CN116875515B

CN116875515B - 改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌gf027及其应用

Info

Publication number: CN116875515B
Application number: CN202311142064.0A
Authority: CN
Inventors: 郭芳先; 韩清波; 刘瑞峰; 李华文; 王震; 马乐辉; 高国久; 陈艺; 李云旭
Original assignee: Tianjin Xiaowei Biotechnology Co ltd; Weifang Junwei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Xiaowei Biotechnology Co ltd; Weifang Junwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-09-06
Filing date: 2023-09-06
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2043-09-06
Also published as: CN116875515A

Abstract

本发明公开了改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌GF027及其应用，涉及微生物技术领域。副干酪乳杆菌GF027保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22831，保藏时间为2021年07月06日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。副干酪乳杆菌GF027的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用上述的副干酪乳杆菌GF027及其应用，可以帮助提高记忆、改善和提高儿童的生长发育，试验表明副干酪乳杆菌GF027可以提高记忆力、促进机体身高、腿骨的生长，还能增加血清中的IGF‑1水平，对儿童的生长发育有促进作用。

Description

改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌GF027及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌GF027及其应用。

背景技术

骨骼健康是指整个骨骼系统的健康，包括骨、软骨、关节、肌腱、韧带等。骨骼在人的一生中不断地通过细胞机制进行着骨的重塑和再造，新生骨形成，老化、受损和无用的骨被溶解吸收，钙作为构成人体骨骼的重要组成成分参与整个过程。儿童少年正处于生长发育旺盛阶段，也是骨骼发育关键时期，该时期的钙营养对人体最大峰值骨量的形成至关重要。

儿童时期体格发育快速增加，钙的吸收率高达75％，生长发育到达高骨量峰值，需要较高的钙摄入，骨形成要大于骨溶解，钙摄入要大于钙排出，钙代谢处于正平衡。青春期是骨量形成的关键阶段，成人骨量的50％是在该时期获得，该阶段钙摄入不足可导致生长发育迟缓、骨软化、骨骼变形，严重缺乏者可导致佝偻病、“O”或“X”型腿、肋骨串珠、鸡胸等，并且钙摄入不足易患龋齿等，从而影响牙齿质量。因此儿童时期补钙必不可少。本发明提供了可以改善提高儿童生长的副干酪乳杆菌GF027，来促进成骨和骨代谢，从而改善和提高儿童的生长。

另外，儿童生长发育过程中智力发育也不能忽视，本发明中的副干酪乳杆菌GF027，可以辅助提高儿童的记忆。

发明内容

本发明的目的是提供改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌GF027及其应用，可以改善和提高儿童的生长发育，辅助提高记忆，试验表明副干酪乳杆菌GF027可以提高记忆力、促进机体身高、腿骨的生长，还能增加血清中的IGF-1水平，对儿童的生长发育有促进作用。

为实现上述目的，本发明提供了副干酪乳杆菌GF027，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22831，保藏时间为2021年07月06日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

优选的，所述副干酪乳杆菌GF027的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述的副干酪乳杆菌GF027在改善和提高儿童生长中的应用。

本发明还提供了上述的副干酪乳杆菌GF027在辅助提高记忆中的应用。

优选的，用于制备食品、保健食品、膳食补充剂或药品。

优选的，所述食品包括发酵品和菌粉制剂，药品包括片剂或粉剂。

优选的，菌粉制剂中活菌数在5.0×10¹¹~8×10¹¹CFU/g。

本发明所述的改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌GF027及其应用的优点和积极效果是：

1、本发明中的副干酪乳杆菌GF027促进儿童生长发育，辅助提高记忆力。

2、本发明中的副干酪乳杆菌GF027可以促进机体身高、腿骨的生长，还能增加血清中的IGF-1水平，从而改善和提高儿童的生长。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明实施例1中副干酪乳杆菌GF027菌株的形态学特征图；

图2为本发明实施例3中副干酪乳杆菌GF027菌株有机氮源的筛选结果图；

图3为本发明实施例5中小鼠服用副干酪乳杆菌GF027菌粉后，各组小鼠体长结果图；

图4为本发明实施例5中小鼠服用副干酪乳杆菌GF027菌粉后，各组小鼠腿骨长度结果图；

图5为本发明实施例5中小鼠服用副干酪乳杆菌GF027菌粉后，各组小鼠血清中的IGF-1水平结果图；

图6为本发明实施例6中小鼠服用副干酪乳杆菌GF027后，小鼠钙表现吸收率。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明实施例中所需的实验材料、试剂等均常规市购所得。

副干酪乳杆菌GF027，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22831，分类命名副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，保藏时间为2021年07月06日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1 副干酪乳杆菌GF027菌株的鉴定

①形态学特征

本发明提供的菌株是从山西河曲酸浆中分离得到的，在MRS培养基中37℃培养48h，菌落为白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐（如图1所示）。

②生理生化特征

副干酪乳杆菌GF027菌株的生理生化特征如表1所示。

表1 GF027菌株的VITEKANC鉴定卡

符号说明：“+”，阳性；“w”，弱阳性；“-”，阴性。

③生物学鉴定

对GF027菌株的16SrDNA基因进行测序，与以NCBI数据库为基源的专业数据库进行序列比对，确定GF027菌株为副干酪乳杆菌，拉丁文名称为Lactobacillus paracasei。GF027的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示：GAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAACGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTTTTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGCAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTT。

实施例2 副干酪乳杆菌GF027的体外耐受性实验

取0.5mL菌悬液与4.5mL的人工胃液混合（菌悬液终浓度为10⁷CFU/mL），于37℃培养箱中静置培养，分别于2h和4h后取样，稀释涂布平板后37℃厌氧培养24h，测定菌落数，以未经人工胃液处理的菌悬液作为对照并计算存活率；

取0.5mL菌悬液与4.5 mL的人工肠液混合（菌悬液终浓度为10⁷CFU/mL），于37℃培养箱中静置培养，分别于2h和4h后取样，稀释涂布平板后37℃厌氧培养24h，测定菌落数，以未经人工肠液处理的菌悬液作为对照并计算存活率，其中，副干酪乳杆菌GF027耐肠液研究结果如表3所示。

表2 副干酪乳杆菌GF027耐酸性及耐人工肠液研究结果

注：未经人工胃液或人工肠液处理的菌落数对8.27×10⁷CFU/mL。

由表2实验结果可看出，副干酪乳杆菌GF027在人工胃液处理4h后，存活率仍能保持在90%以上，说明其耐酸性很好，适合在胃中生存定植；在人工肠液中，由于胰蛋白酶作用，副干酪乳杆菌GF027略有损失，但存活率为99%以上，说明副干酪乳杆菌GF027对人工肠液具有较好的耐受性，因此能够在胆肠中定植存活。综上所述，副干酪乳杆菌GF027对人工胃液和人工肠液具有良好的耐受性，适合在胃肠道中生存。

实施例3 副干酪乳杆菌GF027菌粉的制备

1、副干酪乳杆菌GF027培养基筛选

副干酪乳杆菌GF027采用碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚异麦芽糖、甘露糖、阿拉伯糖、海藻糖、赤藓糖醇、菊粉、木糖醇。以MRS中除去碳源，其它成分不变，碳源添加量为2%，通过添加不同碳源，以3%接种37℃培养18h后，检测活菌计数，其结果如表3所示：

表3

；

由表3可知：副干酪乳杆菌GF027能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚异麦芽糖、甘露糖、海藻糖，不能利用阿拉伯糖、赤藓糖醇、菊粉和木糖醇。鉴于葡萄糖与乳糖、蔗糖、低聚异麦芽糖、甘露糖、海藻糖的商业价格相差较大，本研究选用葡萄糖作为副干酪乳杆菌的生长碳源。

副干酪乳杆菌GF027氮源原料：酵母浸粉902、番茄粉、胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、玉米浆粉、脱脂乳、鱼蛋白胨。以MRS中除去碳源，其他成分不变，氮源添加量为2%，以3%接种37℃培养18h后，检测活菌计数。其结果如表4所示：

表4

；

由表4可知：副干酪乳杆菌GF027在有机氮源：酵母浸粉902、胰蛋白胨、牛肉浸粉和玉米浆中生长良好，繁殖能力快，这四种氮源可作为副干酪乳杆菌GF027的生长氮源。

副干酪乳杆菌GF027采用牛肉浸粉（5、10、15）、酵母浸粉902（10、15、20）、胰蛋白胨（10、15、20）、玉米浆粉（10、15、20）每升含量进行正交试验，葡萄糖和无机盐含量不变，结果如图2所示。

由图2可知：副干酪乳杆菌GF027发酵过程中，有机氮源合适的添加比例分别为牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉902 10g/L、胰蛋白胨10g/L、玉米浆粉15g/L。

副干酪乳杆菌GF027发酵培养基为：葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉90210g/L、胰蛋白胨10g/L、玉米浆粉15g/L，乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L。

2、副干酪乳杆菌GF027菌粉制备

将副干酪乳杆菌GF027在MRS液体培养基中活化两代后，按2%~4%接种量接入上述配方液体培养基中，置于37℃下恒温扩大培养18h；将上述活化并扩大培养的种子液，在4℃环境中，8000rpm离心20min，弃去上清收集菌体；在水溶液中分别添加脱脂乳粉5%~20%、海藻糖5%~25%、蔗糖1%~10%，灭菌，制成冻干保护剂；将菌泥和冻干保护剂充分混匀后预冻3h后进行冷冻干燥，冷阱温度为-50℃，冷冻干燥46~50h。收集冻干好菌粉，进行活菌计数，菌粉活菌数在5.0×10¹¹~8×10¹¹CFU/g。

实施例4副干酪乳杆菌GF027辅助提高记忆的研究

选取4周断乳昆明小鼠（18-20g），雄性，120只，每1组10只，分为三组对照组，三组低剂量组，三组中剂量组，三组高剂量组，分别用于小鼠跳台实验、避暗实验、水迷宫实验。

对照组正常饮食同时灌胃0.2mL无菌水，实验组正常饮食同时灌胃0.2ml的副干酪乳杆菌GF027菌液，其中菌液灌胃含量：低剂量组为2×10⁸cfu/天，中剂量组为4×10⁸cfu/天，高剂量组为1.2×10⁹cfu/天，为人体（60kg，每日食用1200亿）推荐剂量的5、10和30倍，连续给样四周后，对小鼠分别进行跳台实验、避暗实验、水迷宫实验，同时测量各组小鼠体重和身长。

1、小鼠跳台实验

末次给样后，次日开始训练。将动物放入反应箱内适应环境3min，然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通以36v 的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台（绝缘体），以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5min 内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩。24 h或48h 后进行重测验，将小鼠放在平台上，记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各鼠3min 内电击次数和受电击的动物数总数，同时计算出现错误反应的动物的百分率（受电击的动物数占该组动物总数的百分率），结果如表5所示。停止训练5天后进行记忆消退实验（方法同重测验），结果如表6所示。

表5

；

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

表6

；

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

由表5和表6可知：断乳小鼠在食用副干酪乳杆菌GF027四周后，进行跳台实验及记忆消退实验，实验三组与对照组相比有差异性，高剂量组差异性显著。

2、小鼠避暗实验

末次给样后，次日开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，取出小鼠，记录每鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间，此即潜伏期，训练5min，并记录5min内电击次数。24h或48h后重作测验，记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min 内的电击次数，并计算5min 内进入暗室（错误反应）的动物百分率，结果如表7所示。停止训练5天后进行记忆消退实验（方法同重测验），结果如表8所示。

表7

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

表8

；

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

由表7和表8可知：在避暗实验中，小鼠通过不同剂量的副干酪乳杆菌GF027喂食后，与对照相比出现差异性，实验三组中，中剂量组和高剂量组出现差异性，其中高剂量组差异性显著。

3、小鼠水迷宫实验

末次给样后，次日开始训练，训练期间继续给样，每天一次，迷宫泳道水深15cm，水温25±1℃，时间限定为2min，在2min内未到达重点的动物均记为2min，实验时，将动物放于泳道的起点处，同时按下启动键，记录动物到达中的所需的时间和错误次数，结果如表9所示。停止训练5天后进行记忆消退实验（方法同重测验），结果如表10所示。

表9

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

表10

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

由表9和表10可知：在水迷宫实验中，小鼠到达终点时间和错误次数有差异性。

实施例5副干酪乳杆菌GF027促进生长发育的研究

对实施例4中所有小鼠进行身长测量，并使用血清分离管从通过心脏穿刺收集的血液样本中制备血清，并使用小鼠胰岛素样生长因子1(IGF-1）ELISA试剂盒检测IGF-1，解剖小鼠腿骨进行对比，结果如图3、图4和图5所示。

由图3可知：小鼠在灌胃四周不同剂量副干酪乳杆菌GF027菌粉后，体长增长略有不同，实验三组均比对照组略高。

由图4可知：小鼠在灌胃四周不同剂量副干酪乳杆菌GF027菌粉后，腿骨增长略有不同，实验三组均比对照组略高，高剂量组差异性显著。

由图5可知：小鼠在灌胃四周不同剂量副干酪乳杆菌GF027菌粉后，血清中的IGF-1水平增加，实验三组均表现出差异性，且高剂量组差异性显著。

实施例6副干酪乳杆菌GF027促进钙吸收的研究

选取60只出生4周左右的雄性断乳Wistar大鼠，经适应期一周后，禁食12小时，选取50只体重范围为60~75g的Wistar大鼠，分笼饲养；

将上述50只Wistar大鼠按体重随机分为五组，每组10只；五组分别为低钙对照组、碳酸钙对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。

试验期间Wistar大鼠饲喂基础饲料、饮用去离子水，其中基础饲料按《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》中“十、有助于改善骨密度检验方法”中记载的方法配置（表11）。

表11（Ca²⁺计，调整Ca²⁺为150mg/100g饲料）

；

其中①需高压处理后用。

②混合盐：每kg混合盐中各组份含量：KH₂PO₄，501.4g；NaCl，74.0g；MgCO₃，50.2g；乳酸亚铁，5.4g；乳酸锌，4.16g；MnCO₃，3.5g；CuSO₄·5H₂O，0.605g；Na₂SeO₃，6.6mg；KI，7.76mg；Cr₃Cl·6H₂O，0.292g；加蔗糖到1kg。

③混合维生素：每kg混合维生素中各组份含量：维生素A，400,000IU；维生素D₃，100,000IU；维生素E，500IU；维生素K，5mg；维生素B₁，600mg；维生素B₂，600mg；维生素B₆，700mg；维生素B₁₂，1mg；尼克酸，3g；叶酸，200mg；泛酸钙，1.6g；生物素，20mg；加蔗糖到1kg。

④可根据需用量调节淀粉用量。

低剂量组、中剂量组和高剂量组灌胃所用的副干酪乳杆菌GF027为冻干菌粉，其活菌数为6.0×10¹¹CFU/g，低、中、高剂量组分别灌胃菌浓度为5.0×10⁸CFU/mL、2.5×10⁹CFU/mL、5.0×10⁹CFU/mL的菌悬液，灌胃剂量均为1ml/天。不同组别喂食饲料的种类及灌胃剂量如表12所示，其中，中剂量组为人体推荐量的5倍。

表12 不同组别的喂食饲料种类及灌胃剂量

；

将样品溶于于1mL生理盐水中，每天灌胃给药1次，连续6周，期间记录饲料摄入量，收集粪便冻干称重，测定粪钙量，结果如图6所示。

摄入钙（mg/d）=饲料中钙含量（mg/g）×饲料消费量（g/d）。

粪钙（mg/d）=粪便中钙含量（mg/g）×粪便排出量（g/d）。

钙的表观吸收率（%）=（摄入钙-粪钙）/摄入钙×100%。

由图6可知：低、中、高实验三组对钙吸收有很好的促进作用，相对于对照组和模型组，表现出显著差异性（P＜0.05）。

6周后处死，剥离出右侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重；测定股骨骨密度及骨钙含量，不同组别大鼠的骨重、骨密度和骨钙含量统计结果如表13所示。

表13不同组别大鼠的体重、身长、骨重、骨密度和骨钙含量统计表

注：与低钙组比较：*P<0.05，**P<0.01；与碳酸钙对照组比较：#P<0.05，##P<0.01。

由表13结果可知：本研究中5组大鼠在经过6周喂食试验后，从骨重、骨密度数据分析，喂食副干酪乳杆菌GF027的三个实验组较与低钙对照组相比可极显著提高试验动物的骨重和骨密度，与碳酸钙对照组相比较，中剂量组和高剂量组可极显著提高试验动物的骨重和骨密度；从骨钙含量数据分析，三个实验组与低钙对照组和碳酸钙对照组相比较均可极显著提高试验动物的骨钙含量。依据《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》中记载的有助于改善骨密度功能检验方法及结果判定，可判定该受试物-副干酪乳杆菌GF027具有有助于改善骨密度的作用。

因此，本发明所述的改善记忆和儿童生长的副干酪乳杆菌GF027及其应用，可以促进钙的吸收，改善和提高儿童的生长发育，试验表明副干酪乳杆菌GF027可以提高记忆力、促进机体身高、腿骨的生长，还能增加血清中的IGF-1水平，对儿童的生长发育有促进作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.副干酪乳杆菌GF027，其特征在于：其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22831，保藏时间为2021年07月06日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌GF027，其特征在于：所述副干酪乳杆菌GF027的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌GF027在改善和提高儿童生长中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。

4.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌GF027在辅助提高记忆中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：用于制备食品、保健食品、膳食补充剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述食品包括发酵品和菌粉制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：菌粉制剂中活菌数在5.0×10¹¹~8×10¹¹CFU/g。