CN115969887B - 一株可缓解骨质疏松的副干酪乳酪杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株可缓解骨质疏松的副干酪乳酪杆菌及其应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一株副干酪乳酪杆菌XA‑469，此菌株能够提高去卵巢小鼠的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和皮质骨厚度，降低去卵巢小鼠的骨小梁分离度，降低去卵巢小鼠血清中I型胶原羧基末端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶的含量，提高去卵巢小鼠血清中骨钙素和I型前胶原氨基端原肽的含量，剂量依赖性的促进极化后的THP‑1细胞分泌IL‑6、IL‑10、TNFα且剂量依赖性的降低TNFa/IL‑10、IL‑6/IL‑10的比值，降低单层上皮炎症损伤模型的通透性，恢复单层上皮炎症损伤模型中紧密连接蛋白ZO‑1的含量。

Description

一株可缓解骨质疏松的副干酪乳酪杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株可缓解骨质疏松的副干酪乳酪杆菌及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

骨质疏松(osteoporosis)是由于各种原因引起的骨量丢失、降低，骨组织微结构的改变，导致骨脆性增加，从而容易引起患者出现骨折的全身代谢性疾病。骨质疏松分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松两大类。原发性骨质疏松又分为老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松两大类。

内分泌疾病、结缔组织疾病、慢性肾脏疾病、胃肠和营养性疾病、血液系统疾病、神经肌肉系统疾病等均可引起骨质疏松。长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、肝素、抗惊厥药、抗癌药、含铝抗酸剂、甲状腺激素、慢性氟中毒、促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)或肾衰用透析液等也易引起骨质疏松。

骨质疏松的常见症状为疼痛、身长缩短、驼背、骨折和呼吸功能下降。补充钙剂是治疗骨质疏松的基础措施，而仅补充钙剂对于骨质疏松的治疗是远远不够的，需根据患者情况加用药物。目前，临床上主要使用双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、雌激素和降钙素等药物治疗骨质疏松，这些药物能够有效的促进成骨细胞的形成，抑制破骨细胞的形成。

但是，双膦酸盐会导致部分患者出现严重的骨、关节或肌肉不适，少数患者在患牙科疾病或接受侵入性牙科治疗时发生颌骨骨坏死的风险升高；阿仑膦酸的长期使用与股骨粗隆下和股骨骨干骨折的发生有关；选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬可增加静脉血栓栓塞症和中风的风险；雌激素可增加子宫完整患者子宫内膜增生和患癌的风险，且胆结石病和静脉血栓栓塞症的发病率也增加2～3倍；降钙素可能会引起过敏反应，严重的患者可能会出现过敏性休克，且大量使用降钙素会导致患者出现低钙血症，有些患者还会出现关节痛、骨骼肌的疼痛。因此，亟需找到一种能够有效缓解骨质疏松，并且，长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用的药物或治疗方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)XA-469，所述副干酪乳酪杆菌XA-469保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23470，保藏日期为2021年09月22日。

所述副干酪乳酪杆菌XA-469来源于深圳地区的健康人群新鲜粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为副干酪乳酪杆菌，命名为副干酪乳酪杆菌XA-469。

本发明还提供了上述副干酪乳酪杆菌在制备预防和/或治疗骨质疏松的药品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述药品中，上述副干酪乳酪杆菌XA-469的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述副干酪乳酪杆菌XA-469、药物载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明还提供了一种药品，所述药品含有上述副干酪乳酪杆菌XA-469。

在本发明的一种实施方式中，所述药品中，上述副干酪乳酪杆菌XA-469的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述副干酪乳酪杆菌XA-469、药物载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)XA-469，此副干酪乳酪杆菌XA-469的保藏编号为CGMCC No.23470，此副干酪乳酪杆菌XA-469能够显著提高去卵巢小鼠的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和皮质骨厚度，同时，显著降低去卵巢小鼠的骨小梁分离度；显著降低去卵巢小鼠血清中I型胶原羧基末端肽的含量；显著提高去卵巢小鼠血清中骨钙素的含量；显著提高去卵巢小鼠血清中I型前胶原氨基端原肽的含量；显著降低去卵巢小鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶的含量；剂量依赖性的促进极化后的THP-1细胞分泌IL-6、IL-10、TNFα，且剂量依赖性的降低TNFa/IL-10、IL-6/IL-10的比值；显著降低单层上皮炎症损伤模型的细胞膜通透性；显著恢复单层上皮炎症损伤模型中紧密连接蛋白ZO-1的含量，可见，此副干酪乳酪杆菌XA-469在制备预防和/或治疗骨质疏松、骨流失、炎症和肠屏障损伤的产品(如药品等)中具有巨大的应用前景。

并且，副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的副干酪乳酪杆菌XA-469以及有效成分为副干酪乳酪杆菌XA-469的产品具有安全性高这一优势，长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用。

生物材料保藏

一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)XA-469，分类学命名为Lacticaseibacillus paracasei，已于2021年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23470，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1：副干酪乳酪杆菌XA-469的形态特征。

图2：副干酪乳酪杆菌XA-469的菌落特征。

图3：不同组别去卵巢小鼠的骨组织形态。

图4：不同组别去卵巢小鼠的骨体积分数水平。

图5：不同组别去卵巢小鼠的骨小梁厚度水平。

图6：不同组别去卵巢小鼠的骨小梁数量水平。

图7：不同组别去卵巢小鼠的骨小梁分离度水平。

图8：不同组别去卵巢小鼠的皮质骨厚度水平。

图9：不同组别去卵巢小鼠血清中I型胶原羧基末端肽的含量。

图10：不同组别去卵巢小鼠血清中骨钙素的含量。

图11：不同组别去卵巢小鼠血清中I型前胶原氨基端原肽的含量。

图12：不同组别去卵巢小鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶的含量。

图13：不同细胞培养上清中IL-6的含量。

图14：不同细胞培养上清中IL-10的含量。

图15：不同细胞培养上清中TNFα的含量。

图16：不同细胞培养上清中IL-6/IL-10的比值。

图17：不同细胞培养上清中TNFa/IL-10的比值。

图18：不同组单层上皮炎症损伤模型的FITC-dextran细胞膜通透率。

图19：不同组单层上皮炎症损伤模型中紧密连接蛋白ZO-1的含量。

图4～19中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

下述实施例中涉及的副干酪乳酪杆菌菌悬液的制备方法如下：

将副干酪乳酪杆菌划线于MRS固体培养基上，厌氧工作站(Electrotek AW500TG)中37℃条件下静置培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，厌氧工作站(Electrotek AW500TG)中37℃条件下培养18h进行活化，得到活化液；将活化液按4％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，厌氧工作站(Electrotek AW500TG)中37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经3000g离心10min，得到副干酪乳酪杆菌菌体；将副干酪乳酪杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于PBS缓冲液(购自购自北京索莱宝生物科技有限公司)中至菌浓度为1×10⁸CFU/mL，得到副干酪乳酪杆菌菌悬液，将副干酪乳酪杆菌菌悬液于-80℃下保存待用。

实验例1：副干酪乳酪杆菌的获取

具体步骤如下：

以来源于深圳地区的健康人群新鲜粪便为样本，吸取0.5mL样本添加至5mL的MRS液体培养基中，37℃培养24h进行富集，得到富集后的样品；吸取0.5mL富集后的样品添加至4.5mL无菌生理盐水中获得10^-1稀释液，然后吸取0.5mL 10^-1稀释液于4.5mL生理盐水中，得到10^-2稀释液，按此操作，依次得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释液；吸取100μL梯度稀释液涂布于MRS固体培养基上，10^-4、10^-5、10^-6每个梯度1个板，37℃培养48h，得到菌落；根据菌落形状、大小、边缘、透明度等选择MRS固体培养基上具有副干酪乳酪杆菌典型特征的菌落，用接种环挑取菌落在MRS固体培养基上进行划线，37℃培养48h，得到纯化的单菌落；挑取纯化的单菌落分别接种至5mL的MRS液体培养基中，37℃培养24h，得到菌液；将各菌液所对应的各菌株编号后，参照教科书《微生物学》(沈萍，陈向东主编)中所记载的步骤进行革兰氏染色、菌种鉴定、生理生化实验和基因组鉴定分析，并参照《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则》(2020年版)3.7中所记载的步骤进行溶血活性测试，选取具有副干酪乳酪杆菌典型特征的菌株，得到菌株XA-469；

其中，革兰氏染色过程如下：

挑取XA-469的单菌落进行细菌涂片，干燥后进行加热固定；滴加结晶紫染色10s，水洗后甩干，滴加碘溶液染色10s，水洗后甩干，滴加脱色液脱色10s，水洗后甩干，滴加沙黄溶液复染10s，水洗；待标本片自然干燥后，在涂菌处滴加1滴香柏油进行油镜观察，观察结果为：XA-469革兰氏染色为紫色，为杆状革兰氏阳性细菌；

菌株鉴定过程如下：

取XA-469菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取XA-469的基因组，使用序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的27F/1492R引物对(27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCA，1492R：TGTACGGYTACCTTGTTACGACTT)，以提取得到的XA-469的基因组为模板进行扩增，得到XA-469的16S rRNA(XA-469的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)；将XA-469的16S rDNA在NCBI的Blastn程序进行核酸序列比对，结果显示此菌株为副干酪乳酪杆菌，命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)XA-469；

生理生化实验过程如下：

用无菌棉签挑取XA-469的单菌落接种到无菌盐水中，用经过校准的2DensiCHEKTM Plus按相当于McFarland浊度3.0制备均质菌悬液，并在制备30min内上机到ANC卡中进行生理生化鉴定，结果显示XA-469能发酵D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、蔗糖、麦芽三糖、D-核糖，不代谢D-纤维二糖、L-阿拉伯糖、D-木糖；

基因组鉴定分析过程如下：

取XA-469菌体，用SDS法抽提XA-469的DNA，用琼脂糖电泳进行检测抽提DNA质量，用2.0进行DNA定量；基因组选用Nanopore PromethION平台和Illumina NovaSeq平台进行测序，测序策略是10Kb文库，≥100×的测序深度，组装标准为1个contig，0个gap，测序结果为：XA-469含有一个环形基因组，大小为3.08Mbp，另含有3个环形质粒，大小分别为11.8kbp、7.09kbp、73.4kbp；使用Diamond软件，把XA-469基因组编码氨基酸序列与VFDB数据库进行比对，分析获得潜在毒力因子的序列同源性都在80％以下，且主要是编码细胞壁成分的基因，无毒力基因；将XA-469基因组编码氨基酸序列与ARDB数据库进行比对，分析潜在的耐药基因，发现XA-469基因组中无潜在抗性基因；用antiSMASH程序(version2.0.2)对XA-469基因组进行预测，发现XA-469含有Bacteriocin基因簇，包含31个编码基因；

副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)XA-469的形态特征为：白色，细长有弯曲的杆菌(形态特征具体可见图1)；

副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)XA-469的溶血活性测试结果为：γ溶血，即无溶血活性(溶血活性测试结果见图2)。

实验例1：副干酪乳酪杆菌对去卵巢小鼠骨质疏松的影响

具体步骤如下：

取8周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠(购自北京维通利华生物科技有限公司，体重22±5g)18只，随机分为3组，每组6只，3组分别为：假手术组(sham)、模型对照组(OVX)和灌胃副干酪乳酪杆菌XA-469菌悬液的益生菌干预组(OVX+XA-469)。适应性饲养3天后，在第三天禁食12小时，准备进行卵巢切除手术，其中，将模型对照组小鼠和益生菌干预组小鼠使用戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，从背部开口进行卵巢切除并缝合，假手术组小鼠实行假手术(对应位置切口并缝合)，术后恢复5周。恢复5周后开始灌胃直至实验结束，假手术组小鼠和模型对照组小鼠按10μL/g*weight的剂量(0.2mL)灌胃PBS缓冲液，益生菌干预组组小鼠按10μL/g*weight的剂量(0.2mL)灌胃副干酪乳酪杆菌XA-469菌悬液(菌浓度为1×10⁸CFU/mL)，频次为2天1次，共灌胃5周。灌胃5周后，采用腹腔注射戊巴比妥钠进行小鼠麻醉，采血后脱颈处死，取小鼠股骨，以浸润生理盐水的纱布包裹，垂直放入样品杯中，随后放入μ-CT扫描仪内进行骨组织微结构分析，观察参数包括骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular bone thickness,Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular bonenumber,Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular bone separation,Tb.Sp)和皮质骨厚度(Cortical thickness,Ct.Th)，观察结果见图3～8。其中，骨小梁数、骨小梁厚度和骨小梁分离度是评价骨小梁空间形态结构的主要指标。在骨分解代谢大于骨合成代谢情况下，如发生骨质疏松时，Tb.N和Tb.Th数值减少，Tb.Sp数值增加。取小鼠血液，分离制备血清，并用ELISA试剂盒(购自NOVUSBiologicals公司)测定血清中I型胶原羧基末端肽(Collagentype IC-Telopeptide,CTX)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、I型前胶原氨基端原肽(Procollagen type I N-propeptide,PINP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistantacid phosphatase,TRACP)的含量，检测结果见图9～12。其中，CTX是使用最为广泛的胶原降解标志物，反映了破骨细胞骨吸收为特点的代谢性骨病的有效标志物，骨质疏松症、变形性骨炎、多发性骨髓瘤和肿瘤骨转移等疾病中CTX水平升高；OCN又名骨-羟基谷氨酸蛋白(BGP)，是骨非胶原型蛋白的主要成分，是骨组织的特异性蛋白，是成骨细胞产生和分泌的一种激素样多肽，目前认为血清中的OCN是反映成骨细胞功能的生化标志物，成骨细胞合成的骨钙素大约有20％释放入血，血清OCN和骨组织OCN素呈正相关，因此，血中的OCN测定可以反映成骨细胞的功能状态；PINP的表达水平反映了新骨的形成，随着成骨细胞内的新I型胶原蛋白的合成，成骨细胞外的蛋白酶将把PINP从I型前胶原上剪切下来，被剪切下来的PINP一部分可直接沉积到骨基质，另外的进入血循环，当造骨细胞合成减少时，反映新合成的I型胶原蛋白变化的PINP水平就下降；TRACP是骨吸收标志物，主要由破骨细胞释放，TRACP增高见于原发性甲状腺功能亢进症、慢性肾功能不全、畸形性骨炎、肿瘤骨转移、高转换型骨质疏松(绝经后骨质疏松)、糖尿病等。

由图3～8可知，与假手术组相比，模型对照组小鼠的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Ct.Th显著下降，分别从4.07％、46.22μm、0.00089/mm和186.51μm下降为1.13％、40.19μm、0.00026/mm和171.17μm，而Tb.Sp显著升高，从313.96/μm升高到465.24/μm；益生菌干预后，去卵巢小鼠的BV/TV和Tb.N较模型对照组小鼠显著上升，分别从1.13％和0.00026/mm上升为2.89％和0.00064/mm，而Tb.Sp显著下降，从465.24/μm下降到359.98/μm。可见，副干酪乳酪杆菌XA-469可显著提高去卵巢小鼠的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量水平和皮质骨厚度，同时，显著降低去卵巢小鼠的骨小梁分离度。此结果表明副干酪乳酪杆菌XA-469干预具有治疗骨质疏松的功效。

由图9～12可知，与假手术组相比，模型对照组小鼠血清中I型胶原羧基末端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶的含量显著升高，分别从12.81pg/mL和99.61pg/mL上升为23.79pg/mL和194.44pg/mL；益生菌干预后，去卵巢小鼠血清中I型胶原羧基末端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶的含量较模型对照组小鼠显著下降，分别从23.79pg/mL和194.44pg/mL下降为15.21pg/mL和119.85pg/mL；与假手术组相比，模型对照组小鼠血清中骨钙素和I型前胶原氨基端原肽的含量显著下降，分别从63.7pg/mL和190pg/mL下降为60.9pg/mL和147pg/mL；益生菌干预后，去卵巢小鼠血清中骨钙素和I型前胶原氨基端原肽的含量较模型对照组小鼠显著升高，分别从60.9pg/mL和147pg/mL上升为62.64pg/mL和180.91pg/mL。可见，副干酪乳酪杆菌XA-469可显著降低血清中I型胶原羧基末端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶的含量，且提高去卵巢小鼠血清中骨钙素和I型前胶原氨基端原肽的含量。此结果表明副干酪乳酪杆菌XA-469干预具有治疗骨质疏松的功效。

实验例2：副干酪乳酪杆菌免疫调节功能实验

具体步骤如下：

将THP-1细胞(购自ATCC)用完全细胞培养基(购自赛默飞)重悬至细胞密度为1×10⁶个/mL后，以每孔200μL的接种量接种到96孔板中；在96孔板中加入PMA(佛波酯)至终浓度为50ng/mL后，于37℃培养48h极化细胞；将96孔板去上清后，以每孔200μL的添加量添加不含PMA的完全细胞培养基，于37℃静息培养72h；将96孔板去上清后，以每孔200μL的添加量添加含有1μg/mL LPS(脂多糖)的完全细胞培养基，并以感染复数(MOI)分别为0、1、10的添加量加入处于对数中期的副干酪乳酪杆菌XA-469，在厌氧台37℃静置互作2h；将96孔板去上清后，先用D-PBS缓冲液洗涤1遍，然后加入200μL含有1μg/mL LPS(脂多糖)和100g/mL庆大霉素的完全细胞培养基，再于37℃、5％(v/v)CO₂的细胞培养箱中培养22h；收集96孔板中的细胞培养上清，用LegendPlexTM多因子流式检测试剂盒检测细胞培养上清中TNFα、IL-6、IL-10的含量，检测结果见图13～17。

如图13～17所示，副干酪乳酪杆菌XA-469能剂量依赖性的促进极化后的THP-1细胞分泌IL-6、IL-10、TNFα，且剂量依赖性的降低TNFa/IL-10、IL-6/IL-10的比值，这说明副干酪乳酪杆菌XA-469具有抑制炎症的功能。

实验例3：副干酪乳酪杆菌肠屏障修复功能实验

具体步骤如下：

将处于生长对数期的CaCO-2细胞(购自ATCC)和HT-29-MTX-E12细胞按照9：1的细胞数量比接种到Transwell小室的上室中，总接种量2.5×10⁵个细胞；在Transwell小室的上室和下室中分别加入100μL和600μL的完全培养基(购自赛默飞)后，于37℃、5％(v/v)CO₂的细胞培养箱中培养，隔天更换新鲜完全培养基并用EVOM3细胞电阻仪测量细胞跨膜电阻，培养18d至细胞完全融合，跨膜电阻值不再增加；移除上室及下室的培养基，以含10％(v/v)灭活FBS的DMEM高糖培养基(购自赛默飞)为阴性对照(未处理组)，在Transwell小室的上室和下室中分别加入100μL和600μL含100ng/mL IL-1β、40ng/mL TNFα、100μg/mL LPS(脂多糖)和10％(v/v)灭活FBS的DMEM高糖培养基，于37℃、5％(v/v)CO₂的细胞培养箱中培养24h以处理单层细胞上皮，构建单层上皮炎症损伤模型(处理组)；移除上室及下室的培养基，将Transwell小室经PBS缓冲液洗涤1次后，在下室加入无双抗含10％(v/v)FBS的DMEM高糖细胞培养基，并以终浓度为2mM的丁酸钠溶液为阳性对照，以DMEM高糖细胞培养基为溶媒对照，在上室以感染复数(MOI)为10:1的添加量加入100μL重悬于DMEM高糖细胞培养基的副干酪乳酪杆菌XA-469，在厌氧台37℃静置互作2h；移除上室及下室的培养基，将Transwell小室经PBS缓冲液洗涤1次后，在Transwell小室的上室和下室中分别加入100μL和600μL无双抗的DMEM高糖细胞，于37℃、5％(v/v)CO₂的细胞培养箱中培养22h；在上室加入20μL FITC-dextran(4KDa，100μg/mL)，于37℃、5％(v/v)CO₂的细胞培养箱中孵育1h；收集下室培养基60μL，使用多功能酶标仪在激发光490nm、发射光520nm条件下，检测下室培养基中物质的荧光强度并计算FITC-dextran细胞膜通透率，计算结果见图18；移除上室及下室的培养基，将Transwell小室经PBS缓冲液洗涤3次后，加入100μL预冷至4℃的4％(g/100mL)多聚甲醛，4℃固定25min；PBS缓冲液清洗后，每孔加入200μL含0.2％(g/100mL)Triton X-100的PBS缓冲液，冰上静置10min；PBS缓冲液清洗后，每孔加入300μL含5％(g/100mL)BSA的PBS缓冲液，室温(25℃)封闭1h；按照说明书加入抗ZO-1抗体，4℃孵育16h；PBS缓冲液清洗后，加入FITC标记的二抗，室温(25℃)避光孵育2h；PBS缓冲液清洗后，将transwell小室的膜小心剥下，加入含DAPI的封片剂，放置在玻底培养皿中用荧光显微镜进行观察，观察结果见图19；

其中，FITC-dextran细胞膜通透率＝实验孔FITC-dextran荧光值/空白孔FITC-dextran荧光值×100％。

如图18所示，相比于未处理组，处理组单层上皮炎症损伤模型用IL-1β、TNFα和LPS处理后，FITC-dextran细胞膜通透性显著增加，而用丁酸钠或副干酪乳酪杆菌XA-469处理均能显著降低FITC-dextran的细胞膜通透性至未处理组水平。如图19所示，处理组单层上皮炎症损伤模型中的紧密连接蛋白ZO-1的含量相比未处理组显著降低，而经丁酸钠或副干酪乳酪杆菌XA-469处理的单层上皮炎症损伤模型中的紧密连接蛋白ZO-1含量能够明显恢复。上述结果显示副干酪乳酪杆菌XA-469具有肠屏障修复的功能。

实验例4：副干酪乳酪杆菌的耐受性实验

具体步骤如下：

实验一：耐胃液实验

胃液模拟液购自晓东宜健(苏州)仪器设备有限公司，按说明书配置胃液模拟液；取5mL副干酪乳酪杆菌XA-469菌悬液与胃液模拟液(SGF)按1：1体积比混合后，用6M盐酸溶液调pH至3.0，得到混合液；将混合液在厌氧工作站于37℃静置，并分别在静置0、0.5、1、2、4、6h后取样；将不同时间点取的样本用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，得到稀释液；将稀释液涂布于MRS固体培养基上，放置在厌氧工作站于37℃培养，并培养48h后统计MRS固体培养基上的菌落数量，以计算副干酪乳酪杆菌XA-469的存活率，计算结果见表1；其中，存活率＝(Tn时的菌落数/T0时的菌落数)×100％。

实验二：耐肠液实验

肠液模拟液购自晓东宜健(苏州)仪器设备有限公司，按说明书配置肠液模拟液；取5mL副干酪乳酪杆菌XA-469菌悬液与胃液模拟液(SGF)按1：1体积比混合后，用1M氢氧化钠溶液调pH至6.8，得到混合液；将混合液在厌氧工作站于37℃静置，并分别在静置0、0.5、1、2、4、6h后取样；将不同时间点取的样本用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，得到稀释液；将稀释液涂布于MRS固体培养基上，放置在厌氧工作站于37℃培养，并培养48h后统计MRS固体培养基上的菌落数量，以计算副干酪乳酪杆菌XA-469的存活率，计算结果见表1；其中，存活率＝(Tn时的菌落数/T0时的菌落数)×100％。

由表1可知，副干酪乳酪杆菌XA-469具有一定的耐胃液和肠液能力，且耐肠液能力强于耐胃液能力。

表1副干酪乳酪杆菌XA-469在胃液和肠液中放置不同时间后的存活率

组别

0小时

0.5小时

1小时

2小时

4小时

6小时

在胃液中的存活率

100％

100％

55.56％

46.67％

1.18％

0.7％

在肠液中的存活率

100％

81.44％

76.05％

73.05％

56.89％

55.09％

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC No.23470在制备预防和/或治疗骨质疏松，预防和/或治疗骨流失，预防和/或治疗炎症，和/或，预防和/或治疗肠屏障损伤的药品中的应用。

2.一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23470。

3.一种药品，其特征在于，所述药品含有权利要求2所述副干酪乳酪杆菌。

4.如权利要求3所述的一种药品，其特征在于，所述药品含有权利要求2所述副干酪乳酪杆菌和药用辅料。

5.如权利要求4所述的一种药品，其特征在于，所述药用辅料包含药物载体。

6.如权利要求5所述的一种药品，其特征在于，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

7.如权利要求4所述的一种药品，其特征在于，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

8.如权利要求7所述的一种药品，其特征在于，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。