KR102586000B1 - 아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 hdb1098 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 숙취 해소용 조성물 - Google Patents
아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 hdb1098 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 숙취 해소용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알코올 섭취 후 숙취 증상을 일으키는 아세트알데히드를 분해하는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여주는 신규 유산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 숙취 증상 예방 및 해소용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 신규 유산균 균주는 알코올 분해효소보다는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여줌으로써 알코올 섭취 후 숙취 증상을 해소 또는 완화시켜 줄 수 있으며, 균주 자체가 아세트알데히드 분해효소의 활성을 가지므로 유전적인 문제로 아세트알데히드를 제대로 분해하지 못하는 아세트알데히드 분해효소 아형(acetaldehyde dehydrogenase 2 mutation; ALDH2*2)을 지닌 사람과 같이 숙취 증상 해소에 어려움을 가지는 객체에 투여하여 숙취 증상 예방 및 해소에 기여할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따르면, 상기 신규 유산균 균주는 알코올 분해효소보다는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여줌으로써 알코올 섭취 후 숙취 증상을 해소 또는 완화시켜 줄 수 있으며, 균주 자체가 아세트알데히드 분해효소의 활성을 가지므로 유전적인 문제로 아세트알데히드를 제대로 분해하지 못하는 아세트알데히드 분해효소 아형(acetaldehyde dehydrogenase 2 mutation; ALDH2*2)을 지닌 사람과 같이 숙취 증상 해소에 어려움을 가지는 객체에 투여하여 숙취 증상 예방 및 해소에 기여할 수 있다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 알코올 섭취 후 숙취 증상을 일으키는 아세트알데히드를 분해하는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여주는 신규 유산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 숙취 해소용 조성물에 관한 것이다.
술은 예로부터 인간이 사회적 관계 형성과 스트레스 해소 목적 등으로 사용하던 기호성 식품이다. 현재까지도 다양한 상황에서 많이 애용이 되고 있지만 술을 마시고 난 후 메스꺼움, 구토, 두통과 같은 술로 인한 숙취를 유발하게 된다. 이러한 이유로 숙취에 대한 많은 연구가 이어지고 숙취 해소를 위한 다양한 제품들이 출시되고 있다.
술의 주 성분인 에탄올이 체내로 들어오면 알코올 분해효소(alcohol dehydrogenase), 시토크롬 P450 2E1(CYP2E1) 및 다양한 카탈라아제에 의해 아세트알데히드로 전환되며, 이 후 아세트알데히드 분해효소(acetaldehyde dehydrogenase)에 의해 아세테이트로 전환된다. 최종적으로 아세테이트는 이산화탄소와 물로 완전히 분해된다. 이 중 에탄올이 산화되어 생성되는 아세트알데히드는 독성 물질로 알코올에 의한 홍조 반응, 심박수 증가 및 두통 등 숙취 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다.
하지만, 동양인의 30~40%는 아세트알데히드를 제대로 분해하지 못하는데 이는 유전적인 문제로 아세트알데히드 분해효소 아형(acetaldehyde dehydrogenase 2 mutation; ALDH2*2)의 존재가 미치는 영향 매우 크다. 이러한 유전적인 요인은 일상 생활에 큰 문제를 야기하지 않지만, 술이 체내로 들어오면 알코올 분해효소에 의해 아세트알데히드로 전환되지만 아세테이트로의 전환이 적어 간에 아세트알데히드가 쌓여 독소를 계속 지니게 된다. 적은 양의 술의 섭취는 적은 효소로도 분해가 가능하지만, 과량의 음주는 이와 같은 유전적인 문제로 인해 알코올 분해효소에 의해 분해된 아세트알데히드가 아세테이트로 분해되지 않아 간에 독소를 더욱 쌓이게 된다(Chen et al., 2014). 즉 아세트알데히드 분해효소의 활성이 낮은데 알코올 분해효소의 활성이 높다면 혈중 아세트알데히드의 농도가 증가되어 오히려 아세트알데히드 독소로 인한 숙취 증상이 증대될 수 있다. 이러한 이유로 알코올분해효소와 아세트알데히드 분해효소를 동시에 활성화하는 것이 아닌, 아세트알데히드분해효소를 활성화하여 간에 쌓이는 독소를 빠르게 제거하는 것이 아세트알데히드 분해효소 아형을 지닌 사람들에게는 효율적일 수 있다.
2015년 국민건강보험공단 보고서에 의하면 음주로 인한 사회경제적 손실비용은 연간 9조 4,524억원에 달하며, 매년 증가하는 추세를 보이고 있다. 이와 같은 이유로 다양한 숙취 해소 제품들이 개발되고 있지만 옛 문헌을 참고하여 시판중인 제품들에 대한 숙취해소 근거가 부족하다고 판단하여 식품의약품안전처(이하 식약처)에서는 숙취해소 효능에 대한 과학적 근거를 포함하는 숙취해소 제품에 대해서 판매를 허가하는 방향으로 규제를 강화하고 가이드라인을 마련하고 있다.
한편, 프로바이오틱스는 WHO에서 “적당량 섭취 시 숙주에게 건강상 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물”이라는 정의를 내렸지만, 많은 연구를 통해 미생물뿐만 아니라 그의 배양성분까지 확대되면서 '유산균을 이용한 사균체' 또한 프로바이오틱스의 범주에 포함되고 있다.
이러한 변화에 국내 식약처에서도 프로바이오틱스는 상기와 같이 정의하였으며, 식약처에서 고시한 19종의 유산균에는 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 가세리 등을 포함하는 락토바실러스 속, 락토코커스 락티스를 포함하는 락토코커스 속, 엔테로코커스 패칼리스, 엔테로코커스 패슘을 포함하는 엔테로코커스 속, 스트렙토코커스 써모필러스를 포함하는 스트렙토코커스 속, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레브 등을 포함하는 비피도박테리움 속이 있다.
한편, 대한민국 등록특허 제 10-2262646호에는 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물에 관련된 내용이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제 10-2251295호에는 락토바실러스 살리바리우스 V133 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물에 관련된 내용이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제 10-2022-0050257호에서 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 EFEL6800 발효 종균과 이를 이용한 발효 채소에 관련된 내용이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 10-2022-0114993호에는 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 CJNU 1840 균주 및 이의 용도로 커피추출액에 내성을 가지는 신규 미생물 및 이를 이용한 생물 전환된 커피 추출물에 관한 내용이 개시되어 있다. 대한민국 공개특허 10-2004-0104153호에는 알코올 분해능이 있는 유산균 및 그를 함유하는 유제품, 건강 기능성 식품 및 식품첨가제로 생균체의 락토바실러스 퍼멘텀 및 이를 이용한 발효제품에 관련된 내용이 개시되어 있다. 그러나, 숙취의 원인이 되는 아세트알데히드만을 선택적으로 분해하는 유산균은 개시되어 있지 않다.
본 발명자들은 알코올로부터 유래한 숙취 유발 물질인 아세트알데히드만을 선택적으로 분해가 가능한 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주를 분리 동정하고, 이를 숙취 예방 또는 해소용 조성물의 기능성 소재로서 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Chen et al., Targeting aldehyde dehydrogenase 2: New therapeutic opportunities, Physiol Rev 94: 1-34, 2014
본 발명의 주된 목적은 숙취해소에 도움을 주는 선택적인 아세트알데히드 분해효소 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주를 함유하는 아세트알데히드의 분해를 유도하여 혈중 농도를 줄여 숙취 증상을 완화하는데 도움을 주는 숙취 해소용 식품 또는 의약품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명은 숙취 증상 완화 및 해소에 효과를 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주 (기탁번호: KCCM13264P)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 생막걸리로부터 분리된 신규한 유산균으로서, API kit 와 16S rRNA 시퀀싱을 통해 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주로 동정하였으며, 선택적인 아세트알데히드 분해효소 활성을 가지는 것을 확인하고 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 (Lactobacillus fermentum HDB1098)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM)에 2022.11.09자로 기탁하여 기탁번호 KCCM13264P를 부여받았다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 균주는 알코올 분해효소보다는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여주는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 여러 균주들중에서 알코올 분해효소 활성에 비해 아세트알데히드 분해효소 활성이 5배 이상 현저히 높은, 즉 선택적으로 알세트알데히드 분해효소의 활성을 갖는 균주를 선발하여 분리 동정하였으며, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주로 명명하였다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 균주는 생균체보다는 사균체가 아세트알데히드 분해효소의 활성이 더 높은 것을 특징으로 하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 아세트알데히드를 분해하는 효능이 유산균주의 대사산물 유래인지 확인하고자 배지성분, 생균체, 및 사균체의 아세트알데히드 분해효소의 활성을 비교실험한 결과, 대사산물을 포함하는 배지성분보다 생균체 및 사균체의 아세트알데히드 분해효소 활성이 높아서 아세트알데히드 분해효소의 활성화는 균주 유래의 대사산물이 아닌 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균체 자체의 특성임을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) HDB1098은 특이하게도 생균체보다는 사균체가 아세트알데히드 분해효소의 활성이 더 높은 것을 확인하였다. 사균체가 생균체에 비해 다루기 쉽고 안정하기 때문에, 이를 원료로 한 숙취 해소용 조성물의 가공, 보관 및 유통과정에서도 장점으로 작용할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주의 생균체 또는 사균체, 바람직하게는 사균체를 유효성분으로 포함하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주는 알코올 분해효소보다는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여줌으로써 알코올 섭취 후 숙취 증상을 해소 또는 완화시켜 줄 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 균주의 사균체는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주를 배양후 배지성분이 제거된 균체를 열처리하여 사균화시킨 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물을 제공한다. 상기 균주의 배양은 유산균 배양에 적합한 어떤 조건에서도 배양할 수 있으나, 바람직하게 35~40℃, pH 6.0~6.5의 조건에서 배양된 것이 좋다. 상기 열처리는 균체를 사균화시킬 수 있는 어떤 온도에서도 열처리할 수 있으나, 바람직하게는 70~125℃의 조건에서 30~120분간, 더욱 바람직하게는 110~121℃ 조건에서 60~90 분간 열처리하여 제조된 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 균주의 사균체는 건조후 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 유전적인 문제로 아세트알데히드를 분해하지 못하는 아세트알데히드 분해효소 아형(acetaldehyde dehydrogenase 2 mutation; ALDH2*2)을 가지는 객체에 투여하는 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 균주 자체가 아세트알데히드 분해효소의 활성을 가지고 있음을 확인하였으므로, 유전적인 문제로 아세트알데히드를 제대로 분해하지 못하는 아세트알데히드 분해효소 아형(acetaldehyde dehydrogenase 2 mutation; ALDH2*2)을 가지는 객체에 투여하여도 숙취를 해소시켜 줄 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주의 사균체를 0.001~100 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유 및 건강기능식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제품인 것일 수 있다. 상기와 같은 제품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합체, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 단당류(예를 들어 포도당, 과당 등), 이당류 (예를 들어 말토스, 스크로스, 올리고당 등) 및 다당류(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알코올이다. 향미제로서 천연 향미제(타우마린, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오사이드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 매실 추출액 또는 헛개나무열매 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 HDB1098 균주의 사균체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취 할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 요거트, 발효유, 바터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장 소스 등) 등에 첨가하여 제조 될 수 있다.
또한, 본 발명의 HDB1098 균주의 사균체를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 액상, 분말, 과립, 정제 및 캅셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약품 조성물은 바람직하게는 경구로 투여될 수 있으며, 상기 조성물의 약학적으로 유효한 사용량은 연령, 건강 상태 정도 등의 개인차나 제형, 형태에 따라 적절하게 조절될 수 있으나, 바람직하게는 건조된 HDB1098 균주의 사균체의 중량를 일반적으로 성인 하루당 10∼3000mg이 되도록 투여하는 것이 적당하다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098은 아세트알데히드 분해효소를 선택적으로 활성화하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 낮춰주어 알코올 섭취에 의해 발생되는 숙취 증상의 완화 또는 해소에 도움을 줄 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098은 아세트알데히드 분해효소가 부족하거나 유전적으로 활성화가 유도되지 않아 아세트알데히드의 분해가 어려운 상태에서 아세테이트로의 전환을 유도하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 신규 유산균 균주는 알코올 분해효소보다는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여줌으로써 알코올 섭취 후 숙취 증상을 해소 또는 완화시켜 줄 수 있으며, 균주 자체가 아세트알데히드 분해효소의 활성을 가지므로 유전적인 문제로 아세트알데히드를 제대로 분해하지 못하는 아세트알데히드 분해효소 아형(acetaldehyde dehydrogenase 2 mutation; ALDH2*2)을 가지는 객체에 투여하여 숙취를 해소시켜 줄 수 있는 장점이 있다.
도 1은 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 생균, 배지성분 및 사균 제제의 아세트알데히드 분해 활성을 비교 실험한 그래프이다.
도 2는 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 혈중 알코올 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 간 조직의 알코올 분해효소 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 혈중 아세트알데히드 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 간 조직의 아세트알데히드 분해효소 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 혈중 알코올 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 간 조직의 알코올 분해효소 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 혈중 아세트알데히드 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 알코올 투여 30분 전 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주의 사균체를 투여한 실험동물의 간 조직의 아세트알데히드 분해효소 활성을 확인한 결과이다.
본 발명에 대한 내용은 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
아세트알데히드 선택적 분해능을 가지는 균주 선별
아세트알데히드를 선택적으로 분해할 수 있는 유산균 분리를 위해 여러 종류의 생막걸리 시료 1g을 멸균 생리식염수(염화나트륨 0.85% (v/v)) 9mL에 현탁하고 10배수로 단계적으로 희석하였다. 희석액은 BCP agar에서 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양결과 BCP agar에서 균체가 노란색을 띄면 콜로니를 수득하여 MRS agar에 도말 하였다. 도말한 균주가 현미경에서 관찰 시 단일 균주가 되도록 지속적으로 MRS agar에서 계대 배양하며 순수 분리하였다.
위와 같은 단계를 통해 유산균 14종을 분리하였다. 분리한 균주는 각각 MRS broth에서 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하여 알코올 분해효소 활성평가 및 아세트알데히드 분해효소 활성평가에 사용하였다. 평가를 위해 ADH assay kit (abcam, cat. ab102533, england), ALDH assay kit (abcam, cat. ab155893, england)를 사용하였으며 분석 방법은 kit에 동봉된 protocol을 참고하여 진행하였다. 평가 후 알코올분해효소와 아세트알데히드 분해효소의 합을 100(%)으로 설정하고 아세트알데히드 분해효소의 활성이 알코올분해효소의 활성보다 우수하며 분해효소 활성 비율이 80%를 넘는 1종을 선별하였다. 활성도(%) 결과는 [표1]에 나타내었다. [표1] 아세트알데히드 선택적 분해능을 가지는 균주 선별
| Strain | 알코올분해효소 활성(%) | 아세트알데히드분해효소 활성(%) |
| HDB1233 | 58.8 | 41.2 |
| HDB1237 | 61.4 | 38.6 |
| HDB1239 | 62.5 | 37.5 |
| HDB1193 | 71.8 | 28.2 |
| HDB1197 | 39.5 | 60.5 |
| HDB1198 | 25 | 75 |
| HDB1095 | 34.3 | 65.7 |
| HDB1098 | 15.2 | 84.8 |
| HDB1250 | 52.2 | 47.8 |
| HDB1313 | 32.2 | 67.8 |
| HDB1314 | 33.4 | 66.6 |
| HDB1315 | 26 | 74 |
| HDB1316 | 83.6 | 16.4 |
| HDB1317 | 47.4 | 52.6 |
[실시예 2]
아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 균주 동정
실시예 1에서 선발한 아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 균주를 MRS 액체 배지에서 하루 배양 후 API 50 CHL medium kit를 통해 탄소원 이용 패턴을 확인하여 이화학적 동정을 수행하였다. 보라색의 배지가 kit 내 당을 이용하면 노란색으로 변하게 되며, 이는 양성(+)으로 표시하였으며, 색이 변하지 않은 배지는 음성(-)으로 표시하였다. 위 결과는 API web을 통해서 본 균주가 락토바실러스 퍼멘텀(99.6% 일치)임을 확인하였으며 결과는 다음 [표2]과 같다. [표2] API kit를 이용한 이화학적 동정
| Glycerol | - | Salicin | - |
| Erythritol | - | Cellobiose | - |
| D-arabinose | - | Maltose | + |
| L-arabinose | - | Lactose | + |
| D-ribose | + | Melibiose | + |
| D-xylose | - | Sucrose | + |
| L-xylose | - | Trehalose | - |
| D-adonitol | - | Inulin | - |
| Methyl-BD-xylopyranosicle | - | Melezitose | - |
| D-galactose | + | Raffinose | + |
| D-glucose | + | Starch | - |
| D-fructose | + | Glycogen | - |
| D-mannose | - | Xylitol | - |
| L-sorbose | - | Gentiobiose | - |
| Rhamnose | - | D-turanose | - |
| Dulcitol | - | D-lyxose | - |
| Inositol | - | D-tagatose | - |
| Mannitol | - | D-fucose | - |
| Sorbitol | - | L-fucose | - |
| α-Methyl-D-mannoside | - | D-arabitol | - |
| α-Methyl-D-glucoside | - | L-arabitol | - |
| N-acetyl-glucosamine | - | Glutonate | + |
| Amygdalin | - | 2-Keto-gluconate | - |
| Arbutin | - | 5-Keto-gluconate | - |
| Esculin | - | - |
또한, 분리된 균주는 유전체 DNA를 추출하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법을 통하여 16S rRNA 부분 시퀀싱을 수행하여 유전자 정보를 확보하였다[서열번호 1]. 확보한 유전자 정보를 미국국립생물자원센터(National Center for Biotechnology Information, USA)의 미생물 유전자 정보 프로그램으로 유전자 염기서열을 비교하여 균주의 유사성 결과를 통해 균주 명칭을 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)으로 확인하였다. 상기 균주는 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 (Lactobacillus fermentum HDB1098)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM)에 2022.11.09자로 기탁하여 기탁번호 KCCM13264P를 부여받았다.
[실시예 3] 락토바실러스 퍼멘텀 균주들의 아세트알데히드 분해효소 활성 비교
실시예 2를 통해 확인한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098과 자사 보유의 락토바실러스퍼멘텀 1종 및 KCCM 균주 2종(KCCM35461, KCCM35469)으로 같은 락토바실러스 퍼멘텀 간 알코올 및 아세트알데히드 분해효소 기질 특이적인 선택적 활성을 비교하였다. 분해효소 활성을 위한 실험은 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
[표3]에서 표현한 것처럼, 같은 락토바실러스 퍼멘텀 균주라도 알코올 및 아세트알데히드 분해효소의 활성도는 서로 다르며, 각각이 활성화하는 주 효소도 다른 것을 확인할 수 있었다. 이 중 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주는 아세트알데히드 분해효소가 주 활성 효소이며, 실시예 1의 결과와 같이 80% 이상의 활성 비율을 가지는 반면 KCCM35461, KCCM35469는 선택적 활성 효과가 없고 HDB1096은 알코올 분해효소 활성에 선택적으로 작용하는 것으로 나타났다.
| Strain | 알코올분해효소 활성(%) | 아세트알데히드분해효소 활성(%) |
| HDB1096 | 63.9 | 36.1 |
| HDB1098 | 18.8 | 81.2 |
| KCCM35461 | 59.2 | 40.8 |
| KCCM35469 | 47.2 | 52.8 |
[실시예 4] 아세트알데히드를 선택적으로 분해하는 유산균 사균체 제조
유산균 배양분말의 제조를 위해 다음과 같이 수행하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균주를 멸균한 MRS 액체배지에 접종하고 37℃ 조건에서 24시간 배양하여 종배양액으로 하였다. 본 배양은 기본 배지로서 물 1L 기준, 포도당 4% (w/v), 효모추출물 2% (w/v), 인산칼륨 0.2% (w/v), 황산암모늄 0.2% (w/v), 황산마그네슘 0.02% (w/v) 가 되도록 각 성분을 물에 용해하여 121~123℃ 조건에서 30분간 멸균하였다. 멸균된 발효조의 기본배지에 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 종배양액을 접종하고 35~40℃ 조건에서 20시간 동안 배양하되, 수산화나트륨 수용액을 일정시간 간격으로 적하하면서 pH 6.0~6.5로 유지하며 배양하였다.
종료된 배양액을 7,000 rpm의 조건에서 20분간 원심분리 하여 배지 성분을 제거하였다. 배지 성분이 제거된 균체에 멸균수를 투입하여 현탁시킨 후 원심분리 하였다. 위와 같은 방법을 2회 반복 진행하였다. 원심분리를 통해 배지 성분이 충분히 제거된 유산균 균체를 멸균수를 투입하여 현탁시킨 후 110~121℃ 조건에서 60~90 분간 열처리하여 사균화 하였다. 충분히 사균화를 진행한 후 건조하여 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말을 수득하였다.
[실시예 5] 선별 균주의 생균, 배지성분 및 사균 제제의 아세트알데히드 분해 기능성 평가
실시예 4에서 유산균주를 배양 후 배지 성분을 제거하여 제조한 생균제제와 대사산물을 포함하는 배지성분 및 실시예 4로 만든 사균제제를 바탕으로 유산균 형태에 의한 아세트알데히드 분해 기능성 평가를 진행하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
아세트알데히드를 분해하는 효능이 유산균주의 대사산물 유래인지 확인하고자 진행한 평가에서 대사산물을 포함하는 배지성분의 아세트알데히드 분해효소 활성은 55.6 ± 13.9nmol/min/g 으로 가장 낮았으며, 사균이 235.13 ± 51.1nmol/min/g으로 가장 높은 결과를 가졌다. 이러한 결과로 보아 아세트알데히드 분해효소의 활성화는 균주 유래의 대사산물이 아닌 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 균체 자체의 특성으로 보인다.
[실시예 6] 선별 균주의 에탄올 및 아세트알데히드 선택적 분해 기능성 평가
실시예 4에서 제조한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 배양 분말을 숙취 증상 해소에 대한 선택적 기능성 평가를 위해 에탄올 및 아세트알데히드 분해 및 효소활성 평가를 실시하였다.
시험을 위해 ㈜오리엔트바이오로부터 6주령의 수컷 SD 랫트(Rat)를 입수하였다. 일정한 조건(온도: 19~25℃, 상대습도: 30~70%, 환기 10~15회/시간, 주명주기: 12시간/일, 조도: 150~300 Lux 이상)에서 사육하였으며 고형 사료를 자유 급여하였다. 모든 동물에 대하여 검역 및 순화기간 동안 매일 1회 일반증상을 관찰하였으며, 이상증상이 없는 동물을 시험에 사용하였다.
유산균 배양 분말은 멸균한 증류수에 저용량, 중용량, 고용량을 각각 3.25, 6.5, 13mg/kg body weight/d가 되도록 용량을 설정하였으며, 투여량은 10mL/kg로 하여 랫트에 경구 투여하였다.
유산균 배양 분말을 투여 후, 30% 에탄올 10mL/kg을 경구투여하여 숙취를 유발시켰다. 채혈은 유산균 투여 전 blank군의 경정맥에서 채혈하였으며, 음성대조군(에탄올 투여군) 및 각 시험군에서 에탄올 투여 후 1, 3, 5시간 마다 채혈하였다. 혈액은 원심분리하여 혈청만을 수득하여 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 측정 시험에 사용하였다. 5시간의 채혈 종료 후, 랫트를 이산화탄소로 안락사하고 간을 적출하였다. 간은 액체질소로 얼린 후 -80℃ deep freezer에 보관하여 사용하였다. 다음은 숙취 해소 기능성 평가를 위해 진행한 시험 방법 및 결과이다.
6-1. 선별 유산균 배양 분말의 혈중 알코올 농도 측정
[도 2]는 경정맥에서 채혈한 샘플의 혈청에서 혈중 알코올 농도를 측정하였다. 선별한 유산균 샘플을 처리하지 않은 음성대조군은 알코올 섭취 전 (5 ± 6 mg/dL)에서 1시간 후 혈중 에탄올 농도가 150 ± 60 mg/dL, 3시간 후 194 ± 68 mg/dL, 및 5시간 후 99 ± 9 mg/dL 를 나타냈다. 저용량의 유산균 샘플 처리군은 각 채혈 시간에서 134 ± 74 mg/dL, 190 ± 48 mg/dL, 114 ± 25 mg/dL 로 음성대조군과 비교하여 유의적 차이를 나타내지 않았다. 또한, 중용량 시험군은 128 ± 82 mg/dL, 210 ± 63 mg/dL, 123 ± 43 mg/dL 를 나타내었으며, 고용량을 투여한 군에서는 각 시간대에서 117 ± 97 mg/dL, 226 ± 41 mg/dL, 127 ± 20mg/dL 의 혈중 알코올 농도를 나타냈다. 두 시험군 역시 저용량 유산균 시험군과 같이 음성대조군과의 비교에서 유의적인 결과를 보이지 않았다.
6-2. 선별 유산균 배양 분말 투여 시 알코올분해효소 활성
선별한 유산균 분말을 투여 후 알코올분해효소 활성을 확인하기 위해 액체질소로 얼린 간을 마쇄하여 사용하였다. 알코올분해효소 활성 평가를 위해 Kit (Alcohol dehydrogenase colorimetric assay kit, cat.no K787-100, biovision, USA)를 사용하였다. 분석방법은 kit에 동봉된 protocol을 참고하였다.
Blank군에서 알코올분해효소는 8.0 ± 2.8 mU/mg이 확인되었으며, 에탄올을 투여한 음성대조군은 5.4 ± 3.7 mU/mg으로 효소 활성 결과가 확인되었다. 유산균 배양 분말 저농도 시험군의 알코올분해효소는 5.5 ± 3.1 mU/mg으로 음성대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한, 중용량 시험군과 고용량 시험군은 각각 6.3 ± 3.5 mU/mg, 7.0 ± 3.8 mU/mg의 결과가 측정되어 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의적인 결과를 확인하지 못했다. 즉, 선별한 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀은 알코올분해효소를 활성화하지 않기 때문에 알코올에서 아세트알데히드로의 분해를 촉진하지 않았다. 효소 활성평가에 대한 결과는 [도 3]에서 나타내었다.
6-3. 선별한 유산균 배양 분말 투여 시 혈중 아세트알데히드 변화
[도 4]에서는 선별한 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098의 배양분말을 투여했을 때 혈중 아세트알데히드의 변화를 확인하였다. 음성대조군의 혈중 아세트알데히드는 에탄올 투여 1시간 후 6.05 ± 1.13 mg/dL, 3시간 후 2.54 ± 0.68 mg/dL, 5시간 후 0.75 ± 0.19 mg/dL로 0시간 (0.81 ± 0.29 mg/dL)에서 1시간까지 혈중 아세트알데히드의 농도가 증가하다가 이 후 감소하는 경향을 보였다. 저용량의 유산균배양분말 시험군은 1시간 후 4.8 ± 0.75 mg/dL를 나타냈지만, 3시간 후 1.88 ± 0.25 mg/dL, 5시간 후 0.61 ± 0.12 mg/dL로 1시간 이 후 감소하는 경향을 보였으며, 모든 측정 구간에서 음성대조군과 비교하여 유의한 차이를 보였다. 중용량 투여군은 3.1 ± 0.77 mg/dL, 1.23 ± 0.43 mg/dL, 0.49 ± 0.15 mg/dL를, 고용량 유산균 샘플 처리군은 1.68 ± 0.76 mg/dL, 0.9 ± 0.92 mg/dL, 0.44 ± 0.21 mg/dL로 각각의 혈액 샘플 채취 시간에 혈중 아세트알데히드의 농도가 감소하는 경향을 보였으며, 음성대조군에 비교하여 유의적인 차이를 나타냈다. 또한, 농도가 증가함에 따라 아세트알데히드의 농도가 빠르게 감소하는 농도의존적인 결과도 나타냈다. 이러한 결과로, 선별한 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098은 알코올로부터 생성된 아세트알데히드를 빠르게 분해시켜 숙취 해소에 효과가 있는 것으로 설명할 수 있다.
6-4. 선별 유산균 배양 분말의 아세트알데히드 분해효소 활성
락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말의 아세트알데히드 분해효소 활성을 평가하기 위해 동결시킨 SD랫트의 간을 사용하였다. 아세트알데히드 분해효소의 활성은 Aldehyde dehydrogenase activity colorimetric assay kit (cat No. K731-100, biovision, USA)를 사용하였으며, 동봉된 protocol을 바탕으로 실험을 진행하였다.
[도 5]에서, 음성대조군의 아세트알데히드 분해효소 활성은 0.5 mU/mg 으로 측정되었다. 반면, 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말 저용량군은 0.4 mU/mg이며, 중용량군은 0.6 mU/mg 으로 음성대조군과 비교하였을 때, 유의한 차이를 보이지 않았다. 사균체 고용량군은 0.8 mU/mg 으로 음성대조군과 유의적차이를 나타냈으며, blank 군인 0.9 mU/mg에 근접한 결과를 나타내었다. 다시 말해, 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말은 아세트알데히드 분해효소를 활성화시켜 혈중 아세트알데히드를 제거함으로서 정상화에 기여하였다.
이러한 결과를 종합하면 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098은 알코올을 섭취 시, 알코올 분해효소의 활성에 직접적인 영향을 주지 않기 때문에 아세트알데히드로 산화를 유도하지 않아 간에 독성물질로 인한 피로가 쌓이지 않게 도와줄 수 있다. 또한, 아세트알데히드 분해 효소를 활성화하여 혈중 아세트알데히드를 아세테이트로 빠르게 전환시켜 농도를 낮추고 이로 인해 발생할 수 있는 숙취 증상을 완화시킬 수 있다.
이러한 효과로, 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098은 아세트알데히드만을 선택적으로 분해하여 알코올로부터 유래한 독성 물질을 제거하는데 도움을 주며, 아세트알데히드를 효과적으로 제거하지 못하는 사람들에게 숙취 증상 해소에 효과가 있는 것으로 설명할 수 있다.
위 명세서는 락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098이 식품, 식품첨가제, 기능성표시식품 및 건강기능식품 등 다양한 분야에 사용이 가능하며, 언급하지 않은 의약품과 같은 유형의 제품으로의 제조가 불가능한 것이 아니기 때문에 위의 기술분야 외에 다른 유형의 제품 역시 본 발명의 범위에 속한다고 볼 수 있다.
본 발명의 숙취 해소용 조성물은 아래와 같은 제형으로 제조될 수 있으며, 아래의 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
[제제예 1] 정제의 제조
락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말 200 ㎎
유당 100 ㎎
전분 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.
[제제예 2] 액제의 제조
락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말 1000 ㎎
설탕 20 g
이성화당 20 g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
[제제예 3] 캅셀제의 제조
락토바실러스 퍼멘텀 HDB1098 사균체 분말 300 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
락토오스 14.8 ㎎
마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎
통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캅셀에 충전하여 캅셀제를 제조한다.
본 발명에 대해 상기 실시예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다.
Claims (8)
- 숙취 증상 완화 및 해소에 효과를 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주로서, 상기 균주는 알코올 분해효소보다는 아세트알데히드 분해효소의 활성을 선택적으로 촉진하여 혈중 아세트알데히드의 농도를 줄여주고, 상기 균주는 생균체보다는 사균체가 아세트알데히드 분해효소의 활성이 더 높은 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCCM 13264P로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 따른 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주의 사균체를 유효성분을 포함하는 숙취 예방 또는 해소용 식품 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 균주의 사균체는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) HDB1098 균주를 배양후 배지성분이 제거된 균체를 열처리하여 사균화시킨 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 식품 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 유전적인 문제로 아세트알데히드를 분해하지 못하는 아세트알데히드 분해효소 아형을 가지는 객체에 투여하는 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 식품 조성물.
- 삭제
- 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 액상, 분말, 과립, 정제 및 캅셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 숙취 예방 또는 해소용 식품 조성물.
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Citations (9)
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