ATCC23272不同培养时间的待检抗氧化试剂、DSMZ 8535不同培养时间的待检抗氧化试剂、JCM 2764不同培养时间的待检抗氧化试剂、DSMZ 20056不同培养时间的待检抗氧化试剂、DSMZ 20053不同培养时间的待检抗氧化试剂；
最后将各菌种的待检抗氧化试剂通过光谱分析仪，在520nm波长时测定吸光值，检测各菌种的抗氧化性能，结果见表1及其图1；
表1、各菌种不同发酵时间的总抗氧化能力：
结果检测：由表1、图1可知，罗伊氏乳杆菌JYLB-131均有很强的抗氧化性能，其中在发酵18小时时的抗氧化性能最高。
实施例3
罗伊氏乳杆菌JYLB-131对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌性能
1)各试验菌种的选取
从乳酸菌属中选取对照菌种ATCC53608、ATCC55148、ATCC55739、ATCC23272、DSMZ8535、JCM 2764、DSMZ20056、DSMZ20053以及本发明中的罗伊氏乳杆菌JYLB-131检测致病菌种大肠杆菌CICC10899、沙门氏菌CICC10437的抑制作用；
2)各试验菌种稀释液及致病菌种稀释液的制备
各试验菌种稀释液的制备：以罗伊氏乳杆菌JYLB-131为例制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液：
用生理盐水对罗伊氏乳杆菌JYLB-131进行稀释，稀释后的罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液中含有罗伊氏乳杆菌JYLB-131的活菌数为106cfu/mL，将罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液平均分为两份，即罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液A、罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液B，将罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液A在37℃条件下培养8小时，然后调节pH值为6.0，将罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液B调节pH值为6.0，制得罗伊氏乳杆菌JYLB-131发酵稀释液、罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液，备用；
依照罗伊氏乳杆菌JYLB-131发酵稀释液、罗伊氏乳杆菌JYLB-131稀释液的制备方法，依次分别制备ATCC53608发酵稀释液、ATCC53608稀释液，ATCC55148发酵稀释液、ATCC55148稀释液，ATCC55739发酵稀释液、ATCC55739稀释液，ATCC23272发酵稀释液、ATCC23272稀释液，DSMZ8535发酵稀释液、DSMZ8535稀释液，JCM2764发酵稀释液、JCM2764稀释液，DSMZ20056发酵稀释液、DSMZ20056稀释液，DSMZ20053发酵稀释液、DSMZ20053稀释液，备用；
致病菌种稀释液：用生理盐水对大肠杆菌CICC10899进行稀释，制得大肠杆菌CICC10899稀释液，其中大肠杆菌CICC10899稀释液中含有大肠杆菌CICC10899的活菌数为106cfu/mL；依照大肠杆菌CICC10899稀释液的制备方法，制备沙门氏菌CICC10437稀释液，沙门氏菌CICC10437稀释液中沙门氏菌的活菌数为106cfu/mL，备用；
3)试验方法
①分别制备抑制大肠杆菌培养基、抑制沙门氏菌培养基，以制备抑制大肠杆菌培养基为例：取0.1mL的大肠杆菌CICC10899稀释液均匀的涂布在LB固体平板培养基上，静置1小时，然后在培养基上打3个检测孔，检测孔的孔径为10mm、孔深为3mm，制得抑制大肠杆菌培养基，根据抑制大肠杆菌培养基的制备方法制备抑制沙门氏菌培养基；
②以罗伊氏乳杆菌JYLB-131为例分别制备罗伊氏乳杆菌抑菌培养基Ⅰ、罗伊氏乳杆菌抑菌培养基Ⅱ：取0.2mL的罗伊氏乳杆菌JYLB-131将其接种到抑制大肠杆菌培养基上，制得罗伊氏乳杆菌抑菌培养基Ⅰ；取0.2mL的罗伊氏乳杆菌JYLB-131将其接种到抑制沙门氏菌培养基上，制得罗伊氏乳杆菌抑菌培养基Ⅱ；
依照罗伊氏乳杆菌抑菌培养基Ⅰ、罗伊氏乳杆菌抑菌培养基Ⅱ的制备方法，依次制备对照菌种的抑菌培养基；
③将各试验菌种的抑菌培养基，在37℃条件下培养8小时，测定抑菌圈直径，结果见表2及图2；
表2：各菌种对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌圈直径(平均值)
4)结果检测由表2、图2可知，罗伊氏乳杆菌JYLB-131与其他菌株相比，对大肠杆菌和沙门氏菌有很强的抑菌作用。
实施例3
罗伊氏乳杆菌JYLB-131对内毒素降解能力测定
1)各试验菌种的选取
选取的试验菌种为罗伊氏乳杆菌JYLB-131、ATCC53608、ATCC55148、ATCC55739、ATCC23272、DSMZ 8535；
2)操作步骤
①各菌种待检测定菌液、对照组测定液、空白组测定液以及阳性对照组测定液的制备
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131为例制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131待检测定菌液：
接种量按1％体积比计算，在MRS液体培养基Ⅰ中加入罗伊氏乳杆菌JYLB-131，37℃条件下培养48小时，形成发酵菌液，在含有0.05mL鲎试剂的测定管内加入0.1mL发酵菌液，混合均匀，温度为37℃、水浴25分钟，然后加入0.05mL鲎三肽，混合均匀，温度为37℃、水浴3分钟，再加入0.5mL亚硝酸钠溶液，混合均匀，加入0.5mL氨基磺酸铵，混合均匀，最后加入0.5mL萘乙二胺，混合均匀，形成罗伊氏乳杆菌JYLB-131待检测定菌液，备用；
根据罗伊氏乳杆菌JYLB-131待检测定菌液的制备方法，依次制备ATCC53608待检测定菌液、ATCC55148待检测定菌液、ATCC55739待检测定菌液、ATCC23272待检测定菌液、DSMZ 8535待检测定菌液，备用；
制备对照组测定液，在含有0.05mL鲎试剂的测定管内加入0.1mL的生理盐水，混合均匀，温度为37℃、水浴25分钟，加入0.05mL鲎三肽，混合均匀，温度为37℃、水浴3分钟，再加入0.5mL亚硝酸钠溶液，混合均匀，加入0.5mL氨基磺酸铵，混合均匀，最后加入0.5mL萘乙二胺，混合均匀，形成对照组测定液，备用；
制备空白组测定液，在含有0.05mL鲎试剂的测定管内加入0.1mL的生理盐水，混合均匀，温度为37℃、水浴25分钟，加入0.05mL鲎三肽、0.05mL亚硝酸钠溶液，混合均匀，温度为37℃、水浴3分钟，加入0.5mL氨基磺酸铵，混合均匀，最后加入0.5mL萘乙二胺，混合均匀，形成空白组测定液，备用；
制备阳性对照组测定液，在含有0.05mL鲎试剂的测定管内加入0.1mL单位效价为0.125eu/mL的内毒素，混合均匀，温度为37℃、水浴25分钟，加入0.05mL鲎三肽，混合均匀，温度为37℃、水浴3分钟，再加入0.5mL亚硝酸钠溶液，混合均匀，加入0.5mL氨基磺酸铵，混合均匀，最后加入0.5mL萘乙二胺，混合均匀，形成阳性对照组测定液，备用；
②检测方法
将各试验菌种待检测定菌液、对照组测定液、空白组测定液以及阳性对照组测定液通过光谱分析仪，在545nm波长时比色读数，按公式A＝As-(Aa-Ao)计算出破坏内毒素的OD值(OD值越小表示其破坏内毒素的能力越强)，结果表3及见图3；
表3：各菌株对不同浓度内毒素降解能力的对比数据
检测结果：由表3及图3可知，OD值越小表示其破坏内毒素的能力越强，罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌株与其他菌株相比有更强的内毒素降解能力。
实施例4
罗伊氏乳杆菌JYLB-131对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用实验
1、试验组设计
1)试验分组：将300只30日龄的小鼠随机分为5组，每组60只，即空白对照组、模型组、药物组、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组、ATCC 53608组；
2)试验处理：
空白对照组：灌胃蒸馏水，每日1次，每次计量为10mL/kg，连续喂服10天，在第10天灌胃蒸馏水后一个小时，再次灌胃蒸馏水1次，计量为12mL/kg；
模型组：灌胃蒸馏水，每日1次，每次计量为10mL/kg，连续喂服10天，在第10天灌胃蒸馏水后一个小时，灌胃50度的白酒1次，计量为12mL/kg；
药物组：灌胃护肝片，每日1次，每次计量为10mL/kg，连续喂服10天，在第10天灌胃护肝片后一个小时，灌胃50度的白酒1次，计量为12mL/kg；
罗伊氏乳杆菌JYLB-131组：灌胃罗伊氏乳杆菌JYLB-131，每日1次，每次计量为10mL/kg(罗伊氏乳杆菌JYLB-131的活菌数为108cfu/mL)，连续喂服10天，在第10天灌罗伊氏乳杆菌JYLB-131后一个小时，灌胃50度的白酒1次，计量为12mL/kg；
ATCC 53608组：灌胃ATCC53608菌，每日1次，每次计量为10mL/kg(ATCC53608菌的活菌数为108cfu/mL)，连续喂服10天，在第10天灌胃ATCC53608菌后一个小时，灌胃50度的白酒1次，计量为12mL/kg；
3)小鼠肝脏处理
肝匀浆制备：以罗伊氏乳杆菌JYLB-131组中的一只小鼠为例，制备其肝脏组织上清液
(1)用生理盐水对罗伊氏乳杆菌JYLB-131组中的一只小鼠肝脏右叶组织漂洗3次，除去血液，晾干；
(2)按重量份数比，在含有6份生理盐水的烧杯内加入小鼠肝脏右叶组织，剪碎，形成悬浊液，将悬浊液移至玻璃匀浆管中，再用3份生理盐水清洗烧杯并将清洗烧杯的生理盐水倒入玻璃匀浆管中，研磨均匀，使小鼠肝脏右叶组织匀浆化，形成匀浆液，在转速为3000转/分钟，离心15分钟，制得肝脏组织上清液，备用；
根据罗伊氏乳杆菌JYLB-131组中的一只小鼠的肝脏组织上清液的制备方法，依次制备罗伊氏乳杆菌JYLB-131组其他小鼠的肝脏组织上清液，同时依照此方法制备其他各组小鼠的肝脏组织上清液，备用；
分别将各组中的肝脏组织上清液平均分为4份，即空白对照组A、模型组A、药物组A、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组A、ATCC53608组A；空白对照组B、模型组B、药物组B、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组B、ATCC53608组B；空白对照组C、模型组C、药物组C、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组C、ATCC53608组C；空白对照组D、模型组D、药物组D、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组D、ATCC53608组D，备用；
2、试验检测
1)肝脏乙醇脱氢酶活力(ADH)测定
利用肝脏乙醇脱氢酶活力(ADH)测试盒分别对空白对照组A、模型组A、药物组A、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组A、ATCC 53608组A中的肝脏组织上清液进行乙醇脱氢酶活力(ADH)测定，检测结果见表4及图4，操作步骤按试剂盒说明进行操作；
检测机理：乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)在含有辅酶I氧化还原酶(alcohol：NAD+oxidoreductase)存在的弱碱性范围内，乙醇脱氢酶催化乙醇的脱氢反应生成乙醛，NAD+被还原成还原型辅酶NADH，NADH在340nm处有最大吸收峰，通过测定340nm处吸光度的变化率得出其酶活性；
表4：各组中肝脏乙醇脱氢酶活力(ADH)检测
分组 ADH(U/mg protein)
Blank group 146.75
Model group 93.93
Drug group 128.54
JYLB-131 125
ATCC53608 94.6
检测结果，由表4及图4可知，罗伊氏乳杆菌JYLB-131使小鼠肝机体内有较高的ADH酶活力，肝脏乙醇脱氢酶活力达到125U/mg，与同类菌株相比效果显著，与药物治疗效果相近；
2)丙二醛(MDA)生成量测定
利用丙二醛(MDA)生成量测试盒分别对空白对照组B、模型组B、药物组B、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组B、ATCC53608组B中的肝脏组织上清液进行丙二醛(MDA)生产量测定，检测结果见表5及图5，操作步骤按试剂盒说明进行操作；
检测机理为：利用丙二醛(MDA)与硫代巴比妥酸(TBA)缩合能形成一种红色化合物，在532nm处有最大吸收值的特点，检测小鼠肝脏中MDA的含量；
表5：各组中丙二醛(MDA)生成量测定
分组 MDA(nmol/mg protein)
Blank group 2.38
Model group 3.39
Drug group 2.76
JYLB-131 2.29
ATCC53608 3.17
检测结果，由表5及图5可知，罗伊氏乳杆菌JYLB-131在降低MDA方面效果显著，MDA的生成量为2.29nmol/mg，与正常组水平相当，明显优于同类菌株效果和药物组效果；
3)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
利用超氧化物歧化酶(SOD)活性测试盒分别对空白对照组C、模型组C、药物组C、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组C、ATCC53608组C中的肝脏组织上清液进行超氧化物歧化酶活性测定，检测结果见表6及图6，操作步骤按试剂盒说明进行操作；
检测机理为：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，当肝脏组织上清液中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，在波长550nm处有最大吸收值；
表6：各组小鼠肝脏中SOD活性检测
分组 SOD(U/mg protein)
Blank group 72.74
Model group 52.78
Drug group 69.27
JYLB-131 77.43
ATCC53608 58.58
检测结果，由表6及图6可知，罗伊氏乳杆菌JYLB-131提高小鼠肝脏中SOD活性明显，小鼠肝脏中SOD的活性值为77.43U/mg，超出正常组小鼠水平；
4)还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定
利用肝脏谷胱甘肽(GSH)含量测试盒分别对空白对照组D、模型组D、药物组D、罗伊氏乳杆菌JYLB-131组D、ATCC53608组D中的肝脏组织上清液进行还原型谷胱甘肽含量测定，检测结果见表7及图7，操作步骤按试剂盒说明进行操作；
检测机理为：二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)是一种可被还原型谷胱甘肽GSH还原的二硫化物，DNTB被GSH还原后，生成一种淡黄色化合物，在412nm处有吸收峰，可通过测DNTB被还原的量而计算GSH的消耗量；
表7：各组小鼠肝脏中还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定
分组 GSH(mg/g protein)
Blank group 34.93
Model group 22.3
Drug group 45.37
JYLB-131 47.17
ATCC53608 24.47
检测结果，由表7及图7可知，罗伊氏乳杆菌JYLB-131与其他试验组相比，对提升小鼠肝脏中GSH水平效果明显，小鼠肝脏中还原型谷胱甘肽GSH的含量为47.17mg/g。
实施例5
罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的制备
1、罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的制备包括以下步骤：
1)按体积百分比，将1％的罗伊氏乳杆菌接种到99％的MRS液体培养基中，在37℃条件下，兼性厌氧培养18小时，吸取菌液，在2000转/分钟条件下、离心10分钟，冻干，得到沉淀物；
2)按体积份数比，在1份沉淀物中加入1份低聚异麦芽糖，混合均匀，得到罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉，罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉中罗伊氏乳杆菌的含量≥50亿/g。
试验1罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的肝解毒试验
动物来源：选取30日小白鼠，体重75g，随机分为2个小组，每组15个重复；
试验设置为：试验组1、对照组1，分别对试验组1、对照组1中小白鼠喂服苯唑青霉素，每日剂量为2g/50g，连续服用5日，5日后试验组1喂服罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉,用量为10mg/50g，每天灌胃一次，连用7日；空白对照组为采用清水，用量为10mg/kg，每天灌胃一次，连用7日；
7日后解剖各组的小白鼠，观察肝脏病理情况，记录肝肿大率、肝坏死率，结果见表8；
组别 肝肿大率 肝坏死率
试验组1 12％ 5％
对照组1 76％ 38％
由表8可知，试验组1中喂服罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉，可以有效缓解肝肿大以及坏死。
实施例6
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉作为主料制备乳酸菌片剂，步骤如下：
1)按重量份数比，取3份亮氨酸、4份蛋氨酸，混合均匀，制得氨基酸复合剂；
2)按重量份数比，在混合机内加入1份麦芽糖、0.5份柠檬酸、5份大豆蛋白、5份膳食纤维、1份生物素、3份氨基酸复合剂、2份蜂蜜、1份麦芽、0.5份稳定剂，混合均匀，形成辅料；
3)按重量份数比，在1份罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉中加入1份辅料，混合均匀，过筛、经过压片机，制得乳酸菌片剂。
在乳酸菌片剂中罗伊氏乳杆菌JYLB-131的含量为50亿/g。
实施例7
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉作为主料制备乳酸菌蜜膏，步骤如下：
1)按重量份数比，取2份亮氨酸、2份蛋氨酸、4份色氨酸、5份苏氨酸，混合均匀，制得氨基酸复合剂；
2)按重量份数比，在混合机内加入1份麦芽糖、0.7份柠檬酸、7份大豆蛋白、7份膳食纤维、1份生物素、4份氨基酸复合剂、1份麦芽、0.8份稳定剂，搅拌均匀，形成辅料；
3)按重量份数比，在8份蜂蜜中加入1份罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉、1份辅料，混合均匀，装瓶，制得乳酸菌蜜膏。
在乳酸菌蜜膏中罗伊氏乳杆菌JYLB-131的含量为250亿/g。
实施例8
以罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉作为主料制备乳酸菌颗粒剂，步骤如下：
1)按重量份数比，取3份亮蛋氨酸、4份色氨酸、5份苏氨酸，混合均匀，制得氨基酸复合剂；
2)按重量份数比，在混合机内加入2份麦芽糖、0.8份柠檬酸、8份大豆蛋白、8份膳食纤维、2份生物素、5份氨基酸复合剂、3份蜂蜜、2份麦芽、1份稳定剂，搅拌均匀，形成辅料；
3)按重量份数比，在1份罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉中加入1份辅料，混合均匀，过筛，经过制粒机，形成乳酸菌颗粒剂。
在乳酸菌颗粒剂中罗伊氏乳杆菌JYLB-131的含量为1000亿/g。
对比例1
对比例1与实施例3不同的是，缺少罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉，其他技术特征均相同。
对比例2
对比例2与实施例3不同的是，缺少氨基酸复合剂，其他技术特征均相同。
对比例3
对比例3与实施例3不同的是，缺少罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉、氨基酸复合剂，其他技术特征均相同。
对比例4
对比例4为hydrodol氨基酸片醒酒胶囊(购自京东商城，产地为澳大利亚)。
试验2本发明中含有罗伊氏乳杆菌JYLB-131的食品用于预防酒后不适的试验
试验成员来源：30岁成年男性，体重为75kg，每组各5人。
设置7个试验组、1个对照组2，每组成员在饮酒前30分钟，服用实施例6-8中的食品5g、对比例1-3中的食品5g，以及对比例4购买的药物(服用按说明书服用，饮酒前服用4粒)，然后各组试验成员均饮用白酒300mL，之后分别观察各组成员在饮酒后30分钟、饮酒后60分钟、饮酒后150分钟的不适症状，并测量饮酒后60分钟时各组成员的血压，并记录结果，结果见表9；
表9：实施例6-8、对照例1-4、对照组2预防酒后不适的试验
由表9可知，本发明制备的食品在饮酒前服用，可以有效改善酒后不适，避免酒后头痛、头晕、呕吐等症状，效果以实施例8最佳，明显优于其他实施例组和对比例组、对照组。
试验3本发明中含有罗伊氏乳杆菌JYLB-131的食品或制剂用于改善酒后不适的试验
试验成员来源：30岁成年男性，体重为75kg；
设置7个试验组、1个对照组3，每组各5人每组成员均饮酒300mL，在饮酒后20分钟，服用服用实施例6-8中的食品5g、对比例1-3中的食品5g，对比例4购买的药物(按说明书在饮酒前服用4粒)，然后分别观察各组成员在饮酒后60分钟、饮酒后120分钟、饮酒后150分钟的不适症状，并测量饮酒后120分钟时各组成员的血压，并记录结果，结果见表10；
表10：实施例6-8、对照例1-4、对照组3改善酒后不适的试验
由表10可知，本发明制备的食品或制剂在饮酒后使用，可以有效改善酒后不适，避免酒后头痛、头晕、呕吐症状的发现，本发明实施例中的以罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉为主料制备的食品，对于改善酒后不适的效果以实施例8为最佳，而对比例1-4对于改善酒后不适的效果较差，尤其是对比例3，由于没有加入罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉、氨基酸复合剂，依靠蜂蜜、麦芽等组分来改善酒后不适的效果不佳。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌及其在食品、药品中的应用
<130> 2019
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1508
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌JYLB-131(Lactobacillus reuteriJYLB-131)
<400> 1
tcaggatgaa cgccggcggt gtgcctaata catgcaagtc gtacgcactg gcccaactga 60
ttgatggtgc ttgcacctga ttgacgttgg atcaccagtg agtggcggac gggtgagtaa 120
cacgtaggta acctgccccg gagcggggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca 180
taacaacaaa agccacatgg cttttgtttg aaagatggct ttggctatca ctctgggatg 240
gacctgcggt gcattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgat gatgcatagc 300
cgagttgaga gactgatcgg ccacaatgga actgagacac ggtccatact cctacgggag 360
gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg caagcctgat ggagcaacac cgcgtgagtg 420
aagaagggtt tcggctcgta aagctctgtt gttggagaag aacgtgcgtg agagtaactg 480
ttcacgcagt gacggtatcc aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 540
taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt 600
gcttaggtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccgaagaa gtgcatcgga aaccgggcga 660
cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg 720
gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgcaac tgacgctgag gctcgaaagc 780
atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctagg 840
tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 900
gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 960
tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tgcgctaacc 1020
ttagagataa ggcgttccct tcggggacgc aatgacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt actagttgcc 1140
agcattaagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggacg 1200
acgtcagatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca 1260
acgagtcgca agctcgcgag agtaagctaa tctcttaaag ccgttctcag ttcggactgt 1320
aggctgcaac tcgcctacac gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1380
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ttgtaacgcc 1440
caaagtcggt ggcctaacct ttatggaggg agccgcctaa ggcgggacag atgactgggg 1500
tgaagtcg 1508
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.一种提高酒后乙醇脱氢酶活力的罗伊氏乳杆菌JYLB-131，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的保藏编号为：CGMCC NO.18040，菌种命名为JYLB-131，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
2.如权利要求1所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131在制备食品或药品中应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的食品或药品具有解酒护肝作用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的食品或药品具有提高酒后乙醇脱氢酶活力的作用、降低酒后丙二醛含量的作用、提高酒后超氧化物歧化酶活性的作用、提高酒后还原型谷胱甘肽含量的作用。
5.一种食品，其特征在于，以权利要求1中所述的保藏编号为：CGMCC NO.18040的罗伊氏乳杆菌JYLB-131进行制备。
6.根据权利要求5所述的一种食品，其特征在于，所述食品包含罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉。
7.根据权利要求6所述的一种食品，其特征在于，所述含有罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的食品的剂型为片剂、蜜膏、口服剂、颗粒剂或胶囊。
8.根据权利要求6所述的一种食品，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉中罗伊氏乳杆菌的活菌含量≥50亿/g。
9.根据权利要求6所述食品，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉的制备方法，包括：
1)按体积百分比，将1％的罗伊氏乳杆菌JYLB-131接种到99％的MRS液体培养基中，在37℃条件下，兼性厌氧培养18小时，吸取菌液，在2000转/分钟条件下、离心10分钟，冻干，得到沉淀物；
2)按体积份数比，在1份沉淀物中加入1份低聚异麦芽糖，混合均匀，得到罗伊氏乳杆菌JYLB-131菌粉；
所述MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O0.05g、蒸馏水1000mL。
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