CN116103208B

CN116103208B - 唾液乳杆菌在抗氧化上的应用

Info

Publication number: CN116103208B
Application number: CN202310365816.3A
Authority: CN
Inventors: 刘静波; 尹恒; 赵建飞; 严鸿林; 齐仁立; 王琪; 汤文杰; 杨勇; 曹山川
Original assignee: Pig Technology Innovation Center Chongqing; Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Pig Technology Innovation Center Chongqing; Southwest University of Science and Technology
Priority date: 2023-04-07
Filing date: 2023-04-07
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2043-04-07
Also published as: CN116103208A

Abstract

本发明涉及唾液乳杆菌在抗氧化上的应用，唾液乳杆菌RS‑23‑1在抗氧化上的应用，唾液乳杆菌RS‑23‑1在制备用于抗氧化产品中的应用。所述唾液乳杆菌命名为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius RS‑23‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26619，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。本发明猪源唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius RS‑23‑1具有提高动物的抗氧化能力，从而减少诱发动物的疾病，可以用于制备抗氧化产品。

Description

唾液乳杆菌在抗氧化上的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及唾液乳杆菌在抗氧化上的应用。

背景技术

目前养猪业由于养殖密度大、畜舍环境差、病源微生物复杂等原因，特别是仔猪在断奶时，由于会经历一个迅速的生理转化过程，导致仔猪产生严重的氧化应激反应。劣质饲料会加剧断奶仔猪的营养应激，引起仔猪生产性能下降，疾病抵抗力降低，腹泻率、死亡率升高，给养猪业带来巨大的经济损失。为减少养殖过程中疾病的发生，生产中大量使用抗生素，但是长期使用抗生素破坏了仔猪肠道微生物区系平衡、降低了机体免疫能力、对病菌产生了耐药性，因此，开发高效、绿色的能够提高仔猪抗氧化能力的抗生素替代品是养猪业亟需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供唾液乳杆菌在抗氧化上的应用，唾液乳杆菌RS-23-1具有提高动物抗氧化能力，因此将其应用于抗氧化中。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

第一个方面，本发明提供唾液乳杆菌RS-23-1在抗氧化上的应用。

第二个方面，本发明提供唾液乳杆菌RS-23-1在制备抗氧化产品中的应用。

进一步地，所述唾液乳杆菌RS-23-1为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1，保藏编号为CGMCC No.26619，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。

第三个方面，本发明提供一种抗氧化产品，含有保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1或唾液乳杆菌RS-23-1菌悬液或唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物。

进一步地，所述唾液乳杆菌菌悬液的制备方法如下：

将活化后的唾液乳杆菌接种于MRS液体培养基中发酵培养，收集菌体，重悬于PBS，调整密度为1×10⁹CFU／mL。

优选地，所述唾液乳杆菌按 1-3％（v/v）接种于MRS液体培养基中。

进一步地，所述唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物的制备方法如下：

将所述唾液乳杆菌菌悬液在冰浴条件下超声破碎，离心，收集上清液，得到无细胞提取物。

优选地，所述超声破碎的条件为245-255 W，超声5-10 s，间隔10-15 s，共10-15min。

进一步地，所述抗氧化产品是用于提高动物抗氧化能力的药物或饲料添加剂。

优选地，所述饲料添加剂的添加量为饲料中唾液乳杆菌活菌数为1×10⁷CFU/g。

本发明所具有的优点和有益效果是：

本发明猪源唾液乳杆菌RS-23-1的菌悬液（IC）和细胞提取物（CFE）均具有一定的DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力，表明该菌株在体外具有一定的抗氧化活性，具有提高动物的抗氧化能力，将其应用于抗氧化中，制备成抗氧化产品，可以减少诱发动物的疾病。

本发明的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1的保藏信息如下：

保藏编号：CGMCC No.26619；

分类命名：唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius；

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2023年2月21日。

附图说明

图1为候选菌抑菌圈效果图，其中：A大肠杆菌；B金色葡萄球菌；C沙门氏菌；1：RS-23-1；3：RS-23-3；5：RS-23-5；7：RS-23-7；15：RS-23-15；

图2为猪源唾液乳杆菌RS-23-1革兰氏染色观察（×1000）；

图3为株遗传进化分析；

图4为猪源乳酸杆菌RS-23-1生长曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在下述实施例中：

MRS固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K₂HPO₄2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，MgSO₄·7H₂0 0.58g，MnSO₄·4H₂0 0.25g,琼脂 15-20g,蒸馏水1000mL。

LB 琼脂培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂 15-20g。

MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K₂HPO₄2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，MgSO₄·7H₂0 0.58g，MnSO₄·4H₂0 0.25g,蒸馏水1000mL。

实施例1

本实施例提供一种唾液乳杆菌菌悬液的制备方法，步骤如下：

将活化后的保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1按 2％（v/v）接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h，8000 g离心10 min，4 ℃，收集菌体，所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，重悬于 PBS，调整密度为1×10⁹CFU／mL。

实施例2

本实施提供一种唾液乳杆菌无细胞提取物的制备方法，步骤如下：

将活化后的保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1按2％（v/v）接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h，8000 g离心10 min，4 ℃，收集菌体，所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，重悬于 PBS，调整密度为1×10⁹CFU／mL，得到唾液乳杆菌菌悬液；

将唾液乳杆菌菌悬液在冰浴条件下超声破碎，离心，收集上清液，得到无细胞提取物。所述超声破碎的条件为250 W，超声5 s，间隔10 s，共10 min。

实施例3

本实施例提供一种益生菌剂的制备方法，步骤如下：

将猪源唾液乳杆菌RS-23-1涂布接种100μL在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养三代，然后接种至20 L自动发酵罐中制备成益生菌液（37℃，pH=5.0～5.5，24h），应用平板计数法计算所生产菌液的活菌数，样品中乳杆菌RS-23-1活菌数为1×10¹⁰CFU/g。本实施例中MRS固体培养基的用量是在10mm的培养板里面铺3mm厚的MRS固体培养基。

实施例4

本实施例提供一种抗氧化药物，该抗氧化药物含有保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1。所述药物还包括药用辅料。所述药物的剂型可以是粉剂、片剂、注射剂、口服液等。

实施例5

本实施例提供一种抗氧化药物，该抗氧化药物含有保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1菌悬液。所述药物还包括药用辅料。所述药物的剂型可以是粉剂、片剂、注射剂、口服液等。

实施例6

本实施例提供一种抗氧化药物，该抗氧化药物含有保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物。所述药物还包括药用辅料。所述药物的剂型可以是粉剂、片剂、注射剂、口服液等。

实施例7

本实施例提供一种饲料添加剂，该饲料添加剂含有保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1。所述饲料添加剂在饲料中的添加量为饲料中保藏编号为CGMCCNo.26619的唾液乳杆菌活菌数为1×10⁷CFU/g。

实验例8

具有抗菌效果的猪源乳酸杆菌的筛选与鉴定

1．猪源唾液乳杆菌筛选分离

以四川绵阳本地猪的新鲜猪粪为样本，无菌称取猪粪便0.1g加入到装有 0.9 mL无菌 PBS缓冲液的1.5 mL 离心管，涡旋混匀后三层纱布过滤，取滤液，用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释至 10^-3、10^-4、10^-5，取各梯度稀释液均匀涂布于含碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃恒温培养24 h，挑取不同形态、色泽且有溶钙圈的单一菌落划线接种至MRS固体培养基中，37℃恒温培养24 h，如此纯化3次直至得到纯菌株。初步筛选分离到20株革兰阳性的乳酸菌，编号分别为 RS-23-1 至RS-23-20。

制备猪源乳酸菌悬液：

将初步筛选分离到的编号为 RS-23-1 至RS-23-20的20株革兰阳性的乳酸菌分别涂布接种在100μL在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养三代，分别将菌种继续接种至20 L自动发酵罐（37℃，pH=5.0～5.5，24h）中制备成浓度为 1×10⁹cfu/mL的菌悬液。其中MRS固体培养基的用量是在10mm的培养板里面铺了3mm厚的MRS固体培养基。

2．猪源唾液乳杆菌拮抗病原菌特性筛选

在已制备好的无菌 LB 琼脂培养基上分别滴加菌液浓度为 1×10⁹cfu/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌各1 mL，用一次性涂布棒将菌液均匀铺开覆盖于培养基表面；静置 1 min 后用移液枪吸出多余菌液，然后用直径7 mm的无菌打孔器打孔，火焰下封板；待凝固后往孔中加入100 μL 浓度为 1×10⁹cfu/mL 的各猪源乳酸菌悬液，37 ℃恒温培养24 h，每种益生菌做3个平行，用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm），用抑菌圈直径的大小表示益生菌抑菌活性。

抑制病原菌试验，通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的抑制，初筛得到抑菌效果良好的乳酸菌2株，分别为RS-23-1、RS-23-15，其中RS-23-1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳，抑菌结果如表1、图1。将通过抑菌试验所得优势菌株保存，进行下一步耐受消化道环境的复筛。

表1 候选菌抑菌试验结果

3．猪源唾液乳杆菌耐酸耐胆盐筛选

为进一步对候选菌株耐受消化道环境的复筛，进行了耐酸耐胆盐的试验，实验步骤如下：

耐胆盐实验：1. 将过夜培养的菌株（根据生长曲线确定菌液浓度和培养时间）按5 % （v/v）接种于不同胆盐水平(体积浓度分别为 0. 15 % 和 0. 3 % ) 的 MRS 液体培养基中，37℃放置2 h；

2. 分别在 0 和 2 h 取 100 μL 菌液逐级稀释（根据初始浓度判定稀释浓度），稀释液涂布MRS固体培养基，37℃培养24或48h，菌落计数；

3. 计算成活率。每个样品3个重复。

存活率（%）=“2 h”菌落数/“0 h”菌落数 ×100%

耐酸实验：1. 将过夜培养的菌液按 5 % （v/v）接种到 pH 为 2 和 3的 MRS 液体培养基中， 37 ℃ 放置 2 h；

2. 分别在 0 和2 h 取 100 μL 菌液逐级稀释（10^-3、10^-5、10^-7），稀释液涂布MRS固体培养基，37℃培养24或48h，菌落计数；

3. 计算成活率。每个样品 3 个重复。

存活率（%）=“2 h”菌落数/“0 h”菌落数 ×100%。

试验结果如表2。在PH在2和3的环境下，RS-23-1的存活率均最高，综上表明RS-23-1的耐酸性最佳。在0.15%胆盐的环境下，两株菌均有一定耐受力；而在0.3%胆盐的环境下，RS-23-1的耐受力最佳。综合耐酸耐胆盐的结果，RS-23-1具有良好的耐酸耐胆盐特性，并确定为目标菌株。

表2 两株筛选菌株的酸和胆盐耐受力

4．猪源唾液乳杆菌RS-23-1的鉴定

在分离出纯净的乳酸杆菌的单个菌落之后,对该菌落进行鉴定。本申请中猪源唾液乳杆菌RS-23-1的鉴定过程可以为：根据分离纯化后得到的乳酸杆菌的菌落进行处理，通过对分离纯化得到的乳酸杆菌的细胞形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列进行鉴定，鉴定为唾液乳杆菌，命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26619，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。鉴定数据如下：

4.1 形态学鉴定

本申请猪源唾液乳杆菌RS-23-1菌落形态如表3，如图2所示，革兰氏染色观察可发现，筛选出的乳酸菌为短杆状。

表3 RS-23-1菌落形态

4.2 生理生化特性鉴定

分离菌株的生理生化特征见表4。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》进行对照分析，初步判定RS-23-1为产乳酸乳杆菌属细菌。

表4 RS-23-1生理生化鉴定结果

注: +表示阳性；-表示阴性

4.3唾液乳杆菌的分子生物学鉴定

采用细菌鉴定 16S rDNA 通用引物 27F及1492R 进行PCR扩增，引物序列如表5所示，引物由上海生工生物科技有限责任公司合成。

表 5 16S rDNA 引物序列

PCR 扩增模板为活化后的新鲜菌液，体系为 50μL，详见表6。

表 6 PCR 反应体系

PCR 扩增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 45 s；55℃ 45 s；72℃ 1 min；重复 35个循环；72℃ 8 min。PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后于上海生工生物有限公司测序，在GenBank进行BLAST比对分析。猪源唾液乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在GenBank进行BLAST比对，绘制遗传进化树，结果如图3所示， RS-23-1与参考菌株Ligilactobacillus salivarius（BCRC 14759）在同一分枝上，亲缘性最近，因此可判定RS-23-1为唾液乳杆菌。

5．猪源唾液乳杆菌RS-23-1的生物学特性分析

图4 所示为猪源唾液乳杆菌RS-23-1在37℃、有氧条件下的生长曲线，通过对猪源唾液乳杆菌RS-23-1生长曲线的测定，可以发现RS-23-1在8 h后进入对数生长期，14 h后进入稳定期。

实验例9

菌液制备及体外抗氧化检测

1、试剂

无水乙醇、铁氰化钾、PBS缓冲液、醋酸、三氯化铁、抗坏血酸、过氧化氢、硫酸亚铁、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、焦性没食子酸（邻苯三酚）、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（Tris）、磷酸盐缓冲液、邻二氮菲溶液等，以上试剂均为分析纯。

2、样品菌液的提取

制备唾液乳杆菌的菌悬液和无细胞提取物：

将活化后的唾液乳杆菌按2％（v/v）接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h，8000 g离心10 min，4 ℃，收集菌体，所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，重悬于 PBS缓冲液，调整密度为1×10⁹CFU／mL，将其平均分为2部分，1部分作为菌体细胞（IC）；另1部分在冰浴条件下超声破碎（250 W，超声5s，间隔10s，共10 min)，8000 g离心10 min，收集上清液，得到无细胞提取物（CFE）。

3、体外抗氧化活性测定

3.1 DPPH 自由基清除能力的测定

0.2 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液的配置：称取50 mg DPPH，加入634 mL无水乙醇，摇匀。

菌悬液（IC）的DPPH自由基清除率：取菌悬液 1 mL 置于试管中，加入 DPPH 无水乙醇溶液 2 mL（浓度为 0.2mmol/L），混匀后，室温下避光反应 30 min，4℃，8000 g，离心10 min 后取上清液，517 nm 下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

DPPH 清除率（%）=[1-(A菌悬液-A空白)/A对照]×100%

（空白组：DPPH 用等体积无水乙醇代替；对照组：样品溶液用等体积蒸馏水代替，并用等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零）。

无细胞提取物（CFE）的DPPH自由基清除率：取无细胞提取物1 mL 置于试管中，加入 DPPH 无水乙醇溶液 2 mL（浓度为 0.2mmol/L），混匀后，室温下避光反应 30 min，4℃，8000 g，离心 10 min 后取上清液，517 nm 下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

DPPH 清除率（%）=[1-(A无细胞提取物-A空白)/A对照]×100%

菌悬液（IC）样品组：将制备得到菌悬液（IC）1 mL 置于试管中，加入 DPPH 无水乙醇溶液 2 mL（浓度为 0.2 mmol/L），混匀后，室温下避光反应 30 min，4℃，8000 g，离心10 min 后取上清液，517 nm 下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

无细胞提取物（CFE）样品组：将制备得到无细胞提取物（CFE）1 mL 置于试管中，加入 DPPH 无水乙醇溶液 2 mL（浓度为 0.2 mmol/L），混匀后，室温下避光反应 30 min，4℃，8000 g，离心 10 min 后取上清液，517 nm 下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

空白组：将制备得到无细胞提取物1 mL 置于试管中，加入无水乙醇溶液 2 mL（浓度为 0.2 mmol/L），混匀后，室温下避光反应 30 min，4℃，8000g，离心 10 min 后取上清液，517 nm 下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

对照组：将蒸馏水1 mL 置于试管中，加入DPPH 无水乙醇溶液 2 mL（浓度为 0.2mmol/L），混匀后，室温下避光反应 30 min，4℃，8000 g，离心 10 min 后取上清液，517 nm下测定其吸光度，去离子水调零。每组做3个重复，求其平均值。

DPPH 清除率（%）=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100% 。

3.2 羟自由基(·OH)清除活性的测定（Fenton法）

Fenton法是利用H₂O₂和Fe²⁺混合发生Fenton反应。生成具有很高反应活性的·OH，而水杨酸能捕捉·OH并产生有色物质（二羟基苯甲酸），该物质在510 nm下有最大吸收。但是如果加入一定量具有清除能力的物质，就会和水杨酸的反应产生竞争，从而导致有色物质（二羟基苯甲酸）的产生量减少,引起溶液的吸光度发生一定的变化。再根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。

H₂O₂+Fe²⁺→·OH+OH^-+Fe³⁺

液体的配置：①FeSO₄·7H₂O：精密称取 0.05 g七水合硫酸亚铁置于 100 ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀即得到1.8nmol/L的硫酸亚铁溶液。

②水杨酸-乙醇：精密称取量为0.0249 g的水杨酸置于 100 ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀稳定后，即得到 1.8 nmol/L的水杨酸-乙醇溶液。

③0.3% H₂O₂溶液：精密量取量为 1.0 ml 30%的过氧化氢置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混合均匀后，即得到0.3% H₂O₂溶液。

具体步骤如下：试管中依次加入2 mL 1.8 mmoL/mL的FeSO₄，1 mL样品，以及0.3%H₂O₂溶液0.1 mL，摇匀，再加入1.8mmol/mL的水杨酸-乙醇溶液1.5 mL，摇匀，于30℃ 静置30min后，于510 nm处测得样品组吸光值Ai；将样品组中的H₂O₂溶液换成等量的蒸馏水，进行反应，作为样品参照组并测得其吸光值Aj ；将样品组中的样品换成等量的蒸馏水，进行反应，作为空白对照组测得吸光值Ao。按以下公式计算出羟自由基清除率：

清除率(%)=Ao－(A_i－A_j)/Ao ×100％。

3.3 超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)清除活性的测定（邻苯三酚法）

邻苯三酚在碱性环境下极其容易发生自氧化，产生具有颜色的中间产物和超氧阴离子O₂ ^-·，O₂ ^-·又对自氧化反应具有催化作用，根据有色物质产生的多少来判断O₂ ^-·的生成量。当加入具有抗氧化活性物质后，可减弱邻苯三酚的自氧化，从而使得利用有色物质减少的趋势来判断抗氧化活性大小。

液体的配置：①25nmol/L邻苯三酚：精密称取邻苯三酚0.315g，置于100ml容量瓶中，再加入10ml 0.1mol/L的盐酸，最后加蒸馏水至刻度，摇均，即得到25nmol/L的邻苯三酚。邻苯三酚要现配现用，20℃下反应。

②Tris-Hcl缓冲溶液：精密称取3.0285g Tris试剂置于500ml容量瓶中，再加入114.5ml 0.1mol/L的盐酸，最后加蒸馏水至刻度，摇均，即得0.05mol/L的缓冲液。

具体步骤如下：取出试管加入7.5ml Tris-Hcl缓冲溶液，置于25℃水浴锅中预热20 min后，分别加入1 ml样品溶液和0.5ml浓度25 mmol/L邻苯三酚溶液，混合后置于25℃水浴锅中反应5min，加入浓Hcl 1ml终止反应，作为样品组在紫外可见分光光度计下320 nm波长处测定溶液的吸光度Ai；样品参照组用相同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液并测定溶液的吸光度Aj；空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品溶液测定溶液的吸光度Ao。按以下公式计算出O₂ ^-·的清除率：

清除率(%)=Ao－(A_i－A_j)/Ao ×100％

3.4 还原能力的测定

液体的配置：① 0.2 mol/L、pH 6.6 的磷酸缓冲溶液：分别先配制甲液0.2MNa₂HPO₄（17.19g Na₂HPO₄·12H₂O+240 mL H₂O）和乙液0.2M NaH₂PO₄（11.23g NaH₂PO₄·2H₂O+360 mL H₂O）；甲液取40 mL，乙液取60 mL，混合后就是PH6.6的溶液。

②1%铁氰化钾：1g铁氰化钾+100 mL；

③ 三氯乙酸1mL+9 mL H₂O；

④ 0.1%三氯化铁：0.1g三氯化铁+100 mL。

取 0.5 mL 样品置于试管中，加入浓度为0.2 mol/L、pH 6.6 的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加入 0.5 mL 1%铁氰化钾，50℃水浴20 min后迅速冰浴冷却。再加入 10%三氯乙酸0.5 mL，4000 r/min 离心10 min，取上清液 1 mL，加入1 mL 蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁，混合均匀。室温放置10 min，700nm波长测定其吸光度。每个样品3个重复。吸光度越大表示待测样品的还原能力越强。每组做3个重复，求其平均值。

结果

猪源唾液乳杆菌RS-23-1的菌悬液（IC）和细胞提取物（CFE）均具有一定的 DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力以及一定的还原能力，表明该菌株在体外具有一定的抗氧化活性。结果如表5。

表5 RS-23-1体外抗氧化能力测定

实验例10

动物实验及体内抗氧化能力的测定

1、猪源唾液乳杆菌RS-23-1菌液准备：

将猪源唾液乳杆菌RS-23-1涂布接种100μL在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养三代，然后将菌种继续接种至20 L自动发酵罐中（37℃，pH=5.0～5.5，24h）制备成益生菌液，应用平板计数法计算所生产菌液的活菌数，样品中乳杆菌RS-23-1活菌数为1×10¹⁰CFU/g。其中MRS固体培养基的用量是10mm的培养板里铺3mm厚的MRS固体培养基培养基。

2、动物实验处理

选用18头健康、平均体重为6.9-7.1 kg的28日龄断奶仔猪。根据体重相近公、母比例一致的原则，随机将试验仔猪分成3个组，每组设1个圈，每圈6头，公母各半。对照组饲喂基础日粮，阳性对照组（某厂家乳酸菌组）在基础日粮中添加的某厂家乳酸菌（沧州市益宏生物科技有限公司，畜禽用乳酸菌）调整至饲料中活菌数为1×10⁷CFU/g，试验组（RS-23-1组）在基础饲粮中添加猪源唾液乳杆菌调整至饲料中活菌数为1×10⁷CFU/g，预饲期3天，正式试验期28天。供试猪均按照猪场常规词养管理，试验期间免疫、驱虫和消毒程序均按猪场正常程序进行。试验饲喂结束，每组前腔静脉采血5 mL，置于血清管中促凝，3000r/min离心10min，分离血清后-20℃保存待测。断奶仔猪基础饲粮配方组成见表6。

表6 断奶仔猪基础日粮配方组成

预混料为每千克饲粮提供：VA 4800 IU，VD₃880 IU， VE 30 IU, VK₃2.4 mg，VB₁2.0 mg，VB₂8 mg,VB₆1.2 mg，VB₂0.03 mg，叶酸 2.0 mg，生物素 0.2 mg，烟酸 40mg，泛酸25 mg，Cu 14.4 mg，Fe 120mg, Zn 125 mg，Mn 50 mg，Co 0.4 mg，Se 0. 3mg，I 0.3 mg。

3、抗氧化能力测定

将采集的仔猪血清样品使用抗氧化能力指标检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）进行检测，共测定四个指标：总抗氧化能力（T-AOC）(A015-1-2，南京建成生物工程研究所有限公司)、总超氧化歧化酶（SOD）(A001-3-2，南京建成生物工程研究所有限公司)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）(A005-1-2，南京建成生物工程研究所有限公司)、丙二醛（MDA）(A003-1-2，南京建成生物工程研究所有限公司)。

本申请猪源唾液乳杆菌应用到断奶仔猪中后的抗氧化能力的检测

检测了血清中氧化应激相关生化指标。其中T-SOD、CAT、GSH-Px和T-AOC是机体抗氧化能力的指标，MDA为氧化损伤指标。

猪源唾液乳杆菌RS-23-1组和某厂家乳酸菌组中仔猪血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性和总抗氧化能力（T-AOC）活性均高于对照组，而两个实验组中血清丙二醛（MDA）含量均显著低于对照组（P<0.05），且这些指标在RS-23-1组和某厂家乳酸菌组中无显著性差异。表明猪源唾液乳杆菌RS-23-1提高了断奶仔猪的抗氧化能力，并达到了某商用益生乳杆菌的效果。数据如表7。

表7 猪源唾液乳杆菌 RS-23-1对仔猪抗氧化能力的影响

注：同一列不同字母代表差异显著(p<0．05)。

根据上述实验结果可知，本发明猪源唾液乳杆菌具有提高动物的抗氧化能力，可以用于制备抗氧化制品。虽然本实施例以猪为例进行了说明，但是本发明猪源唾液乳杆菌对于鸡、牛、羊、马、鸭、鹅、兔、鱼中的任何一种均具有提高抗氧化能力，从而减少诱发动物的疾病。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1在非治疗目的的抗氧化上的应用，其特征在于，所述唾液乳杆菌RS-23-1的保藏编号为CGMCC No.26619，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。

2.一种抗氧化产品，其特征在于，含有权利要求1所述的唾液乳杆菌RS-23-1或唾液乳杆菌RS-23-1菌悬液或唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物。

3.根据权利要求2所述的抗氧化产品，其特征在于：所述唾液乳杆菌RS-23-1菌悬液的制备方法如下：

将活化后的唾液乳杆菌RS-23-1接种于MRS液体培养基中发酵培养，收集菌体，重悬于PBS，调整密度为1×10⁹ CFU／mL。

4.根据权利要求3所述的抗氧化产品，其特征在于：所述唾液乳杆菌RS-23-1按1-3％（v/v）接种于MRS液体培养基中。

5.根据权利要求2-4任一项所述的抗氧化产品，其特征在于：所述唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物的制备方法如下：将所述唾液乳杆菌RS-23-1菌悬液在冰浴条件下超声破碎，离心，收集上清液，得到无细胞提取物。

6.根据权利要求5所述的抗氧化产品，其特征在于：所述超声破碎的条件为245-255 W，超声5-10 s，间隔10-15 s，共10-15 min。

7.根据权利要求2所述的抗氧化产品，其特征在于所述抗氧化产品是用于提高动物抗氧化能力的药物或饲料添加剂。

8.根据权利要求7所述的抗氧化产品，其特征在于所述饲料添加剂的添加量为饲料中唾液乳杆菌活菌数为1×10⁷ CFU/g。