CN116083324A - 一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种ba79及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用，所述动物双歧杆菌乳亚种BA79命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株，保藏编号为CGMCCNo.24111。该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，可以显著改善肠易激综合征反应尤其是便秘型肠易激综合征反应，具体表现为排便量增加、粪便含水量增加、摄食量和体重提高、血清中5‑HT和VIP减少、血清中SP水平增加。

Description

一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用，尤其涉及一种能够改善或治疗便秘型肠易激综合征(constipation-predominant IBS，IBS-C)的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用。
背景技术
肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是最常见的功能性胃肠病之一，以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和/或大便性状异常为特征。流行病学研究显示，在世界范围内约15-20％的成人受其影响。IBS一般不会威胁患者的生命安全，但会严重干扰患者的日常生活。目前，随着高通量测序技术的发展，大量研究发现肠道菌失衡，特别是双歧杆菌失衡，在IBS的发生发展中具有重要作用。双歧杆菌能够抵抗肠道病原菌的定植和入侵、增强肠道上皮的屏障作用，其代谢产物还能够增强肠道的防御作用。在IBS患者肠道内，双歧杆菌明显减少，这说明增加肠道双歧杆菌数量在治疗IBS中具有积极作用。
IBS通常分为四类：(1)便秘型IBS(constipation-predominant IBS，IBS-C)；(2)腹泻型IBS(diarrhoea-predominant IBS，IBS-D)；(3)混合型IBS(mixed-type IBS，IBS-M)；(4)未定型IBS(unsubtyped IBS)。IBS的分类没有严格的标准，主要是根据各类病症的严重程度，因此经常出现交替情况，IBS疾病的发病机制尚不清楚，目前的研究认为IBS疾病是由多种因素综合作用的结果，这些因素包括心理变化、肠道能动性和免疫功能的改变、肠道敏感性的增加、神经递质失衡等。
便秘主导型肠易激综合征(IBS-C)是一种功能性肠道疾病，临床症状主要为腹痛、腹胀、排便频率降低、大便干结成块等，其在世界范围内发病率很高，约为10-20％。因其发病机制尚不明确，目前临床治疗多局限于单个靶点，主要治疗药物包括离子通道调节剂、渗透性缓泻剂、5-羟色胺(5-HT)受体激动剂等，部分药物具有治疗周期长且毒副作用大的缺点，严重影响患者的生活质量。因此，开发更多的能够有效预防或治疗肠易激综合征的策略是很有必要的，使用药物治疗肠易激综合征并不排除用于抗击这种疾病的其他措施的重要性。
肠道菌群对于维持肠道消化、营养、免疫、内分泌功能具有重要意义，还影响机体的生长发育、代谢、情绪反应等方面。目前现有技术中用于改善便秘的微生物制剂还十分有限，而且这些制剂改善便秘的效果仍需进一步提高。因此，如何提供一种改善或治疗便秘的效果好，且在治疗过程中不会导致患者产生不良反应的微生物制剂，已成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用，尤其提供一种能够改善或治疗便秘型肠易激综合征(constipation-predominant IBS，IBS-C)的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79，所述动物双歧杆菌乳亚种BA79命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis BA79菌株，保藏编号为CGMCC No.24111，保藏日期为2021年12月15日。
本发明从人母乳样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BA79菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，可以显著改善肠易激综合征反应尤其是便秘型肠易激综合征反应，具体表现为排便量增加、粪便含水量增加、摄食量和体重提高、血清中5-HT和VIP减少、血清中SP水平增加。使用该菌种进行改善或治疗时，不会产生耐药性，改善或治疗过程中也不会引起患者的不良反应，可用于制备改善或治疗便秘型肠易激综合征的产品，如药物和保健品等。
本发明所涉及的BA79菌株的筛选步骤如下：
(1)选取人母乳样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基(培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物)上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的30株人乳来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力(人工模拟)、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株，对其进行鉴定。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79的培养物，所述培养物由包括如下步骤的方法制得：将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株接种于培养基中在30-37℃(例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、37℃等)下培养18-24h(例如18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h等)；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、半胱氨酸盐酸盐。
本发明优选上述培养条件，动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BA79菌株能够达到生长稳定期，并且具有更加优异的碳源利用能力。
第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79在制备改善或治疗肠易激综合征的产品中的应用；所述产品包括保健品或药品。
本发明所涉及的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactisBA79菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。
优选地，所述肠易激综合征为便秘型肠易激综合征。
第四方面，本发明提供一种具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂，所述具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂包含第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株。
优选地，在所述益生菌剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis BA79菌株的活菌数不低于1×1010CFU/mL或1×1010CFU/g，例如1×1010CFU/mL、2×1010CFU/mL、5×1010CFU/mL、8×1010CFU/mL、1×1011CFU/mL、5×1011CFU/mL、1×1012CFU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型可以为冻干粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂等剂型。
优选地，所述具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂还包含保护剂和/或益生元；
所述保护剂包括脱脂奶粉；
所述益生元包括低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、菊粉、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白、乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。更优选低聚木糖。
第五方面，本发明提供一种具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂，所述具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂包含权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei LC86菌株；所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCC No.1.12731，保藏日期为2020年7月20日。
本发明还创造性地发现上述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BA79菌株能够与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株进行复配使用用于改善或治疗肠易激综合征，同样具有优异的效果，且与单一菌剂相比，复合菌剂具有更显著的改善或治疗肠易激综合征的效果，说明BA79菌株与LC86菌株在上述功效上具有协同增效作用。
优选地，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactisBA79菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的活菌数之比为(5-10):1，例如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。
优选地，所述具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂还包含保护剂和/或益生元；
所述保护剂包括脱脂奶粉；
所述益生元包括低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、菊粉、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白、乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。更优选低聚木糖。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从人母乳样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BA79菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，可以显著改善肠易激综合征反应尤其是便秘型肠易激综合征反应，具体表现为排便量增加、粪便含水量增加、摄食量和体重提高、血清中5-HT和VIP减少、血清中SP水平增加。使用该菌种进行改善或治疗时，不会产生耐药性，改善或治疗过程中也不会引起患者的不良反应，可用于制备改善或治疗便秘型肠易激综合征的产品，如药物和保健品等。
本发明还创造性地发现上述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BA79菌株能够与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株进行复配使用用于改善或治疗肠易激综合征，同样具有优异的效果，且与单一菌剂相比，复合菌剂具有更显著的改善或治疗肠易激综合征的效果，说明BA79菌株与LC86菌株在上述功效上具有协同增效作用。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述涉及的动物双歧杆菌乳亚种为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis BA79菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24111，保藏日期为2021年12月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1.12731，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的MRS固体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.1g、MnSO4 0.05g、琼脂20g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用；
下述涉及的MRS液体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.1g、MnSO4 0.05g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后备用。
下述涉及的动物双歧杆菌乳亚种BA79菌悬液：将动物双歧杆菌乳亚种BA79接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，使用PBS重悬菌体，即得。浓度调节为1×109CFU/mL，实验中根据需要稀释菌液浓度。
下述涉及的副干酪乳杆菌LC86菌悬液：将副干酪乳杆菌LC86接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到副干酪乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。实验中根据需要调节菌液浓度。浓度调节为1×109CFU/mL，实验中根据需要稀释菌液浓度。
实施例1
本实施例筛选一株能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种，步骤如下：
(1)选取人母乳样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基(培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物)上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的人乳来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力(人工模拟)、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株，具体为如下：
A.胃肠液耐受能力测试：
人工模拟胃液：配制0.5％NaCl溶液，加入0.3％胃蛋白酶，用1mol/L HCl调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
人工模拟肠液：配制0.5％NaCl溶液，加入0.1％胰蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
待选菌株在人工胃液和肠液中厌氧培养3h，取0h和3h的消化液进行活菌数检测，计算其存活率。菌株存活率(％)＝A/B×100％，式中A表示该菌0h的活菌数(CFU/mL)，B表示该菌3h的活菌数(CFU/mL)。
B.HT-29细胞粘附能力测试：
菌种活化：待选菌株按2％接种量接种于含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃培养14h，取发酵液离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为108CFU/mL。
HT-29细胞培养：在细胞培养瓶中，加入5mL DMEM完全培养液(含10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素溶液)，于5％ CO2恒温培养箱中37℃孵育，每天换1次培养液，待细胞状态良好后(70％～80％融合)，用0.2％消化液(胰酶-EDTA)进行消化传代。
黏附性试验：将消化的HT-29细胞调整浓度到105cell/mL，接种到12孔细胞培养板中，每孔1mL，于5％ CO2浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层，用无菌PBS洗涤两次，其中一个孔用胰酶消化，用血球计数板进行细胞计数；其他孔中分别加入待选菌株悬液1mL，于5％CO2培养箱中37℃孵育2h后，用无菌PBS洗涤细胞5次，除去未黏附的菌悬液，每孔加入0.2mL胰酶-EDTA缓冲液消化细胞5min，消化完后加入0.8mL PBS吹打均匀，取菌液进行稀释活菌计数。
C.抑菌能力测试：
采用牛津杯法测试对致病菌的抑制能力：取拮抗菌株按2％(V/V)接种至含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃恒温静置培养12h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在106CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，每孔注入200μL拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
D.功能性低聚糖利用能力测试：
无糖培养基：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母浸膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、K2HPO40.2％、MgSO4 0.058％、MnSO4 0.019％、吐温-80 0.1％、L-半胱氨酸盐酸盐0.1％。
菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖购于量子高科(中国)生物股份有限公司，低聚木糖(XOS)购自山东龙力生物科技有限公司。
将低聚木糖(XOS)、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖按2％加入到上述无糖培养基中，获得含低聚糖为碳源的培养基。将待选菌株接种到含低聚糖的培养基中，37℃恒温静置培养12h，测定OD600吸光度判断菌株对功能性菌株的利用能力。
综合以上胃肠液耐受能力(人工模拟)、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和对利用功能性低聚糖能力实验，BA79是最好的菌株。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
(1)形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可知，菌落为乳白色，呈半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
(2)16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养18h。吸取1mL菌液于离心管中，8000rpm下离心10min，去上清液，收集菌体。
提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQ ID No:1所示。
SEQ ID No:1：
GAGAACTACGAGTCTACCTTAGACGGCTCCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGAATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGTGCTTCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTTGCATGTGTAGCACGCCGCCCTCGGCAATT。
将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌乳亚种。
实施例3
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BA79的耐胃酸能力，步骤如下：
(1)制备人工胃液：
以质量分数计，人工胃液中含有0.20％的NaCl以及0.30％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
(2)耐胃酸能力测试：
取1.0mL动物双歧杆菌乳亚种BA79菌悬液(浓度为1×109CFU/mL)，分别与9.0mLpH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，
其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表1。
表1
人工胃液pH 活菌数N0(0h) 活菌数N1(3h) 存活率(％)
2.0 <![CDATA[(6.81±0.32)×10<sup>8</sup>]]> <![CDATA[(5.47±0.11)×10<sup>8</sup>]]> 80.0
2.5 <![CDATA[(6.69±0.41)×10<sup>8</sup>]]> <![CDATA[(6.31±0.26)×10<sup>8</sup>]]> 90.4
3.0 <![CDATA[(6.72±0.32)×10<sup>8</sup>]]> <![CDATA[(6.43±0.29)×10<sup>8</sup>]]> 95.6
由表1可以看出，本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种BA79具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达80.0％以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达90.4％以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达95.6％以上。良好的耐酸能力为其制备改善或治疗便秘型肠易激综合征的产品创造了条件。
实施例4
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BA79的耐肠液能力，步骤如下：
(1)制备人工肠液：
将胰蛋白酶溶于pH 8.0的PBS中使其终浓度为0.8g/L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。
(2)耐肠液能力测试：
取1.0mL动物双歧杆菌乳亚种BA79菌悬液(浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)加入至9mL模拟肠液(pH 8.0)中，混匀后于37℃培养8h后检测活菌数。用MRS固体培养基37℃培养48h，候选益生菌的存活率用以下公式计算：
存活率(％)＝[log CFU N1/log CFU N0]×100％；
其中，N1＝经过模拟肠液处理之后的候选益生菌活菌数，N0＝未处理前候选益生菌的活菌数。测试结果如表2所示：
表2
活菌数N0(0h) 活菌数N1(3h) 存活率(％)
人工肠液 <![CDATA[(5.68±0.22)×10<sup>8</sup>]]> <![CDATA[(4.22±0.31)×10<sup>8</sup>]]> 74.3
由表2可以看出，本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种BA79具有良好的耐肠液能力，在人工肠液中孵育3h，存活率可达74.3％以上。良好的耐肠液能力为其制备改善或治疗便秘型肠易激综合征的产品创造了条件。
实施例5
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BA79的耐胆碱能力，步骤如下：
将1mL浓度调节为1×109CFU/mL的动物双歧杆菌乳亚种BA79接种于100mL含有0.3％胆盐的MRS-THIO(MRS含有0.2％的巯基乙酸钠)培养基中，37℃培养4h，在600nm处测吸光值。本次实验使用鼠李糖乳杆菌LGG作为对照菌，LGG菌的培养方法与BA79相同。OD600值越大说明乳酸菌耐受胆盐的能力越强。测试结果如表3所示：
表3
OD600(4h)
鼠李糖乳杆菌LGG 0.22
动物双歧杆菌乳亚种BA79 0.38
由表3可以看出，经过4小时培养后动物双歧杆菌乳亚种BA79的OD600为0.38，高于鼠李糖乳杆菌LGG，这说明动物双歧杆菌乳亚种BA79耐胆盐的能力高于鼠李糖乳杆菌LGG。
实施例6
本实施例提供一种动物双歧杆菌乳亚种BA79菌粉，所述动物双歧杆菌乳亚种BA79菌粉通过以下方法进行制备：
将动物双歧杆菌乳亚种BA79菌种接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，得到动物双歧杆菌乳亚种菌体；
将菌体用质量浓度为10％的脱脂奶粉水溶液重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在37℃下预培养1h后冻干，得到所述动物双歧杆菌乳亚种BA79菌粉，测的菌粉的活菌数为3000亿CFU/g。
采用上述相同方法制备副干酪乳杆菌LC86菌粉，测的菌粉的活菌数为300亿CFU/g。
实施例7
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BA79对便秘型肠易激综合征大鼠的治疗作用，步骤如下：
(1)便秘型肠易激综合征大鼠动物模型的造模方法：冰水灌胃法，具体实施方式为，选择出生1个月的Wistar大鼠，质量120-150g。每天每只大鼠给予冰水(0-4℃生理盐水)2mL灌胃，共14天。
(2)分组及菌粉干预方法：50只大鼠随机分为5组，模型组(IBS组)、LC86组、BA97组和LC86+BA97组各10只，使用冰水灌胃法构建便秘型肠易激综合征动物模型；对照组(CTL组)10只，不灌胃，正常饲食、饮水。模型组(IBS组)、LC86组、BA97组和LC86+BA97组除灌胃外也给予正常饲食、饮水。每只大鼠分笼独立饲养，为消除生物节律的影响，均于上午08:00开始灌胃。14天后(试验第1周和第2周)，造模结束。从第15天开始，LC86组、BA97组和LC86+BA97组使用实施例7制得的菌粉进行干预，BA97组每天灌胃1×109CFU的BA79，LC86组每天灌胃1×109CFU的LC86，LC86+BA97组每天灌胃9×108CFU的BA79和1×108CFU的LC86，IBS组灌胃30℃生理盐水，对照组不灌胃，正常饲食、饮水。干预周期为14天(试验第3周和第4周)。
(3)大便粒数观察：收集灌胃后3-24小时，每只大鼠的粪便，记录大便粒数。结果如表4所示：
表4
组别 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周
CTL组 48.1±3.1 48.5±1.5 50.3±2.8 47.5±2.86 47.1±2.6
IBS组 47.6±3.0 45.6±2.4 39.2±3.5 38.5±3.2 39.3±3.8
BA97组 47.7±4.4 43.8±4.1 40.2±3.7 42.2±2.5 45.2±2.3
LC86组 47.7±4.6 44.3±2.9 39.9±2.6 41.8±3.1 43.9±2.4
LC86+BA97组 47.5±2.9 45.7±2.0 39.1±2.4 43.6±2.7 45.8±2.9
由表4数据可知：在前2周的造模期，灌胃冰水使得大鼠的粪便粒数显著降低；经过2周的干预后，在第四周BA79组和LC86+BA97组大鼠粪便粒数为45.2±2.3粒和45.8±2.9粒，显著高于模型组的39.3±3.8粒(p<0.05)，说明动物双歧杆菌乳亚种BA79可以显著改善便秘型肠易激综合征大鼠的排便，且LC86与BA97联合使用的效果更优。
(4)大便含水率测定：称量大便湿重，然后冷冻干燥后，称量干便的质量，计算大便含水量百分比(％)。结果如表5所示：
表5
Figure BDA0004135947330000161
Figure BDA0004135947330000171
由表5数据可知：在前2周的造模期，灌胃冰水使得大鼠的粪便含水率显著降低；经过2周的干预后，在第四周BA79组和LC86+BA97组大鼠粪便含水率为49.61±0.33％和50.68±0.65％，显著高于模型组的47.87±0.21％(p<0.05)，说明动物双歧杆菌乳亚种BA79可以显著改善便秘型肠易激综合征大鼠粪便含水率，且LC86与BA97联合使用的效果更优。
(5)大鼠体重测定(g)：结果如表6所示：
表6
Figure BDA0004135947330000172
由表6数据可知：在前2周的造模期，灌胃冰水使得大鼠的体重显著降低；经过2周的干预后，在第四周BA79组和LC86+BA97组大鼠体重为144.98±5.8g和147.97±5.37g，显著高于模型组的140.25±10.8(p<0.05)，说明动物双歧杆菌乳亚种BA79可以显著改善便秘型肠易激综合征大鼠体重，且LC86与BA97联合使用的效果更优。
(6)大鼠进食量测定(g)：结果如表7所示：
表7
Figure BDA0004135947330000181
由表7数据可知：在前2周的造模期，灌胃冰水使得大鼠的摄食量显著降低；经过2周的干预后，在第四周BA79组和LC86+BA97组大鼠每天的摄食量为13.06±2.80g和15.89±4.11g，显著高于模型组的10.13±1.30g(p<0.05)，说明动物双歧杆菌乳亚种BA79可以显著改善便秘型肠易激综合征大鼠的摄食量，且LC86与BA97联合使用的效果更优。
(7)大鼠血清中5-HT、VIP和SP的检测：大鼠灌胃治疗14天后，禁食24小时，不限水，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，血液在3500r/min下离心5分钟，取上清保存在-80℃冰箱中备用。通过ELISA法检测各组大鼠血清中5-HT、VIP和SP含量。其中检测5-HT、VIP和SP的ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。结果如表8所示：
表8
Figure BDA0004135947330000182
Figure BDA0004135947330000191
由表8数据可知：与对照组(CTL组)相比，模型组(IBS组)血清5-羟色胺和血管活性肠肽水平显著升高(p<0.01)，而P物质显著水平降低(p<0.01)；BA79治疗可显著降低便秘型肠易激综合征大鼠血清5-羟色胺和血管活性肽水平(p<0.01)，显著提升P物质水平(p<0.01)。5-羟色胺是胃肠道的关键神经递质之一，在肠道的分泌、蠕动和感知中起着重要作用。而血管活性肠肽VIP作为抑制性神经递质，可抑制胃肠分泌，使胃肠血管舒张，平滑肌松弛，降低内脏抵抗，抑制胃蠕动。P物质与血管活性肠肽VIP相对应，使结肠粘膜分泌水和电解质，二者的平衡失调与便秘型肠易激综合征的发病有关。上述结果说明，BA79可通过调节5-羟色胺、血管活性肠肽和P物质的水平，发挥治疗便秘型肠易激综合征的作用，且LC86与BA97联合使用的效果更优。
实施例8
本实施例提供一种改善或治疗便秘型肠易激综合征的保健品，所述改善或治疗便秘型肠易激综合征的保健品包括：实施例6制得的动物双歧杆菌乳亚种BA97冻干粉0.1克和低聚木糖(XOS)1.9克，可制成小袋产品用于冲饮。按每袋2.0克计，该产品每袋内含有40亿CFU益生菌。低聚木糖是一种益生元，其能促进动物双歧杆菌乳亚种BA79功效的发挥，其与BA79复合制备的保健品有利于进一步改善或治疗便秘型肠易激综合征。
实施例9
本实施例验证实施例8制得的保健品对便秘型肠易激综合征大鼠的治疗作用，步骤如下：
(1)便秘型肠易激综合征大鼠动物模型的造模方法：冰水灌胃法，具体实施方式为，选择出生1个月的Wistar大鼠，质量120-150g。每天每只大鼠给予冰水(0-4℃生理盐水)2mL灌胃，共14天。
(2)分组及菌粉干预方法：40只大鼠随机分为4组，模型组(IBS组)、BA97组和XOS+BA97组各10只，使用冰水灌胃法构建便秘型肠易激综合征动物模型；对照组(CTL组)10只，不灌胃，正常饲食、饮水。模型组(IBS组)、BA97组和XOS+BA97组除灌胃外也给予正常饲食、饮水。每只大鼠分笼独立饲养，为消除生物节律的影响，均于上午08:00开始灌胃。14天后(试验第1周和第2周)，造模结束。从第15天开始，BA97组使用实施例6制得的菌粉进行干预，XOS+BA97组使用实施例8制得的保健品进行干预，其中BA97组和XOS+BA97组每天均灌胃1×109CFU的BA79，IBS组灌胃30℃生理盐水，对照组不灌胃，正常饲食、饮水。干预周期为14天(试验第3周和第4周)。
(3)大便粒数观察：收集灌胃后3-24小时，每只大鼠的粪便，记录大便粒数。结果如表9所示：
表9
Figure BDA0004135947330000201
由表9数据可知：经过2周的干预后，BA79组大鼠粪便粒数为44.5±3.1粒，显著高于模型组的41.2±2.8粒(p<0.05)，而BA97+XOS组大鼠粪便粒数为47.6±2.5粒，说明动物双歧杆菌乳亚种BA79和低聚木糖有很好的相互增效的作用，效果优于单独使用动物双歧杆菌乳亚种BA79。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79及其培养方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种BA79命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis BA79菌株，保藏编号为CGMCC No.24111，保藏日期为2021年12月15日。
2.根据权利要求1所述的能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79的培养物，其特征在于，所述培养物由包括如下步骤的方法制得：将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株接种于培养基中在30-37℃下培养18-24h；
所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、半胱氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的能够改善或治疗肠易激综合征的动物双歧杆菌乳亚种BA79在制备改善或治疗肠易激综合征的产品中的应用；所述产品包括保健品或药品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肠易激综合征为便秘型肠易激综合征。
5.一种具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂，其特征在于，所述具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂包含权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis BA79菌株。
6.根据权利要求5所述的具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株的活菌数不低于1×1010CFU/mL或1×1010CFU/g。
7.根据权利要求5所述的具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂，其特征在于，所述具有改善或治疗肠易激综合征的益生菌剂还包含保护剂和/或益生元；
所述保护剂包括脱脂奶粉；
所述益生元包括低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、菊粉、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白、乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂，其特征在于，所述具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂包含权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei LC86菌株；所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCC No.1.12731，保藏日期为2020年7月20日。
9.根据权利要求8所述的具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BA79菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的活菌数之比为(5-10):1。
10.根据权利要求8所述的具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂，其特征在于，所述具有改善或治疗肠易激综合征的复合益生菌剂还包含保护剂和/或益生元；
所述保护剂包括脱脂奶粉；
所述益生元包括低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、菊粉、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白、乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
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