CN114651984A - 干酪乳杆菌lc89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用 - Google Patents

干酪乳杆菌lc89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干酪乳杆菌LC89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用。本发明创造性地发现干酪乳杆菌LC89在治疗功能性便秘这种特殊的便秘亚型方面具有优异的效果，其治疗效果优于现有技术中公开的有改善便秘潜力乳双歧杆菌BLa80等菌种，在缓解功能性便秘的产品的制备中具有重要的应用价值。

Description

干酪乳杆菌LC89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便 秘的产品中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及干酪乳杆菌LC89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用。
背景技术
尽管每个人的排便频率因人而异，但大多数人排便的时间间隔是有规律的且不会出现明显的紧张感或不适。然而，有一部分人则存在功能性排便障碍，即功能性便秘(Functional Constipation,FC)，又被称为慢性特发性便秘(Chronic IdiopathicConstipation,CIC),是一种常见的胃肠道疾病，临床表现为持续性排便困难、排便次数减少或排便不尽感。FC通常不是由器质性疾病或药物因素导致的，通常是多因素的，包括生活习惯、精神心理因素、环境条件、饮食习惯等。
根据流行病学调查结果表示，FC常见于两大人群，一是老年人群，尤其是女性，二是儿童，在学龄前儿童中尤其常见，全球患病率前者高达24％，后者约9.5％，同时存在发病年龄趋于年轻化的情况，其主要发病机制是肠动力障碍，即FC患者通常伴随着肠道菌群紊乱等相关胃肠道疾病，体内的有益菌会逐渐减少，如乳酸杆菌、双歧杆菌等，同时像大肠杆菌和肠球菌等致病菌也会随之增多。目前的治疗方式多采用缓泻剂、解除粪便嵌塞、饮食指导及排便训练等，但成效一般，容易出现药物依赖性，腹痛腹泻，造成更深的心里压力和焦虑等问题，影响到患者正常的生活状态。因此，若能从肠道菌群调节入手，也许可以从根本上解决FC患者排便障碍的问题，这一治疗或改善功能性排便障碍的方式也已成为国内外研究的热点。研究发现，益生菌尤以乳杆菌属，比如干酪乳杆菌，可以通过竞争肠道粘附位点，分泌乳酸、乙酸、过氧化氢、细菌素等抗菌物质，调节肠道菌群等方式抑制病原菌的定植和生长繁殖，从而维持肠道健康。
然而，目前现有技术中的干酪乳杆菌等菌种虽然可以调节肠道健康，具有治疗便秘的潜力，但对于功能性排便障碍这种特殊的便秘亚型是否有疗效，还未可知。
因此，如何提供一种可以治疗功能性排便障碍的微生物制剂，减轻功能性排便障碍患者的各种痛苦体验，同时调节人体肠道微生态，在肠道环境中发挥有益作用，抑制肠道有害菌的生长，改善肠道菌群的平衡，增强对病原体的防御屏障功能，已成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供干酪乳杆菌LC89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供干酪乳杆菌LC89在制备缓解功能性便秘的产品中的应用。
优选地，所述产品包括食品、保健品或药物。
优选地，在所述产品中，干酪乳杆菌LC89的活菌数为1×108CFU/g以上，例如1×108CFU/g、5×108CFU/g、1×109CFU/g、5×109CFU/g、1×1010CFU/g、1×1011CFU/g、1×1012CFU/g等。
第二方面，本发明提供一种微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用，所述微生物制剂包括干酪乳杆菌LC89培养物，所述干酪乳杆菌LC89培养物由包括如下步骤的制备方法制备得到：
将干酪乳杆菌LC89接种于添加益生元的MRS培养基中进行培养，离心，收集菌体，即得；
所述益生元包括菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖、水苏糖、低聚木糖、低聚甘露糖或抗性糊精中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如菊粉和低聚半乳糖的组合、水苏糖和低聚木糖的组合、低聚木糖和低聚甘露糖的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述益生元包括菊粉和低聚半乳糖。
优选地，所述培养的温度为33-40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地，所述微生物制剂还包括其他菌株培养物，所述其他菌株培养物包括嗜热链球菌培养物、双歧杆菌培养物、植物乳杆菌培养物、德氏乳杆菌培养物或鼠李糖乳杆菌培养物中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如嗜热链球菌培养物和双歧杆菌培养物的组合、嗜热链球菌培养物和德氏乳杆菌培养物的组合、德氏乳杆菌培养物和鼠李糖乳杆菌培养物的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述其他菌株培养物包括植物乳杆菌Lp05培养物。
优选地，在所述微生物制剂中，植物乳杆菌Lp05与干酪乳杆菌LC89的活菌数比为(1-4):(1-2)。
上述(1-4)中的具体数值例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.5、2.7、3、3.2、3.5、3.7、4等。.
上述(1-2)中的具体数值例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等。
优选地，所述产品包括食品、保健品或药物。
第三方面，本发明提供一种缓解功能性便秘的固体饮料，所述缓解功能性便秘的益生菌酸奶包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂和冻干保护剂。
所述冻干保护剂包括葡萄糖、菊粉、低聚半乳糖、乳糖、蛋白胨、维生素C钠或吐温-80中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如葡萄糖和菊粉的组合、乳糖和蛋白胨的组合、维生素C钠和吐温-80的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述冻干保护剂以重量份数计包括葡萄糖1.0-5.0份、菊粉1.0-5.0份、低聚半乳糖1.0-5.0份、蛋白胨1.0-2.0份、维生素C钠0.01-0.15份和吐温-80 0.1-0.5份。
上述1.0-5.0份中的具体数值例如1.0份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份、2.0份、2.2份、2.5份、2.7份、3.0份、3.2份、3.5份、3.7份、4.0份、4.2份、4.5份、4.7份、5.0份等。
上述1.0-2.0份中的具体数值例如1.0份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份、2.0份等。
上述0.01-0.15份中的具体数值例如0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份、0.10份、0.11份、0.12份、0.13份、0.14份、0.15份等。
上述0.1-0.5份中的具体数值例如0.1份、0.15份、0.2份、0.25份、0.3份、0.35份、0.4份、0.45份、0.5份等。
第四方面，本发明提供一种缓解功能性便秘的益生菌酸奶，所述缓解功能性便秘的益生菌酸奶的制备原料包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，还包括生牛乳、浓缩牛奶蛋白，浓缩乳清蛋白、稀奶油、鸡蛋黄粉、柑橘纤维粉或甜味剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如生牛乳和浓缩牛奶蛋白的组合、浓缩牛奶蛋白和浓缩乳清蛋白的组合、稀奶油和鸡蛋黄粉的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述缓解功能性便秘的益生菌酸奶的制备原料以重量份数计包括：干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂、水50％-85％、生牛乳10％-20％、浓缩牛奶蛋白0.1％-2％，乳清浓缩蛋白0.1％-3％、稀奶油1％-5％、赤藓糖醇1％-5％、鸡蛋黄粉1％-5％、柑橘纤维粉1％-5％和甜菊糖苷1％-5％。
上述50％-85％中的具体数值例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％等。
上述10％-20％中的具体数值例如10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％等。
上述0.1％-2％中的具体数值例如0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、1％、1.3％、1.5％、1.7％、2％等。
上述0.1％-3％中的具体数值例如0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、1％、1.3％、1.5％、1.7％、2％、2.3％、2.5％、2.7％、3％等。
上述1％-5％中的具体数值例如1％、1.3％、1.5％、1.7％、2％、2.3％、2.5％、2.7％、3％、3.3％、3.5％、3.7％、4％、4.3％、4.5％、4.7％、5％等。
所述干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂的接种量为20-50g/T，例如20g/T、25g/T、30g/T、35g/T、40g/T、45g/T、50g/T等。
第五方面，本发明提供如第四方面所述的缓解功能性便秘的益生菌酸奶的制备方法，所述制备方法包括步骤如下：
(1)生牛乳经净乳、标准化、巴氏杀菌，得牛奶；
(2)称取部分牛奶(20％-50％)，加热至45-50℃，加入稀奶油，浓缩牛奶蛋白、鸡蛋黄粉，混合均匀，静置水合30-40min；
(3)再称取部分牛奶(20％-50％)，加热至75-80℃，加入部分赤藓糖醇(20％-80％)、柑橘纤维，剪切15-20min至混合均匀，加入剩余的赤藓糖醇、甜菊糖苷，混合均匀，冷却至常温，与步骤(2)所得物料混合均匀，加入剩余的牛奶，搅拌均匀，得混合料；
(4)将混合料加热至60-65℃，均质机压力调至18-20MPa进行均质，加热至95-97℃并保温4-6min进行杀菌，冷却至41-43℃，接入干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，搅拌10-20min至完全溶解，41-43℃静置发酵5-7h，至pH值4.6以下，滴定酸度70-75°T，破乳并冷却，即得。
第六方面，本发明提供一种缓解功能性便秘的益生菌口服液，所述缓解功能性便秘的益生菌口服液的制备原料包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，还包括脱脂乳粉、白砂糖、葡萄糖、果胶、香精、乳酸或甜味剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如脱脂乳粉和白砂糖的组合、果胶和香精的组合、香精和乳酸的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述缓解功能性便秘的益生菌口服液以质量百分含量计包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂、水20％-70％、脱脂乳粉5％-25％、白砂糖5％-10％、葡萄糖5％-10％、果胶0.1％-5％、酸奶香精0.01％-0.5％、乳酸0.1％-5％、乳酸奶香精0.01％-0.5％和三氯蔗糖0.1％-0.5％。
所述干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂的接种量为20-50g/T，例如20g/T、25g/T、30g/T、35g/T、40g/T、45g/T、50g/T等。
上述20％-70％中的具体数值例如20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％等。
上述5％-25％中的具体数值例如5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％等。
上述5％-10％中的具体数值例如5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
上述0.1％-5％中的具体数值例如0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
上述0.01％-0.5％中的具体数值例如0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％等。
上述0.1％-0.5％中的具体数值例如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％等。
第七方面，本发明提供如第六方面所述的缓解功能性便秘的益生菌口服液的制备方法，所述制备方法包括步骤如下：
(1)将部分水(20％-70％)与脱脂乳粉在45-50℃下混合，搅拌2-10min，使物料充分混匀，静置水合20-40min，加入葡萄糖搅,1-5min，混合均匀，得混合料；
(2)将混合料在60-65℃下预热，均质，均质压力为180-200bar，加热至95-98℃，保温100-150min，冷却至37-38℃；
(3)接入干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，搅拌至混合均匀，在36-38℃下发酵72h以上，当酸度为160-175°T时停止发酵，冷却至20-25℃，得发酵乳；
(4)将果胶、白砂糖、甜味剂与剩余水在70-80℃混合，搅拌至溶解均匀，在95-97℃下杀菌，时间为10-20s，冷却至20-25℃，得无菌糖水；
(5)将发酵乳与无菌糖水以1:(2-5)的重量比进行混合，用乳酸调整酸度至158-165°T，加入香精，并充分混合，在180-200bar下均质至分散均匀，即得。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地发现干酪乳杆菌LC89在治疗功能性便秘这种特殊的便秘亚型方面具有优异的效果，其治疗效果优于现有技术中公开的由改善便秘潜力的菌种乳双歧杆菌BLa80等。
本发明创造性地在培养基中添加菊粉和低聚半乳糖的组合，二者相互配合，协同增效，显著促进了干酪乳杆菌LC89的生长，提高了其活菌数。
此外，本发明创造性地将干酪乳杆菌LC89与植物乳杆菌Lp05进行复配，二者相互促进，在治疗功能性便秘方面具有意料不到的协同增效的效果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述实施例、对比例、应用例和对比应用例所涉及的原料信息如下：
所述干酪乳杆菌LC89命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC89菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述植物乳杆菌Lp05命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Lp05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23547，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
干酪乳杆菌LC89的培养
将干酪乳杆菌LC89以2％的接种量接种于改良MRS液体培养基(即添加益生元的MRS液体培养基)中，于37℃培养16h后，转入新鲜的改良MRS液体培养基中，37℃培养16h后，经10000g离心5min，收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤菌体后10000g再次离心5min，得到干酪乳杆菌LC89培养物，用40％甘油和改良MRS液体培养基混合溶液重悬，得干酪乳杆菌LC89菌悬液，-80℃冻存待用。
所述改良MRS液体培养基的配方为：按质量份数计，蛋白胨1％、牛肉膏1％、葡萄糖2％、益生元1.7％、酵母浸膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、K2PO4·3H2O0.2％、MgSO4·7H2O0.058％、MnSO4 0.019％、L-半胱氨酸0.1％、吐温-80 0.1％、琼脂2％。分别选用不同益生元(各组益生元的总量相等)进行培养，测试培养得到的干酪乳杆菌LC89菌悬液的活菌数变化情况(OD600)，结果见表1(表中的比例是指质量比)。菊粉购自维乐夫、低聚半乳糖购自量子高科、低聚果糖购自量子高科、水苏糖购自承德京天、低聚甘露糖购自永安缘和。
表1
益生元 OD<sub>600</sub>
菊粉 4.925
低聚半乳糖 4.055
菊粉+低聚半乳糖(10:7) 6.768
低聚果糖+水苏糖+菊粉(2:5:10) 4.294
水苏糖+低聚甘露糖+低聚半乳糖(5:5:7) 4.345
结果显示：菊粉和低聚半乳糖在促进干酪乳杆菌LC89生长增殖方面具有协同增效的功效，这种效果是其他益生元组分或组合所达不到的。
实施例2
干酪乳杆菌LC89耐胃酸能力测试
制备人工胃液：以质量分数计，人工胃液中含有0.20％的NaCl以及0.30％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用；
干酪乳杆菌LC89菌悬液的制备方法参照实施例1，其中培养基中的益生元为菊粉与低聚半乳糖的组合，质量比为10:7。
耐胃酸能力测试：取1.0mL干酪乳杆LC89菌悬液(浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：存活率(％)＝N1/N0×100％，其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。
结果显示，干酪乳杆菌LC89具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率达67％以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率达80％以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率达93％以上。良好的耐酸能力为其制备缓解功能性便秘的产品创造了条件。
实施例3
功能性便秘大鼠模型的建立
清洁级SD大鼠48只，体重230g±20g，由上海市实验动物研究中心提供，已获得上海实验动物研究中心动物伦理委员会(伦理号：2021082003)的伦理批准。
分组及给药：将大鼠随机分为正常组(8只)和模型组(40只)。其中模型组随机分成5个剂量组(每组8只)，采用复方地芬诺酯灌胃法建立SD大鼠功能性便秘模型，9mg/kg、15mg/kg、18mg/kg、23mg/kg、28mg/kg。复方地芬诺酯片(购于常州康普药业有限公司)使用研钵进行研磨至细粉末后，再用蒸馏水按5个剂量组所需的浓度配置成混悬液备用。大鼠在经过12h的禁食后分别以10mL/kg的灌胃量每天灌胃1次，给药6周。
功能性便秘大鼠指标评价标准：每日对大鼠进行临床表现观察和排便情况记录、每间隔2周对大鼠进行体重检测，统计各组大鼠的死亡情况并分析原因。不同剂量复方地芬诺酯对大鼠体重和死亡率的影响结果见表2。
表2
Figure BDA0003573768200000111
注：表中的a表示：与空白组相比P<0.05。
结果显示：造模结束后，大鼠出现精神状态较差，进食减少，大便粒小且干硬，扎堆运动减少。根据表2结果来看，与空白组对比，不同剂量复方地芬诺酯对大鼠体重和死亡率的影响呈现差异化。其中，当复方地芬诺酯的剂量≦15mg/kg时，不会引起大鼠的死亡，当剂量大于15mg/kg时，大鼠的死亡率与其呈现正相关。从大鼠的体重情况上看，造模2周后各造模组与空白组相比均具有显著差异(P<0.05)，造模4周后9mg组与空白组无差异，其他造模组与空白组相比差异均较显著(P<0.05)。因此本发明选择复方地芬诺酯15mg/kg/天作为建立功能性便秘大鼠模型的灌胃剂量。
实施例4
干酪乳杆菌LC89对功能性便秘大鼠便秘症状的改善情况
(1)将24只大鼠随机分为3组(每组8只)：正常对照组(CTL组)、功能性便秘模型组(FC组)和干酪乳杆菌LC89治疗的功能性便秘大鼠组(LC89组)。各组大鼠正常培养14天后开始造模，造模期间，除CTL组大鼠外，其他大鼠均经口给予复方地芬诺酯15mg/kg，每日1次，连续14天，诱导功能性便秘。LC89组于第15天至第28天每日口服1次将干酪乳杆菌悬液(109CFU/天)，而CTL组和FC组于第15天至第28天每日用生理盐水按1mL/100g灌胃。
干酪乳杆菌悬液的制备方法为：将干酪乳杆菌LC89接种于改良MRS液体培养基中(其中培养基中的益生元为菊粉与低聚半乳糖的组合，质量比为10:7，其他组分参照实施例1)，37℃下培养17h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于改良MRS液体培养基中，37℃下培养17h，得到菌液；将菌液在6000g下离心15min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到干酪乳杆菌上清液；使用生理盐水重悬菌体，得到干酪乳杆菌悬液。
分别记录各组大鼠在造模前与造模后的粪便参数：通过灌胃炭粉指示液的方法来记录大鼠排下首粒黑便时间，4h后采集大鼠粪便，记录数量及粪便湿重(M1)，并在干燥箱中干燥3h后记录粪便干重(M2)。粪便含水量计算如下：粪便含水量百分比(％)＝(M1-M2)/M1×100％。结果见表3。
表3
Figure BDA0003573768200000131
注：a表示：与造模前相比P<0.05；b表示：与CTL组相比P<0.05；c表示：与FC组相比P<0.05。
结果显示，与CTL组相比，FC组首粒黑便时间较长，粪便含水量、粪便数量显著减少。与FC组相比，LC89组大鼠首粒黑便排出的时间明显缩短，粪便含水量和粪便数量明显增加，此结果充分证明了干酪乳杆菌LC89对功能性便秘大鼠便秘症状的改善作用。
(2)血清生化指标检测：使用3％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，于下腔静脉采血，分离出血清，利用ELISA试剂检测血清中胃动素和胃泌素含量。结果见表4。
表4
组别 胃动素 胃泌素
CTL组 107.05±3.11 15.32±0.95
FC组 88.91±2.10<sup>a</sup> 9.07±2.15<sup>a</sup>
LC89组 115.97±3.11<sup>ab</sup> 14.75±1.34<sup>b</sup>
结果显示，与CTL组相比，FC组大鼠血清中的胃动素和胃泌素含量均明显下降(P<0.05)。与FC组相比，LC89组大鼠血清中的胃动素和胃泌素含量都显著提高(P<0.05)，已经接近CTL组的水平。此结果说明，干酪乳杆菌LC89对胃肠激素胃动素、胃泌素含量变化有显著影响，由此可知，干酪乳杆菌LC89具有促进胃肠运动，提高胃肠道的收缩力和张力的作用。
(3)对各组大鼠的肠动力进行评价。肠道转运率，即肠推进率的计算方法为：肠推进率(％)＝A/B×100％，A：幽门括约肌和活性炭染色肠末端之间的长度；B：肠全长(幽门至直肠的距离)。
结果显示，FC组大鼠的肠推进率(43.98±5.38)显著低于CTL组(75.12±5.41)(P<0.05)，而LC89组大鼠的肠推进率(71.26±5.33)显著高于FC组(43.98±5.38)(P<0.01)，已经接近CTL组的水平。此结果说明，干酪乳杆菌LC89对肠道功能恢复效果明显。
实施例5
干酪乳杆菌LC89对功能性便秘患儿的治疗效果评价
选取了2020年12月-2022年1月在福建省福州市连江某医院就诊过的86名功能性便秘患儿作为研究对象，按随机数字表法分为实验组(n＝43)和对照组(n＝43)。实验组男20例，女23例，年龄1.2-6岁，平均年龄(2.5±0.13)岁；对照组男22例，女21例，年龄1.3-5.5岁，平均年龄(3.1±0.15)岁。2组患者在年龄、病程、性别方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本实验已通过该院医学伦理委员会的批准，同时在患儿家属同意下签署了知情同意书。
纳入标准：符合罗马IV的诊断标准并且排除了患有其他慢性病或者重大的医疗问题的儿童。
治疗方法：
对照组：接受常规治疗，使用乳果糖治疗，使用剂量采取1-3岁：7.5mL/次/天；3-6岁：10mL/次/天，治疗周期4周，均于早晨服用，具体情况可根据腹泻与便秘症状情况进行调整。
实验组：使用含有干酪乳杆菌LC89的固体饮料，早晨服用，一天一袋，每袋含干酪乳杆菌LC89活菌数约为1×109CFU。
固体饮料的制备方法为：将干酪乳杆菌LC89按照2％的接种量接种到改良MRS液体培养基中(其中培养基中的益生元为菊粉与低聚半乳糖的组合，质量比为10:7，其他组分参照实施例1)，于37℃下培养16h，得到活化后的培养液；将培养液于10000g离心5min后得到菌体；将菌体用pH为6.86的磷酸盐缓冲液清洗3次后用乳糖冻干保护剂(含2.3％乳糖、3.7％脱脂乳粉，余量为水)重悬(1011CFU菌体/1g冻干保护剂)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到干酪乳杆菌LC89菌粉。将干酪乳杆菌LC89菌粉(1010CFU)同5.25g抗性糊精、0.29g菊粉和0.01g低聚半乳糖进行混合，得到含干酪乳杆菌LC89的固体饮料。
观察指标及判定标准：
治疗效果参考疗效标准(主要根据患儿排便频率和大便性状来定，参考罗马IV诊断标准，Bristol粪便分型标准)：显效：自主排便频率>2次/周，Bristol分型>II型，无排便困难及便血；有效：未达到完全缓解；无效：仍符合罗马IV功能性便秘的诊断标准。总有效率＝(显效+有效)/总例数×100％。使用调查问卷来获取患儿的基本信息，使用随访表格获取患儿治疗4周内的服药情况(是否服药、具体剂量和不良反应的情况等)和便秘情况(病程、排便频率、粪便的Bristol分型、是否有其他便秘伴随症状等)。并电话随访患儿治疗后8周内的便秘情况。失访患儿均排除，并补充符合纳入标准的患儿。结果见表5-7。
表5治疗4周内排便频率情况比较
时间 对照组(n＝43) 实验组(n＝43)
治疗前 2.29±1.05 2.31±0.92
治疗1周 3.78±2.00<sup>a</sup> 3.64±0.19<sup>ab</sup>
治疗2周 3.95±1.28<sup>a</sup> 4.89±0.26<sup>abc</sup>
治疗3周 4.01±0.78<sup>a</sup> 5.02±1.06<sup>abc</sup>
治疗4周 4.07±0.57<sup>a</sup> 5.20±1.79<sup>abc</sup>
注：a表示与本组治疗前相比P<0.05；b表示与本组治疗1周后相比P<0.05；c表示与本组治疗2周后相比P<0.05。
表6治疗4周内粪便Bristol分型情况比较
时间 对照组(n＝43) 实验组(n＝43)
治疗前 2.01±1.52 1.97±0.45
治疗1周 3.57±1.03<sup>a</sup> 3.49±0.19<sup>ab</sup>
治疗2周 4.01±1.34<sup>ab</sup> 3.89±0.26<sup>abc</sup>
治疗3周 4.05±0.26<sup>ab</sup> 4.02±1.06<sup>abc</sup>
治疗4周 4.04±0.63<sup>ab</sup> 4.27±1.06<sup>abc</sup>
注：a表示与本组治疗前相比P<0.05；b表示与本组治疗1周后相比P<0.05；c表示与本组治疗2周后相比P<0.05。
表7治疗完成后8周内的效果对比
Figure BDA0003573768200000161
注：a表示与对照组相比P<0.05。
由表5结果可知：研究前，两组患儿排便情况无显著差异(P>0.05)；对照组治疗1周后患儿排便情况有一定程度的改善，但治疗2周到4周内患儿的排便频率情况未发生显著变化(P>0.05)；实验组治疗4周内每周排便频率均显著增加(P<0.05)。此结果说明，干酪乳杆菌LC89能够平稳增加功能性便秘患儿的排便频率。
由表6结果可知：治疗前两组患儿粪便Bristol分型为II-III型，且无显著差异，实验组经过4周的治疗，粪便每周均有显著软化(P<0.05)，对照组粪便性状在治疗后1周迅速变软(P<0.05)，但在后面几周治疗期变化较小(P>0.05)，此结果说明，干酪乳杆菌LC89能够更平稳地软化粪便，作用发挥较稳定。
由表7的结果可知，总体上来说，两组均无不良反应发生。在疗效对比上，实验组治疗后4周总有效率能达到95％，对照组治疗后4周临床总有效率能达到86％以上，但是治疗后8周其临床疗效约67％，不如实验组。实验组治疗后8周疗效较稳定，治疗效果高于97％，显著优于对照组(P>0.05)。此结果说明干酪乳杆菌LC89在缓解/治疗功能性便秘上具有突出贡献，起效快，疗效稳定持久，且安全性高。
实施例6
不同菌株对功能性便秘大鼠便秘症状的改善情况
对比干酪乳杆菌LC89、植物乳杆菌Lp05、副干酪乳杆菌L9(保藏编号为CGMCCNo.9800)、乳双歧杆菌BLa80(保藏编号为CGMCC No.22547)、以及不同菌株组合对功能性便秘大鼠便秘症状的改善情况。
将36只大鼠随机分为6组，按实施例4的方法诱导功能性便秘，并记录粪便参数。随后开始给药处理，持续14天，各组分别口服不同菌株的菌悬液(总活菌数109CFU/天)，植物乳杆菌Lp05、副干酪乳杆菌L9、乳双歧杆菌BLa80的菌悬液的制备方法参照实施例4中干酪乳杆菌悬液的方法。记录给药14天后各组大鼠的粪便参数。粪便参数的记录方法参照实施例4。各组大鼠给药前与给药后粪便参数的变化情况见表8。
测试方法参照实施例4，各组给药后与给药前相比，首粒黑便缩短时间、粪便含水量增量及粪便数量增量的对比结果见表8。
表8
Figure BDA0003573768200000181
结果表明，与现有技术中其他菌种相比，干酪乳杆菌LC89对功能性便秘有更好的治疗效果。而且，将干酪乳杆菌LC89与植物乳杆菌Lp05进行复配，二者相互促进，在治疗功能性便秘方面具有意料不到的协同增效的效果。
实施例7
本实施例提供一种益生菌口服液，其制备原料以重量百分含量计如下：脱脂乳粉3.25％、白砂糖10％、葡萄糖1.5％、果胶3.5％、酸奶香精0.025％、乳酸0.2％、乳酸奶香精0.02％、三氯蔗糖0.02％、干酪乳杆菌LC89菌粉40g/T，余量为纯化水。具体操作步骤如下：
A干酪乳杆菌LC89菌粉的制备：
将干酪乳杆菌LC89按照2％的接种量接种到改良MRS液体培养基中(其中培养基中的益生元为菊粉与低聚半乳糖的组合，质量比为10:7，其他组分参照实施例1)，于37℃下培养16h，得到活化后的培养液；将培养液于10000g离心5min后得到菌体；将菌体用pH为6.86的磷酸盐缓冲液清洗3次后用乳糖浓度为100g/L的乳糖冻干保护剂(含2.3％乳糖、3.7％脱脂乳粉)重悬(1011CFU菌体/1g冻干保护剂)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到干酪乳杆菌LC89菌粉。
B发酵乳制备
1)配料
纯化水：纯化水电导率控制在20us/cm以内；
溶解：纯化水加热至50℃加入脱脂乳粉，搅拌5min,使物料充分混匀，静置水合30min；加入葡萄糖搅拌2min，使其混合均匀。
2)巴氏杀菌
预热：预热温度为65℃；
均质：均质压力为190bar(先调二级使压力表指示为50bar,再调一级使压力表指示为190bar)；
加热：加热至97℃；
保温：保温温度控制在97℃，时间为120min；
冷却：保温时间到后，冷却至37℃。
3)发酵
添加干酪乳杆菌LC89 40g/T，搅拌2min，使其混合均匀；
发酵温度为37℃；酸度为170°T时停止发酵，冷却至常温，得发酵乳。
C糖水的制备
1)将果胶、部分白砂糖(一半的配方量)混合后加入70℃纯化水，搅拌30分钟至溶解均匀，加入剩余白砂糖、三氯蔗糖；
2)杀菌：温度应控制在97℃，时间为15s；
3)冷却：冷却至常温，得无菌糖水。
D益生菌口服液的制备
1)混料：将发酵乳与无菌糖水进行混合，两种物料的混合比例为1:3；用乳酸调整酸度至158°T；加入香精(酸奶香精、乳酸奶香精)，并充分混合。
5)二次均质：均质压力为180bar；
6)冷却：冷却至常温；
7)灌装，2～10℃冷藏，即得。
产品含量检测依据国家标准或者行业标准。
取200μL益生菌口服液，按照108CFU/kg体重的剂量对大鼠进行灌胃，连续4周，可有效缓解大鼠功能性便秘的症状。
实施例8
本实施例提供一种益生菌酸奶，以重量百分含量计其制备原料如下：生牛乳15％、浓缩牛奶蛋白1％，乳清浓缩蛋白1％、稀奶油3％、赤藓糖醇2％、鸡蛋黄粉3％、柑橘纤维粉2.5％、甜菊糖苷1％，直投式益生菌发酵剂接种量40g/T，具体操作步骤如下：
A直投式益生菌发酵剂的制备
将甘油管保存的干酪乳杆菌LC89、嗜热链球菌ST81(保藏编号为CGMCC No.15752)和保加利亚乳杆菌LB42(保藏编号为CGMCC No.15751)分别按2％比例接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养约18h，活化3代，确保纯度种子液的纯度。
将活化好的种子分别以2％比例接种到发酵罐中，37℃培养12h，pH控制5.8±0.2，将菌液于10000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌泥，加入葡萄糖、菊粉、低聚半乳糖、蛋白胨、维生素C钠、吐温-80组成的混合保护剂，然后经真空冷冻干燥后制备成直投式益生菌发酵剂。
其中直投式益生菌发酵剂中各组分以重量份数计：分别为嗜热链球菌ST81 15份、保加利亚乳杆菌LB42 2份、干酪乳杆菌LC89 40份、葡萄糖2.0份、菊粉1.5份、低聚半乳糖1.5份、蛋白胨1.0份、维生素C钠0.05份、吐温-80 1.0份。
B益生菌酸奶的制备
1)预处理：生牛乳验收，净乳，标准化，巴氏杀菌，得牛奶，冷藏；
2)化料：
a.称取部分牛奶(三分之一配方量)，加热至50℃，加入稀奶油，浓缩牛奶蛋白、鸡蛋黄粉，混合均匀，静置水合30-40min；
b.再称取部分牛奶(三分之一配方量)，加热至75℃，加入部分(一半配方量)赤藓糖醇与柑橘纤维的混合料，剪切20min至混合均匀，加入余下赤藓糖醇、甜菊糖苷，混合均匀，冷却至常温与a中的物料混合均匀；
3)定容：加入剩余的牛奶进行定容，并搅拌均匀；
4)均质：将物料加热至60℃，均质机压力调至18MPa(先调二级使压力表指示为5MPa，再调一级使压力表指示为18MPa)进行均质；
5)杀菌：将料液加热至97℃并保温5min杀菌；
6)冷却：物料应冷却至41℃；
7)接种：接入直投式益生菌发酵剂，搅拌15min至完全溶解；
8)发酵：41℃静置发酵6h，至pH值4.6以下，滴定酸度70°T；
9)冷却：破乳并冷却至25℃；
10)罐装、冷藏：物料灌装后在2～6℃下冷藏。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的干酪乳杆菌LC89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.干酪乳杆菌LC89在制备缓解功能性便秘的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、保健品或药物；
优选地，在所述产品中，干酪乳杆菌LC89的活菌数为1×108CFU/g以上。
3.一种微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用，其特征在于，所述微生物制剂包括干酪乳杆菌LC89培养物，所述干酪乳杆菌LC89培养物由包括如下步骤的制备方法制备得到：
将干酪乳杆菌LC89接种于添加益生元的MRS培养基中进行培养，离心，收集菌体，即得；
所述益生元包括菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖、水苏糖、低聚木糖、低聚甘露糖或抗性糊精中的任意一种或至少两种的组合。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述益生元包括菊粉和低聚半乳糖；
优选地，所述培养的温度为33-40℃。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂还包括其他菌株培养物，所述其他菌株培养物包括嗜热链球菌培养物、双歧杆菌培养物、植物乳杆菌培养物、德氏乳杆菌培养物或鼠李糖乳杆菌培养物中的任意一种或至少两种的组合。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述其他菌株培养物包括植物乳杆菌Lp05培养物；
优选地，在所述微生物制剂中，植物乳杆菌Lp05与干酪乳杆菌LC89的活菌数比为(1-4):(1-2)。
7.如权利要求3-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、保健品或药物。
8.一种缓解功能性便秘的固体饮料，其特征在于，所述缓解功能性便秘的固体饮料包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂包括葡萄糖、菊粉、低聚半乳糖、乳糖、蛋白胨、维生素C钠或吐温-80中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种缓解功能性便秘的益生菌酸奶，其特征在于，所述缓解功能性便秘的益生菌酸奶的制备原料包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，还包括生牛乳、浓缩牛奶蛋白，浓缩乳清蛋白、稀奶油、鸡蛋黄粉、柑橘纤维粉或甜味剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种缓解功能性便秘的益生菌口服液，其特征在于，所述缓解功能性便秘的益生菌口服液的制备原料包括干酪乳杆菌LC89和/或包含干酪乳杆菌LC89的微生物制剂，还包括脱脂乳粉、白砂糖、葡萄糖、果胶、香精、乳酸或甜味剂中的任意一种或至少两种的组合。
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