CN109486713B - 一种液态复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液态复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用，制剂包括以下组分及重量份含量：复合乳酸杆菌3‑4.5份、保护剂9‑15份，制剂的pH值为3.9‑5.2；制备时，先制得混合乳酸杆菌种子液，再制得发酵菌液，最后将菌泥加入至保护剂中，混合均匀即可。与现有技术相比，本发明针对液态乳酸菌制剂保存期限相对较短的缺陷，通过在液态复合乳酸杆菌制剂中加入含有能量物质的保护剂供菌体存活，并保持较低的pH，以延缓菌体生长速度，最终达到延长液态复合乳酸杆菌制剂在常温下的保存期限的目的，从而提高其在猪场中的实际应用效果。

Description

一种液态复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，涉及一种液态复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用。

背景技术

目前，抗生素和化学药物等物质在常规养殖中已被大量使用，破坏了动物肠道内菌群平衡，降低动物自身免疫力，同时抗生素产生的耐药性和动物产品中药物残留问题日益引起关注。寻找替代抗生素的安全绿色添加剂是畜牧业生产中亟待解决的问题。

微生态制剂因其无污染、无残留、安全可靠等优点得到人们的重视和利用，是抗生素的理想替代品。在众多微生物添加剂中，乳酸菌制剂是饲用微生物添加剂中应用最广泛、效果较好的一类。乳酸菌制剂能直接补入外源性有益菌，调节动物自身肠道微生态平衡，抑制有害菌，增强基体免疫力，从而能够促进动物的健康成长。乳酸菌制剂能在动物肠道中大量定殖，提高机体对食物的消化和代谢，促进营养物质的吸收和利用；同时，也能抑制致病菌的繁殖，改善肠道内环境，调整机体胃肠道菌群平衡，提高动物健康水平。在猪的养殖过程中，应用乳酸菌制剂可以达到提高日增重、改善料重比、增强机体抗病力、提高成活率、降低腹泻率、提高经济效益的效果。因此，近几年有关乳酸菌制剂及其在养猪方面的应用研究越来越多，越来越深入。

有研究认为，在仔猪刚出生而其胃肠道中尚未形成菌群之前进行人工接种乳酸菌，有利于乳酸菌抢先占领肠道环境，从而降低哺乳仔猪对致病菌的感染机会；仔猪断奶后便开始快速生长发育，由于胃酸、消化酶的分泌不足和肠黏膜损伤等原因，容易因大肠杆菌等致病菌的大量繁殖导致肠道微生态系统的失调，在日粮中添加乳酸菌制剂能有效促进断奶仔猪肠道菌群平衡；同时，日粮中添加乳酸菌还能够提高生长育肥猪的生产性能，并能提高猪肉品质以及降低猪舍恶臭气体；乳酸菌产生的丰富的营养物质可以促进常量及微量元素如钙、铁、锌等的吸收，为母猪提供必需营养物质，从而起到改善母猪生产力、提高胚胎存活率、仔猪初生重的作用；另外，妊娠母猪由于孕酮含量的增加往往会造成肠道蠕动的缓慢，导致便秘，母猪分娩后，也易因泌乳造成猪体内分泌状态变化而导致猪体便秘。乳酸菌能够产生有机酸，促进肠道的蠕动，从而减少母猪的便秘。总体而言，乳酸菌对猪群各个生长阶段均具有优良的生物学功能，应大力投入到现在乃至未来的猪群生长应用中。

乳酸菌制剂按制剂品剂型可分为固体剂型和液体剂型。固体剂型一般是将发酵液或收集的菌体附着于载体上并经过固体发酵、干燥、粉碎、包装而成；液体剂型一般是将发酵液直接应用或与其他功能成分混合复配制成。其中，固体制剂贮存方便、便于运输，且贮存期限长于液态制剂，因此目前市面上的乳酸菌多以固体粉剂形式存在，液体制剂相对较少。但是，固体制剂存在制作工艺复杂，并且在贮存、加工以及与全价料混合后活菌数量会有所减少等缺陷。液态乳酸菌制剂制备工艺简单，使用方便，但其缺点是不便运输，并且常温下贮存期短。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种液态复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，该制剂包括以下组分及重量份含量：复合乳酸杆菌3-4.5份、保护剂9-15份，所述的制剂的pH值为3.9-5.2。

进一步地，所述的复合乳酸杆菌包括以下组分及重量份含量：植物乳杆菌1-1.5份、嗜酸乳杆菌1-1.5份、保加利亚杆菌1-1.5份。

进一步地，该制剂中，所述的复合乳酸杆菌的活菌数≥9.6×10⁷CFU/g。

进一步地，该制剂中，所述的保护剂包括以下组分及重量份含量：葡萄糖1-3份、蛋白胨0.01-0.03份、甘油5-10份、Tween80 0.5-2份、谷氨酸钠1-3份、碳酸钙0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.08-0.1份、磷酸二氢钾0.8-1份。

进一步地，该制剂中，所述的保护剂的pH值为5.5-6.0。

一种液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将复合乳酸杆菌接种于液体培养基上，并于35-40℃下静置培养20-28h，得到混合乳酸杆菌种子液；

2)将混合乳酸杆菌种子液接种于发酵培养基上，并于35-40℃下发酵18-24h，得到发酵菌液；

3)将发酵菌液离心分离后，得到菌泥，将菌泥加入至保护剂中，混合均匀后，即得到所述的液态复合乳酸杆菌制剂。

进一步地，步骤2)中，所述的发酵过程中，pH值为7.0-7.5，搅拌转速为80-100r/min。

进一步地，步骤3)中，所述的离心分离过程中，离心机转速为3500-4500r/min，离心时间为4-6min；离心后，除去上清液，得到菌泥。

一种液态复合乳酸杆菌制剂的应用，将所述的制剂加入至猪的基础日粮中，所述的制剂的质量为基础日粮质量的0.18-0.22％。

对于液态乳酸菌制剂来说，保护剂可减轻制备、储存和运输过程中因失水对细胞造成的损伤，尽可能的保持细胞原有的特性，因此，保护剂的选择和用量对乳酸菌的活性是至关重要的。

本发明中，保护剂中的葡萄糖、蛋白胨能为乳酸菌提供碳源、氮源供其生长；葡萄糖还能与水分子结合，增加溶液的黏性，而Tween80是一种很好的乳化剂和分散剂，能使保护液中的营养成分更加的均匀，二者结合使溶液中各组分更加稳定；葡萄糖的羟基基团，能联结菌周围的自由基，可避免菌直接暴露在介质中。同时，甘油和谷氨酸钠是小分子化合物，能渗透入细胞内部，利用自身的羟基基团与细胞内的大分子物质形成氢键，从而取代了与水分子的氢键，降低细胞脱水皱缩的速度；碳酸钙能促进乳酸菌产生其发酵所需的酶，加速乳酸菌的发酵和繁殖，同时碳酸钙也能中和乳酸菌发酵过程中产生的酸，与添加磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的作用类似，共同维持乳酸菌液态制剂的pH平衡。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1)本发明针对液态乳酸菌制剂保存期限相对较短的缺陷，通过在液态复合乳酸杆菌制剂中加入含有能量物质的保护剂供菌体存活，并保持较低的pH，以延缓菌体生长速度，最终达到延长液态复合乳酸杆菌制剂在常温下的保存期限的目的，从而提高其在猪场中的实际应用效果；

2)本发明液态制剂保留了发酵时的营养成分，且代谢产生的有机酸可抑制致病菌如沙门氏菌、大肠杆菌的生长和脱落，更能促进机体的消化和免疫功能；此外，乳酸菌代谢产物丰富，其中代谢的乳糖可以有效降低肠胃pH值，从而提高胃蛋白酶的活性，促进蛋白的消化；

3)制备方法简单，操作方便，成本低廉，适合大规模生产；制剂的初始乳酸杆菌活菌数≥2.5×10⁹CFU/g，常温下保存三个月后，活菌数≥9.6×10⁷CFU/g，具有活菌含量高，富含生物活性物质的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

1、按以下表1配方配制乳酸菌液体培养基：

表1液体培养基配方

将保存的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚杆菌菌种分别接种于500mL液体培养基中，37℃静置培养24h，将静置发酵后的三种菌液混合，制得混合乳酸杆菌种子液1500mL。

2、将混合乳酸杆菌种子液接入1t发酵罐进行发酵，采用常规的发酵工艺对乳酸杆菌进行发酵，发酵工艺条件为：温度37℃，pH＝7.2，转速80-100r/min，发酵18-24h。发酵培养基配方如表2所示：

表2发酵培养基配方

3、按如下配方配制保护剂：葡萄糖1-3份、蛋白胨0.01-0.03份、甘油5-10份、Tween80 0.5-2份、谷氨酸钠1-3份、碳酸钙0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.087份、磷酸二氢钾0.834份，pH为5.8。将发酵好的菌液于4000r/min离心5min，去除上清液，用保护剂(菌泥体积的3-5倍)将菌泥冲洗至锥形瓶中，搅拌10min，混合均匀后，取少量样品计数，其余菌液用规格为250mL的无菌塑料瓶分装。室温放置。

4、分别于第15天、第30天、第45天、第60天、第75天、第90天取样观察：外观、气味、活菌量、pH。取样观察及检测结果如表3所示：

表3液态复合乳酸杆菌制剂不同保存天数的活菌量和pH变化

试验方法及结果：

试验设计：选择体重、窝仔数、母猪胎次、初生日期相近的纯种长白断奶仔猪9窝，按饲养试验要求随机分为3个处理组，每个处理组3窝仔猪，每窝10头仔猪，分别饲喂纯日粮(空白组)、添加抗生素日粮(对照组)、添加本实施例制备的液态复合乳酸杆菌制剂日粮(实施例组)。计算试验仔猪的日平均采食量、日增重、料重比、腹泻率与死亡率。

表4试验仔猪分组设计方案

仔猪采用高床饲养，通风良好，自由采食，每个栏内安装鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。试验期间对试验猪进行打耳号、驱虫和防疫注射；试验从断奶后(29日龄)到60日龄共32天。试验期间，每天早上8:00仔细观察仔猪有无腹泻现象。每日记录料耗，试验开始第0天及饲养试验结束时第32天，禁食(自由饮水)24h后称重，计算各阶段的平均日增重、平均采食量和饲料转化率；试验结束时，收集仔猪新鲜粪便，保存于-70℃超低温冰箱中，测定其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及乳酸杆菌的个数。

表5各处理组仔猪生产性能试验结果

表6各处理组仔猪粪便中不同微生物的含量(CFU/g)

由表5可见，与空白组相比，对照组能明显提高仔猪的日增重、降低仔猪的料肉比，同时也降低仔猪的腹泻率。与对照组相比，实施例组日增重的增加也更显著，同时料肉比和腹泻率均更低。由此可见，在早期断奶仔猪饲料中添加液态复合乳酸杆菌制剂能有效提高仔猪的生产性能，促进仔猪生长。由表6可见，实施例组粪便中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的含量最低，乳酸菌含量最高，这表明液态复合乳酸杆菌制剂对大肠杆菌等肠道致病菌有良好的抑制作用，也与试验中各处理组的仔猪腹泻率结果相一致，进一步说明了添加液态复合乳酸杆菌制剂能维持仔猪肠道内正常菌群的优势地位，抑制有害菌的定殖，促进营养物质的吸收，降低腹泻的发生。

综上所述，本发明液态复合乳酸杆菌制剂的在猪场实际应用中效果显著，能明显改善仔猪的腹泻情况，提高生产性能，在替代抗生素方面大有可为。

实施例2：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，包括以下组分及重量份含量：复合乳酸杆菌3份、保护剂15份，制剂的pH值为3.9。

该液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：

1)将复合乳酸杆菌接种于液体培养基上，并于40℃下静置培养20h，得到混合乳酸杆菌种子液；

2)将混合乳酸杆菌种子液接种于发酵培养基上，并于40℃下发酵18h，发酵过程中，pH值为7.5，搅拌转速为80r/min，得到发酵菌液；

3)将发酵菌液进行离心分离，离心分离过程中，离心机转速为4500r/min，离心时间为4min；离心后，除去上清液，得到菌泥，将菌泥加入至保护剂中，混合均匀后，即得到液态复合乳酸杆菌制剂。

将该液态复合乳酸杆菌制剂加入至猪的基础日粮中，制剂的质量为基础日粮质量的0.22％。

实施例3：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，包括以下组分及重量份含量：复合乳酸杆菌4.5份、保护剂9份，制剂的pH值为5.2。

该液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：

1)将复合乳酸杆菌接种于液体培养基上，并于35℃下静置培养28h，得到混合乳酸杆菌种子液；

2)将混合乳酸杆菌种子液接种于发酵培养基上，并于35℃下发酵24h，发酵过程中，pH值为7.0，搅拌转速为100r/min，得到发酵菌液；

3)将发酵菌液进行离心分离，离心分离过程中，离心机转速为3500r/min，离心时间为6min；离心后，除去上清液，得到菌泥，将菌泥加入至保护剂中，混合均匀后，即得到液态复合乳酸杆菌制剂。

将该液态复合乳酸杆菌制剂加入至猪的基础日粮中，制剂的质量为基础日粮质量的0.18％。

实施例4：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，包括以下组分及重量份含量：复合乳酸杆菌3.8份、保护剂12份，制剂的pH值为4.2。

该液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：

1)将复合乳酸杆菌接种于液体培养基上，并于37℃下静置培养24h，得到混合乳酸杆菌种子液；

2)将混合乳酸杆菌种子液接种于发酵培养基上，并于34℃下发酵21h，发酵过程中，pH值为7.2，搅拌转速为90r/min，得到发酵菌液；

3)将发酵菌液进行离心分离，离心分离过程中，离心机转速为4000r/min，离心时间为5min；离心后，除去上清液，得到菌泥，将菌泥加入至保护剂中，混合均匀后，即得到液态复合乳酸杆菌制剂。

将该液态复合乳酸杆菌制剂加入至猪的基础日粮中，制剂的质量为基础日粮质量的0.2％。

实施例5：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，包括复合乳酸杆菌及保护剂。

其中，复合乳酸杆菌包括以下组分及重量份含量：植物乳杆菌1.2份、嗜酸乳杆菌1.3份、保加利亚杆菌1.1份。复合乳酸杆菌的活菌数≥9.6×10⁷CFU/g。

保护剂包括以下组分及重量份含量：葡萄糖2份、蛋白胨0.02份、甘油7份、Tween801份、谷氨酸钠2份、碳酸钙0.2份、磷酸氢二钾0.09份、磷酸二氢钾0.9份。保护剂的pH值为5.8。

实施例6：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，包括复合乳酸杆菌及保护剂。

其中，复合乳酸杆菌包括以下组分及重量份含量：植物乳杆菌1份、嗜酸乳杆菌1.5份、保加利亚杆菌1份。复合乳酸杆菌的活菌数≥9.6×10⁷CFU/g。

保护剂包括以下组分及重量份含量：葡萄糖3份、蛋白胨0.01份、甘油10份、Tween80 0.5份、谷氨酸钠3份、碳酸钙0.1份、磷酸氢二钾0.1份、磷酸二氢钾0.8份。保护剂的pH值为6.0。

实施例7：

一种液态复合乳酸杆菌制剂，包括复合乳酸杆菌及保护剂。

其中，复合乳酸杆菌包括以下组分及重量份含量：植物乳杆菌1.5份、嗜酸乳杆菌1份、保加利亚杆菌1.5份。复合乳酸杆菌的活菌数≥9.6×10⁷CFU/g。

保护剂包括以下组分及重量份含量：葡萄糖1份、蛋白胨0.03份、甘油5份、Tween802份、谷氨酸钠1份、碳酸钙0.3份、磷酸氢二钾0.08份、磷酸二氢钾1份。保护剂的pH值为5.5。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种液态复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，该制剂包括以下组分及重量份含量：复合乳酸杆菌3-4.5份、保护剂9-15份，所述的制剂的pH值为3.9-5.2；

所述的复合乳酸杆菌由以下组分及重量份含量组成：植物乳杆菌1-1.5份、嗜酸乳杆菌1-1.5份、保加利亚杆菌1-1.5份；

所述的保护剂包括以下组分及重量份含量：葡萄糖1-3份、蛋白胨0.01-0.03份、甘油5-10份、Tween80 0.5-2份、谷氨酸钠1-3份、碳酸钙0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.08-0.1份、磷酸二氢钾0.8-1份；

所述的保护剂的pH值为5.5-6.0；

所述的制剂的制备方法包括以下步骤：

1)将复合乳酸杆菌接种于液体培养基上，并于35-40℃下静置培养20-28h，得到混合乳酸杆菌种子液；

2)将混合乳酸杆菌种子液接种于发酵培养基上，并于35-40℃下发酵18-24h，得到发酵菌液；

3)将发酵菌液离心分离后，得到菌泥，将菌泥加入至保护剂中，混合均匀后，即得到所述的液态复合乳酸杆菌制剂。

2.根据权利要求1所述的一种液态复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，该制剂中，所述的复合乳酸杆菌的活菌数≥9.6×10⁷CFU/g。

3.一种如权利要求1至2任一项所述的液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将复合乳酸杆菌接种于液体培养基上，并于35-40℃下静置培养20-28h，得到混合乳酸杆菌种子液；

2)将混合乳酸杆菌种子液接种于发酵培养基上，并于35-40℃下发酵18-24h，得到发酵菌液；

3)将发酵菌液离心分离后，得到菌泥，将菌泥加入至保护剂中，混合均匀后，即得到所述的液态复合乳酸杆菌制剂。

4.根据权利要求3所述的一种液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵过程中，pH值为7.0-7.5，搅拌转速为80-100r/min。

5.根据权利要求3所述的一种液态复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的离心分离过程中，离心机转速为3500-4500r/min，离心时间为4-6min；离心后，除去上清液，得到菌泥。

6.一种如权利要求1至2任一项所述的液态复合乳酸杆菌制剂的应用，其特征在于，将所述的制剂加入至猪的基础日粮中，所述的制剂的质量为基础日粮质量的0.18-0.22％。