CN110938572B - 一种减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物，其组成包括动物双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种或多种，并提供了其作为减轻鼻咽癌放化疗副作用的医学配置品、食品和保健品的应用。本发明还提供了该益生菌组合物的生产制备方法。本发明选择的益生菌是以乳酸菌和双歧杆菌为主，安全性好、针对性强、无毒副作用、价格低廉且能够实现工业化生产。

Description

一种减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物及制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于鼻咽癌治疗的益生菌组合物及其生产制备方法。
背景技术
鼻咽癌属高发恶性肿瘤之一，其发生于鼻咽腔顶部和侧壁，患者自然生存期仅为18.7个月，Ⅳ期者自然生存时间为7～9个月1。鼻咽癌的发生、发展与EB病毒感染、环境、饮食、遗传因素以及化学因素密切相关，临床主要表现为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等2。目前，鼻咽癌治疗主要以放射治疗为主，残余病灶行手术切除，其对放射敏感的淋巴上皮癌患者5年存活率约30-50％，而对放射线不敏感的鳞状细胞癌患者5年存活率小于10％3。
最新研究发现，肠道微生物可直接干预各种癌症的发生、发展、治疗和预后4,5。因此，从不患癌/难患癌家族人群肠道筛选抗癌益生菌，制备益生菌膳食、保健品乃至药品用于肿瘤病人，并探究和明确益生菌组合制剂对肿瘤辅助治疗的作用机制，将有利于实现益生菌制剂对鼻咽癌乃至其它类型肿瘤的预防和治疗、提高患者的生存率和生存质量、降低癌症患者死亡率。
然而，目前并未有明确且切实有效的特定微生物或微生物组合用于鼻咽癌的治疗或辅助治疗。众多已公开的科研或者专利技术均集中于化药或生物抗体的研发，众所周知，化药以及生物抗体的生产成本十分高，且存在分离纯化以及安全性等各方面的潜在问题。
对于工业生产来说急需一种组成明确、来源稳定、安全性高的微生物或微生物组合用于鼻咽癌的治疗或辅助治疗产品的生产制备。
例如，中国专利102008465A提供了一种海洋微生物来源大环内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。在微克浓度水平对多种人肿瘤细胞株和动物瘤株有强烈的细胞毒作用，对动物裸鼠移植瘤模型有强烈的抗肿瘤作用。然而其效果验证采用的均为瘤细胞株，并未披露针对非瘤细胞是否存在非特异性伤害，安全性尚存在争议。
益生菌(Probiotics)是指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主(人和动物)健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物6-8。迄今为止，应用较为广泛的益生菌有三大类:乳杆菌类，如嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)；双歧杆菌类，如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(B.breve)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)；链球菌类，如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、粪链球菌(S.faecalis)。益生菌在防治腹泻、缓解不耐乳糖症状、预防阴道感染、增强人体免疫力、缓解过敏作用、降低血清胆固醇、预防癌症和抑制肿瘤生长等方面发挥了积极的作用。
然而，尽管益生菌药物在临床使用达数年之久，其有效性和安全性得到相对保证，但是鉴于上述益生菌药物均为“老药”，存在或多或少的问题。问题如下：1，目前，市场上流通的益生菌药物其药物批准时间多超过10年，鉴于当时益生菌鉴定及评价标准与当前评价标准有区别，因此可能会造成企业菌株标识与实际不符的错误(最初国家菌株识别限于技术水平，主要依靠生理生化鉴定，其要求企业使用益生菌在属水平无误即可，因此导致很多企业菌株在种水平发生错误标识)；2，国家规定益生菌活菌数量不低于106CFU，因此国内益生菌企业说明书中益生菌活菌含量多为>106CFU/粒，但研究表明只有活菌数大于109CFU方能确保益生菌有效性(我们研究表明，大多数药物实际含活菌数量>109CFU，但是仍需要从源头杜绝企业钻空子的可能性)；3，一些对人体健康存在潜在危害的细菌，如粪肠球菌(尽管粪肠球菌有明确有益健康的作用，并且具有使用的悠久历史，但是目前肠球菌仍是机会性致病菌，可以引起医院内感染，粪肠球菌的安全性仍是一个值得关注的问题。其一，某些肠球菌菌株携带抗生素耐药基因，容易造成抗生素耐药性的传播及耐药菌株的产生；其二，某些肠球菌菌株含有毒力因子)、蜡样芽孢杆菌(该菌在生长过程中产生多种活性物质对致病菌或条件致病菌有明显的抑制作用；能迅速消耗消化道内环境中的游离氧，形成肠道低氧环境，不利于肠道需氧生物的生长繁殖(球虫)，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌的生长。但同时，蜡样芽孢杆菌与少数食物中毒有关(约2–5％，包括一些严重的恶心、呕吐以及腹痛)却依然被作为益生菌进行使用，其原因主要是因为当时科技不发达，上述细菌潜在危害性不为当时监管部门和消费者所得知。因此，寻找并复配维护人体健康安全的益生菌产品并探究其作用机理迫在眉睫。
本申请人团队在上述技术背景的基础上，克服了筛选地域、筛选样本、筛选参数的不确定性以及筛选结果的随机性等各方面技术障碍。通过行3轮不同的微生物分离、筛选和评价，得到1株耐酸、耐胆盐的益生微生物植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其具有良好的抗氧化性、广谱的抑杀致病菌能力。之后，我们将上述益生菌与现有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌进行反复验证和复配，以冻干粉形式给予少量鼻咽癌患者使用(15人)。主要用于评价该复合菌粉的有效性。结果表明复配后的益生菌可显著提升患者免疫力，减少患者粘膜副反应，效果优于培菲康；上述实验已在美国临床试验数据库注册(ClinicalTrials，注册号NCT03112837)，并于2017年8月通过江西省肿瘤医院伦理审查。
参考文献：
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4、Wei Hu,Fan Kuang,Zhanjun Lu,Ning Zhang,Tingtao Chen.Evaluation ofthe killing effect of the isolated Serratia marcescens KH-001on Diaphorinacitri using high-throughput sequencing.Frontiers in Microbiology,2018,9.
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6、Miaoxing Liu,Xiangwei Song,Fen Yu,Fengshun Li,Xiaotong Shi,ChaowenXue,Tingtao Chen,Xiaolei Wang.The First Visually Observable Three-modeAntibiotic Switch and its Relative 3D Printing Assisted Applications.Journalof Materials Chemistry B,2016；4:2544-2547.
7、Chaowen Xue,Xiaotong Shi,Xuan Fang,Haiyan Tao,Hui Zhu,Fen Yu,Xingwei Ding,Miaoxing Liu,Fang Fang,Fan Yang,Zhipeng Wei,Tingtao Chen,Zongliang Wang,Guoping Wang,Xigao Cheng,Junchao Wei,Yingjie Lin,Ke-Yu Deng,Xiaolei Wang,and HongBo Xin.The“Pure Marriage”between 3D Printing and Well-ordered Nanoarrays by using PEALD Assisted Hydrothermal SurfaceEngineering.ACS Applied Materials&Interfaces,2016；8.
8、Fen Yu,Xuan Fang,Huimin Jia,Miaoxing Liu,Xiaotong Shi,Chaowen Xue,Tingtao Chen,Zhipeng Wei,Fang Fang,Hui Zhu,Hongbo Xin,Jing Feng,XiaoleiWang.Zn or O？An Atomic Level Comparison on Antibacterial Activities of ZincOxides.Chemistry–A European Journal 2016；22:8053-8058.
发明内容
本发明提供了一种用于减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物及其应用。将微生物学、分子生物学、生物信息学、免疫学有机结合，相对于普通方法，更加精准地分析比较了中国江西省婺源县赋春镇源头村村民和鼻咽癌患者肠道菌群的差异，分离筛选对肿瘤有抑制和治疗效果的潜在菌株，最终将通过临床实验验证其对鼻咽癌患者免疫、预后及生存期方面发挥的积极作用。鉴于口腔粘膜是导致鼻咽癌患者治疗中断和复发的最关键副作用，因此团队使用射线导致的大鼠口腔粘膜炎模型，评价益生菌制剂对鼻咽癌大鼠放化疗后副作用的治疗效果。
整体上，本发明提供了益生菌组合物在制备治疗或辅助治疗鼻咽癌的药物、食品或保健品中的用途。益生菌组合物包括植物乳杆菌MH-301、动物双歧杆菌LPL-RH、鼠李糖乳杆菌LGG-18、嗜酸乳杆菌No.2。
一方面，本发明提供了一种用于减轻鼻咽癌放化疗后副作用的益生菌组合物。通过筛选得到了可用于减轻鼻咽癌放化疗后副作用的益生菌复配制剂。
具体地，所述益生菌组合物中的植物乳杆菌筛选自江西省上饶市婺源县赋春镇源头村(无癌村)健康志愿者的肠道菌群。
具体地，所述益生菌组合物经过SD大鼠辐射口腔粘膜炎模型验证。
具体地，所述益生菌组合物包括动物双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的任意一种或多种。
其中，植物乳杆菌为植物乳杆菌MH-301，保藏号为CGMCC No.18618；保藏时间为2019年09月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
其中，鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌LGG-18，保藏号为CGMCC No.14007；保藏时间为2017年04月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
其中，动物双歧杆菌为动物双歧杆菌LPL-RH，保藏号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。此菌种已于2011年8月17日在中国专利201110054259.0中公开，并于2012年11月28日获得授权。
其中，嗜酸乳杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，购买信息如下：
Figure BDA0002327573820000051
Figure BDA0002327573820000061
备注：价格等级，A类500元一支，B类800元一支，C类1200元一支，D类邮件咨询。
具体地，所述益生菌组合物可以是粉剂，颗粒剂，胶囊剂，片剂等剂型。
优选地，所述益生菌组合物配比为1:1:1:1。
另一方面，本发明提供了一种用于减轻鼻咽癌放化疗后副作用的医药配置品，所述的医药配置品包含上述益生菌组合物。
所述的医药配置品的剂型根据给药方式包括但不限于：经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。
所述的经胃肠道给药剂型包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂。
所述的非经胃肠道给药剂型包括但不限于：注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型、腔道给药剂型。
所述的注射给药剂型包括但不限于：静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、腔内注射剂。
所述的呼吸道给药剂型包括但不限于喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。
所述的皮肤给药剂型包括但不限于外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂。
所述的粘膜给药剂型包括但不限于滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂。
所述的腔道给药剂型包括但不限于栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂。
所述的医药配置品还包括药学上可接受的辅料。所述的药学上可接受的辅料包括但不限于溶剂、乳化剂、崩解剂、增溶剂、抗氧剂、pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂、稀释剂、润湿剂、粘合剂、成膜剂等。
再一方面，本发明提供了一种用于减轻鼻咽癌放化疗后副作用的食品，所述的食品包含上述益生菌组合物。
所述的食品的类型包括但不限于：饼干、乳制品、代餐品、肉制品、酱汁、烘焙食品、酸奶、冰淇淋、发酵谷类基产品、果汁、米酒、糖果、糖浆、罐头食品、腌制品、调味品、豆制品、巧克力、馅料、茶制品、膨化食品等。
所述的食品还包括食品添加剂。
所述的食品添加剂包括但不限于防腐剂、酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、胶基糖果中基础剂物质、着色剂、护色剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、面粉处理剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、稳定剂和凝固剂、甜味剂、增稠剂、食品用天然香料、食品用合成香料等。
又一方面，本发明提供了一种用于减轻鼻咽癌放化疗后副作用的保健品，所述的保健品包含上述益生菌组合物。
所述保健品的功效包括但不限于：辅助术后炎症恢复、对胃黏膜损伤有辅助保护、调节肠道菌群、通便、减肥、促进消化、增强免疫力等。
所述保健品的类型包括但不限于：药酒、胶囊、片剂、冲剂、茶制品、果汁、水果醋、口服液、软胶囊、颗粒、发酵奶制品、发酵谷制品、发酵豆制品、蜜膏、露剂、散剂、鲜汁、代餐粉等。
所述保健品还包括保健品添加剂。
所述保健品添加剂包括但不限于：香精香料、着色剂、甜味剂、酸味剂、增鲜剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗氧剂、营养强化剂等。
本发明中所述的医药配置品、食品、保健品的制备方法可采用本领域目前现有的以及未来研发出的相关制备方法。应当明确的是采用何种具体制备方法并不能作为对本申请保护范围的限定。无论采用目前已有的还是未来研发的制备方法，只要包含上述益生菌组合物，均在本申请要求保护的范围内。所述医学配置品，食品，保健品还可应用在肠梗阻、便秘、腹泻、、精神性疾病、糖尿病、高血压、阿尔兹海默症、帕金森症的治疗或辅助治疗中。
又一方面，本发明还提供了上述用于减轻鼻咽癌放化疗副作用的的益生菌组合物的生产制备方法。
具体地，所述的生产制备方法包括针对上述益生菌组合物的任一或任几种的培养方法。
所述的培养方法包括但不限于：液体发酵法、固体发酵法、半固体发酵法。
所述的液体发酵法的类型包括但不限于分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。
所述的固体发酵法的类型包括但不限于自然富集固态发酵、强化微生物混合固态发酵、限定微生物混合固态发酵、单菌固态纯种发酵。
所述的半固体发酵法的类型包括但不限于间歇式发酵。
所述的液体发酵法采用的培养基包括但不限于LB培养基、AAM-AS液体培养基、MRS培养基、PTYG培养基、PY培养基、YPD培养基、BSM培养基；及其改进的、变形的、优化的类型。
所述的固体发酵法采用的培养基包括但不限于LB固体培养基、YEB固体培养基、沙保罗琼脂培养基、R2A琼脂培养基、YPD固体培养基、BSM固体培养基；及其改进的、变形的、优化的类型。
所述半固体发酵法采用的培养基包括但不限于：LB培养基、YEB培养基、沙保罗琼脂培养基、R2A琼脂培养基、YPD培养基；及其改进的、变形的、优化的类型。
本发明的筛选菌株均来自于人体肠道，理论上对人体安全、无毒副作用。此外，本发明选择的益生菌在我国都被列为食品可用菌，可直接用于食品，安全且无任何毒副作用。本发明的益生菌组合物安全性好、针对性强、无毒副作用、价格低廉且能够实现工业化生产。
本发明中的人体实验已在美国临床试验数据库注册，注册号NCT03112837，并于2017年8月通过江西省肿瘤医院伦理审查。
保藏说明：
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2019年09月26日
菌种名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
菌株编号：MH-301
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18618
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2011年02月22日
菌种名称：动物双歧杆菌
拉丁名：Bifidobacterium animalis
菌株编号：LPL-RH
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4599
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2017年04月07日
菌种名称：鼠李糖乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus rhamnosus
菌株编号：LGG-18
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14007
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2002年1月28日
菌种名称：嗜酸乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus acidophilus
菌株编号：No.2
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.1.2919
附图说明
图1为基础实验例2中的耐酸实验结果图。
图2为基础实验例2中的耐胆盐实验结果图。
图3为基础实验例2中的抗菌实验结果图。
图4为基础实验例2中的抗氧化实验结果图。
图5为基础实验例2中的细胞粘附性实验结果图。
图6为实施例1中大鼠口腔黏膜炎实验结果图。
图7为实施例1中大鼠舌组织炎症相关蛋白、凋亡相关蛋白、肠组织肠道通透性相关蛋白的表达情况实验结果图。
图8为实施例1中高通量测序下的大鼠模型肠道菌群多样性评价。
图9为实施例2中复配益生菌对鼻咽癌患者的辅助治疗的临床结果比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
整个实施过程使用到的部分仪器列表如下：
场发射扫描电子显微镜：ZEISS/Sigma300英国Sigma300；正置荧光显微镜：BX63日本奥林巴斯；共聚焦显微镜：ZEISS/LSM800德国LSM800；流式细胞仪：BD jazz美国；冰冻切片机：HM525 ThermoFisher；包埋中心：Histostar ThermoFisher；超速冷冻离心机：OPTIMAL-80XP美国贝克曼；微量超速冷冻离心机：OPTIMA max xp美国贝克曼；超速冷冻离心机：avanti j-26xp美国贝克曼；全自动脱水机：Excelsior ES ThermoFisher；动物整体生理功能系统PL3508/FE136澳大利亚ADI公司；心室压力容积系统PL3508B48/R澳大利亚ADI公司；离体心脏灌流系统PL3508B2-220澳大利亚ADI公司；离体组织灌流系统ML0146/25-220澳大利亚ADI公司；多功能酶标仪spectraMax M5美国MD公；RT PCR实时荧光定量PCR仪ViiA7USA/ABI；双向电泳系统PROTEANRi12TM IEF SYSTEM美国伯乐公司；全自动层析系统AKTAAvanta25瑞典GE公司；大规模层析系统10mm Manual Process System瑞典GE公司；微毛细管细胞分析仪Guava EasyCyte 5HT美国Millipore公司；液相色谱仪Agilent 1260德国Agilent公司；SOLiD 5500Anaiyzer测序系统5500USA/ABI；ion torrent离子流测序仪iontorrent USA/ABI；生物分析仪2100bioanalyzer 2100Agilent；倒置荧光显微镜IX83日本奥林巴斯；大鼠代谢笼TSE PhenoMaster德国。
基础实验例1：无癌村肠道益生菌的筛选
(1)收集无癌村(江西省上饶市婺源县赋春镇源头村)村民、正常人(正常饮食、无癌症的健康人)和鼻咽癌患者(江西省肿瘤医院)早晨第一次粪样(每组均为3男2女，三个月内未服用抗生素，非素食者)，之后称取10g粪便样品到内置灭菌甘油的10mL的离心管内，甘油含量为样品的10％，用封口胶密封离心管口(以上操作在厌氧袋内完成)。迅速将样品保存在干冰中，并在最短时间内转移至-80℃超低温冰箱中。
(2)肠道微生物的分离
无菌采取粪便0.5～1.0g，加入试管中，添加无菌玻璃珠对粪便进行充分振荡，混匀后进行10倍倍比稀释，选择合适浓度在选择培养基上培养计数。待菌落长出后，以菌落形态、革兰染色鉴定所需目的菌。
分离单菌基因组DNA的提取按粪便DNA提取试剂盒操作。
分离菌株的PCR扩增：以分离株细菌的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F(SEQ ID No.1)和1492R(SEQ ID No.2)进行PCR扩增，得到PCR产物送上海生工测序，在NCBI上进行细菌比对。
(3)益生菌特性评价
筛选的益生菌耐酸、耐胆盐、抗氧化、抑菌、细胞粘附和抑制致病菌粘附实验均为实验室常规技术，不赘述。
筛选结果：
通过在三轮筛选中，利用平板计数、革兰氏染色和测序技术从无癌村民中分离和鉴定出十几株微生物，如下所示：
菌株编号 比对结果 相似度(％)
1 Lactobacillus acidophilus 99
2 Weissella cibaria 98
3 Lactobacillus curvatus 98
4 Weissella confusa 98
5 Lactobacillus plantarum 99
6 Lactobacillus salivarius 98
7 Lactobacillus rhamnosus 99
8 Bifidobacterium animalis 97
9 Enterococcus faecium 98
10 Lactobacillus mucosae 98
11 Pediococcus pentosaceus 99
并最终筛选得到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)用于本研究，该菌株已保藏；此外，复合的另外三种菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
其中，植物乳杆菌为植物乳杆菌MH-301，保藏号为CGMCC No.18618；保藏时间为2019年09月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
其中，鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌LGG-18，保藏号为CGMCC No.14007；保藏时间为2017年04月07日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
其中，动物双歧杆菌为动物双歧杆菌LPL-RH，保藏号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。此菌种已于2011年8月17日在中国专利201110054259.0中公开，并于2012年11月28日获得授权。
其中，嗜酸乳杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，购买信息如下：
CGMCC 1.2919
拉丁学名 Lactobacillus acidophilus
曾用名 -
中文译名 嗜酸乳杆菌
原始编号 No.2
菌株来源 中国科学院微生物研究所
保藏人 刘英昊
直接来源国家 中国
保藏时间 1/28/2002
其他保藏编号 -
生物危害 四类
模式菌株 非模式菌株
菌株用途 发酵乳制品
培养温度 30℃
培养基 0006
其他培养条件 -
分离源 -
采集地点 -
采集国家 -
Genbank(保藏人) -
参考文献 -
价格 B类
提供形式 冻干物
平台资源号 1511C0002100002700
备注：价格等级，A类500元一支，B类800元一支，C类1200元一支，D类邮件咨询。
基础实验例2：菌株性能测试
针对上述四株菌株进行耐酸、耐碱盐、抑菌性、抗氧化、细胞黏附评价实验，实验方法均为常规方法。
耐酸实验(图1)结果表明，所有选用菌株均可耐受pH2.5以上的酸度，因此所选分离株均可大量耐受胃酸(胃酸pH约为2.5-4.0)、安全进入肠道，发挥益生效果，其中B.animalis耐酸能力最强。
胆盐实验(图2)表明筛选菌株对胆盐耐受能力有差异，其中Lactobacillusrhamnosus和Lactobacillus acidophilus在胆盐浓度0.5％中长势稍差。
选取了日常生活中常见的8株食源性致病菌作为抑菌研究对象，评价了筛选菌株对上述致病菌的体外抑制效果。抑菌实验结果(图3)表明，尽管筛选菌株对上述致病菌的抑制有个体差异，甚至对某些致病菌不具备抑制效果，但是单独每株筛选菌均可抑制绝大部分致病菌的生长，因此我们在后期可通过对上述4株益生菌进行复配，解决单独菌株不能全面抑菌的问题。
抗氧化实验(图4)，4株益生菌对五种不同指标的清除率效果不一，对于DPPH的清除，4株菌的效果都很好，约为90％左右；对于羟基自由基的清除，4株菌的清除率均在60％左右；而对Fe2+的螯合能力B.animalis效果最好，约为40％左右；还原活性最高的为B.animalis。通过与文献报道中的益生菌抗氧化活性的比较，可以看出这4株乳酸菌都有一定的抗氧化活性，而且每一株的抗氧化活性都在较高水平。
细胞粘附实验(图5)，结果发现筛选益生菌对肠上皮细胞具有非常强的粘附能力，预示其在人体肠道可能存留时间较久。
基础实验例3：商品化益生菌药物(培菲康)对鼻咽癌患者的辅助治疗结果
详细实验过程以及具体指标数据等参见文献：C J.,H W.,C X.,Q D.,E C.,Y Q.,et al.A randomized,double-blind,placebo-controlled trial of probiotics toreduce the severity of oral mucositis induced by chemoradiotherapy forpatients with nasopharyngeal carcinoma.Cancer 2019,125,1081-90.
实验结果显示：纳入研究的病人培菲康组和安慰剂组疗效评价，培菲康组重度黏膜炎发生率为15％左右，而安慰剂组重度黏膜炎的发生率为45％；在临床生化指标中，经过培菲康治疗后恢复到正常水平的的病人比例远高于安慰剂组；临床指标评价，安慰剂组与培菲康组相比，安慰剂组中免疫细胞的数量显著降低，而培菲康组显著降低了免疫细胞CD4+T细胞(76.59％比52.85％，p<0.05)，CD8+T。
实施例1动物实验
益生菌复配制剂对口腔黏膜炎大鼠的作用
(1)SD大鼠辐照口腔黏膜炎模型建立及分组
选取8周龄SPF级SD雄性大鼠，每组18只随机分为3组。分别为：空白对照组(C组)、模型组(M组)和治疗组(T组)。其中空白对照组采用常规培养方式；模型组使用直线加速器一次性给予20Gy的口腔部位照射，自由饲养21天，在第7、14、21各杀6只，并取相关组织进行分子生物学实验；治疗组，使用直线加速器一次性给予20Gy的口腔部位照射，照射前3天及造模过程中在饮水中添加混合益生菌，和模型组在同样时间杀同样的数量进行对比。
治疗组所添加的混合益生菌为本发明筛选获得的动物双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌分别培养制备成菌粉，按照菌粉重量比为1：1：1：1混合为混合菌粉后，以0.2g混合菌粉/kg大鼠体重的添加量给药。
(2)辐射方法
大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(3mL/kg)麻醉后，通过尾部和腿部粘贴到丙烯酸板上将大鼠固定在俯卧位。辐射局限于口腔并保护身体的其余部分(辐射的上边界是下眼睑和耳垂下边缘之间的横向线；辐射的后边界是耳垂的假想垂直线)，使用直线加速器(LINAC，6MV，21EX)，通过相对的粒子束以2Gy/min的速率输送单个辐射剂量(20Gy)，以辐射源到轴为100cm的距离进行辐照。照射结束后立即对舌部给予生理氯化钠溶液湿润，以最大化减轻操作中机械损伤对舌黏膜的影响，并把大鼠置于洁净的保温盒内待其自然苏醒。
(3)样本采集
a、大鼠血液标本收集：术前1天，大鼠尾静脉血进行血常规指标检测，手术当天进行腹腔静脉取血，收集血液样本并对其做ELISA检测炎症因子：IL1-β、IL-22、TNF-α和流式分析检测CD3、CD4、CD8细胞数量及比值。
b、粪便收集：收集造模后大鼠第0、6、13、21天粪便于2mL离心管中，冻存于-80℃备用。
c、舌、口腔黏膜、肠道组织及内脏组织的采集：每组大鼠，分别将舌、空肠、回肠、十二指肠、结肠和结肠内容物收集于无菌的离心管中，液氮速冻，保存于-80℃冰箱。分离心、肝、脾、肺、肾并称重，计算脏器比。用PBS缓冲液冲洗各肠段残留的内容物，将这些组织切成合适大小的片段，一部分分装于1.5mL离心管中，超低温保存(-80℃)，用于检测蛋白质表达，另一部分浸泡在4％的多聚甲醛中，低温保存(4℃)，用于HE染色和免疫组化染色。
d、指标检测：每天固定时间称量大鼠体重，记录体重变化；每天观察口腔粘膜情况及严重程度并给予评分(根据口腔黏膜炎症指数)，并拍摄舌背黏膜照片备用；流式细胞技术检测外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的数量及比值；Western blot法检测大鼠舌组织标本中炎症通路TLR4/MyD88/NF-kB、凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、BAX、bcl-2及肠道粘膜通透性相关蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-3、AQP3、JAM-1；染色观察舌粘膜上皮细胞的厚度改变，淋巴细胞浸润以及血管数；免疫组化检测炎症、凋亡相关蛋白；口腔黏膜炎SD大鼠模型肠道菌群多样性评价(高通量测序)。
数据统计学分析：采用SAS和SPSS23.0统计软件进行。
实验结果：
1、大鼠黏膜炎情况观察结果(图6)显示：模型组M(右)放化疗后，表现出显著的粘膜炎症状，但是治疗组T(中)服用益生菌后可显著降低口腔黏膜炎症状，其接近于空白对照组(左)。
2、大鼠舌组织炎症相关蛋白、凋亡相关蛋白、肠组织肠道通透性相关蛋白的表达情况(图7)显示：模型组(M)中炎性蛋白和凋亡蛋白表达升高，肠组织肠道通透性相关蛋白减少；而治疗组(T)接收益生菌治疗后，与M组相比，显著降低了炎性蛋白和凋亡蛋白的表达，升高了肠组织肠道通透性相关蛋白的表达，接近于空白对照组(C)。
3、大鼠粪便高通量结果(图8)显示：模型组(M)菌群紊乱，致病菌数量升高，益生菌数量降低；服用益生菌后(T)，其显著增加了益生菌数量，降低了致病菌数量。
实施例2人体实验
为验证本申请的益生菌粉对鼻咽癌患者确实有效，申请者团队在人群中进行了验证。
入组患者信息：在江西省肿瘤医院被诊断为患鼻咽癌、接收放化疗的患者。
总体年龄分布：41-70。
总体性别比例：男：女＝3：7。
实验组人数：34。
安慰剂组人数：36。
实验组：本发明筛选获得的动物双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌分别培养制备成菌粉，按照菌粉重量比为1：1：1：1混合为混合菌粉，所得菌粉含上述每种细菌均为109CFU/2g。以2g混合菌粉/人，通过口服方式给药。
安慰剂组：相对于实验组，口服不含益生菌，其它成分与实验组相同的药物。
治疗结果表明(图9)，本发明提供的益生菌组合菌粉可显著提升鼻咽癌患者放化疗后的免疫能力(CD3+、CD4+、CD8+细胞)，降低由放化疗导致的粘膜副反应。图中，A：黏膜炎分度；B：CD3+T细胞减少率；C：CD4+T细胞减少率；D：CD8+T细胞减少率；E：淋巴细胞比率；F：血红蛋白；G：体重。*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；ARCP：放疗+化疗+复配益生菌治疗后；ARCPM：放疗+化疗+安慰剂治疗后)。
Figure BDA0002327573820000181
序列表
<110> 哈尔滨美华生物技术股份有限公司
<120> 一种减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物及制备方法
<130> 20191121
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 1
gagtttgatc ctggctcag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 2
ggctaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一株植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC No.18618，保藏时间为2019年09月26日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.一株鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCC No.14007，保藏时间为2017年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
3.一种用于减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物中的益生菌由权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.18618的植物乳杆菌、权利要求2所述的保藏号为CGMCC No.14007的鼠李糖乳杆菌、保藏号为CGMCC No.4599的动物双歧杆菌和保藏号为CGMCC No.1.2919的嗜酸乳杆菌组成；所述的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的菌数比例为1：1：1：1。
4.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，所述的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的口服给药量均为109CFU。
5.一种用于减轻鼻咽癌放化疗副作用的医药配置品，其特征在于，所述的医药配置品包括权利要求3-4任意一项所述的益生菌组合物。
6.权利要求3-4任意一项所述的益生菌组合物在制备治疗或辅助治疗鼻咽癌的药物中的用途。
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