TW202302837A - 副乾酪乳桿菌tci727及副乾酪乳桿菌tci727/或其代謝產物用於製備促進鈣質吸收之組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

一種副乾酪乳桿菌 ( Lactobacillus paracasei) TCI727，其中副乾酪乳桿菌TCI727係以寄存編號BCRC 911032寄存於財團法人食品工業發展研究所。

Description

副乾酪乳桿菌TCI727及副乾酪乳桿菌TCI727/或其代謝產物用於製備促進鈣質吸收之組合物的用途
本揭露關於一種副乾酪乳桿菌，特別是關於一種副乾酪乳桿菌TCI727及副乾酪乳桿菌TCI727/或其代謝產物用於製備促進鈣質吸收的組合物的用途。
研究指出，鈣質的吸收容易受植酸抑制，其中富含植酸的食物包括豆類、穀物、種子及堅果，在腸道中這些物質會與鈣結合而形成鈣鹽，將使得攝入食物中的鈣質隨著植酸排出體外，不利於個體對於攝入食物中的鈣質的吸收及降低個體攝入鈣的利用率。因此，黃豆及芝麻雖富含鈣質，但卻礙於其本身富含植酸，因而其不是優良的鈣質補充來源。
基於人體缺乏植酸酶，需要靠腸道菌叢幫助分解攝入食物中的植酸成分。
此外，鈣的主動運輸必須藉助活化維生素D調節，增加細胞的鈣離子通道蛋白，以增加鈣的吸收。
有鑑於此，在一些實施例中，一種副乾酪乳桿菌( Lactobacillus paracasei)，其係其係寄存於財團法人食品工業發展研究所（寄存編號為BCRC 911032）、及德國微生物菌種保藏中心（DSMZ）（寄存編號為DSM 33756）。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727具有植酸酶。
在另一些實施例中，一種副乾酪乳桿菌( Lactobacillus paracasei) TCI727或其代謝產物用於製備促進鈣質吸收的組合物的用途，其中副乾酪乳桿菌TCI727係以寄存編號為BCRC 911032寄存於財團法人食品工業發展研究所。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物用以提供一個體有效量的植酸酶。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物用以提升一個體的維生素D含量。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物用以提升骨細胞的鈣含量。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物用以提升一個體的骨鈣素含量。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物用以促進一個體的鈣吸收及/或骨質生成。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727的有效劑量至少為1x10 8CFU/天的副乾酪乳桿菌TCI727。
在一些實施例中，含有副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的促進鈣質吸收的組合物的型式，係為粉末、顆粒、錠劑、液體或膠體。
在一些實施例中，當組合物為粉末的型式，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的劑量係為 100 mg/天。
在一些實施例中，含有副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的促進鈣質吸收的組合物，可製成食品、飲品、營養補充劑或醫藥品。
綜上所述，根據任一實施例的副乾酪乳桿菌及副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的用途，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物能促進鈣質吸收。在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物可藉由植酸酶分解植酸來促進鈣質吸收，藉以避免口服補充的鈣質受日常飲食中的植酸影響。此外，在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物具有提升骨細胞的鈣含量，及提升個體的骨鈣素含量。如此一來，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物適用於提供安全又有效的補鈣益生菌。
為了使本領域具有通常知識者能瞭解本發明的特點，以下就說明書及申請專利範圍中提及術語及用語進行一般性的說明及定義。除非另有說明，否則文中使用的所有技術及科學上的字詞，皆具有本領域技術人員對於本發明所瞭解的通常意義，當有衝突情形時，應以本說明書的定義為準。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生 t檢驗（student's t-test）進行分析。
本文所述的用語「個體」是指人類或非人的哺乳動物，較佳為人類。
本文中所述的用語「有效劑量」係指一物質在一個體引發特定功效所需要的量。如本技術領域熟習技藝者所認知，有效劑量將依給予途徑、賦形劑的使用以及與其它物質共用的可能而變化。
本案發明人自生乳 (牛乳)中篩選出一新穎菌株，並且將此新穎菌株經16S核糖體核糖核酸（16S rRNA）序列分析後依親緣關係鑑定為副乾酪乳桿菌 ( Lactobacillus paracasei)，並且經命名為 Lactobacillus paracaseiTCI727 (後稱副乾酪乳桿菌TCI727)。於此，副乾酪乳桿菌TCI727係以寄存編號BCRC 911032寄存於財團法人食品工業發展研究所，以及以寄存編號DSM 33756寄存於德國微生物菌種保藏中心DSMZ。其中，副乾酪乳桿菌TCI727係具有如SEQ ID NO: 1所示的16S核糖體核糖核酸（16S rRNA）序列。
副乾酪乳桿菌TCI727為革蘭氏陽性桿菌，可於厭氧環境下生長，屬於兼性厭氧乳酸菌。副乾酪乳桿菌TCI727生長的溫度為35℃至37℃，並且可於酸鹼值（pH值）為3至7的環境下生存。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727及/或其代謝產物能促進鈣吸收。其中，促進鈣吸收所指可為提供個體有效量的植酸酶、提升一個體的維生素D含量、改善一個體的維生素D含量、骨細胞的鈣含量、骨鈣素含量、促進一個體的鈣吸收、促進一個體的骨質生成、或其任意組合。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727的代謝產物的製備方式如下所述，例如，可直接使用經歷副乾酪乳桿菌TCI727的代謝循環的含副乾酪乳桿菌TCI727與代謝產物的培養液。
在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727的代謝產物的製備方式如下所述，例如，使用經移除副乾酪乳桿菌TCI727等固體物的含代謝產物的液體。移除固體物可採用任何合宜的操作來施行，只要對培養後所產生的代謝產物的所欲效益沒有不利的影響即可。一般而言，移除固體物係採用物理手段來施行，並且此物理手段可為例如：離心分離、濾膜過濾、沉澱傾析等操作。視需要地，前述物理操作可重複或合併進行，以盡可能去除培養液中的菌體等固體物。
在一些實施例中，含有副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的促進鈣質吸收的組合物，可製成食品、飲品、營養補充劑或醫藥品。
在一些實施例中，含有副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的促進鈣質吸收的食品組合物，其係可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、或特殊營養食品。含有副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的促進鈣質吸收的食品組合物可製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食類、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品，但不以此為限。
在一些實施例中，健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、或特殊營養食品係可以一日一次、一日多次或數日一次等不同頻率食用，端視投予個體的年齡、體重及健康狀況而異。亦可針對投予族群的需要，調整任一實施例的健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品中的副乾酪乳桿菌TCI727/或其代謝產物的含量，例如，調整至每日應服用的量。
例 1 ：副乾酪乳桿菌 TCI727的 篩選與鑑定
(1-1) 篩選
自生乳中取適量樣品於固態乳桿菌MRS培養基 (BD Difco TMLactobacilli MRS Broth， with 1.5體積% agar) 上塗盤並於37℃厭氧環境(即培養環境中氧氣濃度為1體積%)下培養至單一菌落 (single colony)形成。於此，培養16小時後，單一菌落 (single colony) 形成。
(1-2) 鑑定
從 (1-1) 挑取多個單一菌落後，並以乳酸菌的16S核糖體核糖核酸（16S rRNA） 進行各個單一菌落的菌種鑑定。在菌種鑑定的過程中，透過聚合酶連鎖反應（PCR） 得到各個單一菌落的16S核糖體核糖核酸（16S rRNA） 序列 （即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4）。接著，利用美國國家生物技術資訊中心（NCBI）網站，將SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的基因序列分別與其他乳桿菌菌種的16S rRNA序列進行序列比對後，可知此些單一菌落的16S rRNA序列與其他副乾酪乳桿菌亞種（ Lactobacillus paracasei）的16S rRNA序列的相似性如表1所示。
表1
菌株編號 分離來源 16S rRNA 序列 序列編號 相似性(Per. Ident) 比對的副乾酪乳桿菌菌種 (NCBI accession number)
TCI727 生乳 (牛乳) SEQ ID NO:1 97.05% CP029686.1、 CP026097.1、CP025582.1、AB070609.1、MT505628.1
L1281 生乳 (牛乳) SEQ ID NO:2 98.23%-98.83% MN480476.1、MT886394.1、MN480472.1、MT473696.1
L1282 乳牛糞便 SEQ ID NO:3 99.71%-99.81% MH891696.1、MT463546.1、MT505636.1、MT473302.1、MT463826.1
L1286 人類母乳 SEQ ID NO:4 99.91%-100.00% MT613486.1、MT611749.1、MG551244.1、MF632297.1、ON366855.1、ON366694.1、ON366685.1
其中，分離自生乳且與其他副乾酪乳桿菌亞種 (表1所示「比對的副乾酪乳桿菌菌種」) 的相似度達97.05%的具有SEQ ID NO：1的基因序列的單一菌落即為副乾酪乳桿菌TCI727。並且，將此副乾酪乳桿菌TCI727以寄存編號BCRC 911032寄存於財團法人食品工業發展研究所，以及以寄存編號DSM 33756寄存於德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)。
其中，分離自生乳且與其他副乾酪乳桿菌亞種 (表1所示「比對的副乾酪乳桿菌菌種」) 的相似度達98.23%-98.83%的具有SEQ ID NO：2的基因序列的單一菌落，命名為副乾酪乳桿菌L1281。
其中，分離自乳牛糞便且與其他副乾酪乳桿菌亞種 (表1所示「比對的副乾酪乳桿菌菌種」) 的相似度達99.71%-99.81%的具有SEQ ID NO：3的基因序列的單一菌落，命名為副乾酪乳桿菌L1282。
其中，分離自人類母乳且與其他副乾酪乳桿菌亞種 (表1所示「比對的副乾酪乳桿菌菌種」) 的相似度達99.91%-100.00%的具有SEQ ID NO：4的基因序列的單一菌落，命名為副乾酪乳桿菌L1286。
(1-3) 採用NCBI BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）進行相似性之比對分析： 表2
菌株編號 菌種名稱 菌種序列 亞種編號 相似度
TCI727 Lactobacillus para caseiTCI727 SEQ NO:1 L1281 98.77%
L1282 97.94%
L1286 98.16%
基此，根據表2的比對結果顯示，即使是同樣從生乳分離出來的相同菌種，不同菌株還是會產生不同效果，即使TCI727和副乾酪乳桿菌L1281有高達98.77%的相似度，其仍無法產生相同的效果，如例4之實驗結果說明如後。
例 2 ：個別含有副乾酪乳桿菌 TCI727 / 或 副乾酪乳桿菌 L1281/ 或副乾酪乳桿菌 L1282/ 或副乾酪乳桿菌 L1286 的菌液 的 製備
(2-1) 材料
液態培養基：液態乳桿菌MRS培養基 (BD Difco TMLactobacilli MRS Broth)。
(2-2) 實驗流程
首先，以例1所得的副乾酪乳桿菌TCI727做為目標菌株。
將目標菌株，接種至1L(升)液態乳桿菌MRS培養基中，並調整液態乳桿菌MRS培養基中的目標菌株的菌量，以形成其吸光值  (OD600) 為0.1的初始菌液。
接著，將前述初始菌液於37 ℃厭氧環境下恆溫培養24小時後，以形成副乾酪乳桿菌TCI727菌液 (含有副乾酪乳桿菌TCI727菌株的菌液)。
其中，以例1鑑定所得的副乾酪乳桿菌L1281做為目標菌株，依照上面相同的實驗流程製得副乾酪乳桿菌L1281菌液。
其中，以例1鑑定所得的副乾酪乳桿菌L1282做為目標菌株，依照上面相同的實驗流程製得副乾酪乳桿菌L1282菌液。
其中，以例1鑑定所得的副乾酪乳桿菌L1286做為目標菌株，依照上面相同的實驗流程製得副乾酪乳桿菌L1286菌液。
例 3 ：副乾酪乳桿菌 TCI727 的代謝產物 的製備
將例2所得的副乾酪乳桿菌TCI727菌液以高速離心機 (Thermo Megafuge 16 centrifuge) 設定轉速5,000xg離心20分鐘，以形成去除副乾酪乳桿菌TCI727的菌體的上清液以及含副乾酪乳桿菌TCI727的菌體的沉澱物。
於此，可得到去除菌體的上清液(即副乾酪乳桿菌TCI727的代謝產物)，以及含菌體 (即副乾酪乳桿菌TCI727菌體) 的沉澱物。
例 4 ： 檢測植酸 酶的活性
檢測原理：培養基中的植酸被分解而於培養基觀察到澄清區域 (zones of clearing)，代表相應處的塗佈菌株具有植酸酶活性；反之，培養基維持渾濁態區域，則代表相應處的塗佈菌株無分解植酸的活性。
(4-1) 材料
1.待測樣品：取自例2所獲得的副乾酪乳桿菌TCI727菌液、副乾酪乳桿菌L1281菌液、副乾酪乳桿菌L1282菌液及副乾酪乳桿菌L1286菌液。
2.含有植酸鈉的培養基 (後稱植酸鈉培養基)：其組成份為10% (v/v) 瘤胃液 (rumen fluid，品牌: ELITE-MEDIA)，0.25% 葡萄糖，0.25% 纖維二糖 (Sigma)，0.3% 澱粉 (Sigma)，1.8% (w/v) 洋菜 (BD) 以及1.0% (w/v) 植酸鈉 (sodium phytate, Sigma)。
3. 試劑1：由6.25% (w/v) 鉬酸銨水溶液 (aqueous ammonium molybdate solution)及0.42% 釩酸銨水溶液 (ammonium vanadate solution) 所組成。
(4-2) 實驗流程
1. 分別將來自於例2所製得的副乾酪乳桿菌TCI727菌液、副乾酪乳桿菌L1281菌液、副乾酪乳桿菌L1282菌液及副乾酪乳桿菌L1286菌液，進行菌液濃度標準化至OD600nm = 1.0後，個別塗佈於一個植酸鈉培養基所畫分的四個扇形區域，並於37°C且厭氧環境下培養5天。
2. 接著，將2% (w/v) 氯化鈷水溶液覆蓋植酸鈉培養基表面，並於靜置5分鐘後去除。
3. 接著，再倒入的試劑1，並於室溫環境下靜置5分鐘。
4. 將上述試劑1去除，並觀察植酸鈉培養基是否有澄清區域1出現。
(4-3) 實驗結果
由圖1可得而知，相比於其他三株同菌種 (亦即副乾酪乳桿菌L1281、副乾酪乳桿菌L1282及副乾酪乳桿菌L1286)的扇形區域呈現霧狀不透光的狀態(其表示其上仍有植酸存在)，植酸鈉培養基對應於塗佈有副乾酪乳桿菌TCI727菌液的區域，可見副乾酪乳桿菌TCI727的菌落周圍明顯觀察到植酸已被消除的澄清區域1，因此由檢測結果可得副乾酪乳桿菌TCI727具有植酸酶的活性。
故，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物可藉由植酸酶分解植酸。
例 5 ：檢測 TCI727 產生維生素 D3 的能力
實驗目的：已知鈣的主動運輸必須藉由維生素D (Vitamin D) 的調節，因此為了測試本發明的副乾酪乳桿菌TCI727產生維生素D3的能力，於此利用ELISA套組檢測例3所得的副乾酪乳桿菌TCI727的上清液中維生素D3含量。
(5-1) 維生素D3 (VD3) ELISA套組檢測
材料 維生素D3 ELISA檢測套組 (購自Cloud-clone corp；Cat. CEA920Ge)，套組內含有以下溶液：標準液（Standard）、標準稀釋劑（Standard diluent）、檢測試劑A（Detection reagent A）、檢測試劑B（Detection reagent B）、分析稀釋劑A（Assay diluent A）、分析稀釋劑B（Assay diluent B）、試劑稀釋劑 (Reagent diluent)、TMB液（TMB substrate）、終止液 (Stop solution)、清洗液 (Wash buffer)：原液為濃縮液 (30X)。
實驗前準備
1. 標準序列稀釋液的製備：以 1 ml的標準稀釋劑回溶標準液，置於室溫環境 10 分鐘使其充分溶解，輕輕搖晃 (勿起泡)，回溶標準液最終達濃度為 200 ng/ml。取50 μl回溶後之標準液加入含有950 μl標準稀釋劑的1.5 ml 微量離心管，製成最終濃度為1000 pg/ml，待稀釋用。準備 6個新的 1.5 ml 微量離心管，個別加入等體積(100 μl) 的標準稀釋劑，接著在第一管微量離心管加入 100 μl 的回溶標準液，混和均勻後再從第一管取 100 μl 至第二管，依序稀釋至第6管，最後得到濃度為500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml、31.25 pg/ml及15.625 pg/ml的標準序列稀釋液。此外，空白組(Blank)為僅含有標準稀釋劑 (0 ng/ml)。
2. 第一空白組的製備：其製備流程與標準序列稀釋液的製備方式相同。
3. 檢測試劑A操作溶液、檢測試劑B操作溶液、1X 清洗溶液、TMB液參照使用說明書中配置步驟。
4. 1X DPBS:將 10X DPBS(購自 Gibco；Cat. 14200-075) 以滅菌後的 ddH2O 稀釋 10 倍，pH 7.0-7.2。
5. 分析樣品：取自例3所獲得的副乾酪乳桿菌TCI727的上清液，以及取自(5-1)所獲得的第一空白組。將副乾酪乳桿菌TCI727的上清液以及第一空白組進行適當的濃度稀釋 (以使分析樣品的濃度落在標準曲線的線性範圍內)，其中以1x DPBS 在一定比例下分別對第一空白組及副乾酪乳桿菌TCI727的上清液進行稀釋。其中稀釋後的副乾酪乳桿菌TCI727的上清液以製得實驗組（不含細胞）。其中稀釋後的第一空白組以製得空白組（不含細胞）。空白組和實驗組分別用於後續的維生素D3檢測步驟中。
以下簡述維生素D3檢測步驟，詳細操作步驟可參照維生素D3檢測試劑套組內所附的使用說明書執行。
實驗流程
1. 將 50 μl/well 的標準序列稀釋液（如上述多個濃度）、空白組以及實驗組加入96孔盤 (其已預塗專一性抗維生素D3的單株抗體且是隨時可使用的，包含在維生素D3檢測試劑套組中），再立即加入 50 μl/孔的檢測試劑A操作溶液，並且將二液輕搖混合後，於37℃下反應 1 小時以形成已作用液體。
2. 抽吸孔盤中已作用液體，再加入 350 μl/孔的1X 清洗溶液，然後靜置 1-2 分鐘。於靜置後，將孔盤倒置在紙巾上，以盡量移除孔內所有液體。
3. 接著，加入 100 μl/孔的檢測試劑B操作溶液至各孔中，並於37℃下反應 30 分鐘。
4. 進行如同步驟2所述的操作過程共 5 次。
5. 加入 90 μl/孔的TMB液至各孔中，並於 37℃下暗處反應 10 分鐘。其中，此步驟需避光，且反應時間不可超過 30 分鐘。
6. 加入 50 μl/孔的終止液至各孔中，並輕拍孔盤使其充分混和(變色)。
7. 最後，以分光光度計 (Thermo Fisher Scientific‎)量測各孔在O.D.450奈米的吸光度，並將各孔的吸光度與標準序列稀釋液的吸光度比較，以求出分析樣品（各組別上清液）的維生素D3濃度。
(5-2) 實驗結果
請參閱圖2。空白組所測得的維生素D3含量為17.49 pg/ml，實驗組所測得的維生素D3含量為527.73 pg/ml。換言之，相比於空白組，經副乾酪乳桿菌TCI727的上清液處理的實驗組，維生素D3含量明顯提升，為空白組的30倍 (***：與空白組比較具有顯著差( p＜0.001))。
由此可知，當副乾酪乳桿菌TCI727可透過自生合成維生素D3，並明顯提升其上清液維生素D3含量，而維生素D3經文獻證實有助調節鈣離子運輸蛋白的生成及提升鈣離子幫浦的活性，從而促進腸道細胞的鈣吸收。
例 6 ：檢測 提升骨質鈣含量的能力
(6-1) 材料
1. 細胞株：小鼠骨髓基質細胞株OP9 (bone marrow stromal cell，後稱OP9細胞)，其係購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC ®) 的OP9細胞株(ATCC RCRL-2749 TM)。
2. 細胞培養基：包含90% MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，產品編號Cat.12000-022)、 20%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，購自Gibco， Cat.10437-028)及1%的青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco， Cat.15240-062)。
3. 分化培養基：包含90% DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium，購自Gibco，Cat.12100-038) 添加額外成分使其含有10% FBS (fetal bovine Serum，購自Gibco，10438-026)及1%青黴素-鏈黴素(購自Gibco，Cat.15140122)、50 μM抗壞血酸 (ascorbic acid，購自Sigma)、10 -7M迪皮質醇 (dexamethasome，購自Sigma)、及10 mM β-甘油 (β-glycerol，購自Sigma)。
4. 測試樣品：取自於例3所製得的副乾酪乳桿菌TCI727的上清液。
5. 染劑：茜素紅S 染劑(Alizarin Red S，購自Sigma)。
6. 4%甲醛(Formaldehyde)：購自景明(ECHO)，產品編號Cat.119690010。
7. 磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)：購自Gibco，產品編號10437-028。
8. ddH 2O。
9. CPC緩衝液：含有10 vol% Cetylpyridinium chloride (CPC) 的磷酸鈉溶液，其中磷酸鈉的濃度為10 mM。
(6-2) 實驗流程
誘發為硬骨細胞 (osteocyte)
1. 取2×10 4個OP9細胞至每孔含有500μL的細胞培養基的24孔細胞培養盤中，於5 體積%二氧化碳濃度、溫度37 ℃的恆溫箱中培養隔夜。接著，將前述細胞培養基更換為新鮮的分化培養基。
2. 接續培養7天，其中每3天更換一次新鮮的分化培養基。
3. 觀察細胞型態，確認OP9細胞已分化為硬骨細胞後，將硬骨細胞分為空白控制組(mock)及實驗組，並接續培養7天且其中每3天更換一次新鮮的分化培養基。其中，實驗組的分化培養基含有測試樣品，測試樣品為例3所獲得的副乾酪乳桿菌TCI727的上清液。空白控制組(mock) 則不另外加入任何測試樣品，為單純的分化培養基。
4. 完成前述7天的培養後，接續茜素紅S染劑 (Alizarin Red S)2染色。
茜素紅S染劑 (Alizarin Red S) 2染色以確認鈣沉澱
1. 小心地抽吸各孔中的分化培養基，並以PBS溶液沖洗硬骨細胞。
2. 於小心地抽吸PBS溶液後，於各孔加入4%甲醛以固定硬骨細胞10分鐘。
3. 以ddH 2O沖洗掉4%甲醛。
4. 接續製備染劑茜素紅S溶液，取2 g的茜素紅S粉末溶於100 ml的ddH 2O並以孔徑0.22 μm濾膜過濾後以形成過濾後茜素紅S溶液。取100-200 μL的過濾後茜素紅S溶液加入至各孔中，並染色1分鐘。
5. 小心地抽吸各孔中的過濾後茜素紅S溶液，並以ddH 2O沖洗以脫色。其中，於此步驟獲得染色樣品。
6. 接著，置於顯微鏡下以觀察染色樣品中的硬骨細胞的鈣沉澱，其中對應於茜素紅S染劑2染色的地方，即為鈣沉澱。
7. 加入200 μL CPC緩衝液至染色樣品中，並將其放置於擺蕩機上且輕輕擺蕩1個小時以獲得含有CPC緩衝液的染色樣品。
8. 分別自各組別的含有CPC緩衝液的染色樣品取出100 μL至96孔盤，並於O.D. 550奈米的吸光度來定量分析硬骨細胞中的鈣含量。
(6-3) 實驗結果
請參閱圖3A。在顯微鏡下觀察個別空白控制組(mock)及實驗組的鈣沉澱結果，由硬骨細胞染色結果圖3A顯示，相比於空白控制組，在實驗組所觀察到的茜素紅S染劑2 (紅色染劑) 染色的總面積，明顯多於空白控制組。
經由在O.D. 550奈米的吸光度的檢測下，量化統計後的相對骨質鈣含量的結果請參閱圖3B。空白控制組為未經副乾酪乳桿菌TCI727的上清液處理，也就是指空白控制組中的硬骨細胞在正常的生理代謝情況下，設定其所能產生的鈣沉澱為100%。而實驗組的硬骨細胞在經過副乾酪乳桿菌TCI727的上清液的處理歷時7天後，其相對於空白控制組所產生的鈣沉澱含量為137.2% (*：與空白控制組比較具有顯著差 ( p＜0.05))。可得而知，副乾酪乳桿菌TCI727的上清液在歷時7天內即可明顯提升硬骨細胞的鈣含量。
例 7 ： 人體試驗
為了評估副乾酪乳桿菌TCI727樣品的促進個體鈣吸收的能力，以及進一步評估其對於個體骨質保健的能力，於此，進行人體試驗以確認服用副乾酪乳桿菌TCI727菌體對於個體促進鈣吸收及骨質生成的影響。
試驗設計
分為控制組及實驗組，受試者共6人，其中各組別的受試者人數為三位。其中，各組別的受試者本身條件包括：骨質疏鬆風險高者 (停經婦女及/或年齡大於60歲)、曾經檢測過且被醫生判定骨密度偏低者或常喝咖啡者。
控制組：受試者每日服用一次測試樣品，連續服用 4 週，並且，於試驗前（即未開始服用測試樣品，並視為第0週）及試驗後(即連續服用測試樣品4週後，並視為第4週)分別進行試驗前後的血液中鈣含量及血液中骨鈣素含量檢測。其中，控制組中的受試者服用的測試樣品，係為單純的鈣片補充組。其中，前述鈣片 (市售) 係為磷酸鈣加上檸檬酸鈣，劑量為 500 mg/天。 實驗組：受試者每日服用一次測試樣品，連續服用 4 週，並且，於試驗前（即未開始服用測試樣品，並視為第0週）及試驗後(即連續服用測試樣品4週後，並視為第4週)分別進行試驗前後的血液中鈣含量及血液中骨鈣素含量檢測。其中，實驗組中的受試者服用的測試樣品，係為鈣片搭配副乾酪乳桿菌TCI727菌體(活菌菌粉)的合併服用。其中，前述鈣片 (市售) 係為磷酸鈣加上檸檬酸鈣，劑量為 500 mg/天。其中，副乾酪乳桿菌TCI727菌體 (TCI727促鈣吸收菌，以組合物的形式) 的劑量為50 mg/天。其中，前述副乾酪乳桿菌TCI727菌體係取自例3所獲得的。
其中，血液中鈣含量及血液中骨鈣素含量檢測皆是以靜脈採血方式收集血液檢體，並將血液檢體送至檢驗所（立人醫事檢驗所）測定血液中鈣含量及骨鈣素含量。
7-1 ：副乾酪乳桿菌 TCI727 促進個體鈣吸收的能力，從而提升個體血液中維生素 D 濃度
檢測結果
請參閱圖4A。在控制組中，試驗前 (即圖4A第0週)，3位受試者的平均血液中維生素D濃度為21.8 ng/mL，而在試驗後（即圖4A第4週），3位受試者的平均血液中維生素D濃度為22.2 ng/mL。換言之，控制組中的受試者在測試樣品係為單純的鈣片補充組的條件下，經過每日服用一次前述測試樣品，且連續服用 4 週後，平均血液中維生素D濃度僅增加1.8 %。
相對地，在實驗組中，試驗前 (即圖4A第0週)，3位受試者的平均血液中維生素D濃度為24.1 ng/mL，而在試驗後（即圖4A第4週），3位受試者的平均血液中維生素D濃度為25.6 ng/mL。換言之，實驗組中的受試者在測試樣品係為鈣片搭配副乾酪乳桿菌TCI727菌體的合併服用的條件下，經過每日服用一次前述測試樣品，且連續服用 4 週後，受試者平均血液中維生素D濃度大幅增加6.2 %。基此，副乾酪乳桿菌TCI727可透過自生維生素D以幫助個體對於鈣質的吸收，從而提升個體血液中維生素D濃度及強化骨骼。
7-2 ：副乾酪乳桿菌 TCI727 提升個體血液中骨鈣素濃度，從而促進個體骨質生成的能力
研究顯示，骨鈣素 (Osteocalcin) 主要由造骨細胞 (osteoblasts) 所生成，其含量與骨質的生成具有正相關性，因而骨鈣素 (Osteocalcin)可做為骨質生成的生物性指標。
檢測結果
請參閱圖4B。在控制組中，試驗前 (即圖4B第0週)，3位受試者的平均血液中骨鈣素濃度為17.5 %，而在試驗後（即圖4B第4週），3位受試者的平均血液中骨鈣素濃度為17.9 %。換言之，控制組中的受試者在測試樣品係為單純的鈣片補充組的條件下，經過每日服用一次前述測試樣品，且連續服用 4 週後，平均血液中骨鈣素濃度僅增加2.3%。
相對地，在實驗組中，試驗前 (即圖4B第0週)，3位受試者的平均血液中骨鈣素濃度為16.5 %，而在試驗後（即圖4B第4週），3位受試者的平均血液中骨鈣素濃度為18.2 %。換言之，實驗組中的受試者在測試樣品係為鈣片搭配副乾酪乳桿菌TCI727菌體的合併服用的條件下，經過每日服用一次前述測試樣品，且連續服用 4 週後，平均血液中骨鈣素濃度大幅增加10.3 %。基此，驗證了鈣片搭配副乾酪乳桿菌TCI727菌體(活菌菌粉)的合併服用的情況下可促進骨質生成，且其效果優於單純鈣片補充組。
基此，人體試驗結果驗證了副乾酪乳桿菌TCI727 (TCI727促鈣吸收菌) 對於骨質保健的能力。
綜上所述，根據任一實施例的副乾酪乳桿菌及副乾酪乳桿菌 TCI727或其代謝產物的用途，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物能促進鈣質吸收。在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物可藉由植酸酶分解植酸來促進鈣質吸收，藉以避免口服補充的鈣質受日常飲食中的植酸影響。在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物具有提升腸道細胞的維生素D3含量。此外，在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物具有提升骨細胞的鈣含量。在一些實施例中，副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物具有提升個體的維生素D濃度及骨鈣素含量。副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物可用於製備促進鈣質吸收的組合物，其中組合物係為粉末、顆粒、錠劑、液體或膠囊的劑型。含有副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物的促進鈣質吸收的組合物可製成食品、飲品、營養補充劑或醫藥品，其中組合物藉由口服方式給予一個體。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神所作些許的更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
1:澄清區域 2:茜素紅S染劑
[圖1]是副乾酪乳桿菌TCI727、L1281、L1282及L1286於植酸鈉培養基進行植酸酶的活性檢測結果照片圖； [圖2]是圖1所示的副乾酪乳桿菌TCI727的維生素D3含量的柱狀圖； [圖3A]是細胞實驗中茜素紅S染劑 (Alizarin Red S)染色以觀察鈣沉澱的細胞鈣沉澱染色結果圖； [圖3B]是細胞實驗中，基於圖3A的細胞鈣沉澱染色結果圖，進一步量化統計後所得的相對骨質鈣含量的柱狀圖； [圖4A]是人體試驗中，第0週及第4週檢測血液中維生素D含量的柱狀圖；及 [圖4B]是人體試驗中，第0週及第4週檢測血液中骨鈣素含量的柱狀圖。
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Claims (10)

  1. 一種副乾酪乳桿菌( Lactobacillus paracasei) TCI727，其中該副乾酪乳桿菌TCI727係以寄存編號BCRC 911032寄存於財團法人食品工業發展研究所。
  2. 如請求項1所述之副乾酪乳桿菌TCI727，其中該副乾酪乳桿菌TCI727包含SEQ ID NO:1的一核苷酸序列。
  3. 如請求項1所述之副乾酪乳桿菌TCI727，其中該副乾酪乳桿菌TCI727具有植酸酶。
  4. 一種如請求項1所述之副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物用於製備促進鈣質吸收之組合物的用途。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物係用以提供一個體有效量的植酸酶。
  6. 如請求項4所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物係用以提升一個體之維生素D含量。
  7. 如請求項4所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物係用以提升骨細胞之鈣含量。
  8. 如請求項4所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌TCI727或其代謝產物係用以促進一個體之鈣吸收及/或骨質生成。
  9. 如請求項4所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌TCI727之有效劑量至少為1x10 8CFU/天的副乾酪乳桿菌TCI727。
  10. 如請求項4所述之用途，其中該組合物的劑型為粉末、顆粒、錠劑、液體或膠體。
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