CN117467584B - 一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂、制备方法及应用 - Google Patents

一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂、制备方法及应用，属于微生物技术领域；所述菌剂包括干酪乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种；所述干酪乳酪杆菌的分类命名为干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei，保藏编号为CGMCC No.28768；所述动物双歧杆菌乳亚种的分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis，保藏编号为CGMCC No.28767。本发明干酪乳酪杆菌King30和动物双歧杆菌乳亚种King86制备的复合益生菌菌剂，可以实现其功能的协同增效，共同改善肠道健康。

Description

一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂、制备方法及应用，属于微生物技术领域。
背景技术
近年来，养猫人士不断增加，人们将猫视为自己的伴侣。伴侣动物在人们心中的地位日趋重要，其健康也受到了广泛关注。在猫饲养过程中，经常由于季节更替、饲养环境改变以及换粮等产生应激反应，从而影响猫的机体健康，并可能会导致软便腹泻、食欲不振、精神萎靡等情况发生。同时，在猫饲养过程中，由于猫有舔毛的习性，容易使病原菌进入体内造成肠道菌群紊乱甚至疾病的发生。此外，由于现有的猫治疗技术和手段尚未完全成熟，偶有抗生素滥用的情况发生，一方面容易使细菌产生抗药性，进化出“超级细菌”，另一方面，过度的抗生素残留会破坏猫肠道的菌群平衡，对猫肠道产生有害刺激，可能导致便秘、拉稀、消化不良等肠道疾病，严重影响猫肠道健康。胃肠道疾病是幼猫常见的临床疾病，由于幼猫消化道尚未发育完全，胃肠蠕动能力较差，消化功能薄弱，胃肠屏障功能不完善，更容易引起炎症反应，导致胃肠道疾病的发生。
益生菌被定义为“当给予一定剂量时，有益于宿主健康的活微生物”。研究表明，益生菌能提高机体对营养物质的消化吸收和利用，促进肠道蠕动，改善肠道菌群结构和功能，促进消化酶合成和分泌，提高抗应激能力等。益生菌制剂安全无毒、无副作用，可作为兽药和宠物食品添加剂使用，但目前的猫用益生菌制剂多为单菌株，复合益生菌在猫上的应用鲜有报道；现有技术中也未见有同时增强猫的食欲、改善猫粪便状态、降低软便率和腹泻率、提高猫营养物质消化率的益生菌。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂、制备方法及应用，实现以下发明目的：促进猫饮食及饮水，增强食欲；降低猫软便率和腹泻率，改善粪便状态；提高猫的养分表观消化率以及消化能。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂，所述菌剂包括干酪乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种；所述干酪乳酪杆菌的分类命名为干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei，保藏编号为CGMCC No.28768；所述动物双歧杆菌乳亚种的分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏编号为CGMCC No.28767。
所述菌剂中，干酪乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种的菌体数量比例为1:0.8-1.2。
所述菌剂中，总菌体数量为4.8-5.2×109cfu/g。
所述制备方法为将干酪乳酪杆菌菌剂与动物双歧杆菌乳亚种菌剂按照1：0.8-1.2的质量比例混合，即得复合益生菌菌剂；所述干酪乳酪杆菌菌剂的菌体数量为4.8-5.2×109cfu/g；所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂的菌体数量为4.8-5.2×109cfu/g。
所述干酪乳酪杆菌菌剂的制备方法为将干酪乳酪杆菌经活化、培养得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，冷冻干燥后得到菌粉，再与低聚异麦芽糖混合，得到干酪乳酪杆菌菌剂；所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法为将动物双歧杆菌乳亚种经活化、培养得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，冷冻干燥后得到菌粉，再与低聚异麦芽糖混合，得到动物双歧杆菌乳亚种菌剂。
所述的复合益生菌菌剂在制备改善猫肠道健康产品中的应用。
干酪乳酪杆菌King30，分类命名为干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2023年10月25日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.28768。
动物双歧杆菌乳亚种King86，分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2023年10月25日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.28767。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明干酪乳酪杆菌King30和动物双歧杆菌乳亚种King86制备的复合益生菌菌剂，可以实现其功能的协同增效，共同改善肠道健康。
本发明制备的复合益生菌菌剂，能够促进猫饮食及饮水，增强食欲，猫的采食量达到64.39g/d，饮水量达到206.15 mL/d。
本发明制备的复合益生菌菌剂，能够降低猫软便率和腹泻率，改善粪便状态，猫的软便率降低至4.67%，腹泻率降低至1.67%。
本发明制备的复合益生菌菌剂，能够提高猫对养分的表观消化率以及消化能，猫的粗蛋白表观消化率达89.57%，粗脂肪表观消化率达到90.15%，干物质表观消化率达89.51%，消化能达到92.51MJ/kg。
具体实施方式
MRS平板培养基的制备方法为蛋白胨10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g，用蒸馏水溶解，定容至1L；将上述原料混合后，自然pH，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
MRS液体培养基的制备方法为蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g，用蒸馏水溶解，定容至1L；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可。
实施例1菌种的分离鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1）菌株来源：健康猫粪便，2021年12月26日采集于山东省青州市。
（2）制备样品：
①取10mL灭菌后的生理盐水（0.85%）放置于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的健康猫粪便1g加入其中，振荡，待用；
②将步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。
（3）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别取100μL使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h。
（4）分离纯化：根据菌落直径1~2mm、菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起的菌落特征，挑取单菌落在MRS平板培养基上进行三区划线，划线后在37℃、厌氧条件下培养48h，重复上述操作，共经过3次划线，纯化得到纯菌株，将纯菌株加入到甘油管中于-80℃保藏。
2、鉴定
将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心；鉴定结果为：该菌株为干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei。
该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
将鉴定后的菌株命名为干酪乳酪杆菌King30，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下：
干酪乳酪杆菌King30，分类命名为干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei，保藏日期：2023年10月25日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.28768。
实施例2菌种的分离鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1）菌株来源：健康猫粪便，2022年2月15日采集于山东省淄博市。
（2）制备样品：
①取10mL灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的健康猫粪便1g加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。
（3）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别取100μL使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h。
（4）分离纯化：根据菌落直径1 ~ 2mm、菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起的菌落特征，挑取单菌落在MRS平板培养基平板上进行三区划线，划线后在37℃、厌氧条件下培养48h，重复上述操作，共经过3次划线，纯化得到纯菌株，将纯菌株加入到甘油管中于-80℃保藏。
2、鉴定
将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心；鉴定结果为：该菌株为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. Lactis。
该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
将鉴定后的菌株命名为动物双歧杆菌乳亚种King86，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下：
动物双歧杆菌乳亚种King86，分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏日期：2023年10月25日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.28767。
实施例3制备干酪乳酪杆菌King30菌剂
（1）取保藏的干酪乳酪杆菌King30在MRS平板培养基上活化，挑1个单菌落转接到100mL MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养12h制得种子液，然后按照1%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液；
（2）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得浓度为2.0×1010cfu/mL的菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（3）将菌粉与低聚异麦芽糖混合制成干酪乳酪杆菌King30菌剂，低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。
在本实施例中，制备的干酪乳酪杆菌King30菌剂中菌体数量为5×109cfu/g。
实施例4制备动物双歧杆菌乳亚种King86菌剂
（1）取保藏的动物双歧杆菌乳亚种King86在MRS平板培养基上活化，挑1个单菌落转接到100mL MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养12h制得种子液，然后按照1%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液；
（2）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得浓度为2.0×1010cfu/mL的菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（3）将菌粉与低聚异麦芽糖混合制成动物双歧杆菌乳亚种King86菌剂，低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。
在本实施例中，制备的动物双歧杆菌乳亚种King86菌剂中菌体数量为5×109cfu/g。
实施例5制备复合益生菌菌剂
将实施例3制备的干酪乳酪杆菌King30菌剂与实施例4制备的动物双歧杆菌乳亚种King86菌剂按照1：1的质量比例混合，即得复合益生菌菌剂，其中菌体数量为5×109cfu/g。
实施例6复合益生菌菌剂促进猫饮食饮水试验
与山东省某第三方检测机构合作收集40只中华田园猫，6-12月龄，平均体重为（3.62±0.89）kg，随机分为4组，标记为CON、A、B、C，每组10个重复，每个重复1只猫，其中雄性猫∶雌性猫=1：1。其中，CON组为对照组，饲喂基础饲粮；A组饲喂基础饲粮+2g实施例3制备的干酪乳酪杆菌King30菌剂；B组饲喂基础饲粮+2g实施例4制备的动物双歧杆菌乳亚种King86菌剂；C组饲喂基础饲粮+2g实施例5制备的复合益生菌菌剂。基础饲粮满足AAFCO的营养需求，其组成及营养水平见表1。
试验正试期为30d。试验前已进行必要的免疫、驱虫处理，并且在试验开始前1个月内没有接受任何会改变肠道微生物区系的药物（例如抗生素）。在整个试验期间，每只猫单笼饲养，保证猫自由饮水和进食。每天早、晚各铲屎1次，每周更换猫砂1次，每天打扫卫生和消毒猫舍，保持宠物圈舍内的清洁。
记录每日采食量、饮水量，结果见表2。
表1 猫基础日粮组成及营养水平（干物质基础，%）
注：预混料的组成为每千克饲粮提供维生素A 35600IU，维生素D32680IU，维生素E80IU，维生素K 0.72mg，维生素B18.90mg，维生素B212.90mg，泛酸47mg，烟酸67.60mg，吡哆醇12.30mg，生物素0.14 mg，叶酸0.80mg，Fe 390mg，Mn 27mg，Cu 16mg，Zn 110mg，I 5.50mg，Se 0.65mg。
由表2可知，A、B、C三组猫的采食量与对照组相比均有显著提升，C组猫的饮水量与对照组相比有显著提升，且C组猫的采食量、饮水量相对于A组、B组均有明显的提高，说明服用复合益生菌菌剂相对于单一菌剂能够有效促进猫饮食及饮水，增强食欲。
表2 复合益生菌菌剂对猫采食特性的影响
注：同行数据肩标含有相同小写字母表示差异不显著（P>0.05），不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
实施例7复合益生菌菌剂改善猫粪便状态、降低软便率和腹泻率试验
每日观察实施例6中40只猫的粪便状态，并按表3标准进行粪便评分，根据粪便评分计算腹泻率和软便率，计算公式如下：腹泻率（％）＝正试期每只猫出现腹泻的次数/正试期每只猫粪便评分统计总次数×100；软便率（％）＝正试期每只猫出现软便的次数/正试期每只猫粪便评分统计总次数×100。
表3 粪便评分标准
注：1≤粪便评分＜2为便秘，2≤粪便评分≤3为正常，3＜粪便评分＜4为软便，4≤粪便评分≤5为腹泻。
从表4可见，对于猫30天粪便评分的综合值来看，对照组猫的粪便评分略高于正常范围，A、B、C三组猫的粪便评分均在正常范围内，并且C组猫的粪便评分最接近中间值，说明服用该复合益生菌菌剂可改善粪便状态。从软便率和腹泻率来看，A、B、C组猫的软便率和腹泻率均低于对照组，并且C组的软便率和腹泻率均显著低于A、B组，说明复合益生菌菌剂相对于单菌菌剂能够明显降低猫软便率和腹泻率，取得较好的效果。
表4 复合益生菌菌剂对猫粪便特征的影响
注：同行数据肩标含有相同小写字母表示差异不显著（P>0.05），不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
实施例8复合益生菌菌剂提高猫营养物质消化率试验
在实施例6的试验结束前5天开展动物营养消化试验，采用盐酸不溶灰分（AIA）法推算各饲粮营养物质的表观消化率，收粪期每天早、晚饲喂结束后及时收集粪便，称重，放入-20℃冰箱冷藏保存，待5d收粪期结束后，将5d的粪便混匀，制成风干样品用于测定各营养物质含量。各营养物质表观消化率（％）=100－100×（饲粮中指示剂含量/粪中指示剂含量）×（粪中某营养物质含量/饲粮中某营养物质含量），结果见表5。
养分表观消化率可以衡量饲粮的可消化性和动物的消化能力，从表5可见，A组的粗蛋白、干物质表观消化率以及消化能均高于对照组，B、C组的粗蛋白、粗脂肪、干物质表观消化率以及消化能均高于对照组；与对照组相比，C组的粗蛋白表观消化率提升了13.84个百分点，粗脂肪表观消化率提升了7.58个百分点，干物质表观消化率提升了8.68个百分点，消化能由84.17MJ/kg上升到92.51MJ/kg，同时，C组相对于A、B组，各指标也有显著提升，说明复合益生菌菌剂相对于单菌菌剂，能够明显提高养分表观消化率以及消化能。
表5 复合益生菌菌剂对猫养分表观消化率和消化能的影响
注：同行数据肩标含有相同小写字母表示差异不显著（P>0.05），不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05）；
通过上述试验可见，本发明复合益生菌菌剂相对于干酪乳酪杆菌King30菌剂或动物双歧杆菌乳亚种King86菌剂，能够有效促进猫饮食及饮水，增强食欲；明显降低猫软便率和腹泻率；明显提高养分表观消化率以及消化能，说明干酪乳酪杆菌King30和动物双歧杆菌乳亚种King86之间具有协同作用，共同改善猫的肠道健康。

Claims (5)

1. 一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂，其特征在于：所述菌剂包括干酪乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种；所述干酪乳酪杆菌的分类命名为干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei，保藏编号为CGMCC No.28768；所述动物双歧杆菌乳亚种的分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏编号为CGMCC No.28767；
所述菌剂中，干酪乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种的菌体数量比例为1:0.8-1.2。
2.根据权利要求1所述的一种改善猫肠道健康的复合益生菌菌剂，其特征在于：所述菌剂中，总菌体数量为4.8-5.2×109cfu/g。
3.权利要求1所述复合益生菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法为将干酪乳酪杆菌菌剂与动物双歧杆菌乳亚种菌剂按照1：0.8-1.2的质量比例混合，即得复合益生菌菌剂；所述干酪乳酪杆菌菌剂的菌体数量为4.8-5.2×109cfu/g；所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂的菌体数量为4.8-5.2×109cfu/g。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述干酪乳酪杆菌菌剂的制备方法为将干酪乳酪杆菌经活化、培养得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，冷冻干燥后得到菌粉，再与低聚异麦芽糖混合，得到干酪乳酪杆菌菌剂；所述动物双歧杆菌乳亚种菌剂的制备方法为将动物双歧杆菌乳亚种经活化、培养得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，冷冻干燥后得到菌粉，再与低聚异麦芽糖混合，得到动物双歧杆菌乳亚种菌剂。
5.权利要求1所述的复合益生菌菌剂在制备改善猫肠道健康产品中的应用。
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