CN113151056A - 益生菌组合物、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了益生菌组合物、其制备方法和用途。益生菌组合物包含罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌原料，其中按原料重量计，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝1.5‑2.5：0.5‑1.5：0.5‑1.5。罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌或动物双歧杆菌原料的单位重量的菌落形成单位相同。罗伊氏乳杆菌是以保藏号209138保藏于中国典型培养物保藏中心的罗伊氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌是以保藏号CGMCC 15210保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的嗜酸乳杆菌和/或动物双歧杆菌是动物双歧杆菌BB‑115。本发明的益生菌组合物可实现在低剂量条件下缓解慢传输型便秘症状，可显著有效地调节便秘相关的胃肠调节肽指标，如P物质(SP)、胃泌素(Gas)、血管活性肽(VIP)等。

Description

益生菌组合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及益生菌领域，具体地涉及治疗肠道疾病的益生菌组合物。

背景技术

便秘是一种粪便干结坚硬或排出困难、排便次数减少的现象。便秘大部分是因为缺少膳食纤维而引起的。有些便秘的发病与肠道微生物有关，比如双歧杆菌，它在维持正常的肠道蠕动方面具有重要作用。长期便秘会使粪便内大量的有害物质反复刺激肠壁，可能造成直肠癌。因此，长期习惯便秘并不是正常表现，应给予重视。一些人用泻药来对抗便秘却使得自己的病情加重，便秘越来越频繁。

益生菌是活的细菌。它们是可以天然存活于人体胃肠道中的细菌。它们帮助梳理消化道，能对便秘起作用。2020年，中国食品科学技术学会益生菌分会发布《益生菌的科学共识(2020年版)》，指出了益生菌的功效发挥具有菌株特异性，表明益生功能需要在菌株水平进行确认。

Martoni等人针对嗜酸乳杆菌DDS-1、动物双岐杆菌乳酸亚种UABla-12、长双岐杆菌UABI-14、两歧双岐杆菌UABb-10的益生菌进行临床研究，发现这四种益生菌与安慰剂组相比，对治疗便秘的效果并不明显。Ibarra等人研究了动物双歧杆菌乳亚种HN019对功能性便秘影响，结果发现其对便秘的治疗无明显效果。因此，即使属于同一菌种，但并非所有菌株对于便秘均有功效。

《益生菌的科学共识(2020年版)》也指出益生菌的核心特征是足够数量、活菌状态和有益健康功能，表明了菌株数量的重要性。Philip等人发现动物双歧杆菌乳亚种HN019降低整肠转运时间，剂量越高，肠转运时间越短，肠转运越快。Janos等人发现嗜酸乳杆菌以剂量依赖方式抑制脂多糖诱导的细胞因子IL-1β和TNF-α的产生，剂量越高，效果越明显。郭均等人发现植物乳杆菌DMDL9010以剂量依赖形式影响SD大鼠脂质水平，高剂量效果显著高于低剂量。这些案例均表明，在益生菌的使用中，高剂量的使用通常占有一定的优势。

因此，本领域中需要能够在低剂量加速肠道蠕动，或治疗或预防便秘的益生菌组合物。

发明内容

益生菌产品最重要的品质之一是保证一定数量的活菌数，这也是导致产品成本过高的一个重要因素。为了保证活菌数量，达到更好的功效，往往需要在配方中添加高含量的益生菌。本发明通过特定比例的菌株组合以低剂量施用就能加速肠道蠕动或治疗或预防便秘，如小肠推进率，首粒时间，黑便粒数和黑便重量等指标中证明的，这些特点可以兼顾产品功效和成本控制。

具体地，本发明提供了一种益生菌组合物，其包含罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌。罗伊氏乳杆菌是以保藏号CCTCCM 209138保藏于中国典型培养物保藏中心的罗伊氏乳杆菌。嗜酸乳杆菌是以保藏号CGMCC 15210保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的嗜酸乳杆菌。动物双歧杆菌以动物双歧杆菌BB-115购自安徽锦乔生物科技有限公司。动物双歧杆菌BB-115菌株先前已经公开于艾忠华等，双歧杆菌与鼠李糖乳杆菌三联活菌制剂联合治疗小儿轮状病毒肠炎的疗效及对免疫功能的影响，《中国医学创新》第13卷第6期第59-61页，2016年2月；左继东等人，补充双歧杆菌与鼠李糖乳杆菌三联活菌制剂对肠道手术后肠道菌群的影响，中国当代医药2017年2月第24卷第5期第25-27页。以上菌株可由商业渠道长期供应。

在益生菌组合物中，按原料重量计，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝1.5-2.5：0.5-1.5：0.5-1.5。

在一个实施方案中，按原料重量计，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝2：1：1。

在一个实施方案中，按益生菌组合物重量计，罗伊氏乳杆菌的含量为40％-60％，例如50％。在一个实施方案中，嗜酸乳杆菌的含量为15％-35％，例如25％。在一个实施方案中，动物双歧杆菌的含量为15％-35％，例如25％。在一个实施方案中，罗伊氏乳杆菌的含量为50％，嗜酸乳杆菌的含量为25％，且动物双歧杆菌的含量为25％。

在一个实施方案中，益生菌组合物为胶囊、片剂、粉末、滴剂、凝胶剂或悬浮液形式。

在一个实施方案中，益生菌组合物的单位剂量中的罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌BB-115的总量为5x10⁸CFU-5x10⁹CFU。在一个实施方案中，益生菌组合物的单位剂量中的罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌的总量为5x10⁸-1x10⁹CFU。

在一个实施方案中，益生菌组合物包含用于治疗或缓解便秘的成分。在一个实施方案中，益生菌组合物包含用于治疗或预防便秘的食品添加剂或药品添加剂。

在一个实施方案中，益生菌组合物为食品、药品或保健品。

在另一个方面，本发明还提供了制备本发明的益生菌组合物的方法，其包括按比例均匀混合益生菌组合物的步骤。

在另一个方面，本发明还提供了本发明的益生菌组合物在制备用于治疗或预防受试者中的便秘的药物、食品或保健品中的用途。在一个实施方案中，便秘为慢传输型便秘。

在另一个方面，本发明还提供了本发明的益生菌组合物在制备用于加速肠道蠕动的药物、食品或保健品中的用途。

本发明的优点包括：

1.与青春双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌相比，本发明的益生菌组合罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌能够缓解便秘体感功效，表明本发明的菌株组合的技术效果是令人惊讶的。

2.通过组合特定菌株比例：例如罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝2：1：1，本发明的益生菌组合物能够在低剂量达到缓解便秘体感的功效，同时在调节相关便秘指标上具有优越的表现，从而能够兼顾产品功效和成本控制，表明本发明的特定比例的菌株组合实现了令人惊讶的技术效果。

附图说明

图1：动物实验流程图。

图2：菌粉干预后各组小鼠结肠c-kit和AQP3 mRNA的表达情况。

具体实施方式

益生菌在肠道菌群的调节作用方面的研究已经十分广泛了，但是对于其是否能够改善慢传输型便秘方面的研究仍需要进一步证实。同时为了保证活菌数量，达到更好的功效，往往需要在配方中添加高含量的益生菌。令人惊讶地，本发明人使用特定菌株按一定比例组合后，即可实现在低剂量条件下缓解慢传输型便秘症状，同时低剂量(5×10⁸CFU)可显著有效地调节便秘相关的胃肠调节肽指标，如P物质(SP)、胃泌素(Gas)、血管活性肽(VIP)等。

本发明提供了含有益生菌的组合物。益生菌是指一类对宿主有益的活性微生物。人体和动物体内有益的益生菌包括酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌等。在本文中，益生菌是罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌，具体为以保藏号209138保藏于中国典型培养物保藏中心的罗伊氏乳杆菌，以保藏号CGMCC 15210保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的嗜酸乳杆菌和商购的动物双歧杆菌BB-115(例如购自安徽锦乔生物科技有限公司)。在益生菌组合物中，按原料重量计，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝1.5-2.5：0.5-1.5：0.5-1.5。例如，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝2：1：1。菌落计数的方法是本领域技术人员公知的，例如包括平板菌落计数。例如，本发明的益生菌组合物可以通过取单位重量或体积的组合物，分配到相应菌株的培养基中，并且通过培养后计算菌落数来计算总数或比例。本发明的组合物的单位剂量中的罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌的总量为5x10⁸CFU-5x10⁹CFU。

益生菌组合物可以为各种口服形式，例如可以配制成胶囊、片剂、粉末、滴剂、凝胶剂或悬浮液形式。益生菌组合物还可以包含用于治疗或缓解便秘的成分，例如其它益生菌菌种或菌株，条件是罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌需要满足本发明规定的比例和总活菌数目。

益生菌组合物可以包含用于治疗或预防便秘的食品添加剂或药品添加剂，从而制备成药物、食品或保健品。这些药物、食品或保健品可以用于预防或治疗便秘。在一个实施方案中，便秘为慢传输型便秘。这些药物、食品或保健品可以也可以用于加速肠道蠕动。因此，本发明提供了使用益生菌组合物治疗便秘或加速肠道蠕动的方法。

益生菌双歧杆菌BB-12源自科汉森收集的乳品发酵剂，被鉴定为动物双歧杆菌乳双歧亚种。临床研究证明BB-

通过胃肠道可以存活，并能维持健康的胃肠道菌群，能够改善肠道功能。

实施例

提供以下内容以进一步说明本发明。

菌株材料

青春双歧杆菌CCFM626购自江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心CCFM-JU。原料产品规格：1.5x10¹¹CFU/g。

短双岐杆菌CCFM622购自江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心CCFM-JU。原料产品规格：1.5x10¹¹CFU/g。

罗伊氏乳杆菌是以保藏号209138保藏于中国典型培养物保藏中心的罗伊氏乳杆菌，购自安徽锦乔生物科技有限公司，已发表的文献中也称为“罗伊氏乳杆菌GL-104”。原料产品规格：1.5x10¹¹CFU/g。

嗜酸乳杆菌LA-99是以保藏号CGMCC 15210保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的嗜酸乳杆菌，购自安徽锦乔生物科技有限公司，已发表的文献中也称为“嗜酸乳杆菌TYCA06”。原料产品规格：1.5x10¹¹CFU/g。

动物双歧杆菌BB-115以动物双歧杆菌BB-115购自安徽锦乔生物科技有限公司，已发表的文献中称为“动物双歧杆菌BB-115”。原料产品规格：1.5x10¹¹CFU/g。

菌株BB-12购自科汉森公司。以上菌株可由商业渠道长期供应。

实施例1：益生菌组合物产品的制备

益生菌组合物产品的制备方法：

使用菌粉，青春双歧杆菌CCFM626：短双歧杆菌CCFM622：动物双歧杆菌BB-115＝2：1：1，制备益生菌组合物1。

使用菌粉，罗伊氏乳杆菌LR-168：嗜酸乳杆菌LA-99：动物双歧杆菌BB-115＝4：3：3，即40％，30％，30％，制备益生菌组合物2。

将罗伊氏乳杆菌LR-168、嗜酸乳杆菌LA-99和动物双歧杆菌BB-115按表1中所示的含量混合均匀，即可制得益生菌组合物3，其中罗伊氏乳杆菌LR-168：嗜酸乳杆菌LA-99：动物双歧杆菌BB-115＝2：1：1。

表1

实施例2：益生菌组合物产品的体内效果

实验对象：6周龄雄性SPF级BABL/c小鼠。

执行标准：动物实验方案经江南大学伦理委员会批准(JN.No20190930b0501220,JN.No20191115b0500110)，并按照欧盟指导方针(2010/63/EU)执行。

实验设计：70只小鼠随机分配成空白组、模型组、阳性对照组、1倍组-益生菌组合物3、10倍-组益生菌组合物3、益生菌组合物1组、益生菌组合物2组，每组10只小鼠，各组小鼠所给受试物成分及用量如下表2所示。

灌菌组中的受试物为实施例1中制备的益生菌组合物产品。

表2：各组小鼠所给受试物成分及用量

饲养环境保持在(23±2)℃，相对湿度(50±10)％，12h光照12h黑夜交替；在经过7天适应培养后，各组小鼠分别按照上述要求进行给药，第22天处死小鼠取样。动物实验的过程可见图1。

检测指标

1.首粒黑便时间、数量、重量、小肠推进率的测定

第21天，空白组给予0.2mL生理盐水溶液、模型组、1倍灌菌组(益生菌组合物3)、10倍灌菌组(益生菌组合物3)、益生菌组合物1组、和益生菌组合物2组均给予0.2mL生理盐水溶液重悬的盐酸洛哌丁胺悬液(10mg/kg b.w)，1小时后，各组灌胃含有各自受试样品的墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间，6h黑便粒数和黑便重量。

第21天，各组小鼠禁食不禁水过夜，第22天空白组给予0.2mL生理盐水溶液，模型组、1倍灌菌组(益生菌组合物3)、10倍灌菌组(益生菌组合物3)、益生菌组合物1组、和益生菌组合物2组均给予0.2mL生理盐水溶液重悬的盐酸洛哌丁胺悬液(10mg/kg b.w)，30min后，空白组和模型组灌胃墨汁，1倍灌菌组(益生菌组合物3)、10倍灌菌组(益生菌组合物3)、益生菌组合物1组、和益生菌组合物2组灌胃含有各自灌胃菌粉的墨汁。30min后处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取肠管，测定小肠总长度，计算墨汁推进率：

小肠推进率％＝墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)*100％

2.血清、结肠组织胃肠调节肽的测定

第22天处死，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，参照相应试剂盒说明书(小鼠胃动素(MTL)CAS：SBJ-M0543-96T、小鼠胃泌素(GAS)CAS：SBJ-M0634-96T、小鼠P物质(SP)CAS：SBJ-M0494-96T、小鼠内皮素(ET-1)CAS：SBJ-M0443-96T、小鼠生长抑素(SS)CAS：SBJ-M0544-96T、小鼠血管活性肽(VIP)CAS：SBJ-M0082-96TELISA试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司)进行实验，根据标准曲线计算中血清中胃肠调节肽。

用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS按照1:9(g:mL)在组织破碎仪上进行破碎，最后5000×g离心10min，取上清检测胃肠调节肽和细胞因子的浓度。

3.小鼠结肠组织AQP3基因和c-kit基因表达量的测定

c-kit基因

在人的消化系统中，存在着一种Cajal间质细胞(intestinal cells of Cajal，ICC)，ICC相当于心脏的起搏细胞，它是胃肠道的电的起搏细胞，它能产生一种促进肠道蠕动的慢波。而c-kit受体在ICC发育过程中具有十分重要的作用，所以可以通过检测肠道中c-kit蛋白的表达量来反映肠道中Cajal细胞的数量。已经有研究发现可通过提高胃肠道ICC的c-kit基因表达，从而促进结肠的蠕动，缓解便秘症状(Yin J,Liang Y,Wang D,etal.Naringenin induces laxative effects by upregulating the expression levelsof c-Kit and SCF,as well as those of aquaporin 3in mice with loperamide-induced constipation[J].International journal of molecular medicine,2018,41(2):649-658)。

水通道蛋白

水通道蛋白(aquaporin)是一种细胞膜上的蛋白质，可控制水在细胞的进出。水通道蛋白有许多的亚家族，其中AQP3基因在小鼠结肠中高表达。研究表明腹泻和便秘患者中，水通道蛋白的水平都会存在异常(牛亭惠,吴国泰,陈振鹤,等.水通道蛋白3在慢传输型便秘模型大鼠结肠黏膜中的表达[J].甘肃中医药大学学报,2017,34(2):7-10)。

采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chinaeaction,qRT-PCR)来测定相关蛋白的表达量。取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，按说明书用Trizol法提取总RNA，1ug总RNA经逆转录合成30uL cDNA，基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。AQP3基因、c-kit基因、actin基因引物序列如表3所示。

根据反应曲线得到各组样品目的基因和内参基因的阈值循环数(CycleThreshold,Ct)，采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，ΔCt＝Ct Mean目的基因-Ct Mean内参基因；ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组；实验组和对照组的基因表达差异为2^(-ΔΔCt)。空白对照组的数值为1。

表3：AQP3基因、c-kit基因、actin基因引物序列

Primer名称	序列(5’to 3’)
		actin-F	GGTGAAGGTCGGTGTCAACG
actin-R	CAAAGTTGTCATGGATGACC
		c-Kit-F	GATCCTGCCAAACTTTTCCTGC
c-Kit-R	TTTAGCCACATGGAGTTCAGG
		AQP3-F	GCTGTCACCCTTGGCACTT
AQP3-R	TGCATAGATGGGCAGCTTGA

以逆转录得到的cDNA为模板，进行实时荧光定量聚合酶链式反应，反应体系共10uL。反应条件为：95℃2min，95℃30s，59℃、30s，72℃20s，共38个循环。以actin基因为内参，CFX96Manager软件分析结果。

数据分析

GraphPad prism8画图，所有的数据采用SPSS 21.0进行显著性分析，应用one-wayANOVA对不同组进行比较，所有数据均以X±S表示，P＜0.05表示差异显著。

表4：对洛哌丁胺引起的便秘小鼠肠道排泄的影响

注：a-e：不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母则无显著性差异。

表5：对洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清中胃肠调节肽的影响

注：a-e：不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母则无显著性差异。

表6：对洛哌丁胺引起的便秘小鼠结肠组织中胃肠调节肽的影响

注：a-e：不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母则无显著性差异。

实验结果

1、与模型组相比，1倍灌菌组益生菌组合物3、10倍灌菌组益生菌组合物3和益生菌组合物2组在首粒时间、数量、重量和小肠推进率上均有所改善，表明本发明的三种菌株的组合能够改善便秘和胃肠蠕动。与阳性对照组相比，1倍灌菌组益生菌组合物3和10倍灌菌组益生菌组合物3在首粒时间、数量、重量和小肠推进率上具备相当或更好的效果，且实现该效果的剂量更低。

2、与阳性对照组相比，1倍灌菌组益生菌组合物3和10倍灌菌组益生菌组合物3在表6中所示的指标上具备相似或更高的效果。血清中，P物质(SP)和血管活性肠肽(VIP)在1倍灌菌组中优于10倍灌菌组，效果更趋于空白组。胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、生长抑素(SS)在1倍灌菌组和10倍灌菌组中无显著差异。在结肠组织中，胃泌素(Gas)在1倍灌菌组中效果优于10倍灌菌组，P物质(SP)、胃动素(MTL)、血管活性肽(VIP)和内皮素(SS)在1倍灌菌组和10倍灌菌组中无显著差异。

3、1倍灌菌组和10倍灌菌组在AQP3和c-kit基因表达量上无显著差异，同时相比模型组显著提高。

结论

1.小肠推进率能直接反映小肠的运动能力，与空白组的小鼠小肠推进率相比较，模型组的小肠推进率低于空白组有显著性差异(P<0.05)。与模型组的小肠推进率相比较，阳性对照组的小肠推进率高于模型组有显著性(P<0.05)。说明洛哌丁胺在该剂量下造模成功。

2.小鼠排首粒黑便时间可以反映食糜在整个肠道转运时间。与空白组的小鼠首粒黑便时间相比较，模型组的时间远高于空白组有显著性差异(P<0.05)。与模型组的墨汁推进率相比较，阳性对照组的时间低于模型组有显著性(P<0.05)。1倍灌菌组和10倍灌菌组之间无显著差异。

3.在黑便重量和黑便粒数结果中，与模型组的黑便重量和黑便粒数相比较，空白组和阳性对照组重量和粒数大于模型组，有显著性(P<0.05)，1倍灌菌组和10倍灌菌组之间无显著差异。

4.阳性对照组相比模型组，能不同程度恢复血清和肠道组织中胃肠调节肽的水平。

5.在血清中，1倍灌菌组的SP和VIP相比10倍灌菌组恢复水平更接近于空白组，显示出1倍灌菌组的优势；胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、生长抑素(SS)在1倍灌菌组和10倍灌菌组间无显著差异。

6.在结肠组织中，胃泌素(Gas)在1倍灌菌组中效果优于10倍灌菌组，P物质(SP)、胃动素(MTL)、血管活性肽(VIP)和内皮素(SS)在1倍灌菌组和10倍灌菌组间无显著差异。

7.根据图2的数据显示，阳性对照组相比模型组，能显著恢复c-kit和AQP3的基因表达；1倍灌菌组和10倍灌菌组在基因表达水平无显著差异，表明低剂量的效果完全可以媲美高剂量组。

8.与阳性对照组相比，1倍灌菌组益生菌组合物3和10倍灌菌组益生菌组合物3在首粒时间、数量、重量和小肠推进率上具备相当或更好的效果，且实现该效果的剂量更低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种益生菌组合物，其包含罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌原料，其中按原料重量计，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝1.5-2.5：0.5-1.5：0.5-1.5；其中罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌或动物双歧杆菌原料的单位重量的菌落形成单位相同，优选地罗伊氏乳杆菌是以保藏号209138保藏于中国典型培养物保藏中心的罗伊氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌是以保藏号CGMCC 15210保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的嗜酸乳杆菌和/或动物双歧杆菌是动物双歧杆菌BB-115。

2.权利要求1的益生菌组合物，其中按原料重量计，罗伊氏乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌＝2：1：1。

3.权利要求1或2的益生菌组合物，其中按益生菌组合物重量计，罗伊氏乳杆菌的含量为40％-60％，优选50％，嗜酸乳杆菌的含量为15％-35％，优选25％，和/或动物双歧杆菌的含量为15％-35％，优选25％。

4.权利要求1-3中任一项的益生菌组合物，其中益生菌组合物为胶囊、片剂、粉末、滴剂、凝胶剂或悬浮液形式。

5.权利要求1-4中任一项的益生菌组合物，其中益生菌组合物的单位剂量中的罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌的总量为5x10⁸CFU-5x10⁹CFU，优选地，5x10⁸-1x10⁹CFU。

6.前述权利要求中任一项的益生菌组合物，其中所述益生菌组合物包含用于治疗或缓解便秘的成分，例如用于治疗或预防便秘的食品添加剂或药品添加剂，例如膳食纤维。

7.前述权利要求中任一项的益生菌组合物，所述益生菌组合物为食品、药品或保健品。

8.制备前述权利要求中任一项的益生菌组合物的方法，其包括按比例均匀混合益生菌组合物的步骤。

9.前述权利要求中任一项的益生菌组合物在制备用于治疗或预防受试者中的便秘的药物、食品或保健品中的用途，优选地其中所述便秘为慢传输型便秘。

10.前述权利要求中任一项的益生菌组合物在制备用于加速肠道蠕动的药物、食品或保健品中的用途。

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