CN117323298A - 一种长双歧杆菌冻干制剂、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)冻干制剂、其制备方法和用途。所述长双歧杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.25684。本发明的长双歧杆菌冻干制剂，可显著调节免疫力，刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生细胞细子TNF‑α和IL‑6，降低LPS诱导的RAW264.7细胞产生炎症因子NO、TNF‑α和IL‑6，增强细胞免疫功能；生产工艺参数简单，易于控制，周期短，所得产品能够长期储存，产品质量稳定。

Description

一种长双歧杆菌冻干制剂、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种包含长双歧杆菌的冻干制剂、其制备方法和用途。
背景技术
免疫功能低下或缺乏常常会引发多种局部性或全身性感染症，轻者感冒，次者感染乙肝、丙肝病毒使肝脏受损伤导致肝癌，最严重的是感染艾滋病毒，使人体丧失抗病原的能力。免疫力低下还可引发咽炎、胃炎、肠炎、肺炎、支气管炎、鼻炎、中耳炎、肝炎、乳腺炎、癌症、皮肤感染等疾病。免疫力过高的时候，还会将身体内的正常细胞组织当作是侵入者，随即展开进攻，人们的免疫系统会被破坏，会增加患上免疫系统几率，比如过敏性紫癜、系统性红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎等。人们身体最理想的状态应该是保持稳定的免疫力，即使免疫力不是太高，也不是太低，健康也会维持在平稳状态下。
长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)是一类革兰氏阳性、不运动、不产芽孢，细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人的消化道、阴道和口腔等生境中，是人肠道菌群的重要组成成员之一。
CN114728028A公开一种合生元组合物，包含长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)CR15和假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)，该组合物用于调节个体胃肠道微生物群。CN114728028A没有公开包含该组合物可以用于提高免疫力，更没有公开包含所述组合物的冻干制剂。
因此，需要一种能够长期储存，产品质量稳定，同时能够调节免疫力、维持免疫平衡的长双歧杆菌长亚种冻干制剂。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种包含长双歧杆菌的冻干制剂，所述冻干制剂能够可显著调节免疫力，刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生细胞细子TNF-α和IL-6，降低LPS诱导的RAW264.7细胞产生炎症因子NO、TNF-α和IL-6，增强细胞免疫功能，体液免疫功能和单核—巨噬细胞功能，维持免疫平衡，且该菌株可高产乳酸，短链脂肪酸，具有良好的生产性能。
本发明的另一个目的是提供一种包含长双歧杆菌的冻干制剂，其能够显著增强细胞免疫功能、体液免疫功能和单核－巨噬细胞功能，从而维持人体正常免疫功能。
本发明的另一个目的是，提供一种制备包含长双歧杆菌的冻干制剂的方法，所述方法生产工艺参数简单，易于控制，周期短，所得产品能够长期储存，产品质量稳定。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供一种冻干制剂，包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株和冻干保护剂，所述长双歧杆菌菌株的保藏编号为CGMCCNo.25684。
在一个示例中，所述长双歧杆菌菌株包含由SEQ ID NO:1表示的16SrRNA基因。
优选地，所述冻干保护剂包含：脱脂奶粉80～100g/L，40～50g/L海藻糖，2～3g/L维生素C，4～5g/L L-谷氨酸钠的保护剂。
另一方面，本发明提供了如上所述的冻干制剂在制备用于提高免疫力，维持免疫平衡的药物中的用途。
优选地，所述长双歧杆菌菌株用于双向调节细胞细子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌量。
优选地，所述冻干制剂用于降低炎症因子NO。
优选地，所述冻干制剂用于刺激小鼠巨噬细胞产生细胞细子TNF-α和IL-6，降低LPS诱导的巨噬细胞产生炎症因子NO、TNF-α和IL-6。
优选地，所述冻干制剂用于增强细胞免疫功能、体液免疫功能和单核－巨噬细胞功能，从而维持人体正常免疫功能。
再一方面，本发明提供了用途制备如上所述的冻干制剂的方法，包括以下步骤：
(1)菌株培养，将长双歧杆菌菌株以占培养基总量1-3％的接种量接种于无菌液体培养基中，培养16～24小时，得到种子培养液，然后将得到的种子培养液以占培养基总量1-3％的接种量接种于发酵培养基，进行发酵培养，得到长双歧杆菌发酵菌液；
(2)干燥。
优选地，所述发酵培养基包含：葡萄糖40～60g/L，酵母提取物60～100g/L，三水合乙酸钠3～10g/L，硫酸镁0.1～0.2g/L,酸酸锰0.05～0.1g/L，磷酸氢二钾1～2g/L，柠檬酸三铵2～4g/L，吐温80 1～2g/L，氯化钙0.05～0.1g/L，L-半胱氨酸盐0.5～1g/L。
优选地，发酵过程中自动流加氢氧化钠溶液保持恒定pH 5.5～6.5致发酵至产酸停止，氢氧化钠不再流加时终止发酵。
优选地，所述冻干制剂为活菌制剂，所述方法还包括在菌株培养步骤之后以及干燥之前制备冻干保护剂，并且在干燥步骤进行冷冻干燥；可选地，所述冻干保护剂包含：脱脂奶粉80～100g/L，40～50g/L海藻糖，2～3g/L维生素C，4～5g/L L-谷氨酸钠的保护剂。
优选地，冷冻干燥的条件为：预冻温度为-40～-45℃，预冻时间为4～5h，一次干燥温度为-20～-15℃，一次干燥时间为20～25h，二次干燥温度为30～35℃，二次干燥时间为6～10h。
优选地，所述冻干制剂为死菌制剂，所述干燥步骤为先进行热灭活，然后经过喷雾干燥塔干燥，获得所述死菌制剂；可选地，所述热灭活的条件为80～100℃处理10～40min。
本发明具有以下有益效果：
本发明的包含长双歧杆菌菌株的冻干制剂，可显著调节免疫力，刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生细胞细子TNF-α和IL-6，降低LPS诱导的RAW264.7细胞产生炎症因子NO、TNF-α和IL-6，增强细胞免疫功能，体液免疫功能和单核—巨噬细胞功能，维持免疫平衡，且该菌株可高产乳酸，短链脂肪酸，具有良好的生产性能。
本发明的制备包含长双歧杆菌的冻干制剂的方法，生产工艺参数简单，易于控制，周期短，所得产品能够长期储存，产品质量稳定。
附图说明
图1示出了双歧杆菌属菌株的生物进化树。
图2示出了基于UPGMA方法构建的本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株的RAPD聚类分析图。
图3示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响。
图4示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞炎症介质NO分泌水平的影响。
图5示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞炎症介质TNF-α分泌水平的影响。
图6示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞炎症介质IL-6分泌水平的影响。注：*与阳性对照组比较p<0.05，**与阳性对照组比较p<0.01，***与阳性对照组比较p<0.001。
图7示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞因子TNF-α分泌量的影响。
图8示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞因子IL-6分泌量的影响。
图9示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株增强细胞免疫功能的结果。
图10示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株增强体液免疫功能的结果。
图11示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株增强单核-巨噬细胞功能的结果。
图12示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉显著增强小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能的结果。
微生物保藏说明
本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)HOM1190菌株于2022年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.25684。
本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株HOM1190菌株于2023年5月送检到中国科学院微生物研究所进行鉴定。
检测鉴定结论如下：在本实验室条件下，根据送检菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、tuf基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》、International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，送检菌种(菌种编号：HOM1190)的鉴定结果为：Bifidobacterium longum subsp.Longum(长双歧杆菌长亚种)。
该菌株的细胞形态为：多形态杆状；生理生化特征为：革兰氏阳性，接触酶阴性(-)，氧化酶阴性(-)；16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，tuf基因序列如SEQ ID NO:9所示。
具体实施方式
本发明公开了菌株、特性及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为更进一步阐述本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域常规方法及条件实施。
如上所鉴定的，本发明中的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株HOM1190菌株被鉴定为Bifidobacterium longum subsp.Longum(长双歧杆菌长亚种)，因此，在本发明中使用的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是指长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)。
一氧化氮(NO)炎症因子由内皮细胞、上皮细胞及炎症细胞等生成的一种小分子介质，其浓度与炎症细胞数目高度关联，可以作炎症的标志物。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生，可调节机体免疫反应。一方面，机体免疫力过低时，它可以激活淋巴细胞、巨噬细胞等各种免疫细胞，增强其杀伤的活性，具有抗感染和抗肿瘤的作用；另一方面，当免疫力过高时，产生炎症时，它被过度激活，也是炎症标志物。
白细胞介素-6(IL-6)主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生，可调节机体免疫反应。一方面，IL-6能使B细胞前体成为产生抗体的细胞；和集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能。另一方面，IL-6的过表达或调控可扰乱人体多器官系统的正常功能，可引起许多疾病。在炎症反应中，IL-6的升高早于其他细胞因子，而且持续时间长，因此是一个关键的炎症因子。
TNF-α和IL-6既是炎症因子也是细胞因子。
本申请的发明人还发现，本发明的长双歧杆菌长亚种菌株HOM1190具有双向调节细胞细子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌量，即刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生细胞细子TNF-α和IL-6，并降低LPS诱导的RAW264.7细胞产生炎症因子NO、TNF-α和IL-6。且该菌株可显著可增强机体免疫力，可显著增强细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能，有助于维持人体正常免疫功能。
为使本发明要解决的技术问题、采用的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是，本发明中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中所使用的试剂和材料，如无特别说明，均采用常规方法配制或者由商业途径获得。
本发明中使用的长双歧杆菌长亚种菌株，是从含有所需菌株的健康婴儿粪便中分离的，具体分离方法如实施例1中所述。
实施例1长双歧杆菌长亚种HOM1190的分离及鉴定
(1)人工胃肠液配制
人工胃液：取稀盐酸(1mol/L)16.4mL,加水800mL，调节pH至3.0，加入胃蛋白酶10g,摇匀后,加水至1000mL，5000rpm离心5min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，备用。
人工肠液：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL，用0.4％(0.1mol/L)的氢氧化钠溶液调节pH至6.8，另取胰酶10g，猪胆盐3g，加水适量使溶解，将两液混合，加水至1000mL，5000rpm离心5min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，备用。
(2)分离培养基配制
MRS-Cys液体培养基：每升MRS broth培养基(货号：CM1163，英国OXOID公司)的基础上加入0.5克L-半胱氨酸盐酸盐，121℃灭菌15min，备用，2-8℃避光保存一周。
含有溴甲酚紫的MRS-Cys固体培养基：每升MRS固体培养基(货号：CM1175，英国OXOID公司)基础上添加溴甲酚紫0.04g，充分搅拌均匀。121℃灭菌15min，超净工作台中倒板，每个培养皿中倒入约15mL，凝固后备用。
(3)长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株的分离筛选
本发明的长双歧杆菌长亚种分离自健康婴儿粪便。
用无菌厌氧管收集离体粪便，置于厌氧环境下低温保存。取样当天即开始试验，取约1g粪便样品，加入含有9mL的MRS-Cys液体培养基的厌氧管中，37℃厌氧培养24h，8000rpm离心10min，弃上清，加入人工胃液10mL，混匀后，37℃厌氧培养3h，8000rpm离心10min，弃上清，加入人工肠液10mL，混匀后，37℃厌氧培养3h，利用10倍稀释法对样品稀释，稀释至10-6，从原液到10-6依次取100μL，涂布含有溴甲酚紫的MRS-Cys固体培养基平板，37℃厌氧，静止培养72h。
挑取周边变黄的单菌落，划线培养，纯化3-4次至菌落单一，同时进行革兰氏染色、镜检观察菌落形态。转接单菌落至液体培养基中进行纯培养，甘油保种，保存于-80℃冰箱。
(4)长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株形态观察
长双歧杆菌长亚种HOM1190在MRS琼脂培养基上37℃厌氧培养48h，菌落呈乳白色，圆形，菌落直径约2～5mm，表面湿润光滑，边缘整齐，粘液状。光学显微镜下观察，菌体长而弯曲，呈棍棒状或Y形杆菌，菌体大小约为0.3～0.8μm×4～10μm，不形成芽孢，同时筛选了其他两株相同形态的菌株，命名为BH14-1和BH18-7。
(5)长双歧杆菌长亚种HOM1190菌株的鉴定
16S rRNA基因菌种鉴定：将保存的菌株HOM1190，BH14-1和BH18-7，分别提取DNA，进行16S rRNA基因扩增，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收、测序，分离获得的菌株进行16SrRNA基因测序。根据其16S rRNA基因的序列，用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，利用Mega 7.0软件绘制生物进化树，如图1所示，三种菌株HOM1190，BH14-1和BH18-7的鉴定结果均为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)，其中HOM1190菌株的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO:1所示：
TTACCATGCAAGTCGAACGGGATCCATCAGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTA
根据其16S rRNA基因的序列，用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，利用Mega7.0软件绘制生物进化树，如图1所示，菌株HOM1190的鉴定结果为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)，命名为HOM1190。
(6)随机扩增多态性DNA(RAPD)菌株鉴定：将保存的菌株提取DNA，以菌株DNA为模版，分别用OPA-02、OPA-18、OPL-07、OPL-16和OPM-05共5种引物，如表1所示，进行PCR。通过PCR扩增出能够显示多态性的DNA片段，继凝胶电泳后呈现出不同的DNA差异，通过聚类分析软件进行分析，如图2所示，长双歧杆菌长亚种HOM1190与其他长双歧杆菌长亚种菌株不同，具有唯一性。
表1
引物 序列 SEQ ID NO
OPA-02 5’-TGCCGAGCTG-3’ 2
OPA-18 5’-AGGTGACCGT-3’ 3
OPL-07 5’-AGGCGGGAAC-3’ 4
OPL-16 5’-AGGTTGCAGG-3’ 5
OPM-05 5’-GGGAACGTGT-3’ 6
27F 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 7
1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 8
实施例2抑制常见致病菌能力试验
(1)指示菌活化
指示菌株大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC8739；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC9027；单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111和艰难梭菌(Clostridium difficile)ATCC9689均购买于中国工业微生物保藏中心。将指示菌(大肠埃希菌ATCC8739；金黄色葡萄球菌ATCC6538；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；铜绿假单胞菌ATCC9027；单增李斯特菌ATCC19111)以占培养基总量1％的接种量接种于TSB培养基中，37℃，180rpm有氧培养24h备用。艰难梭菌ATCC9689以占培养基总量1％的接种量接种于BHI培养基，37℃，静止厌氧培养24h备用。
(2)长双歧杆菌长亚种活化
将实施例1中制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190，以占培养基总量1％的接种量接入到已灭菌的实施例1所述的MRS-Cys液体培养基中，37℃静置厌氧培养24小时，活化两次后得菌株发酵液。然后在8000rpm条件下离心10min，取上清液做抑菌试验。
(3)平板制备
将已灭菌的TSA培养基加热到完全融化，倒入培养皿内，置于水平台面上使琼脂层形成均匀厚度，待其凝固。将指示菌加入到TSA培养基中，震荡均匀后，倒入预先制备好的TSA空白琼脂平板内，静置凝固。
(4)抑菌实验
用无菌镊子将牛津杯轻放于平板上，中间保持一定距离，向其中分别加入0.2m L待测的乳酸菌发酵液上清液，置于4℃冰箱中扩散24小时后，37℃培养箱中培养至少18小时，观察抑菌圈的出现。形成抑菌圈后用直尺进行测量。以实施例1中的液体培养基(MRS-Cys)为阴性对照，长双歧杆菌长亚种BH14-1和BH18-7作为阳性对照菌株，每个样做3个平行，抑菌结果见表2。
表2长双歧杆菌长亚种HOM1190对致病菌的抑制效果
注：“–”无抑菌活性；“+”11-16mm；“++”17-22mm；“+++”≥23mm
由表2可知，与阳性对照菌株BH14-1和BH18-7相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190对6种致病菌均有较强的抑制作用，对铜绿假单胞菌及单增李斯特菌抑菌效果较好，说明该菌株具有较好的抑制致病菌的能力。
实施例3肠上皮细胞黏附能力试验
试验的目的就是评价长双歧杆菌HOM1190对小肠上皮细胞的粘附性能。人结肠癌细胞Caco-2是常用细胞模型，它是一种细胞器，在体外可以连续传代培养。培养一定时间可以跟小肠上皮细胞同质。
(1)细胞培养基配制
完全培养基：高糖DMEM培养基，其中添加10％灭活的胎牛血清(FBS)及1％(v/v)的抗生素(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，混合后于4℃储存。
不完全培养基：高糖DMEM培养基，其中添加10％灭活的胎牛血清(FBS)混合后于4℃储存。
(2)细胞的复苏与培养
人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞购买于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。用新鲜的培养液重悬Caco-2细胞，使其均匀分散于培养瓶中，在5％ CO2和95％空气的气体条件下37℃进行培养，复苏时每48h更换培养液1次。待细胞生长良好时(80％融合)，用胰酶-EDTA溶液对Caco-2细胞在温度为37℃的条件下进行消化，将细胞消化后调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于24孔板中培养至细胞长至融合度达80％。
(3)长双歧杆菌长亚种活化
分别将实施例1中制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190，BH14-1和BH18-7，以占培养基总量1％的接种量接入到已灭菌的实施例1所述的MRS-Cys液体培养基中，37℃静置厌氧培养24小时，活化两次后得菌株发酵液。
(4)粘附实验
8000rpm离心10min收集在相应培养基中生长的菌体；用DPBS洗涤菌体3次后不完全培养基重悬菌体，并调节菌体浓度为107cfu/mL；将上述菌悬液1mL加入含有长至单层的Caco-2细胞的24孔板中，于5％CO2培养箱中37℃孵育2h；孵育后用无菌DPBS洗涤3次；胰酶-EDTA溶液对Caco-2细胞在温度为37℃的条件下进行消化，统计细胞数与黏附前后活菌数，每个样做3个平行，结果见表3。
表3长双歧杆菌长亚种HOM1190对Caco-2细胞的粘附能力
注：同列肩标为不同大写字母的表示差异极显著(p<0.01)
结果表明，长双歧杆菌长亚种HOM1190对人结肠癌细胞Caco-2的粘附指数为1.17，与其他两株长双歧杆菌长亚种BH14-1和BH18-7相比，可以极显著(p<0.01)地提高小肠上皮细胞的粘附能力。
粘附指数＝粘附后细菌数/每个平皿细胞数
粘附率＝粘附后细菌数/粘附前细菌数
实施例4乳酸和短链脂肪酸产生能力试验
分别将实施例1中制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190，BH14-1和BH18-7，以占培养基总量1％的接种量接入到已灭菌的实施例1所述的MRS-Cys液体培养基中，37℃静置厌氧培养24小时，活化两次后得菌株发酵液。然后在8000rpm条件下离心10min，取上清液用气相色谱仪检测乳酸和短链脂肪酸的含量。实施例1所述的MRS-Cys液体培养基为阴性对照，每个样做3个平行，数据采用SPSS25.0软件进行单因素方差(ANOVA)分析及邓肯多重比较，结果见表4。
表4长双歧杆菌长亚种HOM1190乳酸和短链脂肪酸产生能力
注：同列肩标为不同大写字母的表示差异极显著(p<0.01)
由表4可知，与其他两株长双歧杆菌长亚种BH14-1和BH18-7相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190可以极显著地(p<0.01)提高乳酸和短链脂肪酸(甲酸、乙酸和丁酸)的产生能力。
实施例5体外抗炎试验
(1)细胞培养基配制
完全培养基：高糖DMEM培养基，其中添加10％灭活的胎牛血清(FBS)及1％(v/v)的抗生素(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，混合后于4℃储存。
不完全培养基：高糖DMEM培养基，其中添加10％灭活的胎牛血清(FBS)混合后于4℃储存。
(2)供试菌体样品准备
将实施例1中制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190，以占培养基总量1％的接种量接入到已灭菌的实施例1所述的MRS-Cys液体培养基中，37℃静置厌氧培养24小时，连续活化两代后用于活菌计数及细胞实验。8000rpm下离心10min，收集菌体后，使用不含抗生素的DMEM完全培养基调整至工作浓度为活菌组，另外菌体收集后，100℃加热30min，然后分别将菌数调到工作浓度为死菌组。
(3)小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的培养
将小鼠巨噬细胞RAW264.7(购买于中国医学科学院基础医学研究所)接种于完全培养基中按照1:3的比例(v/v)进行传代，选择3～10代的细胞用于试验。
(4)细胞活力检测
用不完全培养基调节细胞数为5×105个细胞/mL，每孔吸取0.1mL细胞液铺在96孔培养板中，待4小时细胞。取培养好的96孔板细胞，吸去细胞培养液，每孔加入0.1mL用不完全培养基调试的不同浓度供试菌体(5×105，1×106，5×106，1×107，5×107，1×108，5×108，1×109)37℃，5％ CO2培养箱中培养1h，然后加入1μg/mL LPS，共同培养24小时后，按照普洛麦格公司生产的MTS细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒进行细胞活力检测。简要步骤为每孔加入20μL MTS，于培养箱中避光孵育1h，使用酶标仪在490nm处读取吸光值，每个处理3个重复。以正常培养的细胞为对照，计算细胞的相对活力。检测结果如图3所示。由图3的结果可知，当活菌体浓度不大于1×108CFU/mL，死菌浓度大于5×108CFU/mL时，巨噬细胞RAW264.7活力均高于100％，因此，活菌体选择1×108CFU/mL和1×107CFU/mL，死菌体选择5×108CFU/mL和1×108CFU/mL进行细胞抗炎效果评价试验。
(5)抗炎能力检测
将小鼠巨噬细胞RAW264.7(约5×105个细胞/mL)加入24孔培养板中，每孔1mL；待4h贴壁后，弃去培养基，每孔加入1mL含菌培养基(选择细胞活力不低于100％的菌浓度作为试验对象)孵育1h后，每孔加入终浓度为1μg/mL的LPS，选择1mL不完全培养基当阴性对照，1mL不完全培养基+1μg/mL LPS当阳性对照，37℃，5％ CO2培养箱中培养24h后，3000rpm离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书测定细胞上清中NO、TNF-α和IL-6的含量。每个处理进行3个重复，数据采用GraphPad prism9软件进行单因素方差(ANOVA)及邓尼特t检验(Dunnett’s T test)即多个实验组和一个对照组间均数的两两比较分析，结果如图4、图5和图6所示。与阴性对照组相比，LPS刺激RAW264.7细胞导致NO、TNF-α和IL-6的分泌量极显著地(p<0.01)增加。与LPS单独处理相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌(1×108CFU/mL)或死菌(5×108CFU/mL)与LPS共处理后，均能极显著地(p<0.01)降低NO、TNF-α和IL-6的分泌量。与LPS组比较，长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌或死菌均能极显著地(p<0.01)抑制LPS刺激RAW264.7细胞产生的炎症因子NO、TNF-α和IL-6的含量，且具有剂量依赖效应，高剂量高于低剂量。固有免疫系统能够通过模式识别受体(PRRs,pattern recognitionreceptors)识别许多微生物中共享、结构保守的分子结构，称之为病原相关分子模式(PAMPs，Pathogen-associated molecular patterns)Toll样受体(TLRs:Toll-likereceptors)，是一种重要的细胞表面PRRs，主要表达在具有免疫功能的细胞如巨噬细胞表面。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分，也是革兰氏感染的主要致病分子。LPS是一种较强的抗原，能够被TLR4识别，结合后能启动MyD88t IRAK信号级联，进而激活核转录因子NF-κB和NF-κB靶基因，能引起促炎因子的过量表达、诱导炎症性相关的疾病发生。而长双歧杆菌长亚种HOM1190降低LPS受体TLR4的表达量从而抑制炎症介质的产生与释放，降低炎症反应。
实施例6体外促细胞因子分泌试验
(1)细胞培养基配制
完全培养基：高糖DMEM培养基，其中添加10％灭活的胎牛血清(FBS)及1％(v/v)的抗生素(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，混合后于4℃储存。
不完全培养基：高糖DMEM培养基，其中添加10％灭活的胎牛血清(FBS)混合后于4℃储存。
(2)供试菌体样品准备
将实施例1中制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190，以占培养基总量1％的接种量接入到已灭菌的实施例1所述的MRS-Cys液体培养基中，37℃静置厌氧培养24小时，连续活化两代后用于活菌计数及细胞实验。8000rpm下离心10min，收集菌体后，使用不含抗生素的DMEM完全培养基调整至工作浓度(5×105CFU/mL)为活菌组，另外菌体收集后，100℃加热30min，然后分别将菌数调到不同工作浓度，为死菌组。5×105CFU/mL为死菌低剂量组，5×106CFU/mL为死菌中剂量组，5×107CFU/mL为死菌高剂量组。
(3)小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的培养
将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞(购买于中国医学科学院基础医学研究所)接种于完全培养基1中按照1:3的比例进行传代，选择3～10代的细胞用于试验。
(4)细胞因子活力检测
将活化好小鼠巨噬细胞RAW264.7(约5×105个细胞/mL)加入24孔培养板中，每孔1mL；待4小时贴壁后，弃去培养基，每孔加入1mL含菌培养基；设空白对照组，加入1mL DMEM培养基；共培养24h后收集细胞上层清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，按照试剂盒说明书测定细胞上清中TNF-α和IL-6的含量。实施例1所述的MRS-Cys液体培养基为阴性对照，每个样做3个平行，数据采用GraphPad prism9软件进行单因素方差(ANOVA)及邓尼特t检验即多个实验组和一个对照组间均数的两两比较分析，结果见图7和图8所示。
结果表明，长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌及死菌均能够显著提高RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6，且随着死菌量的增加，RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6的能力增强。其作用机制为：长双歧杆菌长亚种HOM1190的细胞壁的主要成份肽聚糖(WPG)和磷壁酸(LTA)作用于巨噬细胞RAW264.7后，与Toll受体2结合，激活NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞释放出肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6号(IL-6)，增强机体的免疫力。综合实施例6试验结果可以得出结论，长双歧杆菌长亚种HOM1190一方面在正常情况下维持肠上皮细胞处于适度的炎症状态，但对机体不构成损害，用于调节免疫功能，清除病原体。另一方面当机体处于一种过量的炎症状态时，又有通过调节TLR介导的信号，抑制炎症，维持免疫平衡，使其处于一种健康状态。
实施例7抗生素敏感性试验
药敏试验依据国际标准化组织制定的ISO10932-2010牛奶和乳制品.适用于双歧杆菌和非肠球菌乳酸菌(LAB)的抗生素最低抑菌浓度(MIC)测定方法进行。
(1)培养基配制
MRS-Cys液体培养基：同实施例1
LSM-Cys液体培养基：称取Iso-Sensitest培养基(货号：CM0473B，英国OXOID公司)21.06g，称取MRS Broth 5.2g，L-半胱氨酸盐酸盐0.3g，加水至0.5L，调节pH 6.85±0.1，121℃灭菌15min，pH应为6.7±0.1，备用，2-8℃避光保存一周。
(2)长双歧杆菌长亚种活化与增殖
将实施例1中制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190，以占培养基总量1％的接种量接入到已灭菌的实施例1所述的液体培养基(MRS-Cys)中，37℃静置厌氧培养24小时，活化两次后得菌株发酵液。将活化的长双歧杆菌长亚种HOM1190在MRS-Cys琼脂培养基上繁殖，37℃静置厌氧培养48小时。
(3)抗生素微稀释板制备
称取抗生素0.0512g，加入溶剂10mL，氯霉素和红霉素用乙醇溶解(无需过滤)，氨苄西林用磷酸盐缓冲液(pH 8.0，0.1mol/L)，其它抗生素用水溶解，震荡溶解后0.22μm滤膜过滤，分装至EP管中，浓度为5120μg/mL(5.12mg/mL),-20℃保存备用。将抗生素母液用水(氨苄西林用磷酸盐缓冲液)稀释到合适的浓度范围。将50μL稀释液加入到微量稀释板的孔中。
(4)制备细菌悬浮液
从琼脂平板中拾取单个菌落。将获得的菌落悬浮在装有2mL至5mL无菌盐水的无菌培养管中。将获得的菌落悬浮于预先还原的LSM-Cys液体培养基中。悬浮菌落直至溶液浊度达到McFarland标准1或用分光光度计在625nm处的光密度为0.16～0.2。悬浮液大约相当于3×108CFU/mL。用推荐的培养基稀释细菌悬浮液，用MRS-Cys液体培养基将细菌悬浮液稀释500倍，因为抗生素溶液会将培养基稀释两倍。稀释后的细菌悬液在制备后30分钟内分配。当使用冷冻板时，在使用前立即在厌氧条件下解冻冷冻的抗生素溶液。将50μL稀释的悬浮液分配到微量稀释板的每个孔中(约3×104CFU/孔)。在37℃静置厌氧条件下孵育平板48h。使用厌氧罐时，在每个平板之间用盖子盖上平板，以在厌氧罐中产生均匀的环境。每组试验做3次重复，同时设阳性对照组和阴性对照组。阳性对照孔不含抗生素，但有测试菌株和含有溶解最高浓度抗生素的溶剂的培养基。阴性对照孔不含测试菌株和抗生素，但有培养基。
(5)读取MIC结果
孵育48小时后，目视读取MIC。孵育后，检查阴性对照孔是否存在可见的菌的生长。如果发现有污染，则拒绝有关菌株产生的所有数据。注意：若阳性对照孔中无生长现象，表明所测试的菌株对用于溶解抗生素的溶剂敏感。在这种情况下，读取该特定抗生素的MIC没有意义。若阴性和阳性对照检查正常，则通过与阳性对照进行比较，目测确定每种抗生素中菌的生长。最好将微量稀释板放置于含有放大镜机架的顶部，提供间接光线的工作台灯便于阅读。细菌的生长很容易在放大镜下检测到，是孔底部的沉淀。丢弃观察到生长不连续的任何系列孔(例如，在16μg/mL和64μg/mL生长，而在32μg/mL不生长)。终点定义为目测无生长的最低抗生素浓度。该浓度即为该特定菌株的该抗生素的MIC。每个样品做3次重复，植物乳植杆菌ATCC14917(购买于中国工业微生物保藏中心)为阳性对照菌株。长双歧杆菌长亚种HOM1190的抗生素敏感性结果见表5。
表5长双歧杆菌长亚种HOM1190抗生素敏感性结果
由表5可知，植物乳植杆菌ATCC14917的MIC结果与ISO10932-2010附录所示的结果是一致的，说明该实验方法是准确的。根据2012年欧洲食品安全局(European Food SafetyAuthority，EFSA)制定了在食品中使用菌种的抗生素耐药标准，可知长双歧杆菌长亚种HOM1190对红霉素，氯霉素，四环素，万古霉素，氨苄西林，克林霉素，庆大霉素，链霉素，卡那霉素都是敏感的。因此，长双歧杆菌长亚种HOM1190产品是相对安全的。
实施例8长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉的制备工艺1
(1)菌种的培养
将实施例1制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190以占培养基总量1％的接种量接种于无菌的MRS-Cys液体培养基中，37℃培养16～24小时，如此传代培养两次得到活化后的种子培养液。将种子培养液以占培养基总量3％的接种量接种于发酵培养基M447中，37℃恒温厌氧培养，发酵过程中自动流加氢氧化钠溶液保持恒定pH5.5致发酵至产酸停止，氢氧化钠不再流加时终止发酵，得到长双歧杆菌长亚种HOM1190高密度培养液，活菌数可达130亿CFU/mL。
(2)冻干保护剂的制备
使用无菌水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、50g/L海藻糖、3g/L维生素C、5g/L L-谷氨酸钠的保护剂。
(3)冷冻干燥
将培养结束的长双歧杆菌长亚种HOM1190发酵菌液，在2～8℃，6000rpm离心处理10min，弃上清液，收集菌泥，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌泥1～2次，将洗涤后菌泥与上述保护剂混合，使混合后菌液浓度达到1010CFU/mL以上，于冻干机内进行冷冻干燥，-45摄氏度预冻4小时，抽真空，温度升到-15℃后，一次干燥20小时，温度升到30℃后，二次干燥10小时。待冻干完毕，用精细研磨机将菌饼进行粉碎处理，获得所述冻干菌粉，冻干菌粉活菌数达到1.9×1011CFU/g。发酵培养基M447配方如表6所示。
表6发酵培养基M447配方
实施例9长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉的制备工艺2
(1)菌种的培养
将实施例1制备的-80℃冷冻保存的长双歧杆菌长亚种HOM1190以占培养基总量3％的接种量接种于无菌的MRS-Cys液体培养基中，37℃培养16～24小时，如此传代培养两次得到活化后的种子培养液。将种子培养液以占培养基总量3％的接种量接种于发酵培养基M425中，35℃恒温厌氧培养，发酵过程中自动流加氢氧化钠溶液保持恒定pH6.0致发酵至产酸停止，氢氧化钠不再流加时终止发酵，得到长双歧杆菌长亚种HOM1190高密度培养液，活菌数可达95亿CFU/mL。发酵培养基M425配方如表7所示。
表7发酵培养基M425配方
(2)冷冻冻干保护剂的制备
使用无菌水与保护剂原料混合制备得到含有80g/L脱脂奶粉、40g/L海藻糖、2g/L维生素C、4g/L L-谷氨酸钠的保护剂。
(3)冷冻干燥
将培养结束的长双歧杆菌长亚种HOM1190发酵菌液，在2～8℃，6500rpm离心处理15min，弃上清液，收集菌泥，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌泥1～2次，将洗涤后菌泥与上述保护剂混合，使混合后菌液菌浓度达到1010CFU/mL以上，于冻干机内进行冷冻干燥，-40摄氏度预冻5小时，抽真空，温度升到-20℃后，一次干燥25小时，温度升到35℃后，二次干燥6小时。待冻干完毕，用精细研磨机将菌饼进行粉碎处理，获得所述冻干菌粉，冻干菌粉活菌数高于1.7×1011CFU/g。
实施例10长双歧杆菌长亚种HOM1190死菌粉的制备工艺
(1)菌种的培养
菌种培养如实施例8或实施例9
(2)菌粉制备
将高密度发酵得到的长双歧杆菌长亚种HOM1190发酵液，经过90℃处理30分钟，每升发酵液复配100g麦芽糊精辅料，经过喷雾干燥塔干燥可得。死菌粉在显微镜下通过血球计数板计数死菌数达于2.1×1011CFU/g。
实施例11增强免疫力动物试验
(1)实验动物及分组：选用北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2020-0004]繁殖的18g-20g SPF级KM种雌性小鼠192只，经过动物适应饲养观察后，随机分为四批，每批4组，每组12只。实验组分为三个剂量组，低剂量组(5×109CFU/kg BW)，中剂量组(2.5×1010CFU/kg BW)和高剂量组(5×1010CFU/kg BW)，每日灌胃实施例8所制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉，溶剂为生理盐水，每日一次经口给予，连续灌胃32d测各项指标。小鼠灌胃体积为10mL/kg BW，对照组灌胃高剂量同等质量的菌粉辅料的生理盐水溶液。各剂量组均给予维持饲料。实验一批进行碳廓清实验；实验二批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验；实验三批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；实验四批进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验。
(2)实验方法
A.脏器体重比值的测定
小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
B.迟发型变态反应(DTH)实验(足跖增厚法)
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)绵羊红细胞(SRBC)悬液(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4d，测量左后足跖部厚度。然后在测量部位皮下注射20％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液20μL，于注射后24h测量左后足跖部厚度。以上两次测量均为同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
C.ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，制成细胞悬液。用Hank's液洗2次，每次离心5min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1m的完全培养液中，镜检计数，调整细胞浓度3×106个/mL。再将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1.0mL，在其中一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置二氧化碳培养箱中5％CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1.0mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体移入比色杯中，在分光光度计上比色测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
D.抗体生成细胞数(PFC)的测定(Jerne改良玻片法)
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液0.2mL。将SRBC免疫5d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液。离心(1000r/min)5min，用Hank’s液洗2次，最后将细胞悬浮在8.0mLHank’s液中。将琼脂糖加热溶解后，与等量2倍浓度Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10％(v/v，用SA液配制)SRBC悬液50μL、脾细胞悬液8μL，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中37℃温育1h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞来表示。受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
E.半数溶血值(HC50)的测定
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液0.2mL进行免疫。5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，3000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为300倍，取1.0mL置试管内，依次加入10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC悬液0.5mL，补体1.0mL(用SA缓冲液按1∶8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温15min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1.0mL，加Hb稀释液3.0mL。同时取10％(v/v，用SA缓冲液配制)的SRBC悬液0.25mL，加Hb稀释液至4.0mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算：样品半数溶血值＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项实验结果阳性。
F.小鼠碳廓清实验
按体重从小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁(0.05mL/10gBW)。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2.0mL，0.1％，Na2CO3溶液中。用分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以0.1％Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。以吞噬指数(a)表示小鼠碳廓清的能力按下式计算a：
k＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)a＝体重÷(肝重+脾重)×k1/3
受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
G.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，将其仰位固定于鼠板上，经腹腔注入生理盐水2mL，轻轻按揉腹部20次。取腹腔巨噬细胞洗液1mL，分别滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1：1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬百分率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100％吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
得出的吞噬百分率再按下式进行数据转换，式中P为吞噬百分率，用小数表示。所得数据为计量资料，受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照组的吞噬百分率和吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
H.NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h将靶细胞YAC-1进行传代培养，应用前以Hank's液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8.0mLHank’s液，1000r/min，10min离心，用1.0mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，镜检计数，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。使效靶比为50∶1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔。置于二氧化碳培养箱中37℃、5％CO2培养4h。将96孔板以1500r/min离心5min，吸取每孔上清100μL置平底96孔培养板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入1mol/L的HCl溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测光密度值(OD)。计算NK细胞活性：NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
得出的NK细胞活性按下式进行数据转换，式中P为NK细胞活性，用小数表示。所得数据为计量资料，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。
(3)数据处理
用SPSS软件进行数据处理。采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，p≤0.05，用邓肯分析进行多重比较统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
(4)实验结果
表8显示了实施例8制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌粉对小鼠体重的影响。
表8长双歧杆菌长亚种HOM1190菌粉对小鼠体重的影响
由表8结果可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190高、中、低剂量组小鼠实验前后体重均无显著性差异(p>0.05)，这表明长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉对小鼠体重没有影响。
表9显示了实施例8制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌粉对小鼠脏/体比值的影响。
表9长双歧杆菌长亚种HOM1190菌粉对小鼠脏/体比值的影响
注：试验组与阴性对照组比较p>0.05
由表9结果可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190高、中、低剂量组小鼠脾/体及胸腺/体均无显著性差异(p>0.05)，这表明长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉对小鼠脾脏和胸腺重量没有影响。
表10和图9显示了实施例8制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌粉对绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH的影响及对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响。
表10长双歧杆菌长亚种HOM1190菌粉对绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH的影响及对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响
注：*与对照组比较p<0.05，**与对照组比较p<0.01，***与对照组比较p<0.001。
由表10和图9的结果可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190中剂量组活性菌粉能显著提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力(p<0.05)，长双歧杆菌长亚种HOM1190高剂量组活性菌粉能极显著提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力(p<0.001)这表明长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉具有显著增强小鼠细胞免疫功能。
表11和图10显示了实施例8制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌粉对抗体生成细胞数及血清半数溶血值的影响。
表11长双歧杆菌长亚种HOM1190菌粉对抗体生成细胞数及血清半数溶血值的影响
注：*与G1组比较p<0.05，**与G1组比较p<0.01，***与G1组比较p<0.001
由表11和图10的结果可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190中剂量组活性菌粉能显著提高小鼠血清半数溶血值(p<0.05)；高剂量组能显著提高小鼠溶血空斑数(P<0.05)，且极显著提高小鼠血清半数溶血值(p<0.001)。这表明长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉具有显著增强小鼠体液免疫功能。
表12和图11显示了实施例8制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌粉对碳廓清能力及对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率及吞噬指数的影响。
表12长双歧杆菌长亚种HOM1190菌粉对碳廓清能力及对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率及吞噬指数的影响
注：*与G1组比较p<0.05，**与G1组比较p<0.01，***与G1组比较p<0.001
由表12和图11结果可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190低剂量组能显著提高小鼠碳廓清能力(p<0.05)。长双歧杆菌长亚种HOM1190中，高剂量组组均能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率(p<0.001)及吞噬指数(p<0.001)；低剂量组能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率(p<0.01)及吞噬指数(p<0.01)。这表明长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉具有显著增强小鼠单核-巨噬细胞功能。
表13显示了实施例8制备的长双歧杆菌长亚种HOM1190活菌粉对NK细胞活性测定的影响。
表13长双歧杆菌长亚种HOM1190菌粉对NK细胞活性测定的影响
注：试验组与阴性对照组比较p>0.05
由表13结果可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190各剂量组小鼠NK细胞活性均无显著性差异(p>0.05)。
图12示出了本发明的长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉显著增强小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能的结果。
由图12可知，与对照组相比，长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉可显著增强小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能，而对小鼠体重、胸腺和脾脏重量及NK细胞活性没有影响。综上所述，长双歧杆菌长亚种HOM1190活性菌粉具有增强免疫力的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此，在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的细节。

Claims (12)

1.一种冻干制剂，包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株和冻干保护剂，所述长双歧杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.25684。
2.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干保护剂包含：脱脂奶粉80～100g/L，40～50g/L海藻糖，2～3g/L维生素C，4～5g/L L-谷氨酸钠的保护剂。
3.根据权利要求1或2所述的冻干制剂在制备用于提高免疫力，维持免疫平衡的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述冻干制剂用于降低炎症因子NO。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述冻干制剂用于刺激小鼠巨噬细胞产生细胞细子TNF-α和IL-6，降低LPS诱导的巨噬细胞产生炎症因子NO、TNF-α和IL-6。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述冻干制剂用于增强细胞免疫功能、体液免疫功能和单核－巨噬细胞功能，从而维持人体正常免疫功能。
7.一种制备根据权利要求1或2所述的冻干制剂的方法，包括以下步骤：
(1)菌株培养，将长双歧杆菌菌株以占培养基总量1-3％的接种量接种于无菌液体培养基中，培养16～24小时，得到种子培养液，然后将得到的种子培养液以占培养基总量1-3％的接种量接种于发酵培养基，进行发酵培养，得到长双歧杆菌发酵菌液；
(2)干燥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：葡萄糖40～60g/L，酵母提取物60～100g/L，三水合乙酸钠3～10g/L，硫酸镁0.1～0.2g/L,酸酸锰0.05～0.1g/L，磷酸氢二钾1～2g/L，柠檬酸三铵2～4g/L，吐温80 1～2g/L，氯化钙0.05～0.1g/L，L-半胱氨酸盐0.5～1g/L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵过程中自动流加氢氧化钠溶液保持恒定pH 5.5～6.5致发酵至产酸停止，氢氧化钠不再流加时终止发酵。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干制剂为活菌制剂，所述方法还包括在菌株培养步骤之后以及干燥之前制备冻干保护剂，并且在干燥步骤进行冷冻干燥；可选地，所述冻干保护剂包含：脱脂奶粉80～100g/L，40～50g/L海藻糖，2～3g/L维生素C，4～5g/L L-谷氨酸钠的保护剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，冷冻干燥的条件为：预冻温度为-40～-45℃，预冻时间为4～5h，一次干燥温度为-20～-15℃，一次干燥时间为20～25h，二次干燥温度为30～35℃，二次干燥时间为6～10h。
12.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，所述冻干制剂为死菌制剂，所述干燥步骤为先进行热灭活，然后经过喷雾干燥塔干燥，获得所述死菌制剂；可选地，所述热灭活的条件为80～100℃处理10～40min。
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