CN111560338A - 一株可缓解骨质疏松的干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可缓解骨质疏松的干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株干酪乳杆菌CCFM1127，此干酪乳杆菌CCFM1127能够缓解骨质疏松，具体体现在：显著提高去卵巢大鼠的骨密度水平；显著提高去卵巢大鼠的骨体积分数水平；显著提高去卵巢大鼠的骨小梁厚度水平；显著降低去卵巢大鼠血清中IL‑1β的含量；显著降低去卵巢大鼠血清中TNF‑α的含量；显著提高去卵巢大鼠血清中IL‑10的含量；显著降低去卵巢大鼠血清中内毒素的含量，可见，干酪乳杆菌CCFM1127在制备预防和/或治疗骨质疏松的产品中具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株可缓解骨质疏松的干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
骨质疏松(osteoporosis)是一种常见的骨骼疾病，它由多种原因引起，随着社会老龄化的日益加剧，越来越多的人罹患骨质疏松。骨质疏松临床分型为：原发性、继发性和特发性。其中，原发性骨质疏松症是随着年龄的增长发生的一种生理性退行性病变，主要表现为绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症；继发性骨质疏松是由代谢性疾病或长期服用某些药物等一些因素所诱发，诱发因素有甲状腺功能亢进或降低、肢端肥大症、糖尿病等；特发性骨质疏松多见于青少年，多伴有遗传家族史，女性多于男性，主要表现为青少年骨质疏松症和妇女妊娠、哺乳期骨质疏松症。目前，骨质疏松已成为威胁中老年人及绝经期妇女的主要疾病之一。
骨质疏松最大的危害是骨质疏松性骨折，骨质疏松性骨折会引发疼痛，严重降低骨质疏松患者的生活质量，并且，骨质疏松性骨折在严重的情况下可致残，使患者活动受限、生活不能自理，给个人、家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。
目前，临床上用于治疗骨质疏松的药物主要包括双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、激素替代剂和降钙素等，这些药物能够有效的促进成骨细胞的形成，抑制破骨细胞的形成，在治疗骨质疏松症上具有较好的临床疗效。可是，在使用这些药物治疗骨质疏松的过程中，有些药物存在的潜在并发症以及副作用也随之突显。例如，双膦酸盐可导致部分患者出现严重的骨、关节或肌肉不适，少数患者在患牙科疾病或接受侵入性牙科治疗时发生颌骨骨坏死的风险升高。阿仑膦酸的长期使用还与股骨粗隆下和股骨骨干骨折的发生有关。选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬可增加静脉血栓栓塞症和中风的风险。在激素替代治疗中，雌激素可增加子宫完整患者子宫内膜增生和患癌的风险，且胆结石病和静脉血栓栓塞症的发病率也增加2～3倍。
因此，仍需找到一种药物，此药物可有效缓解骨质疏松，并且，长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可缓解骨质疏松，且长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127，所述干酪乳杆菌CCFM1127保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61021，保藏日期为2020年05月06日。
所述干酪乳杆菌CCFM1127来源于福建宁德地区的健康人群新鲜粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌CCFM1127。
所述干酪乳杆菌CCFM1127的形态特征为：短杆状，两端圈，单个或成短链，无鞭毛，无孢子。
所述干酪乳杆菌CCFM1127的菌落特征为：圆形、灰白色、光滑(菌落特征具体可见图1)。
所述干酪乳杆菌CCFM1127的生理生化特征为：具有优良的模拟胃肠道存活能力和细胞粘附能力。
本发明还提供了上述干酪乳杆菌在制备预防和/或治疗骨质疏松的产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述干酪乳杆菌CCFM1127的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述干酪乳杆菌CCFM1127、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述干酪乳杆菌CCFM1127的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述干酪乳杆菌CCFM1127的饮料或零食。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述干酪乳杆菌CCFM1127按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含130g/L的脱脂奶粉。
本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS液体培养基。
本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗骨质疏松的产品，所述产品含有上述干酪乳杆菌CCFM1127。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述干酪乳杆菌CCFM1127的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述干酪乳杆菌CCFM1127、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述干酪乳杆菌CCFM1127的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述干酪乳杆菌CCFM1127的饮料或零食。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述干酪乳杆菌CCFM1127按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含130g/L的脱脂奶粉。
本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS液体培养基。
本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
有益效果：
1、本发明提供了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127，此干酪乳杆菌CCFM1127能够缓解骨质疏松，具体体现在：
(1)显著提高去卵巢大鼠的骨密度水平；
(2)显著提高去卵巢大鼠的骨体积分数水平；
(3)显著提高去卵巢大鼠的骨小梁厚度水平；
(4)显著降低去卵巢大鼠血清中IL-1β的含量；
(5)显著降低去卵巢大鼠血清中TNF-α的含量；
(6)显著提高去卵巢大鼠血清中IL-10的含量；
(7)显著降低去卵巢大鼠血清中内毒素的含量，
可见，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127在制备预防和/或治疗骨质疏松的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。
2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的干酪乳杆菌CCFM1127以及有效成分为干酪乳杆菌CCFM1127的产品安全性较高，长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用。
3、干酪乳杆菌具有预防和/或治疗功能性便秘、小儿厌食症、功能性消化不良或反流性食管炎的功能，可见，除骨质疏松外，本发明的干酪乳杆菌CCFM1127以及有效成分为干酪乳杆菌CCFM1127的产品也可用于预防和/或治疗功能性便秘、小儿厌食症、功能性消化不良或反流性食管炎。
生物材料保藏
一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127，分类学命名为Lactobacilluscasei，已于2020年05月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61021，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127的菌落特征。
图2：不同组别去卵巢大鼠的骨密度水平。
图3：不同组别去卵巢大鼠的骨体积分数水平。
图4：不同组别去卵巢大鼠的骨小梁厚度水平。
图5：不同组别去卵巢大鼠血清中IL-1β的含量。
图6：不同组别去卵巢大鼠血清中TNF-α的含量。
图7：不同组别去卵巢大鼠血清中IL-10的含量。
图8：不同组别去卵巢大鼠血清中内毒素的含量。
图2-8中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
绝经后骨质疏松的动物模型于1969年由Saville用去卵巢大鼠首先建立，后被反复证实，现已成为研究绝经后骨质疏松的经典动物模型，因此，下述实施例中使用去卵巢大鼠模拟骨质疏松大鼠。
下述实施例中涉及SPF级SD雌性大鼠购自斯莱克实验动物有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉购自纽瑞兹食品有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的干酪乳杆菌菌悬液的制备方法如下：
将干酪乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到干酪乳杆菌菌体；将干酪乳杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为1×109CFU/mL，得到菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
实施例1：干酪乳杆菌的获取
具体步骤如下：
以来源于福建宁德地区的健康人群新鲜粪便为样本，吸取0.5mL样本添加至5mL的MRS液体培养基中，37℃培养18～24h，进行富集，得到富集后的样品；吸取0.5mL富集后的样品添加至4.5mL无菌生理盐水中获得10-1稀释液，然后吸取0.5mL 10-1稀释液于4.5mL生理盐水中，得到10-2稀释液，按此操作，依次得到10-3，10-4，10-5，10-6稀释液；吸取100μL梯度稀释液涂布于MRS固体培养基上，10-4，10-5，10-6每个梯度1个板，37℃培养48h，得到菌落；根据菌落形状、大小、边缘、透明度等选择MRS固体培养基上具有干酪乳杆菌典型特征的菌落，用接种环挑取菌落在MRS固体培养基上进行划线，37℃培养48h，得到纯化的单菌落；挑取纯化的单菌落分别接种至5mL的MRS液体培养基中，37℃培养18～24h，得到菌液；将各菌液所对应的各菌株编号后，参照教科书《微生物学》(沈萍，陈向东主编)中所记载的步骤进行菌株鉴定、革兰氏染色、生理生化等实验，选取具有干酪乳杆菌典型特征的菌株，经实验共获得两株菌株，两株菌株分别命名为CCFM1127、HN13；
其中，菌株鉴定过程如下：
提取CCFM1127、HN13的基因组，将CCFM1127、HN13的16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，将测序分析得到的CCFM1127、HN13的16SrDNA序列(CCFM1127的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)在GenBank中进行比对，结果显示两株菌株均为干酪乳杆菌，分别命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HN13；
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127的形态特征为：短杆状，两端圈，单个或成短链，无鞭毛，无孢子；
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127的菌落特征为：圆形、灰白色、光滑(菌落特征具体可见图1)；
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1127的生理生化特征为：具有优良的模拟胃肠道存活能力和细胞粘附能力。
实施例2：干酪乳杆菌对去卵巢大鼠骨密度、骨体积分数和骨小梁厚度水平的影响
具体步骤如下：
取体重在250±20g的SPF级SD雌性大鼠20只，随机分为4组，每组5只，4组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃干酪乳杆菌CCFM1127菌悬液的CCFM1127组和灌胃干酪乳杆菌HN13菌悬液的HN13组。
实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。
第一周结束后，将模型对照组、CCFM1127组和HN13组大鼠按照3.3mL/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3mL/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000U/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；
实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液得到的)，CCFM1127组和HN13组大鼠按1.5mL/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5mL/天的剂量灌胃浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。
灌胃结束后处死所有大鼠，统一将各组大鼠左侧股骨从长径中点锯断，将股骨远心端按要求置于micro CT上，测定其距髁间窝约4mm附近干骺端的骨密度(BMD,g/cm3)、骨体积分数(BV/TV,％)、骨小梁厚度(Tb.Th,mm)，检测结果见图2～4。
由图2～4可知，与假手术组相比，模型对照组大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度显著下降，分别从2.33±0.06g/cm3、64.50±7.47％和0.36±0.05mm下降为2.10±0.03g/cm3、39.51±6.15％和0.17±0.04mm；CCFM1127组大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度则较模型对照组大鼠显著上升，分别从2.10±0.03g/cm3、39.51±6.15％和0.17±0.04mm上升为2.22±0.05g/cm3、52.76±7.51％和0.22±0.02mm；而HN13组大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度与模型对照组大鼠相比没有显著差异。
可见，干酪乳杆菌CCFM1127可显著提高去卵巢大鼠的骨密度、骨体积分数和骨小梁厚度水平。
实施例3：干酪乳杆菌对去卵巢大鼠血清中免疫因子水平的影响
具体步骤如下：
取体重在250±20g的SPF级SD雌性大鼠20只，随机分为4组，每组5只，4组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃干酪乳杆菌CCFM1127菌悬液的CCFM1127组和灌胃干酪乳杆菌HN13菌悬液的HN13组。
实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。
第一周结束后，将模型对照组、CCFM1127组和HN13组大鼠按照3.3mL/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3mL/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000U/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；
实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液得到的)，CCFM1127组和HN13组大鼠按1.5mL/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5mL/天的剂量灌胃浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。
灌胃结束后处死所有大鼠，取血液采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定各组大鼠血清中免疫因子IL-1β、TNF-α和IL-10的浓度，检测结果见图5～7。
由图5～6可知，经过干酪乳杆菌CCFM1127的治疗，去卵巢大鼠血清中免疫因子TNF-α、IL-1β的含量分别从20.91±1.84pg/mL、31.46±2.87pg/mL显著下降至17.45±0.80pg/mL、24.13±2.98pg/mL，水平接近假手术组；干酪乳杆菌HN13调节血清中免疫因子TNF-α、IL-1β的能力则明显不如干酪乳杆菌CCFM1127。
由图7可知，经过干酪乳杆菌CCFM1127的治疗，去卵巢大鼠血清中免疫因子IL-10的含量从5.46±4.92pg/mL显著提高至10.02±1.94pg/mL，水平接近假手术组；干酪乳杆菌HN13调节血清中免疫因子IL-10的能力则明显不如干酪乳杆菌CCFM1127。
可见，干酪乳杆菌CCFM1127能显著降低去卵巢大鼠血清中免疫因子TNF-α、IL-1β的含量。
实施例4：干酪乳杆菌对去卵巢大鼠血清中内毒素水平的影响
具体步骤如下：
取体重在250±20g的SPF级SD雌性大鼠20只，随机分为4组，每组5只，4组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃干酪乳杆菌CCFM1127菌悬液的CCFM1127组和灌胃干酪乳杆菌HN13菌悬液的HN13组。
实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。
第一周结束后，将模型对照组、CCFM1127组和HN13组大鼠按照3.3mL/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3mL/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000U/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；
实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液得到的)，CCFM1127组和HN13组大鼠按1.5mL/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5mL/天的剂量灌胃浓度为130g/L的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。
灌胃结束后处死所有大鼠，取血液采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定各组大鼠血清中内毒素的浓度，检测结果见图8。
由图8可知，去卵巢手术将大鼠血清中内毒素的含量从14.68±1.30EU/mL上升至18.36±0.72EU/mL(p<0.001)，而经过干酪乳杆菌CCFM1127的治疗，大鼠血清中内毒素的含量下调为14.78±1.47EU/mL(p<0.001)，水平接近假手术组；干酪乳杆菌HN13调节血清中内毒素的能力则明显不如干酪乳杆菌CCFM1127。
可见，干酪乳杆菌CCFM1127能显著降低去卵巢大鼠血清中内毒素的含量。
实施例5：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备菌液，菌液的具体制备过程如下：
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用浓度为300g/L的蔗糖溶液重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到干酪乳杆菌CCFM1127菌液。
实施例6：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到干酪乳杆菌CCFM1127菌粉；
所述保护剂为浓度为130g/L的脱脂奶粉溶液。
实施例7：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备乳饮品，乳饮品的具体制备过程如下：
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到干酪乳杆菌CCFM1127菌粉；
其中，所述保护剂为浓度为130g/L的脱脂奶粉溶液。
将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加干酪乳杆菌CCFM1127菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到乳饮品(乳饮品需在4℃下冷藏保存)。
实施例8：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备豆奶，豆奶的具体制备过程如下：
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到干酪乳杆菌CCFM1127菌粉；
其中，所述保护剂为浓度为130g/L的脱脂奶粉溶液。
将大豆在温度80℃下浸泡2h后去除大豆皮，得到去皮大豆；将去皮大豆沥去浸泡水后加沸水磨浆，得到豆浆；将豆浆在高于80℃的温度条件下保温12min，得到熟豆浆；将熟豆浆用150目筛网过滤后离心分离，得到粗豆奶；将粗豆奶加热到温度140～150℃后迅速导入真空冷却室进行抽真空，使得粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出，得到熟豆奶；将熟豆奶降温至约37℃后在熟豆奶中添加干酪乳杆菌CCFM1127菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到豆奶(豆奶需在4℃下冷藏保存)。
实施例9：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备果蔬饮料，果蔬饮料的具体制备过程如下：
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到干酪乳杆菌CCFM1127菌粉；
其中，所述保护剂为浓度为130g/L的脱脂奶粉溶液。
将新鲜水果和蔬菜洗净后榨汁，得到果蔬汁；将果蔬汁在温度140℃下高温热杀菌2秒，得到杀菌后的果蔬汁；将杀菌后的果蔬汁降温至约37℃后在杀菌后的果蔬汁中添加干酪乳杆菌CCFM1127菌粉至浓度为不低于1×106CFU/mL，得到果蔬饮料(果蔬饮料需在4℃下冷藏保存)。
实施例10：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得干酪乳杆菌CCFM1127的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
实施例11：干酪乳杆菌的应用
干酪乳杆菌CCFM1127可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
干酪乳杆菌CCFM1127划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到干酪乳杆菌CCFM1127菌粉；
其中，所述保护剂为浓度为130g/L的脱脂奶粉溶液。
称取干酪乳杆菌CCFM1127菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株可缓解骨质疏松的干酪乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 943
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌
<400> 1
gcgcgtgcta tacatgcaag tcgaacgagt tctcgttgat gatcggtgct tgcaccgaga 60
ttcaacatgg aacgagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg 120
gggataacat ttggaaacag atgctaatac cgcatagatc caagaaccgc atggttcttg 180
gctgaaagat ggcgtaagct atcgcttttg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt 240
gaggtaacgg ctcaccaagg cgatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat 300
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gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc 420
tgttgttgga gaagaatggt cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag 480
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gcttaaccga ggaagcgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 660
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gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840
ccgcagctaa cgcattaagc attccgcctg ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt tta 943
Claims (10)
1.一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其特征在于，所述干酪乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61021，保藏日期为2020年05月06日。
2.权利要求1所述干酪乳杆菌在制备预防和/或治疗骨质疏松、功能性便秘、小儿厌食症、功能性消化不良或反流性食管炎的药品中的应用。
3.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述干酪乳杆菌。
4.如权利要求3所述的一种产品，其特征在于，所述产品中，权利要求1所述干酪乳杆菌的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
5.如权利要求3或4所述的一种产品，其特征在于，所述产品包含食品或药品。
6.如权利要求5所述的一种产品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述干酪乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
7.如权利要求6所述的一种产品，其特征在于，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
8.如权利要求6或7所述的一种产品，其特征在于，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
9.如权利要求8所述的一种产品，其特征在于，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂；所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
10.如权利要求5-9任一项所述的一种产品，其特征在于，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114651984A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-06-24 | 微康益生菌(苏州)股份有限公司 | 干酪乳杆菌lc89及包含其的微生物制剂在制备缓解功能性便秘的产品中的应用 |
| CN114634901A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-06-17 | 微康益生菌(苏州)股份有限公司 | 一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌lc16及其培养方法与应用 |
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| CN115969887A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-04-18 | 深圳未知君生物科技有限公司 | 一株可缓解骨质疏松的副干酪乳酪杆菌及其应用 |
| CN115969887B (zh) * | 2022-10-14 | 2024-08-20 | 深圳未知君生物科技有限公司 | 一株可缓解骨质疏松的副干酪乳酪杆菌及其应用 |
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