CN114540257A - 一种卷曲乳杆菌iob901及其在降糖降脂方面的应用 - Google Patents

一种卷曲乳杆菌iob901及其在降糖降脂方面的应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种卷曲乳杆菌IOB901及其在降糖降脂方面的应用，该卷曲乳杆菌IOB901已于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.23350；该应用为卷曲乳杆菌IOB901在降脂方面的应用；该应用为卷曲乳杆菌IOB901在降糖方面的应用。本申请获得的卷曲乳杆菌IOB901制剂，具有菌种活性高，耐酸耐胆盐特性好，菌种具有较高的稳定性；同时卷曲乳杆菌IOB901制剂具有较高的安全性，可改善动物肠道功能、促进消化道蠕动；可有效降低动物血脂和血糖。

Description

一种卷曲乳杆菌IOB901及其在降糖降脂方面的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种卷曲乳杆菌IOB901及其在降糖降脂方面的应用。
背景技术
糖尿病（diabetes mellitus）是一种由遗传因素和环境因素长期共同作用所导致的慢性、全身性、代谢性疾病，以血浆葡萄糖水平增高为特征，主要是因体内胰岛素分泌不足或作用障碍（胰岛素抵抗）引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，可影响正常生理活动，表现为多种急性和慢性并发症。
2019年国际糖尿病联盟发布的最新报告，目前全球糖尿病粗患病率为9.3%，患者人数约4.63亿，预计到2030年患病率将持续增长至10.2%，患者将达到5.784亿，每10名成年人中就有1人患糖尿病，全世界12%健康相关医疗支出被糖尿病所占据，中国位居第二，大约为1090亿美元。值得关注的是，2型糖尿病这一既往被认为在成年人中发病的慢性疾病，正逐渐呈现低龄化趋势。2型糖尿病会造成这些青少年在进入成年后早期出现糖尿病相关并发症，随着超重和肥胖在人群中的蔓延以及不良生活方式造成的影响，这一趋势在不久的将来会带来更大的危害。
血脂异常是2型糖尿病心血管疾病的危险因素，改善血脂水平是预防2 型糖尿病心血管疾病的重要任务之一，但目前调整患者的血脂水平异常大多采用药物治疗，患者长期服用会对机体产生一定的不良反应。因此，通过非药物途径改善血脂水平越来越受到关注。当摄取一定量益生菌时可以改善机体的健康状况，虽然益生菌在预防和治疗2型糖尿病心血管疾病方面，其具体临床应用效果仍存在争议，但也为临床后续治疗提供一定的参考。
卷曲乳杆菌目前在降糖方面尚未有应用，但是本专利菌株经过前期的筛选与特性研究，发现卷曲乳杆菌IOB901在调节动物血糖、血脂，促进动物消化功能方面具有较好的应用。
发明内容
本申请为解决上述技术问题而提供。
本申请所采取的技术方案是：一种卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）IOB901，其特征在于，该菌株已于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.23350。
进一步的，上述卷曲乳杆菌IOB901在降脂方面的应用。
进一步的，上述卷曲乳杆菌IOB901在降糖方面的应用。
进一步的，上述卷曲乳杆菌IOB901在降脂方面和降糖方面的应用，其特征在于，具体为卷曲乳杆菌IOB901菌粉或含有卷曲乳杆菌IOB901菌粉的应用。
进一步的，卷曲乳杆菌IOB901菌粉，制备方法如下：
（1）菌株活化：将菌株按体积比1：20-25接种于活化培养基中，35-37℃，静置，密闭，培养20-24h，即得一级种子液，将一级种子按1：25-30接种于活化培养基中，35-37℃，静置，密闭，培养20-24h，即得二级种子液；
所述活化培养基为蛋白胨10-20g，酵母浸粉10-20g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照体积比为1：50-70的接种量，将培养好的二级种子液接种到灭好菌的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，35-37℃，密闭培养20-30h，即得发酵液；
所述发酵液培养基为蛋白胨10-20g，酵母浸粉10-20g，葡萄糖6-15g，硫酸锰1-3g,七水硫酸1-3g，蒸馏水1000ml，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得IOB901菌粉。
进一步的，在步骤（1）中，所述一级培养基为蛋白胨10g，酵母浸粉10g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
进一步的，在步骤（2）中，发酵液的培养基为：1%蛋白胨（10g），酵母浸粉10g，葡萄糖6g，硫酸锰1g,七水硫酸镁1g，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
本申请具有的优点和积极效果是：本申请获得的卷曲乳杆菌IOB901制剂，具有菌种活性高，菌种具有较高的稳定性和耐酸耐胆盐特性；同时卷曲乳杆菌IOB901制剂具有较高的安全性，可改善动物肠道功能、促进消化道蠕动；可有效降低动物血脂和血糖。
除了上面所描述的本申请解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的优点之外，本申请所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征所带来的优点。
优选的，一种卷曲乳杆菌 IOB901，该菌株已2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3号，保 藏编号为 CGMCC No.23350，分类命名为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。
实施例1：卷曲乳杆菌IOB901菌粉的制备
卷曲乳杆菌IOB901菌粉的制备方法如下：
（1）菌株活化：将菌株按1：20接种于活化培养基中，37℃，静置，密闭，培养20h，即得一级种子液，将一级种子按1：25接种于活化培养基中，37℃，静置，密闭，培养20h，即得二级种子液；
一级培养基为蛋白胨10g，酵母浸粉10g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照1：50的接种量，将培养好的二级种子液接种到灭好菌的发酵液培养基中，发酵罐搅拌转速100r/min，37℃，密闭培养30h，即得发酵液；
发酵液培养基为：蛋白胨10g，酵母浸粉10g，葡萄糖6g，硫酸锰1g,七水硫酸镁1g，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液培养基离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得IOB901菌粉。
实施例2：卷曲乳杆菌IOB901菌粉的制备
卷曲乳杆菌IOB901菌粉的制备方法如下：
（1）菌株活化：将菌株按1：25接种于活化培养基中，35℃，静置，密闭，培养24h，即得一级种子液，将一级种子按1：25接种于活化培养基中，35℃，静置，密闭，培养24h，即得二级种子液；
活化培养基为蛋白胨15g，酵母浸粉20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照1：60的接种量，将培养好的二级种子液接种到灭好菌的发酵液培养基中，发酵罐搅拌转速100r/min，37℃，密闭培养30h，即得发酵液；
发酵液的培养基为：蛋白胨15g，酵母浸粉20g，葡萄糖10g，硫酸锰2g,七水硫酸镁3g，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得IOB901菌粉。
实施例3：卷曲乳杆菌IOB901菌粉的制备
卷曲乳杆菌IOB901菌粉的制备方法如下：
（1）菌株活化：将菌株按1：25接种于活化培养基中，37℃，静置，密闭，培养24h，即得一级种子液，将一级种子按1：30接种于活化培养基中，37℃，静置，密闭，培养24h，即得二级种子液；
一级培养基为蛋白胨20g，酵母浸粉15g，葡萄糖15g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照1：70的接种量，将培养好的二级种子液接种到灭好菌的发酵液培养基中，发酵罐搅拌转速100r/min，37℃，密闭培养30h，即得发酵液；
发酵液的培养基为：蛋白胨20g，酵母浸粉15g，葡萄糖15g，硫酸锰3g,七水硫酸镁2g，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得IOB901菌粉。
将实施例1-实施例3获得的菌粉进行活性检测，检测方法采用GB 4789.35-2016食品安全国家标准，食品微生物学检验，乳酸菌检验。检测结果如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，卷曲乳杆菌IOB901发酵后获得的冻干菌粉活性可达到2.54×1010CFU/g以上，具有较高得菌株活性。
实验例1 卷曲乳杆菌IOB901耐酸耐胆盐实验
耐酸耐胆盐是乳酸菌作为食补因子的重要指标之一。胃酸和胆盐具有抗菌作用，具有益生作用的乳酸菌被食入，随着食物进入口腔，经过胃和小肠，最终到达小肠末端。
人的胃液里含有胃酸，胃酸pH值较低且根据个人身体状况和饮食结构的不同存在较大波动，纯胃酸的pH值约为0.9，正常人胃液的pH值为2.0左右，进食后胃液被稀释，pH值上升至3.5，食物在胃里停留的时间从几分钟到几小时不等，只有极少数具有较强耐酸能力的乳酸菌才能在胃中大量存活并到达肠道内发挥益生作用。本实验选择的是pH=2的条件 ，进行存活率的测试。
Figure 730400DEST_PATH_IMAGE002
IOB901在pH=2的条件下存放2 h时，存活率可达76%，通过检索文献，其它乳酸菌在pH=3存放2 h这个环境下，存活率在50%~70%，在pH=2的条件下存活率更低。由此可知，IOB901具有较好的耐酸性。
通过胃液后存活的菌株将在小肠的上部遇到胆盐，故对胆盐具有抗性是它能够在肠道中生长、存活、发挥功效的一个重要指标。人体内正常的胆盐浓度是在0.3％~0.5％之间，同时食物通过肠道的时间一般为4~16h，因此我们选择在胆盐浓度为0.5％处理4h后，测其存活率。
Figure 468374DEST_PATH_IMAGE003
卷曲乳杆菌IOB901在0.5%的胆盐浓度的条件下，存活率可达70.42%。
实验例2： 卷曲乳杆菌IOB901改善肠道功能、促进消化道蠕动的实验研究
实验动物：昆明种小鼠
实验菌粉：卷曲乳杆菌IOB901
饲养环境：12 h光照/12 h黑夜循环，温度 (22±2) ℃，湿度50%-60%，自由饮水饮食。
方法：取体重20±3g小鼠40只，雌雄各半，平均分成四组，分别是空白对照组、实施例1组、实施例2组、实施例3组。空白对照组灌胃生理盐水10ml/kg，实施例1组、实施例2组、实施例3组灌胃剂量为5×109个菌/kg，每日一次，连续灌胃一周，灌胃前禁食4h，末次灌胃后禁食20h，进行小肠的炭末推进实验。
实验前小鼠禁食24h，用5%的炭末+10%阿拉伯胶制成混悬液，给雄安舒灌胃，（2ml/10g体重），灌胃后20min脱颈椎处死，取出自幽门至回盲处的消化管，平铺于超净台上，测量其全长和炭末前沿至幽门的距离，计算其与全长的白分比，即推进百分率。
卷曲乳杆菌IOB901对小鼠小肠的炭末推进的影响见下表所示：
Figure 204249DEST_PATH_IMAGE004
由表4可知，与空白对照组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组均明显增加小肠的蠕动的速度，改善肠道功能。
实验例3：卷曲乳杆菌IOB901对大鼠降血脂作用的实验研究
实验动物：SD雄性大鼠
实验菌粉：卷曲乳杆菌IOB901
饲养环境：12 h光照/12 h黑夜循环，温度 (22±2) ℃，湿度50%-60%，自由饮水饮食。
小鼠高脂饲料：市售
方法：准备SD雄性大鼠40只，用普通饲料喂养一周，观察动物无异常之后，尾静脉取血，测定血清血脂参数，包括：总胆固醇（Tc）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（TG）。将40只大鼠进行高脂饲料的喂养，形成高血脂模型，然后将动物随机分成4组，分别是空白对照组、实施例1组、实施例2组、实施例3组。空白对照灌胃生理盐水10ml/kg，实施例1组-实施例3组灌胃对应实施例制得的卷曲乳杆菌IOB901菌粉，每日一次，灌胃剂量为5×109个菌/kg，连续4周。各组将于灌胃4周后再次取血，测定血脂变化情况，具体检测结果如下表所示：
Figure 871991DEST_PATH_IMAGE005
由表5可知，在给高血脂大鼠灌胃卷曲乳杆菌IOB901 4周后，实施例1组、实施例2组和实施例3组动物血清中Tc和TG均显著降低，实施例1组、实施例2组和实施例3组的HDL-C显著升高，说明IOB901 菌粉有助于降低大鼠的高血脂。
实验例4 卷曲乳杆菌IOB901对大鼠降糖作用的实验研究
实验动物：SD雄性大鼠
实验菌粉：卷曲乳杆菌IOB901
饲养环境：12 h光照/12 h黑夜循环，温度 (22±2) ℃，湿度50%-60%，自由饮水饮食。
方法：
（1）糖尿病大鼠模型制备：在安全性饲养之后，饲喂高脂高糖饲料3周。注射前禁食4h左右，腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）75mg/kg，建立糖尿病模型，正常组注射柠檬酸缓冲溶液（0.1M，pH4.5），尾部采血随机测定小鼠血糖，血糖值＞11.1mmol/L即为建模成功。建模成功后给药4周，饮食饮水同建模期间一致。将实验小鼠分为空白对照组、模型对照组、降糖药物组、实施例1组、实施例2组和实施例3组。
（2）降糖实验：将已经建好膜的大鼠随机分成6组。分别为空白对照组给予生理盐水10ml/kg、模型对照组给予生理盐水10ml/kg，降糖药物组给予二甲基双胍4mg/kg，实施例1组、实施例2组和实施例3组灌胃对应实施例制得的卷曲乳杆菌IOB901菌粉，每日灌胃一次，灌胃剂量为5×109个菌/kg，灌胃4周，每周测定一次血糖值。在灌胃第三周时进行糖耐量实验。
本实验例中，正常大鼠的血糖值在4～6mmol/L之间，而糖尿病大鼠的血糖值则高于11mmol/L。
IOB901对糖尿病大鼠降糖检测结果如表所示：
Figure 9711DEST_PATH_IMAGE006
由表6可知，在应用降糖药物之后，在一到四周内大鼠的血糖值均有不同程度的降低，在使用降糖药物二周后，血糖值下降的比较明显。使用实施例1-3制备的IOB901灌胃治疗糖尿病大鼠四周后，实施例1组-3组的均具有降糖效果，且降糖效果均优于降糖药物组。
（3）糖耐量实验：将已经建好膜的大鼠随机分成6组，分别进行糖耐量实验。实验前大鼠禁食12h，腹腔注射20%葡萄糖，分别在注射前和注射后0.5h、1h、1.5h、2h取尾静脉血测定血糖浓度。
Figure 721184DEST_PATH_IMAGE007
由表7可知，糖尿病大鼠进行糖耐量实验，在30-60min达到血糖值的高峰，各组灌胃效果与模型对照组相比，均有降低空腹血糖的效果，且实施例1组-3组降糖效果优于降糖药物组。
以上对本申请的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本申请的较佳实施例，不能被认为用于限定本申请的实施范围。凡依本申请的申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本申请的专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.一种卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）IOB901，其特征在于，该菌株已于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.23350。
2.一株如权利要求1所述的卷曲乳杆菌IOB901在降脂方面的应用。
3.一株如权利要求1所述的卷曲乳杆菌IOB901在降糖方面的应用。
4.如权利要求2-3所述的应用，其特征在于，具体为卷曲乳杆菌IOB901菌粉或含有卷曲乳杆菌IOB901菌粉的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，卷曲乳杆菌IOB901菌粉，制备方法如下：
（1）菌株活化：将菌株按体积比1：20-25接种于活化培养基中，35-37℃，静置，密闭，培养20-24h，即得一级种子液，将一级种子按1：25-30接种于活化培养基中，35-37℃，静置，密闭，培养20-24h，即得二级种子液；
所述活化培养基为蛋白胨10-20g，酵母浸粉10-20g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min；
（2）发酵：按照体积比为1：50-70的接种量，将培养好的二级种子液接种到灭好菌的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，35-37℃，密闭培养20-30h，即得发酵液；
所述发酵液培养基为蛋白胨10-20g，酵母浸粉10-20g，葡萄糖6-15g，硫酸锰1-3g,七水硫酸镁1-3g，蒸馏水1000ml，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min；
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得IOB901菌粉。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在步骤（1）中，所述一级培养基为蛋白胨10g，酵母浸粉10g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在步骤（2）中，发酵液的培养基为：蛋白胨10g，酵母浸粉10g，葡萄糖6g，硫酸锰1g,七水硫酸镁1g，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。
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