CN115161348A - 一种具有多功效的后生元组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有多功效的后生元组合物，属于后生元组合物技术领域。该后生元组合物包括质量比为0.5‑2：1‑2：1‑2：0.5‑2的唾液乳酸杆菌AP‑32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI‑02菌株发酵物。通过单菌发酵再混合的方式制备组合物，避免了交叉污染的问题，并通过调节发酵物配比，获得了同时具有抑菌、降血糖、调节免疫力、缓解腹泻、降尿酸功效的后生元组合物，可应用在食品或医疗卫生等领域，具有良好的应用前景。

Description

一种具有多功效的后生元组合物
技术领域
本发明属于后生元组合物技术领域，具体涉及一种具有多功效的后生元组合物。
背景技术
随着人类对益生菌的研究范围和功能的扩大深入，研究者们发现不仅活菌能够发挥益生功能，有一些“非活菌”组分也表现出明显的益生作用，如灭活的菌体细胞、菌体死亡后溶解释放的成分，以及细菌的代谢产物，其中菌体成分包括脂磷壁酸、细胞表面蛋白、肽聚糖、菌毛、鞭毛等，代谢产物包括酶、多肽类、短链脂肪酸、多糖(如胞外多糖)等。这些具有促进健康功效的灭活菌和代谢物均属于“后生元”的范畴。目前，通过不同的方法可以获得后生元制剂，包括加热、酶处理、溶剂萃取、γ或紫外线、超声波等，大多数情况下，热处理是灭活益生菌菌体的常用方法。经过热灭活的益生菌细胞、无细胞上清液和其他活性成分均可产生有益的作用，如免疫调节、平衡肠道菌群、调节生理机能等。在临床层面，含有灭活菌的产品在治疗胃肠道疾病中也发挥着作用，包括腹胀、腹泻、婴儿肠绞痛等。灭活菌还可以在皮肤或呼吸道过敏疾病的管理中发挥作用。后生元已经成为了近年来出现的一种干预肠道微生态系统的新手段。
对免疫缺陷的易感人群及肠道系统发育不成熟的新生儿和儿童，活菌从肠腔到血液的非正常易位会引起全身性感染；活菌会干扰新生儿胃肠道中核心菌群的正常定殖。而灭活的后生元不存在以上这些风险。在生理作用方面，死细胞释放的活性成分可穿过黏液层，更直接地作用于肠上皮细胞，从而可产生更深远的有益影响。因此与活菌相比，后生元具有安全、稳定、易于储运等优势，因此后生元具有非常广阔的开发潜力和应用前景，可应用于医疗卫生领域。
中国专利申请CN113855712A公开了一种可促进排便的组合物，以唾液乳酸杆菌AP-32菌株、植物乳酸杆菌LPL28菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株一种或几种为发酵剂，以牛奶、奶粉、酪蛋白、大豆、豆类制品、乳清为底物进行发酵，取发酵上清液干燥制成后生元，该后生元具有促排便的效果。上述技术的缺陷在于每株菌的发酵条件不同，若混合发酵会导致生产条件难控制，交叉污染等问题。同时混合发酵后，实现的有益功能有限。
由于后生元的作用机制各不相同，本发明发现后生元按比例组合使用可以同时实现多种功效，并且通过单菌发酵再混合，避免交叉污染的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种由复合菌株发酵制成的后生元及其生产工艺，并且发现所述后生元组合后，具有抑菌、改善免疫力、缓解细菌性腹泻、缓解便秘、降血脂、降血糖、降尿酸、降血压的多种功效。
为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
一方面，本发明提供一种具有多功效的后生元组合物，包括质量比为0.5-2：1-2：1-2：0.5-2的唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物，
所述唾液乳酸杆菌AP-32菌株保藏于武汉-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011127；
所述植物乳酸杆菌LPL28菌株保藏于北京-中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：17954；
所述嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株保藏于北京-中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：15210；
所述长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株保藏于北京-中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：15212。
优选地，所述唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物的质量比为0.5-1：1-1.5：1.5-2：1-2，进一步优选为0.5-1：1：2：1-2，最优选为0.5:1:2:1。
再一方面，本发明提供上述后生元组合物的制备方法，包括以下步骤：
将唾液乳酸杆菌AP-32菌株、植物乳酸杆菌LPL28菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株分别进行活化、接种、发酵、离心取上清液，干燥，得唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物，按比例混合得后生元组合物。
优选地，所述活化的方式为：
唾液乳酸杆菌活化：
将菌株接种于MRS液体培养基中，培养，在MRS培养基上连续转接两次。
植物乳酸杆菌活化：
将植物乳杆菌分离株于MRS肉汤培养基复活，再接种至MRS固体培养基，挑取单菌落于MRS肉汤进行菌体富集，之后置于厌氧培养箱培养，经传2代培养至对数期。
嗜酸乳酸杆菌活化：
在无菌条件下，将嗜酸乳杆菌菌粉用灭菌蒸馏水溶解，至MRS培养基密封培养，复壮两代后，通过平板计数法进行细菌计数，比较该菌正常活菌数(30亿/g)，来决定复壮次数；取活化后的的菌种转接到MRS液体培养基中密封培养。
长双歧杆菌婴儿亚种活化：
将双歧杆菌标准株冻干菌粉溶于脱脂乳中，厌氧培养，当凝乳时间达到6-10h，活化完成；将活化菌株接于TPY液体培养培养，收集菌体，接种于双歧杆菌固体培养基厌氧培养。
优选地，所述接种的比例均为0.5-10％，进一步优选为1-3％。
优选地，所述发酵的参数为：唾液乳酸杆菌AP-32菌株35±1℃发酵15-20h；植物乳酸杆菌LPL28菌株35±1℃发酵22-28h；嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株42±1℃发酵18-22h；长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株42±1℃发酵12-18h。
优选地，所述离心的参数均为：温度≤4℃，转数4000-8000rpm，时间8-15min。
优选地，所述干燥的条件均为：喷雾干燥，入风温度100-130℃，出风温度60-70℃。
再一方面，本发明提供上述后生元组合物在抑菌中的应用。
优选地，所述抑菌为抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌中的至少一种。
再一方面，本发明提供上述后生元组合物在制备改善免疫力产品中的应用。
再一方面，本发明提供上述后生元组合物在制备治疗细菌性腹泻产品中的应用。
再一方面，本发明提供上述后生元组合物在制备降血糖产品中的应用。
最后，本发明提供上述后生元组合物在制备降尿酸产品中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明通过单菌发酵再混合的方式制备组合物，避免了交叉污染的问题，并通过调节发酵物配比，获得了同时具有抑菌、降血糖、调节免疫力、缓解腹泻、降尿酸功效的后生元组合物，可应用在食品或医疗卫生等领域，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明工艺流程图；
图2为本发明第8组复合后生元的抑菌效果图；
图3为第8组复合后生元空肠切片(X100)图，从左至右依次为空白组、模型组、复合后生元组；
图4为不同浓度的第8组复合后生元对3t3-l1细胞增殖的影响图，
其中，*表示与空白组差异显著性(P<0.05)，**表示与空白组差异显著性(P<0.01)，***表示与空白组差异显著性(P<0.001)；
图5为第8组复合后生元组孵育成熟的3T3-L1细胞12h后培养基的葡萄糖相对剩余量(％control)，其中，与control组比较，*P<0.05。
图6为其余复合后生元组和单剂组孵育成熟的3T3-L1细胞12h后培养基的葡萄糖浓度图，其中，与control组比较，*P<0.05。
图7为HK-2细胞高尿酸造模示意图。
图8为后生元组合物HK-2细胞毒性图，其中*P<0.05，**P<0.01。
图9为高尿酸造模验证图。
图10为不同浓度样品的尿酸生成量柱状图。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。下文中所述含量均为质量含量。
实施例1菌株发酵物的制备
按照以下步骤制备唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物：
(1)活化：将唾液乳酸杆菌AP-32菌株、植物乳酸杆菌LPL28菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株分别进行活化，活化步骤如下：
唾液乳酸杆菌：
将菌株以2％的接种量转接于50mL MRS液体培养基中，200r/min，37℃恒温摇床培养24h，在MRS培养基上连续转接两次以使其充分活化，4℃冰箱储存，用作种子液。
植物乳酸杆菌：
将甘油冻存的植物乳杆菌分离株于MRS肉汤培养基复活，再接种至MRS固体培养基，挑取单菌落于MRS肉汤进行菌体富集，之后置于厌氧培养箱中37℃培养24h，经传2代培养至对数期，取2mL菌液离心后倒掉上清，待用。
嗜酸乳酸杆菌：
在无菌条件下，将嗜酸乳杆菌菌粉按比例，用事先灭菌的蒸馏水充分溶解，静置，吸取1mL菌溶液到装有99mL MRS培养基于250mL三角瓶中，加盖密封，置于电热恒温振荡培养箱中于37℃下培养24h。复壮两代后，通过平板计数法进行细菌计数，比较该菌正常活菌数(30亿/g)，来决定复壮次数。
取活化后的的菌种用接种环转接到装有100mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中，密封，置于电热恒温振荡培养箱中37℃下培养24h，备用。
长双歧杆菌婴儿亚种：
将双歧杆菌标准株冻干菌粉溶于脱脂乳中，摇匀，置于37℃厌氧培养，当凝乳时间达到约8个小时左右，活化完成。
将活化菌株接于TPY液体培养基于37℃下，培养24h，离心收集菌体备用。用接种环沾取菌液，划线接种于双歧杆菌固体培养基，37℃厌氧培养48h。
(2)接种：分别将活化后的唾液乳酸杆菌AP-32菌株、植物乳酸杆菌LPL28菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株接种，发酵底物由大豆分离蛋白、生乳、葡萄糖混合灭菌制得，接种比例2.5～3％；
(3)发酵：具体菌株发酵参数如下：
Figure BDA0003620950210000061
(4)离心：分别将不同菌株的发酵液离心，离心参数：≤4℃，6000rpm，12min，取上清液；
(5)干燥：分别将不同菌株发酵物的上清液喷雾干燥，喷雾干燥条件为：入风温度120℃，出风温度65℃，即得唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物。
实施例2后生元组合物的制备
将实施例1制备的唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物按比例无菌混合均匀，得后生元组合物(下称复合后生元)，混合比例具体如下：
编号 A B C D
1 1 1 1 1
2 2 1 1 1
3 1 2 1 1
4 1 1 2 1
5 1 1 1 2
6 1 1 2 1
7 1 1 2 2
8 0.5 1 2 1
9 0.5 1 2 0.5
10 2 0.5 0.5 2
注：唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物分别用A、B、C、D表示(下同)。
实施例3功效验证
3.1抑菌功效
3.1.1以第8组复合后生元进行试验，利用双层平板法进行体外抑菌实验，实验分为两个大组，复合后生元120mg组，复合后生元600mg组，每个大组都包含4种致病微生物的抑制实验。
将产品利用无菌水稀释3倍，吸取3μL点样至MRS固体琼脂培养基表面，在37℃的厌氧条件下培养24h。其次，将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌分别在LB液体培养基、盐胱氨酸增菌液、肉浸液肉汤培养基、幽门螺旋杆菌培养基(液体)中培养至对数后期，然后取200μL菌体培养液加至6mL利用无菌水配制的含有0.5％琼脂的半固体培养基中，混匀，然后倾注至制备好的益生菌MRS固体平板上，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在37℃的厌氧条件下培养48h，幽门螺旋杆菌在37℃的三气培养箱中(85％N2，10％CO2，5％O2)培养4天，观察抑菌圈直径的大小。
D抑菌圈＝D外圈-D内圈(样品)
结果如下：
Figure BDA0003620950210000071
3.2.2按照3.1.1所述方法对发酵物单剂进行测试，添加量均为600mg，结果如下：
Figure BDA0003620950210000072
Figure BDA0003620950210000081
以上实验表明，相比于同等用量的发酵物单剂，复合后生元具有显著的抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌的功效。
3.2改善免疫力功效
以BALB/c雄性小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃或不灌胃不同复合后生元及单一发酵物，检测复合后生元对细胞免疫功能(小鼠脾淋巴细胞转化实验)；单核—巨噬细胞功能(小鼠碳廓清实验)；NK细胞活性的影响，验证复合后生元在提高免疫功能方面的功效及差异性。
分组方案如下(每组10只)：
Figure BDA0003620950210000082
1)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)
将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5g/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装2个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波长570nm测定OD值。
用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
2)小鼠碳廓清实验
注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL0.1％Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。
将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数α。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
Figure BDA0003620950210000091
Figure BDA0003620950210000092
3)NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μL；上述各项均设两个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。
Figure BDA0003620950210000093
实验结果
1)对细胞免疫功能的影响
细胞免疫是清除细胞内寄生微生物的最为有效的防御反应，也是排斥同种移植物或肿瘤抗原的有效手段。通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)的实验结果来验证对细胞免疫功能的影响。结果如下：
Figure BDA0003620950210000094
Figure BDA0003620950210000101
注：数据表示为means±SD,，同一列数据中，*与空白组有差异显著(P<0.05)。下同。
由上表可得，与空白组相比较，本发明的复合后生元组1-9淋巴细胞转化率有显著性提高(P<0.05)，说明复合后生元淋巴细胞转化实验结果阳性，有一定的细胞免疫功能。
2)对单核—巨噬细胞功能的影响
单核-巨噬细胞的功能有吞噬、消化异物作用。因此通过小鼠碳廓清实验的实验结果来验证对小鼠单核—巨噬细胞功能的影响。
组别 碳廓清吞噬指数
空白组 3.65±0.47
1 4.22±0.34*
2 4.17±0.42*
3 4.20±0.26*
4 4.29±0.41*
5 4.11±0.33*
6 4.37±0.36*
7 4.32±0.17*
8 4.45±0.39*
9 4.25±0.38*
10 3.84±0.29*
唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物 3.68±0.17
植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物 3.57±0.30
唾嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物 3.69±0.32
长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物 3.61±0.27
由上表可得，与空白组相比，本发明的复合后生元组的碳廓清吞噬指数有显著性提高(P<0.05)。复合后生元组结果为阳性，可判断单核—巨噬细胞功能有改善。
3)对NK细胞活性的影响
NK细胞是一群异质性多功能的免疫细胞，是与特异性免疫应答无关的自然毒杀伤细胞。NK细胞起杀伤作用不需要预先免疫或致敏，杀伤作用早于其它效应细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线。增强NK细胞活性化合物，对免疫调节、抗肿瘤方面有重要的意义。通过NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测LDH定法)的实验结果来验证对NK细胞活性的影响。
组别 NK细胞活性
空白组 21.95±1.05
1 26.84±4.16*
2 26.17±3.22*
3 25.85±2.42*
4 27.39±2.14*
5 26.42±3.26*
6 27.83±3.41*
7 26.49±5.27*
8 27.75±3.03*
9 27.39±3.15
10 24.27±2.04
唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物 22.45±2.63
植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物 21.48±1.44
唾嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物 22.51±1.85
长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物 22.36±2.27
由上表可知，复合后生元组NK细胞活性与空白组相比有显著性提高(P<0.05)。
3.3缓解细菌性腹泻
雄性SPF级BALB/c小鼠(6周龄，体重18-20g)适应性喂养一周后，小鼠随机分成阴性对照组、模型组。复合后生元产品(第8组)均溶于0.25mL的无菌生理盐水中。第二周时，阴性对照组与模型组鼠均灌胃生理盐水，复合后生元组灌胃相应的产品溶液0.2mL。第三周时，在饮用水中加入链霉素(5g/升)处理3d，将小鼠肠道菌群变的紊乱。然后用无菌水代替含有链霉素的水，同时造模前18小时前停止进食。从本周第4d开始，空白对照组每天灌胃3次生理盐水，模型组先灌胃1次生理盐水，然后每天灌胃2次1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液，每只小鼠灌胃0.2mL，连续灌胃四天，每次间隔2小时，灌胃ETEC后更换鼠笼，不添加垫料，而是在鼠笼中铺滤纸，每隔2h观察小鼠的腹泻情况和死亡率，持续四天；复合后生元组先灌胃产品溶液，然后每天再灌胃2次1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液，每只小鼠每次灌胃0.2mL，其余处理同模型组小鼠。实验分组方案如下：
Figure BDA0003620950210000121
具体指标：
①体重：造模期间，每天同一时间称量小鼠体重；
②粪便含水量：小鼠处死前一天，尽可能多的收集小鼠粪便，冻干之后测量前后的含水量，粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100％；
③血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的测定：在最后一次灌胃的24h后，从眶静脉丛血样采集，血液静置，4000g离心，10min，离心取血清，置于-80℃冰箱保存，酶联免疫吸附方法测定血清中炎症因子的表达水平
④腹泻相关蛋白的测定：采用酶联免疫吸附测定方法检测小鼠血清中AQP3、ST、TLR4和IgA的水平
⑤空肠病理观察：解剖部分空肠组织，利用生理盐水将肠内容物冲洗干净，4％多聚甲醛固定24h，脱水、石蜡包埋、切片。取超薄切片(4μm)利用苏木精、伊红染色，染色后的切片以中性树胶作为粘合剂封上盖玻片，病理切片扫描仪用于记录显微照片。
⑥致病菌检测；肠道菌群分析。
1)体重变化和粪便含水量
长时间的腹泻会导致小鼠体重下降，粪便不成形。因此通过记录小鼠的体重变化和粪便含水量能够知晓腹泻症状变化。
组别 体重变化g 含水量％
空白组 0.37±0.30* 0.79±0.11*
模型组 -2.14±0.63 55.30±8.78
复合后生元 -0.71±0.74* 43.10±12.40*
注:*表示与模型组差异显著性(P<0.05)，下同。
从上表可知，与空白组相比较，模型组因为腹泻造成粪便不成型，含水量过多成稀状，体重下降严重，说明腹泻模型造模成功。
与模型组相比较，复合后生元组的含水量有显著性降低(P<0.05),体重变化有所降低；但是未能恢复到正常含水量的程度。说明复合后生元有缓解降低粪便含水量的作用，有助于粪便成型，体重有明显的增加。
2)对血清炎症因子的影响
组别 IL-6[pg/mL] IL-10[pg/mL] TNF-α[ng/L]
空白组 14.52±1.03* 25.03±2.72* 69.09±8.88*
模型组 20.18±1.19 89.15±5.96 133.66±9.79
复合后生元 17.66±1.47* 78.93±6.14* 102.45±15.15*
从上表可知，在促炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α水平上，复合后生元组与模型组相比较有显著性降低(P<0.05)。细菌性腹泻造成小鼠体内IL-6、IL-10和TNF-α在血清含量的增高，因此可以说明，复合后生元组中该炎症因子的含量下降，能缓解腹泻症状。
3)对腹泻相关蛋白的影响
组别 AQP3[ng/L] IgA[ug/ml] TLR4[ng/ml] ST[pg/mL]
空白组 177.41±22.05* 0.3100±0.0443* 1.700±0.394* 0.831±0.057*
模型组 142.23±10.86 0.1877±0.0272 2.942±0.446 1.341±0.062
复合后生元 156.70±12.94* 0.2712±0.0726* 2.468±0.293 1.163±0.077*
在AQP3和IgA水平上，复合后生元组与模型组相比较含量有显著性上升(P<0.05)。通过AQP3的上调，控制肠道内水分子的吸收，降低粪便含水量。IgA增加能增强机体的免疫能力。说明复合后生元组有缓解细菌性腹泻的作用，使小鼠在AQP3和IgA水平上表达恢复。ST含量的增加会抑制消化系统的消化吸收功能，复合后生元组在ST水平上与模型组相比较有显著性下降。
4)空肠病理切片观察
从图3可知，模型组空肠肠壁变薄，肠壁有空隙，肠绒毛变短，肠通道变宽，细胞浸润有大量炎症细胞。复合后生元组相较与模型组，有一定的恢复作用，肠绒毛长度正常，肠壁空隙恢复，少部分组别细胞浸润。
综上，本次实验在细菌性腹泻症状下，发现复合后生元能够调节炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α的水平和增加AQP3的含量促进肠道吸收，提高IgA增强宿主自身的免疫能力，抑制ST的分泌，达到缓解腹泻的效果，降低腹泻带来的脱水症状和身体消瘦，使粪便成形。
3.4降血糖效果
1)3T3-L1细胞培养
3T3-L1前脂肪细胞在添加10％FBS和1％抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中培养，放入37℃、5％CO2的培养箱中静置培养。当细胞长至80％～90％左右进行传代。去旧培养液，用PBS冲洗2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，待到胞质回缩、细胞间隙增大时，加入含10％胎牛血清和1％抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM培养基终止消化，传代后的细胞放入培养箱中继续培养。
2)3T3-L1细胞毒性实验
利用CCK-8法测定不同浓度样品下细胞生长情况，确定最适作用剂量。将3T3-L1细胞以5x104/mL，每孔100μL的细胞密度接种到96孔板，培养48h；将96孔板培养基吸出，加入100μL配制好的样品溶液，同时设置对照孔及调零孔，培养24h；每孔添加10μL CCK-8染色液，37℃培养箱培养1.5h；酶标仪450nm波长检测吸光值，测定细胞生长情况。
viability(％)＝((样品组-调零组))/((空白组-调零组))×100％
3)3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型建立
使用完全培养基(DMEM，10％FBS)将3T3-Ll细胞以105个/mL，每孔1mL的细胞密度接种于12孔板，细胞融合48h后，更换诱导分化培养基1(DMEM，10％NBCS，0.5mmol/L IBMX，1μmol/mL地塞米松，10μg/mL胰岛素)刺激分化，并同时分组加药。48h后更换诱导分化培养基2(DMEM，10％FBS，10μg/mL胰岛素)，相同方法加药培养48h，之后隔天更换完全培养基，2天后检测培养液中葡萄糖含量和细胞中脂滴的生成量。以上培养基均含有100IU/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
4)样品对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取的影响
取诱导分化成熟的各组3T3-L1细胞上清培养液，采用葡萄糖测试试剂盒，测定其中残留的葡萄糖浓度，计算不同处理下3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗。
复合后生元(8组)的实验结果如下：
1)3T3-L1细胞毒性
由于造模试剂含有难溶成分，故添加1‰的DMSO助溶，所有样品的DMSO最终浓度为1‰。为考察样品对细胞的增殖是否存在影响，并选择适宜浓度进行后续实验，样品配制成10～2000μg/mL，对细胞进行细胞毒性实验，结果图4：当复合后生元作用浓度在10-200μg/mL范围内时，3T3-L1细胞的存活率与空白组比较无显著变化；当浓度为500μg/mL～1000μg/mL时细胞存活率显著高于空白组，说明复合后生元样品在该浓度范围内，3T3-L1细胞能够显著增殖。在建立胰岛素抵抗模型时，为减少细胞增殖对实验指标测定的影响复合后生元样品选择50、100、200μg/mL作为低、中、高加样浓度。
2)葡萄糖摄取实验
根据细胞毒性实验对诱导分化的细胞同时进行加样。其中，control组为不加药，复合后生元组的低中高剂量组为：50、100、200μg/mL。
取诱导分化成熟的各组3T3-L1细胞上清培养液，采用葡萄糖检测试剂盒，测定其中残留的葡萄糖浓度，计算不同处理下3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗。
结果如图5：与control组比较，复合后生元低剂量时细胞培养基的葡萄糖剩余量显著降低，中、高剂量无显著性差异，说明低剂量时，复合后生元能够提高细胞摄取葡萄糖的能力。所以低剂量50μg/mL浓度下，后生元孵育成熟的3T3-L1细胞具有降糖作用。
按照上述试验方法，依次对其余9组复合后生元和发酵物单剂进行测试，添加量均为50μg/mL，结果如图6。可以看出，本发明的1-9组复合后生元均具有显著的降糖作用。
3.5降尿酸效果
实验方法：(1)细胞培养
HK-2细胞培养于含10％FBS、1％双抗的RPMI 1640培养液中，置于37℃，5％CO2恒温恒湿培养箱培养。复苏、培养、传代，具体操作同VSMC细胞。
(2)细胞毒性试验
(1)在96孔细胞培养板中，将培养至80％左右的细胞消化、离心、计数，用含10％血清的1640培养基将细胞浓度调整至1×105个/mL，每孔加入100μL细胞悬液，放入37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(2)弃去96孔板中培养基，再分别加入100μL浓度为0～2000μg/mL的样品，每组设置6个副孔。继续培养24h后，每孔加入10μL的CCK-8染色液，将培养板继续放入37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。酶标仪450nm处测定各孔光密度(OD)值，根据每孔OD值计算样品干预后细胞的存活率。
Figure BDA0003620950210000161
(3)HK-2细胞高尿酸血症模型的建立
将HK-2用完全培养基在5％CO2，37℃的细胞培养箱培养，取处于对数生长期的细胞按照105个/mL的细胞浓度接种在24孔板上，细胞培养箱培养24h。24h后弃去培养液，后生元组合物S洗涤3次，空白对照组、模型组加入新的基础培养基，阳性对照组加入非布司他溶液(30μg/mL)，给药组加入样品，放入培养箱中培养。24h后后生元组合物S洗涤3次，模型组和给药组加入用基础培养基配制的浓度为2.5mmol/L的腺苷溶液，培养箱中孵育30h。再在24孔板中各孔加入浓度为0.005U/mL的XO溶液，孵育8h后收集上清液，液相检测。
降尿酸能力测定：
1、HK-2细胞毒性试验
用浓度为50～2000μg/mL的后生元组合物(8组)处理细胞24h后，测定细胞存活率。结果显示，后生元组合物在样品浓度为2000μg/mL时，促使细胞显著增殖(P<0.05)，从而影响细胞存活率。为减少细胞数量对实验结果的影响，综合选择100、400、750μg/mL样品浓度进行后续降尿酸活性评价。
结果如下表和图8所示。
Figure BDA0003620950210000162
Figure BDA0003620950210000171
2、HK-2细胞降尿酸试验
(1)高尿酸模型的建立
为了证明高尿酸模型是否建造成功，采用常见的降尿酸药物非布司他作为阳性对照进行验证。结果如图，根据液相分析数据，模型产尿酸量为1.1682mg/ml，与文献报道的相似。药物进行干预后，尿酸含量降为0.0133mg/ml。说明阳性药物能有效降低细胞模型尿酸含量，建模成功。
(2)后生元组合物和羊乳酶解物降尿酸活性评价
用浓度为100、400、700μg/mL的样品干预细胞后，各样品降尿酸结果如图10所示。
后生元组合物在100、400μg/mL时，与空白组相比尿酸含量下降，具有显著性差异(P<0.05)，且随着剂量增加，尿酸含量下降。但在700μg/mL时与Control组相比尿酸生成量没有显著性差异，说明后生元组合物在100-400μg/mL剂量范围内有降尿酸活性，400μg/mL时效果极好，而在高剂量700μg/mL时435批次后生元组合物不具有降尿酸活性；
Figure BDA0003620950210000172
3.6风味测试
测试方法：采用测试问卷的形式，招募40名志愿者对每种样品进行感官品尝，并填写调查问卷。
可以接受 不能接受 满意比例
1 20 20 50％
2 4 36 10％
3 15 25 38％
4 28 12 70％
5 17 23 43％
6 28 12 70％
7 25 15 63％
8 30 10 75％
9 18 22 45％
可以看出，组合后部分组别的复合后生元风味满意度高，因此可用于食品领域，作为一种食品组合物食用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有多功效的后生元组合物，其特征在于，包括质量比为0.5-2：1-2：1-2：0.5-2的唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物，
所述唾液乳酸杆菌AP-32菌株保藏于武汉-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011127；
所述植物乳酸杆菌LPL28菌株保藏于北京-中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：17954；
所述嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株保藏于北京-中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：15210；
所述长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株保藏于北京-中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：15212。
2.根据权利要求1所述的生元组合物，其特征在于，所述唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物的质量比为0.5-1：1-1.5：1.5-2：1-2；优选为0.5-1：1：2：1-2；进一步优选为0.5：1：2：1。
3.权利要求1-2任一项所述后生元组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将唾液乳酸杆菌AP-32菌株、植物乳酸杆菌LPL28菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株分别进行活化、接种、发酵、离心取上清液，干燥，得唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株发酵物和长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株发酵物，按比例混合得后生元组合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述接种的比例均为0.5-10％；所述发酵的参数为：唾液乳酸杆菌AP-32菌株35±1℃发酵15-20h；植物乳酸杆菌LPL28菌株35±1℃发酵22-28h；嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株42±1℃发酵18-22h；长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株42±1℃发酵12-18h；所述离心的参数均为：温度≤4℃，转数4000-8000rpm，时间8-15min；所述干燥的条件均为：喷雾干燥，入风温度100-130℃，出风温度60-70℃。
5.权利要求1-2任一项所述后生元组合物在抑菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑菌为抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌中的至少一种。
7.权利要求1-2任一项所述后生元组合物在制备改善免疫力产品中的应用。
8.权利要求1-2任一项所述后生元组合物在制备治疗细菌性腹泻产品中的应用。
9.权利要求1-2任一项所述后生元组合物在制备降血糖产品中的应用。
10.权利要求1-2任一项所述后生元组合物在制备降尿酸产品中的应用。
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