CN113604382A - 一株副干酪乳杆菌yt170及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株副干酪乳杆菌YT170及其应用，属于微生物领域。其保藏号为：CGMCC No.22089，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。本发明的菌株是从獭兔粪便中筛选分离得到，该菌株具有高效代谢利用菊粉类低聚糖的能力。本发明还提供了副干酪乳杆菌YT170的相关应用。利用该菌制备的微生态制剂或乳杆菌组合物，可作为饲料及其添加剂、代乳粉等产品广泛应用于动物养殖业中，以降低死亡率，减少抗生素的使用，有助于增加养殖业的经济效益。此外，还适合用于食品、保健品、药品等产品的制备。

Description

一株副干酪乳杆菌YT170及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌及其应用。
背景技术
近年来，由于经济的快速发展、物质生活水平的提高，人们对于动物肉制品的需求量大大提高，为满足市场需求，许多养殖产业逐渐规模化。但规模化养殖的动物，尤其是断奶时期，常常出现腹泻问题，严重影响了养殖业的发展。例如，根据有关兔的疫情统计，在死亡率平均为24%的兔群中，就有75%以上的兔是因腹泻所致。为了提高养殖率，抗生素常被广泛应用于疾病的预防和治疗以及作为抗菌促生长剂，然而长期使用抗生素会导致大量耐药菌株的产生，容易造成食品安全问题。随着经济的迅猛发展，人们的健康意识越来越强，且食品安全问题也引起了各国的高度重视，欧洲以及中国都已经颁布了禁抗令。建立绿色养殖基地，生产高品质、无公害、安全健康的畜禽食品，成为了当今各国的迫切需求。因此，开发绿色抗生素替代品成为了畜禽业研究热点。
乳酸菌具有调控动物肠道微生态平衡、促进营养物质的消化吸收和促进机体健康的作用，可用来降低腹泻率，是公认的理想的抗生素替代品。副干酪乳杆菌是乳酸杆菌属的种群之一，常应用于食品、保健品、药品等生产中，且近年来被农业部允许应用于动物养殖中。但是目前关于副干酪乳杆菌在动物中的应用研究鲜有报道。
本发明提供一株来源于獭兔粪便的具有高效代谢利用菊粉的副干酪乳杆菌YT170，具有益生特性，可与益生元如菊粉结合广泛应用于动物养殖业及其他食品、药品等制造业中。
发明内容
本发明的第一目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)YT170,该菌株是从獭兔粪便中分离得到，其能够高效代谢利用短链和长链菊粉。该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.22089，保藏日期为2021年03月29日。
进一步地，所述副干酪乳杆菌YT170 (CGMCC No.22089 )为革兰氏阳性杆菌，无芽孢。在MRS平板培养基上菌落形态呈乳白色，圆形扁平，中心有白色小点，表面湿润。
更进一步地,本发明提供的副干酪乳杆菌YT170除具有上述生长特征之外，还具有高效代谢长链和短链菊粉的特性，48h内可完全消耗中长链菊粉。
本发明的第二目的在于提供一种微生物菌剂，其包括上述副干酪乳杆菌YT170。
进一步地,该副干酪乳杆菌YT170为活菌，菌体浓度为106~1014CFU/mL。
更进一步地，该液体型微生物菌剂的制备方法包括：取甘油保种菌液划线于MRS平板上活化，37℃恒温培养24 h～48 h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中培养过夜，所得菌液离心、用生理盐水洗涤，菌体沉淀分散于生理盐水得到活菌菌悬液，浓度为106~1014 CFU/mL。
更进一步地，该固体型微生物菌剂的制备方法包括: 将活化好的副干酪乳杆菌YT170加到MRS液体培养基中，37 ℃培养24h～48h，对发酵液进行离心，收集菌体，加入复配保护剂，混合均匀，进行低温喷雾干燥。
更进一步地，低温喷雾干燥进风温度为：80～100℃，出风温度为：40～50℃。
本发明的第三目的在于提供一种微生态制剂，其包括上述微生物菌剂。
进一步地，该微生态制剂可为液体型和固体型。
更进一步地，该固体型微生态制剂可通过包埋法制备。乳酸菌微胶囊包埋技术是一种乳酸菌的保护措施，可以增强菌体对外界不良环境的抵抗力，显著提高菌体的存活率。
本发明的第四目的在于提供一种组合物, 其含有上述微生物菌剂，还可包括一些生理上可接受的赋形剂，该组合物可以是饲料、代乳粉、添加剂、食品、保健品或药品。且该组合物具有调节肠道菌群，维持肠道微生态的平衡，促进机体健康的功能。
进一步地，该组合物还包括益生元。益生元为益生菌的食物，可促进肠道内益生菌的增殖和存活，提供肠道定植能力，起到调节肠道菌群作用，进而发挥益生功效。
更进一步地，该益生元为菊粉。
本发明的第五目的在于提供上述副干酪乳杆菌YT170、微生物菌剂、微生态制剂或组合物在生产饲料、代乳粉、添加剂、药品、保健品或功能性食品中的应用。
进一步地，所述饲料为：粗饲料、青饲料、青贮饲料、能量饲料等。
本发明的第六目的在于提供一种青贮饲料，其通过用副干酪乳杆菌YT170发酵所得。乳酸菌具有较强的产酸能力，其可通过产生大量有机酸的来抑制杂菌（如丁酸菌和腐败菌）的增殖，以减少原料营养物质损失，保证发酵饲料的质量和安全。
进一步地，该青贮原料需富含菊粉，优选地，所述原料包括：菊苣、蒲公英等。
更进一步地，该青贮饲料工艺流程包括：收割、粉碎青贮原料→控制原料水分→加入微生物菌剂→混匀装填→压实密封→质量检测。
更进一步地，原料湿度为65～75%,菌剂中活菌浓度：106～1014 CFU/ml。
再进一步地，其发酵温度为25～37℃，发酵天数为60～90d。
本发明的第七目的在于提供一种代乳粉，代乳粉的使用可解决动物因产仔后死亡、无奶和少奶的问题，满足动物幼仔快速生长发育的营养需要。同时，代乳粉的使用可减少动物母体内物质消耗，有利于提高动物繁殖率和降低养殖成本，对生产实践具有重要意义。
进一步地，上述代乳粉配方为，以重量百分比计，含有：粗脂肪：12%～25%，粗纤维0～3%，蛋白粉10～30%，菌制剂1～5%，氨基酸预混料1%～10%，维生素预混料0～5%，矿物质预混料0～5%，盐0～2%等。
进一步地，粗纤维需富含菊粉。
更进一步地，菌制剂主要活性成分为副干酪乳杆菌YT170，其活菌浓度为106～1014CFU/g。
更进一步地，上述氨基酸预混料需含有蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、半胱氨酸等。
更进一步地，添加菌制剂的温度和冲调温度：不超过50℃，饲喂温度：35℃～45℃。
附图说明
图 1阳性菌株菊粉代谢能力评价结果。注：+和-用来表示bMRS培养基的颜色变化：-（深紫色）、+（浅紫色）、++（浅黄色）、+++（橙黄色）、++++（亮黄色）。
图2为副干酪乳杆菌YT170在菊粉，葡萄糖和无菌水中生长曲线图，图中横坐标为发酵时间，纵坐标为菌液在600 nm测定的OD值。
图3为副干酪乳杆菌YT170发酵葡萄糖和菊粉的pH变化。图中横坐标为发酵时间，纵坐标为发酵液pH值。
图4为薄层色谱分析副干酪乳杆菌YT170在发酵菊粉过程中菊粉组成的动态变化的结果。
图5为副干酪乳杆菌YT170的菌落形态图。
图6为副干酪乳杆菌YT170的细胞形态图。
图7为采用邻接法构建的副干酪乳杆菌YT170及其近缘种16SrRNA序列的系统进化树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。特别需要指出的是，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，下列实施例仅用于说明本发明，本领域技术人员参照本案说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例一：副干酪乳杆菌YT170菌株的筛选与保藏。
无菌条件下取獭兔粪便样品适量于1.5 mL EP管中，加入1 mL MRS液体培养基，于37℃过夜培养、活化。
将培养液充分振荡摇匀，用生理盐水依次进行10倍梯度稀释，得到10-1～10-7的菌源稀释液，选择合适的稀释度，取100μL稀释液均匀涂布于LAMVAB固体培养基平板上，37℃培养24～48 h。
观察并记录菌种特征，用接种环挑取疑似乳酸菌菌落，反复划线分离、并培养，直至菌落纯化。
评价乳酸菌代谢利用菊粉能力：将上述分离纯化的菌株于MRS液体培养基中过夜培养，将过夜培养物按1%（v/v）分别接种于bMRS+菊粉（bMRS中添加1% w/v菊粉）、bMRS+葡萄糖（bMRS中添加1% w/v葡萄糖）和bMRS+H2O（bMRS中添加无菌水），在37°C厌氧培养48 h；其中bMRS中添加了溴钾酚紫钠盐（300 mg/L）作为pH指示剂；菊粉中含有短链低聚果糖（scFOS）。以bMRS+H2O为阴性对照，以bMRS+葡萄糖为阳性对照，根据培养基颜色从紫色变黄的程度来判断乳酸菌对菊粉的代谢利用能力。
将筛选出的能代谢利用含有scFOS的菊粉的阳性乳酸菌接种于bMRS+（不含有scFOS）菊粉（bMRS中添加1% w/v菊粉），在37°C厌氧培养48 h，其中bMRS中添加了溴钾酚紫钠盐（300 mg/L）作为pH指示剂。根据培养基颜色从紫色变黄的程度来判断乳酸菌对菊粉的代谢利用能力。
根据乳酸菌在以菊粉为唯一碳源的培养基上发酵产酸的能力而导致发酵液颜色变黄的程度，从而筛选出一株能高效、特异性代谢利用菊粉的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）YT170。此菌种培养特征如下：在MRS琼脂培养基中长成直径为：1～2mm的乳白色菌落，最佳培养温度：37℃。
所述的副干酪乳杆菌YT170保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC），保藏编号为：CGMCC No. 22089,保藏日期为2021年03月29日。
从图1分析，从獭兔中分离出的能代谢含有scFOS菊粉的乳酸菌共有19株。将其分别接种于不含scFOS的菊粉中发酵48h，根据培养基中pH指示剂颜色从紫色变黄的程度来判断乳酸菌对菊粉的代谢利用能力，如表1所示，其中，仅有YT170可在含有scFOS的菊粉和不含scFOS的菊粉中代谢生长，且发酵48h后，发酵液均变成亮黄色，而其他菌株在不含scFOS的菊粉中无颜色变化。说明仅有YT170能高效代谢利用短链菊粉和长链菊粉。综上可知副干酪乳杆菌YT170是一株能够高效代谢并利用菊粉的乳酸菌。
实施例二：副干酪乳杆菌YT170的菊粉代谢利用特性。
生长曲线和pH测定：将保存的副干酪乳杆菌YT170在MRS平板上划线、37℃培养24～48 h，挑取单菌落于MRS液体培养基中，培养液（1%，v/v）接种于分别含50 mL bMRS+菊粉、bMRS+葡萄糖和bMRS+H2O的无菌离心管中，于37℃培养，分别在1、2、3、4、6、8、10、12、14、15、20、24、48和72 h等14个不同时间点取发酵液用分光光度计通过在波长600 nm（OD600 nm）的光密度来测量乳酸菌生长情况、用酸度计来测定发酵液pH值。
代谢产物的薄层色谱（TLC）分析：利用TLC分析乳杆菌在发酵菊粉过程中菊粉组成的动态变化，将上述0、10、24、36和48 h取样的发酵液12000 rpm离心2 min 取上清液，用毛细管吸取6μL上清液点样于GF254薄层层析板上，并以6μL 1%菊粉和6μL 1%葡萄糖作为对照。展开剂按正丁醇 : 乙酸 : 水=2 : 2 : 1（v/v）的比例配制，点样完成的薄层层析板置于该溶剂中进行展开。显色剂配置：100 mL 丙酮中加入2 g 二苯胺，2 mL 苯胺和10 mL磷酸（wt%=85%）混合得到。最后将展开的薄层层析板用该显色剂喷雾，在105℃下加热10 min显色。
结果分析如下：副干酪乳杆菌YT170在以1%菊粉（inulin）为唯一碳源的培养基中，能够在4～14 h时菌数迅速增加，进入对数期，14 h后进入稳定期，OD值达到最大值，并与在以葡萄糖为碳源的培养基中生长情况接近；同时测定发酵液不同时间点的pH值，发现副干酪乳杆菌YT170在以菊粉为唯一碳源的培养基中，发酵时间14h后，pH就降低至4.6，对比之下，与在含葡萄糖的培养基中发酵pH降低速度和最终值都接近；采用TLC分析YT170在以菊粉为唯一碳源的培养基发酵48 h后的发酵液的组分变化，副干酪乳杆菌YT170在0～10h将菊粉中中等链长的低聚果糖消耗了，并且消耗了一部分聚合度为2～9的低聚果糖；在24h～48 h 完全消耗了中、长链的菊粉，上清液中仅残留少许短链果糖。综述可知，副干酪乳杆菌YT170具有非常高效代谢菊粉的能力，并且既可以代谢利用短链低聚糖组分，又能降解长链菊粉果聚糖。
图2为副干酪乳杆菌YT170在菊粉，葡萄糖和无菌水中生长曲线图，图中横坐标为发酵时间，纵坐标为菌液在600 nm测定的OD值。
图3为副干酪乳杆菌YT170发酵葡萄糖和菊粉的pH变化。图中横坐标为发酵时间，纵坐标为发酵液pH值。
图4为薄层色谱分析副干酪乳杆菌YT170在发酵菊粉过程中菊粉组成的动态变化的结果。
实施例三：菌株的鉴定。
形态学特征： 副干酪乳杆菌YT170的菌落形态如图5所示，其菌落形态呈乳白色，圆形扁平，中心有白色小点，表面湿润。
革兰氏染色：利用革兰氏染色法检测本发明菌株的特征。结果如图6所示,本发明的菌株为革兰氏阳性菌,细胞形态为杆状，无芽孢,为乳杆菌的典型特征。
16S rRNA鉴定：使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒DP302（天根生化科技有限公司，北京，中国）提取乳酸菌基因组DNA。
利用细菌16SrRNA基因通用引物：27F-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R-5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（上海生工生物技术有限公司，上海，中国）进行扩增。PCR反应的总体积为50 μL，其中 1× Taq PCR Master Mix（上海生工生物技术有限公司，上海，中国）25 µL，DNA 1 µL，正向引物1 µL，反向引物1 µL，ddH2O 20 µL。扩增使用T100热循环仪（Bio～Rad，北京，中国）进行，PCR 反应程序为：94℃初始变性4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共35个循环；72℃延伸 10 min。
扩增片段送往成都擎科生物科技有限公司进行测序，获得的序列使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析，建立进化树，如图7所示。
图7系统发育树显示了副干酪乳杆菌YT170的相对位置，由完整16S rDNA序列的邻接法推断得到. 可以看出副干酪乳杆菌YT170和与Lacticaseibacillus paracasei CGMCC 19837（Gen Bank登录号为MW090227:1:67～1485）和Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracaseiT（Gen Bank登录号为D79212.1）亲缘关系最近。
副干酪乳杆菌YT170的16S rRNA基因序列信息已上传NCBI数据库，Gen Bank登录号为MW577649。
实施例四：固体型微生物菌剂的制备方法——喷雾干燥法。
菌种培养与复配：将活化好的副干酪乳杆菌YT170加到MRS液体培养基中，37℃培养 24h，对发酵液进行离心（5000r/min,15min,4℃），弃上清液，收集离心后的菌体，将离心后收集到的菌体加入到复配保护剂：β-环糊精和玉米淀粉中，其中β-环糊精和玉米淀粉的比例为1:3，保护剂与菌体的体积比为 3:1，混合均匀备用。
喷雾干燥：控制进风温度为80～100℃，固形物质量分数为25%，通过调节进料流速来控制出风温度为40～50℃，进行喷雾干燥，得到菌粉，其活菌数为107～1012CFU/ml。
实施例五：副干酪乳杆菌YT170微胶囊包埋技术。
细胞悬浮液的制备：用MRS肉汤培养基培养副干酪乳杆菌YT170，24 h后离心(5000r/min，10 min，4 ℃)；收集YT170菌体，用0.9% 的无菌生理盐水洗涤离心2次，然后用生理盐水重新悬浮菌体，制得1× 1010 CFU /g悬浮液，冰箱4 ℃保存。
微胶囊包埋制备工艺：取 4.00 g 大豆分离蛋白溶于 100 mL 无菌水，60 ℃ 水浴改性 30 min 后冷却至室温。加入1.50 g 海藻酸钠与6.00 g丙三醇， 150 r/min搅拌10min进行复配，加入10 ml菌悬液和菊粉（20g/L）混合物涡旋混合均匀。将其缓慢滴入1.00%氯化钙溶液中，于42℃固定化15～30 min，无菌生理盐水洗涤 3 次，将复配壁材微胶囊加入到1%的明胶溶液150 r/min 搅拌 10 min，使明胶附着均匀，3000 r/min离心 5 min，无菌生理盐水洗涤 3 次，完成微胶囊的制备，于冰箱4℃保存。
实施例六：利用副干酪乳杆菌YT170发酵制备青贮饲料。
步骤如下：将所述副干酪乳杆菌YT170 接种于MRS液体培养基中，37℃培养至菌体浓度达到约1x108 CFU/mL，4500 r/min 离心10 min，收集菌体后用无菌生理盐水洗涤2次，并加入无菌生理盐水制成菌悬液备用。
取新鲜、无霉变的菊苣1kg，用铡刀截至长度2 cm左右再粉碎，控制原料含水量约65%～75%。向其中加入上述1～3ml副干酪乳杆菌YT170菌制剂，均匀混匀。装入聚乙烯袋中，分层压紧，尽量装满（排除里面的空气），用三层保鲜膜密封后扎紧封口，并置于25～37℃发酵60～90d，得到青贮饲料产品。

Claims (16)

1.一种副干酪乳杆菌YT170，其特征在于，所述副干酪乳杆菌YT170保藏号为CGMCCNo.22089，保藏日期为 2021年03月29日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌可以代谢利用菊粉类低聚糖，包括长链和短链菊粉。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，其含有如权利要求1所述的活的副干酪乳杆菌YT170。
4.一种微生态制剂，其特征在于，包括权利要求3所述的微生物菌剂。
优选地，可采用微生物固定化技术，如包埋法进行制备。
5.根据权利要求4所述的包埋法，其特征在于，工艺条件为：以重量百分比计，海藻酸钠2%～2.5%，大豆分离蛋白2%～4%，丙三醇3%～6%，明胶1%，菌制剂5%～10%，菊粉0.1%～2%，CaCl2溶液1.0%～2.5%，菌种固定化温度42℃（+2℃）。
优选地，所述菌制剂的含量为106～1014CFU/ml。
6.一种组合物，其特征在于，其包含如权利要求3所述的一种微生物菌剂，所述菌剂含量为106～1014CFU/ml。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，其包含菊粉类益生元，所述益生元含量为质量浓度0.1%～5%。
8.权利要求1所述的副干酪乳杆菌YT170、权利要求3所述的微生物菌剂、权利要求4所述的微生态制剂或权利要求6所述的组合物在生产饲料、代乳粉、添加剂、药品、保健品、功能性食品中的应用。
9.根据权利要求8所述的饲料，其特征在于，包括粗饲料、青饲料、青贮饲料、能量饲料等。
10.一种青贮饲料，其特征在于，其通过用如权利要求1所述的副干酪乳杆菌YT170发酵所得。
11.根据权利要求10所述的青贮饲料，其特征在于，所述青贮原料需富含菊粉；
优选地，所述原料包括：菊苣、蒲公英等。
优选地，其原料湿度为65～75%。
12.一种如权利要求10所述的青贮饲料，其特征在于，发酵温度为25～37℃，发酵时间为：60～90d。
13.根据权利要求8所述的代乳粉，其特征在于，可用于人和动物。
14.一种动物用代乳粉，其特征在于，以重量百分比计，含有：粗脂肪：12%～25%，粗纤维0～3%，蛋白粉10～30%，菌制剂1～5%，氨基酸预混料1%～10%，维生素预混料0～5%，矿物质预混料0～5%，盐0～2%等。
优选地，粗纤维需富含菊粉。
优选地，菌制剂主要活性成分为副干酪乳杆菌YT170。
优选地，添加菌制剂的温度：不超过50℃，冲调温度：不超过50℃，饲喂温度：35℃～45℃。
15.根据权利要求8所述的添加剂，其特征在于，包括食品添加剂和饲用添加剂。
16.根据权利要求15所述的饲用添加剂，其特征在于，可用于兔及其他动物饮水中。
优选地，所含的副干酪乳杆菌YT170的浓度需大于106CFU/ml。
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