CN116240150A

CN116240150A - 一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99及菌剂、制备方法和应用

Info

Publication number: CN116240150A
Application number: CN202310374472.2A
Authority: CN
Inventors: 司书锋; 韩小龙; 王雪娇; 田华; 周文浩; 姜能凯; 曹艳萍; 刘鑫
Original assignee: Shandong Weiman Pet Food Co ltd
Current assignee: Shandong Weiman Pet Food Co ltd
Priority date: 2023-04-10
Filing date: 2023-04-10
Publication date: 2023-06-09

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99及菌剂、制备方法和应用，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)King99于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25559，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。干酪乳杆菌King99对蛋白质具有较强的水解作用，可以水解粪便中大部分难以消化吸收的蛋白质，经试验验证，在维持正常日常饮食的情况下，宠物在服用使用该菌株制备的菌剂后，可以明显改善软便症状，服用一段时间可以大大降低宠物软便率。

Description

一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99及菌剂、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99及菌剂、制备方法和应用。

背景技术

随着宠物日粮中的肉种类变多、蛋白质来源复杂或蛋白质含量过高，宠物肠胃系统的消化系统负担增加，对蛋白质的消化率降低，从而导致宠物出现软便。为了解决软便问题，一般为使用西药或处方粮，但西药给会给宠物带来副作用，造成动物不良反应甚至危害生命；处方粮解决问题单一，长期喂食容易导致营养不良，以及因配方的偏重引起其它症状。同时，西药或处方粮只能暂时起到治疗作用，不能达到长期调节、保健的作用，停用后软便问题又会复发。

益生菌在肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质，如维生素、氨基酸、未知生长因子等，能够促进机体对蛋白质、铁、钙的消化吸收。同时益生菌在体内还可以产生各种消化酶，比如有很强的蛋白酶，可提高转化率。蛋白酶益生菌能分解蛋白质和多肽，使蛋白质降解成小分子的蛋白胨及氨基酸等物质，一方面使养分更易利用，不容易发生软便的情况，另一方面，益生菌自身蛋白质分解后也可提供更多的营养素，可见蛋白酶益生菌在改善宠物软便症状方面具有良好的应用前景。

发明内容

针对现有的治疗宠物软便的方法安全性差、效果不持久的问题，本发明提供一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99及菌剂、制备方法和应用，提高宠物对蛋白质的消化吸收率，从根本上解决宠物软便问题。

第一方面，本发明提供一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)King99于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25559，保藏地址为中国北京。

第二方面，本发明提供一种干酪乳杆菌King99菌剂，包括上述干酪乳杆菌King99的菌体。

第三方面，本发明提供上述干酪乳杆菌King99菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)取保藏的干酪乳杆菌King99在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中，培养获得菌液；

(2)将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，然后调整浓度为1.0×10¹⁰～2.0×10¹⁰cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；

(3)将菌粉与葡萄糖混合，制成菌剂。

进一步的，步骤(1)中，接种于MRS液体培养基的接种量为1％～2％。

进一步的，步骤(1)中，MRS液体培养基的制备方法如下：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可。

进一步的，步骤(1)中，培养获得菌液的培养条件为：37℃下培养24～48h。

进一步的，步骤(2)中，复原脱脂乳的浓度为15％。

第四方面，本发明提供上述干酪乳杆菌King99在制备改善宠物软便的产品上的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的干酪乳杆菌King99对蛋白质具有较强的水解作用，可以水解粪便中大部分难以消化吸收的蛋白质，经试验验证，在维持正常日常饮食的情况下，宠物在服用使用该菌株制备的菌剂后，可以明显改善软便症状，服用一段时间可以大大降低宠物软便率。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1菌种的分离鉴定

1、菌种来源：发酵咸菜液，2022年1月16日采集于山东省潍坊市安丘市凌河镇张家陡沟村。

2、菌株筛选及纯化

(1)制备样品：

①取灭菌后的生理盐水(0.85％)至于无菌三角瓶中，然后将1mL发酵咸菜液加入其中，振荡，待用；

②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用；

(2)制备MRS平板培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温-80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。

(3)培养：将步骤②的1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；

(4)按照以下菌落特征挑选菌落：

菌落直径1～2mm，菌落白色、圆形、表面湿润、不透明、边缘整齐。

(5)分离纯化

根据步骤(4)的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。

2、鉴定

将步骤(5)分离纯化后的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心，鉴定得到基因序列为：

GTCGATGAACGGTGCTTGCACTGAGATTCGACTTAAAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGCAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACC

鉴定结果：该菌株被鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)，推测为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

将鉴定后的菌株命名为干酪乳杆菌King99，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏信息如下；

菌株名称：干酪乳杆菌King99；分类命名：干酪乳杆菌Lactobacillus casei；保藏日期：2022年8月19日；地址：中国北京，邮编：100101；保藏编号：CGMCC No.25559。

实施例2干酪乳杆菌King99对蛋白质水解作用实验

1.材料与试剂：MRS液体培养基、福林酚试剂、酪蛋白、三氯乙酸、RIPA裂解液、磷酸缓冲溶液、0.1％TNBS溶液，试剂均为分析纯；

其中MRS液体培养基的制备方法如下：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，121℃、0.1MPa下灭菌20min，冷却待用。

2.仪器与设备：离心机、涡旋机、紫外分光光度计。

3.方法

(1)制备粗提酶液：

干酪乳杆菌King99在MRS液体培养基进行活化，将培养液培养至浑浊现象及后期时，将培养液在5000r/min离心，离心10min，所得上清液即为粗提酶液。

(2)测定粗提酶液蛋白酶活力：

蛋白酶活力的测定根据国标GB/T 23527-2009福林法，绘制出标准曲线，King99和ATCC25599每个样品设置三个平行，通过标准曲线计算蛋白酶活力。数据结果如表1所示：

表1干酪乳杆菌King99与干酪乳杆菌ATCC25599模式菌株蛋白酶活力对比

菌株编号	酶活(U/mL)
		干酪乳杆菌King99	28.6
干酪乳杆菌ATCC25599	17.3

注：表中数据均取平均值

干酪乳杆菌King99蛋白酶活力高于ATCC25599模式菌株，即证明干酪乳杆菌King99所产蛋白酶活力较强。

(3)粗提酶液酶解粪便中提取的蛋白质溶液

①从粪便中提取蛋白质溶液：

宠物粪便去除表面，采集粪便样本装入特质盒中，封闭特质盒后置入冰中保存35min；然后将粪便样本转至-80℃冰箱中保存，待用；精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，RIPA裂解液的用量为12.5μL/mg粪便样本，用涡旋机涡旋1.5min，然后进行冰水浴15min，再重复涡旋、冰水浴步骤4次，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；将涡旋液冰水浴后进行4℃、14000g离心5min，取上清液，将上清液再次进行4℃、14000g离心5min，最终的上清液即为含有从粪便中提取的蛋白质溶液，置于-80℃冰箱中保存。

②混合培养进行酶解：

将粗提酶液按8％的体积分数加入蛋白质溶液中，在37℃下培养进行酶解，24h后用于水解度测定。

(4)水解度的测定

采用三硝基苯磺酸(TNBS)法测定。将酶解后的样品按照倍数稀释，取0.25mL的样品(1L中含有的氨基量在0.25×10^-3～2.5×10^-3mmol/g)与2mL磷酸缓冲溶液和2mL的0.1％TNBS溶液混合，50℃的暗室中静置60min，反应完毕后加入4mL 0.1mol/L的HCI终止反应，室温下放置30min，最后于420nm下测定吸光值。使用浓度为0～2.5×10^-3mol/L的L-亮氨酸作标准曲线。根据下面公式计算水解度(DH)：

其中，A1为未水解额样品中每克蛋白含有的氨基量，mmol/g；

A2为水解样品中每克蛋白含有的氨基量，mmol/g；

F1为未水解样品的稀释倍数；

F2为水解样品的稀释倍数；

htot为每克原料蛋白质中总的肽键毫摩尔数，mmol/g。

酶解过程中水解度的变化：干酪乳杆菌King99粗提酶液对蛋白质溶液进行酶解的过程中，水解度逐渐增大，整体呈显著上升趋势，水解度最高可达到96.82％。可以看出，蛋白质被较大程度的水解，表明干酪乳杆菌King99的粗提酶液对蛋白有较强的水解作用。

结论：可以看出干酪乳杆菌King99对蛋白质有较强的水解作用，可以水解粪便中大部分难以消化吸收的蛋白质，从而解决软便的问题。

实施例3制备干酪乳杆菌King99菌剂

(1)取保藏的干酪乳杆菌King99在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照1％的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液；

(2)将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15％(w/w)的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；

(3)将菌粉与葡萄糖混合，制成干酪乳杆菌King99菌剂；葡萄糖购自山东西王糖业有限公司。

本实施例制备的干酪乳杆菌King99菌剂中菌体数量为5亿/g。

实施例4制备干酪乳杆菌King99菌剂

(1)取保藏的干酪乳杆菌King99在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照2％的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养48h，获得菌液；

(2)将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15％(w/w)的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为2.0×10¹⁰cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；

本实施例制备的干酪乳杆菌King99菌剂中菌体数量为10亿/g。

实施例5干酪乳杆菌King99菌剂对宠物软便症状的影响

1、实验准备

选用40只具有软便症状的猫作为试验对象，采用常规饲养方法。

2、实验内容

将40只具有软便症状的猫随机分为2组，每组20只，分别为对照组和实验组，并同时测量体重：

实验组：按照猫的体重3亿/kg的添加量，饲喂实施例3制备的干酪乳杆菌King99菌剂，溶于饮用水中，持续14天。

对照组：按照猫的体重0.6g/kg的添加量，饲喂葡萄糖，溶于饮用水中，持续14天。

每2天对两组猫的软便症状进行记录，判断标准如表2所示。

表2粪便症状判断标准

粪便症状	粪便状态
		便秘	干燥
正常	正常成型
		软便	潮湿，软，有大致形状
拉稀	不成型

根据记录数据，计算软便率(软便率＝试验期软便猫只数/试验期猫只数×100，单位：％)，2周后进行数据对比，结果如表3和表4所示。

表3实验组与对照组软便率对比表

组别

0天

2天

4天

6天

8天

10天

12天

14天

实验组

100％

95％

80％

60％

45％

25％

10％

对照组

100％

95％

90％

85％

75％

表4第14天不同粪便症状的猫的只数

组别	便秘	正常	软便	拉稀
					实验组	0	18	2	0
对照组	0	2	15	3

结论：通过表3和表4可以看出，服用干酪乳杆菌King99菌剂，猫的软便率明显降低，说明干酪乳杆菌King99对于猫软便的症状有明显的改善作用。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种改善宠物软便的干酪乳杆菌King99，其特征在于，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)King99于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25559，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种干酪乳杆菌King99菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述干酪乳杆菌King99的菌体。

3.一种如权利要求2所述干酪乳杆菌King99菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(3)将菌粉与葡萄糖混合，制成干酪乳杆菌King99菌剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，接种于MRS液体培养基的接种量为1％～2％。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，MRS液体培养基的制备方法如下：

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，培养获得菌液的培养条件为：37℃下培养24～48h。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，复原脱脂乳的浓度为15％。

8.一种如权利要求1所述干酪乳杆菌King99在制备改善宠物软便的产品上的应用。