CN115572691A - 一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用，包括菌粉A、菌粉B和培养基C；所述菌粉A由植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌及载体组成；所述菌粉B由反硝化细菌及载体组成。本发明所述的水产发酵剂的使用方法操作简便、发酵成本低、有效活菌数高，有效改善了传统水产饲料添加剂或生物水质改善剂因运输及储存导致的活菌数低、储存稳定性差、应用效果不明显等问题，可广泛应用于水产养殖行业。

Description

一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，我国水产养殖快速发展，但也伴随出现了许多问题，例如高密度养殖过程中一些不合理措施导致了水体污染及水产动物肠道菌群失衡。
活菌微生态制剂是利用有益微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂，主要有效成分包括活菌及其代谢产物，能够改善微生态系统平衡和养殖环境、提高养殖水生动物的抗应激抗病能力。
传统的水产养殖用微生态制剂，或水质改善剂一般由商家自行发酵后以液态形式包装、售卖，虽然生产、包装过程中能够严格保证质量，但是，由于运输、存储过程带来的环境改变，则会导致活菌数的衰减、杂菌生长、产品质量降低、有效性变差，为水产养殖带来潜在的负面影响，同时，市面上现有活菌微生态产品功能单一、菌种抗逆性和活性稳定性差、抑菌效果差等问题，不能同时解决调水、调肠、抗病、促生长这四个问题，所以在水产养殖领域，微生态制剂的使用存在一定的局限性。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于，提供一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用，以解决现有水产养殖用微生态制剂中产品功能单一、菌种抗逆性差、贮存稳定性差、有效活菌数低、抑菌效果差等问题，通过调节水质、调节肠道菌群平衡和促进饲料消化吸收的方式，提高水产养殖动物的生长性能。
为了达到上述目的，本发明提供了一种含植物乳杆菌的水产发酵剂，包括菌粉A、菌粉B和培养基C，三者的重量比例为0.05：(0.5-2)：(20-40)。
作为优选，其中所述菌粉A按重量百分比计的组成为：植物乳杆菌0.2-1％；粪肠球菌8-10％；乳酸片球菌0.2-1％；枯草芽孢杆菌4-10％；酿酒酵母菌0.5-5％；葡萄糖10-20％；硫酸镁1-5％；氯化钠5-20％；玉米淀粉30-35％。
作为优选，其中所述菌粉A的总活菌数为141-310亿CFU/g，所述菌粉A的植物乳杆菌的活菌数为10-50亿CFU/g；所述菌粉A的粪肠球菌的活菌数为80-100亿CFU/g；所述菌粉A的乳酸片球菌的活菌数为10-50亿CFU/g；所述菌粉A的枯草芽孢杆菌的活菌数为40-100亿CFU/g；所述菌粉A的酿酒酵母菌的活菌数为1-10亿CFU/g。
作为优选，其中所述菌粉B按重量百分比计的组成为：反硝化细菌10-30％；麸皮20-30％；滑石粉35-45％；所述菌粉B的反硝化细菌的活菌数为10-30亿/g。
作为优选，其中所述培养基C按质量体积比的组成为：红糖10-50g/L，玉米蛋白胨10-40g/L，酵母浸粉5-10g/L，氯化钠0.5-2g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，硫酸镁0.25-1g/L，轻质碳酸钙0.5-2g/L。
为了达到上述目的，本发明还提供了一种含植物乳杆菌的水产发酵剂的制备方法，包括如下步骤：
菌粉A的制备：将配方量的植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、酿酒酵母菌与二分之一配方量的玉米淀粉进行初级预混，得到菌粉A初级预混物；然后将该菌粉A初级预混物与配方量的枯草芽孢杆菌、葡萄糖、硫酸镁、氯化钠，以及剩余二分之一配方量的玉米淀粉进行二级混合，即得所述菌粉A；
菌粉B的制备：将配方量的反硝化细菌、麸皮与滑石粉混合均匀，即得所述菌粉B；
培养基C的制备：分别将配方量的氯化钠、硫酸锰、硫酸镁、轻质碳酸钙与三分之一配方量的红糖进行初级预混，得到培养基C初级预混物。然后将该培养基C初级预混物与配方量的酵母浸粉、玉米蛋白胨，以及剩余三分之二配方量的红糖进行二级混合，即得所述培养基C。
作为优选，其中所述菌粉A初级预混的转速20-40r/m，混合时间为200-300秒，优选的转速为30r/m，混合时间为240秒。进一步地，所述菌粉A二级混合的转速40-60r/m，混合时间为120-180秒，优选的转速为50r/m，混合时间为150秒。
作为优选，其中所述菌粉B的混合转速为20-40r/m，混合时间为200-300秒，优选的转速为30r/m，混合时间为240秒。
作为优选，其中所述培养基C的初级预混的转速为20-40r/m，混合时间为200-300秒，优选的转速为30r/m，混合时间为240秒。
作为优选，其中所述培养基C二级混合的转速40-60r/m，混合时间为120-180秒，优选的转速为50r/m，混合时间为150秒。
为了达到上述目的，本发明还提供了一种含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备水产发酵饲料和发酵菌液中的应用。
作为优选，其中所述水产发酵饲料包括鱼料、虾料、蟹料、蛙料、甲鱼料或龟料等。
作为优选，其中所述含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备水产发酵饲料中的应用，所述应用是以豆粕、花生粕、鱼粉、面粉、麸皮、磷酸二氢钙、氯化钠为发酵基质，以植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌为主要组分的前述菌粉A为发酵菌剂，发酵基质组分和发酵菌剂组分的重量比为(500-1000)：1。
作为优选，其中所述含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备水产发酵饲料中的应用，包括如下步骤：
A)发酵菌剂的活化：将1-3kg前述菌粉A用30-60L的10-50g/L红糖水于30-35℃的温水中活化1-3h，即得发酵菌剂活化液；
B)发酵基质混合物的制备：先将豆粕、菜籽粕、花生粕先粉碎后过60-80目筛，制成豆粕粉、菜籽粕粉、花生粕粉，然后将质量分数比为20-35％豆粕粉、20-30％菜籽粕粉、10-20％花生粕粉、5-15％鱼粉、20-30％高筋面粉、4-8％麦麸、3-4％豆油、1-2％磷酸二氢钙、0.5-2％氯化钠、0.25-0.5％硫酸镁充分搅拌均匀，即得发酵基质混合物；
C)发酵：将上述步骤A)制得的发酵菌剂活化液均匀喷洒在步骤B)制得的发酵基质混合物中，用透明密封袋装好后置于发酵桶中，常温密闭发酵3-5天(夏秋季发酵2-3天、冬春季发酵3-5天)，发酵后物料色泽均一、质地松软、无霉变结块、气味柔和(果香味、醇香味、酸香味或弱酸味)，即制成发酵饲料，其水分含量为30wt％-40wt％、pH值低于5.00、粗蛋白质含量30-40wt％、酸溶蛋白含量18-20wt％。
D)将上述步骤C)新鲜制成的发酵饲料按水产动物日投喂量的5-20％额外泼洒于池塘中，每天投喂1次，可以提高水产动物的增重和生长率。
作为优选，其中所述含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备发酵菌液中的应用，包括如下步骤：
1)菌粉A的扩培：将0.25-0.5kg菌粉A，使用5-10L的10-50g/L红糖水于30-35℃温水活化0.5-3h；将培养基C使用100℃沸水溶解后，降温至25-35℃，调pH值至6.0-7.0，装液量70-80％(v/v)，定容至90-95L备用；将活化完成的菌粉A按质量体积比1:400-1:200接种于得到的培养基C溶液中，搅拌均匀，于25-35℃密闭培养24-72h，获得菌粉A扩培液；
2)菌粉B的活化：将0.25-0.5kg菌粉B使用5.0-10L的10-50g/L，30-37℃红糖温水活化0.5-3h；
3)将菌粉A扩培液与菌粉B活化液，按体积比20:1-5:1充分混合均匀，即得发酵菌液；
4)将步骤3)新鲜制备的发酵菌液按体积比1:2000-1:100泼洒于鱼、虾、蟹、蛙、甲鱼或龟的水产养殖池塘水体中，视滤食情况和长势增减用量；每7-10天使用一次，每次使用时遵循少量多次的原则，晴天中午使用效果更佳，使用当天晚上要开增氧机。
上述菌粉A所述植物乳杆菌，是从健康动物肠道内容物中筛选分离的植物乳杆菌HEW-A490，已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12554，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。该株植物乳杆菌HEW-A490产酸性能非常强、代谢产物极其丰富、抑菌性能强；该株植物乳杆菌经过24h发酵培养后发酵液的pH值可降至3.37、产酸量可达1.75g/100mL(产酸量的测定参考《GB 12456食品安全国家标准食品中总酸的测定》，总酸以乳酸计)，所产代谢产物非常丰富，包括乳酸菌素、乳酸、短链脂肪酸、β葡萄糖苷酶等，经过液相色谱-质谱联用仪分析该株植物乳杆菌HEW-A490有170种代谢产物，含90种酸，26种氨基酸，10种寡糖，其中苯乳酸含量很高。
上述菌粉A所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.9353，分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
上述菌粉A所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)HEW-P27已于2018年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.15419，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
本发明具有以下有益效果：
本发明涉及的含植物乳杆菌的水产发酵剂，由植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、反硝化细菌等多种复合菌构成，扩培后，发酵液pH值低、活菌数高(总活菌数大于200亿CFU/mL)，活菌在水中可还原水体中亚硝酸盐，使之生成氮气，也可吸收氨态氮、降解氨氮，同时促进水体菌相建立、抑制有害藻类繁殖，维持菌藻平衡，净化水体，稳定水质；此法操作简单，发酵效果稳定，有效解决了液态水产活菌微生态制剂运输、存储和使用效果不佳的问题；
本发明涉及的含植物乳杆菌的水产发酵剂，使用其中的菌粉A(植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌)活化后制备水产发酵饲料，由于菌粉A中的植物乳杆菌HEW-A490产酸能力强、代谢产物丰富，能有效抑制嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、诺卡氏菌等病原菌，减少水产养殖动物病害发生率，同时具有极强的产酸、耐酸、耐胆盐能力，可大幅度提高饲料发酵效率，使得所制备的该发酵饲料富含益生菌、乙酸、乳酸等有机酸、β葡萄糖苷酶等生物酶、活性肽、多糖、促生长因子、免疫刺激因子等，进入水产动物肠道后可促进肠道优势菌群增殖、提高免疫力，另外该发酵饲料有独特酸香味、诱食性好、饲料消化吸收率高，使水产动物摄食量高、肠道粗壮、生长速度加快、提高10-30％的增重率、降低10-15％的饵料系数、降低15-20％的发病率。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例进行说明。以下各种材料或试剂，若非特别说明，均为市售。
实施例1：植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂的制备及其产酸性能、抗逆性能、抑菌性能测试
1.1制备植物乳杆菌HEW-A490发酵液
将植物乳杆菌HEW-A490菌株(保藏编号为CGMCC No.12554)在MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡培养15h，制成植物乳杆菌HEW-A490种子液。经检测，该种子液活菌数为1.2×109CFU/mL。摇瓶发酵培养结束后，将所制成的植物乳杆菌HEW-A490种子液接种至二级发酵培养罐中进行扩大发酵培养，最后再转至三级发酵培养罐中培养20h后终止发酵，制成植物乳杆菌HEW-A490发酵液；经检测，该发酵液的活菌数为5.5×109CFU/mL。
其中，所述种子培养基以重量百分比计的由下述组分组成：葡萄糖0.5％，蔗糖1.2％，酵母膏0.8％，胰蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.17％，余量为水，pH值为6.8±0.2。摇瓶发酵的条件是：发酵温度为37℃，搅拌转速为180r/m，发酵时间为15h。
二级发酵培养以50L发酵罐培养为例，50L发酵罐的培养基以重量百分比计的组成为：蔗糖1.5％，玉米淀粉2.0％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物1.4％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH值6.8±0.2。50L发酵罐的发酵条件为：装液量为30L培养基，接种量为300mL，发酵温度为37℃，搅拌转速为120r/m，发酵时间为10h。
三级发酵培养以5T发酵罐培养为例，5T发酵罐培养基与二级发酵培养基相同。5T发酵罐的发酵条件为：装液量为3.5T培养基，接种量为30L，发酵温度为37℃，搅拌转速为110r/m，发酵时间为20h。
1.2制备植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂
将1.1得到的该植物乳杆菌HEW-A490发酵液于10000r/m离心30min，得到植物乳杆菌HEW-A490活性菌泥，将该活性菌泥和保护剂按1﹕0.2的重量比例混合均匀，成为半流质状态的菌悬液，将该菌悬液放到已灭菌处理的洁净托盘后，投入冻干机中，经过预冻、升华干燥、真空干燥后得到结构疏松的块状植物乳杆菌，全程包括降温至-40℃保持4h，升温至-10℃保持14h，升温至0℃保持8h，至25℃保持10h；收集该块状植物乳杆菌投入挤压制粒机中破碎处理，再经30目标准筛过筛后，获得植物乳杆菌HEW-A490粉末状的活菌制剂，有效活菌数可达5.0×1011CFU/g。
所述保护剂按重量百分比计的组成为：11.5％绵白糖、8.4％乳清粉、4.5％甘油、3.2％脱脂奶粉、1.5％甘露醇、2.2％维生素E、0.2％维生素C，余量为水。
1.3植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂产酸性能测试
表1植物乳杆菌HEW-A490发酵液在不同培养时间的pH值变化及产酸量
Figure BDA0003866628750000061
备注：产酸量的测定参考GB/T12456，总酸以乳酸菌计。
从表1的数据可以看出，本发明提供的植物乳杆菌HEW-A490菌株发酵培养24h后，发酵液的pH值从6.80降低到3.37、产酸量达1.75g/100mL，比对照菌株(植物乳杆菌的活菌数为1000亿CFU/g)具有更强的产酸能力、更快的产酸速度，尤其是产酸量比对照菌株(植物乳杆菌的活菌数为1000亿CFU/g)的产酸量高23％，取得了意料不到的效果。1.4植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂抗逆性能测试
表2实施例1的植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂耐酸和耐胆盐测试
Figure BDA0003866628750000062
Figure BDA0003866628750000071
备注：(1)耐酸的测试过程：把待测样品置于pH 3.0的磷酸缓冲盐溶液中浸泡处理2小时后再检测活菌数，样品处理后的实测活菌数除以没有处理的实测活菌数得到样品在该处理液中的耐酸存活率。其中，pH 3.0的磷酸缓冲盐溶液的配制步骤为：第一步，称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，蒸馏水1000mL；第二步，将上述成分溶解于蒸馏水中，用6mol/L的盐酸调pH值至3.0，121℃灭菌30min，冷却至常温备用。
(2)耐胆盐的测试过程：把待测样品置于含牛胆盐0.15wt％的磷酸缓冲盐溶液中浸泡处理2小时后再检测活菌数，样品处理后的实测活菌数除以没有处理的实测活菌数得到样品在该处理液中的耐胆盐存活率。其中，0.15wt％的胆盐溶液的配制分为三个步骤：第一步，配制pH7.4的磷酸缓冲盐溶液，将氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g依次溶解于1000mL蒸馏水中，用6mol/L的盐酸调pH值至7.4，121℃灭菌30min，冷却备用。第二步，准确称取5.00g牛胆盐(生物试剂，购买于北京博奥星生物技术有限责任公司)，用100mL纯净水溶解，配制成5wt％的胆盐溶液，121℃灭菌30min，冷却备用。第三步，在300mL，pH7.4的磷酸缓冲盐溶液中加入9mL，5wt％的胆盐溶液，涡旋混匀制成含牛胆盐0.15wt％的磷酸缓冲盐溶液。
从表2的数据可以看出，本发明实施例1提供的植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂在消化道低酸性环境下和高胆盐浓度下的耐受力比市面上的植物乳杆菌分别高11个百分点和2个百分点，说明实施例1的植物乳杆菌通过动物体内消化道后有更多的活菌能到达肠道定殖、繁殖成优势菌群，保护动物肠道健康。
1.5植物乳杆菌HEW-A490发酵液抑菌性能测试
以嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、诺卡氏菌为致病菌，比较实施例1得到的植物乳杆菌HEW-A490发酵液(有效成分为乳酸菌素)和抗生素在抑菌效果方面的差异性，所使用的抗生素分别为恩诺沙星药敏片(有效成分为恩诺沙星)、氟苯尼考药敏片(有效成分为氟苯尼考)。在涂有致病菌的平板上打孔、往孔内点种200微升植物乳杆菌HEW-A490发酵液、同时在涂有致病菌的平板上放置恩诺沙星药敏片和氟苯尼考药敏片，30℃恒温培养，培养24h后观察点种区、药敏纸片放置区周围是否出现清晰透明的抑菌圈，具体结果见表3。
嗜水气单胞菌抑菌试验的培养基配方按重量体积比计为：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉16g/L。副溶血弧菌抑菌试验的培养基配方按重量体积比计为：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、NaCl 35g/L、琼脂粉16g/L。诺卡氏菌抑菌试验的培养基为BHI脑心浸液肉汤。
表3实施例1的植物乳杆菌HEW-A490的发酵液抑菌直径(单位：cm)
Figure BDA0003866628750000081
从表3的数据可以看出，本发明实施例1提供的植物乳杆菌HEW-A490对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、诺卡氏菌均有显著的抑制效果，且对嗜水气单胞菌和诺卡氏菌的抑菌效果均优于恩诺沙星和氟苯尼考，对副溶血弧菌的抑菌效果优于恩诺沙星；比氟苯尼考稍弱；从而说明，所述实施例1的植物乳杆菌HEW-A490菌株具有极强的抑菌抗菌能力，可广泛应用于水产养殖中，预防和减少水产动物肠炎、提高饲料的吸收利用率、提升水产养殖效益。
实施例2：一种含植物乳杆菌的水产发酵剂的制备方法
所述含植物乳杆菌的水产发酵剂包括菌粉A、菌粉B和培养基C，按以下方法分别制备：
2.1菌粉A的制备方法
菌粉A的原料以重量百分比计，含有以下组分：植物乳杆菌HEW-A490 0.5％；粪肠球菌10％；乳酸片球菌0.5％；枯草芽孢杆菌10％；酿酒酵母菌0.5％；葡萄糖20％；硫酸镁5％；氯化钠20％；玉米淀粉33.5％；所述植物乳杆菌HEW-A490的活菌数为5.0×1011CFU/g、粪肠球菌的活菌数为1.0×1011CFU/g、乳酸片球菌的活菌数为5.0×1011CFU/g、枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0×1011CFU/g、酿酒酵母菌的活菌数为2.0×1010CFU/g；植物乳杆菌HEW-A490活菌制剂的具体制备方法见实施例1，粪肠球菌和乳酸片球菌活菌制剂的制备方法与实施例1的区别在于菌株类型(对应的菌株为粪肠球菌及乳酸片球菌)和培养基配方的不同。
所述粪肠球菌HEW-A131(保藏编号为CGMCC No.9353)的种子培养基与实施例1植物乳杆菌HEW-A490的种子培养基相同，制得粪肠球菌种子液的活菌数为1.0×109CFU/mL；其二级发酵培养以50L发酵罐培养为例，50L发酵罐的培养基以重量百分比计的组成为：白糖2.8％，玉米浆干粉0.9％，酵母膏0.6％，氯化镁0.09％，磷酸氢二钾0.08％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.16％，硫酸锰0.04％，吐温-80 0.08％，余量为水，pH值为6.8±0.2。50L发酵罐的发酵条件为：装液量为35L培养基，接种量为300mL，发酵温度为37℃，搅拌转速为120r/m，发酵时间为8h。
其三级发酵培养以5T发酵罐培养为例，5T发酵罐培养基与二级发酵培养基相同。5T发酵罐的发酵条件为：装液量为3.5T培养基，接种量为30L，发酵温度为37℃，搅拌转速为80r/m，发酵时间为16h；制得粪肠球菌发酵液的活菌数为4.5×109CFU/mL。
所述乳酸片球菌HEW-P27(保藏编号为CGMCC No.15419)的种子培养基以重量百分比计由下述组分组成：葡萄糖2.80％，胰蛋白胨0.45％，酵母浸粉0.55％，氯化镁0.09％，硫酸锰0.035％，氯化钠0.12％，碳酸钙0.15％，吐温-80 0.08％，余量为水，pH值为6.8±0.2；所制得的乳酸片球菌种子液的活菌数为2.0×109CFU/mL。
其二级发酵培养以50L发酵罐培养为例，50L发酵罐的培养基以重量百分比计的组成为：蔗糖2.5％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物0.5％，氯化镁0.09％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.16％，硫酸锰0.04％，吐温-80 0.08％，余量为水，pH值6.8±0.2。50L发酵罐的发酵条件为：装液量为35L培养基，接种量为300mL，发酵温度为37℃，搅拌转速为120r/m，发酵时间为8h。
其三级发酵培养以5T发酵罐培养为例，5T发酵罐培养基与二级发酵培养基相同。5T发酵罐的发酵条件为：装液量为4.0T培养基，接种量为30L,发酵温度为37℃，搅拌转速为80r/m，发酵时间为16h；所制得的乳酸片球菌发酵液的活菌数为5.6×109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌均为市售产品。
菌粉A的制备步骤为：分别将配方量的植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、酿酒酵母菌与二分之一配方量的玉米淀粉进行初级预混，得到菌粉A初级预混物；然后将该菌粉A初级预混物与配方量的枯草芽孢杆菌、葡萄糖、硫酸镁、氯化钠，以及剩余二分之一配方量的玉米淀粉进行二级混合，即得所述菌粉A，其中植物乳杆菌的有效活菌数为2.5×109CFU/g、粪肠球菌的有效活菌数为1.0×1010CFU/g、乳酸片球菌的有效活菌数为2.5×109CFU/g、枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1.0×1010CFU/g、酿酒酵母菌的有效活菌数为1.0×108CFU/g；所述菌粉A初级预混的转速为30r/m、混合时间为240秒，所述菌粉A二级混合的转速为50r/m、混合时间为150秒。
2.2菌粉B的制备方法
菌粉B的原料以重量百分比计，含有以下组分：30％反硝化细菌、25％麸皮、45％滑石粉，其中反硝化细菌为市售产品，有效活菌数为1.0×1010CFU/g；
菌粉B的制备步骤：分别将配方量的反硝化细菌、麸皮与滑石粉混合均匀，即得所述菌粉B，所述菌粉B的反硝化细菌的有效活菌数为3.0×109CFU/g；所述菌粉B的混合转速为30r/m、混合时间为240秒。
2.3培养基C的制备方法
培养基C的原料组成以质量体积比计，含有以下组分：红糖50g/L，玉米蛋白胨36.25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠1.5g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.5g/L，轻质碳酸钙1.5g/L，即红糖50g、玉米蛋白胨36.25g、酵母浸粉10g、氯化钠1.5g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.5g、轻质碳酸钙1.5g，合计100g，经充分混合均匀后，定量包装，即得培养基C。使用时，每100g培养基C溶解于1000mL水中。
培养基C的制备步骤：先将每种原料按配方量单独称量，再将配方量的氯化钠、硫酸锰、硫酸镁、轻质碳酸钙与三分之一配方量的红糖进行初级预混，得到培养基C初级预混物；然后将该培养基C初级预混物与配方量的酵母浸粉、玉米蛋白胨，以及剩余三分之二配方量的红糖进行二级混合，即得所述培养基C；所述培养基C的初级预混的转速为30r/m、混合时间为240秒，培养基C二级混合的转速为50r/m、混合时间为150秒。
实施例3：一种含植物乳杆菌的水产发酵剂制备发酵菌液的方法
一种含植物乳杆菌的水产发酵剂制备发酵菌液的步骤包括菌粉A的活化与扩培、菌粉B的活化、菌粉A扩培液与菌粉B活化液混合均匀，即制得发酵菌液。
3.1菌粉A的活化与扩培
将实施例2制得的0.05kg菌粉A，用1L质量体积比为50g/L的红糖水于32℃温水活化3h；将20kg实施例2制得的培养基C使用100℃的沸水溶解后，降温至35℃，调pH值至7.0，装液量70％(v/v)，定容至200L备用；将活化完成的菌粉A活化液按体积比1:200接种于事先准备好的培养基C溶液中，搅拌均匀，于35℃的密闭发酵桶中培养48h，即得菌粉A扩培液，该扩培液的pH值低于3.5。
3.2菌粉B的活化
将1.0kg实施例2制得的菌粉B，用20L质量体积比为50g/L的红糖温水于35℃活化2h，即得菌粉B活化液。
3.3制备发酵菌液
将上述步骤3.1制得的菌粉A扩培液与步骤3.2制得的菌粉B活化液按体积比10:1充分混合均匀，即制成所述含植物乳杆菌的水产发酵菌液。
实施例4：一种含植物乳杆菌的水产发酵剂制备水产发酵饲料的方法
一种含植物乳杆菌的水产发酵剂制备水产发酵饲料的步骤包括发酵菌剂的活化、发酵基质混合物的制备、密封发酵三个步骤。
4.1发酵菌剂的活化：
将1kg实施例2制得的菌粉A用30L质量体积比为50g/L的红糖水于32℃温水中活化3h，即得发酵菌剂活化液。
4.2发酵基质混合物的制备
将豆粕、菜籽粕、花生粕先粉碎后过60目筛，制成豆粕粉、菜籽粕粉、花生粕粉，然后将质量分数比分别为20％的豆粕粉、25％的菜籽粕粉、10％的花生粕粉、8％的鱼粉、25％的高筋面粉、6.75％的麦麸、3％的豆油、1.5％的磷酸二氢钙、0.5％的氯化钠、0.25％的硫酸镁充分搅拌均匀，即得发酵基质混合物。
4.3密封发酵
将上述步骤4.1制得的发酵菌剂活化液均匀喷洒(采用农用手动往复式喷雾器)在步骤4.2制得的发酵基质混合物中，用透明密封袋装好后置于发酵桶中，常温密闭发酵3天，即制成水产发酵饲料；经检测，该发酵饲料的水分含量为32wt％、pH值为4.85、粗蛋白质含量为36.71wt％、酸溶蛋白含量为18.5wt％。
实施例5：发酵菌液在草鱼池塘中的应用
选择规格一致(平均尾重4.21±0.03g)的草鱼，将试验鱼在水泥池中饲养2周后，随机分配到两组，每组3个平行的6个2亩鱼塘中，每个鱼塘放鱼400尾，鱼塘保持持续通气(曝气，每天根据天气情况开增氧机以增加水体溶氧，所述增氧机的转速为140转/分钟)，每天上午9时、下午16时各投饲一次，投喂至饱食；对照组的养殖水体不作任何处理，试验组泼洒实施例3制成的含植物乳杆菌的水产发酵菌液，使用时向每一平方米的水面均匀泼洒(采用水勺或手动喷雾器)0.01L发酵菌液，即向每一个2亩鱼塘泼洒13.34L发酵菌液，每7天泼洒一次。饲养过程中，水温保持25±0.5℃，饲喂过程持续6周；每周一次采用便携式水质分析仪测定水中亚硝酸盐及氨氮含量，实验结果见表4。
表4.水中亚硝酸盐和氨氮变化情况
Figure BDA0003866628750000111
Figure BDA0003866628750000121
从表4的数据可以看出，随着含植物乳杆菌的水产发酵菌液的添加，水体中亚硝酸盐和氨氮的含量逐渐降低；试验第6周，试验组亚硝酸盐和氨氮的含量较对照组分别降低72.2％和75.4％，表明池塘中添加一种含植物乳杆菌的水产发酵菌液提高了饲料中氮和磷的利用率，同时能够继续分解水体中的残饵、粪便中的有机质等污染源，净化了水质，降低了水体中有毒有害物质的含量。
实施例6：水产发酵饲料在草鱼中的应用
选择规格一致(平均尾重为82g)的草鱼，将试验鱼分为两个处理，每个处理3个重复，每个重复60条鱼，每天饱食投喂3次，饲养12周。对照组饲喂常规水产配合饲料(其按重量百分比计的配方组成为：豆粕21％、菜籽粕24％、花生粕10％、鱼粉8％、面粉25％、麦麸3.15％、豆油3％、膨润土2％、磷酸二氢钙1.2％、复合多维1％、复合多矿1％、氯化胆碱0.25％、晶体蛋氨酸0.1％、维生素C 0.3％)，试验组按日投喂量的10wt％额外投喂实施例4制得的水产发酵饲料，饲喂结束后，分别测定每组试验鱼的增重、饵料系数，实验结果见表5。所述日投喂量指的是按鱼体重的3％投喂饲料量。
表5鱼体生长情况
对照组 试验组
鱼体初重(g/尾) 82.15±1.04 82.08±1.07
鱼体末重(g/尾) 229.15±3.12 271.28±3.85
增重率(％) 178.94±11.63 230.51±10.25
饵料系数 1.52±0.04 1.35±0.08
备注：增重率＝100％×(末重-初始重)/初始重，饵料系数＝投食量/(末重-初始重)
从表5的数据可以看出，试验组的增重率较对照组高28.8％、饵料系数较对照组低11.18％，表明本发明实施例4制得的水产发酵饲料可明显促进草鱼生长、提高饲料消化率、降低饵料系数。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种含植物乳杆菌的水产发酵剂，其特征在于，包括菌粉A、菌粉B和培养基C，三者的重量比例为0.05：(0.5-2)：(20-40)。
2.如权利要求1所述的水产发酵剂，其特征在于，所述菌粉A按重量百分比计的组成为：植物乳杆菌0.2-1％；粪肠球菌8-10％；乳酸片球菌0.2-1％；枯草芽孢杆菌4-10％；酿酒酵母菌0.5-5％；葡萄糖10-20％；硫酸镁1-5％；氯化钠5-20％；玉米淀粉30-35％。
3.如权利要求2所述的水产发酵剂，其特征在于，所述菌粉A的总活菌数为141-310亿CFU/g，所述菌粉A的植物乳杆菌的活菌数为10-50亿CFU/g；所述菌粉A的粪肠球菌的活菌数为80-100亿CFU/g；所述菌粉A的乳酸片球菌的活菌数为10-50亿CFU/g；所述菌粉A的枯草芽孢杆菌的活菌数为40-100亿CFU/g；所述菌粉A的酿酒酵母菌的活菌数为1-10亿CFU/g。
4.如权利要求1所述的水产发酵剂，其特征在于，所述菌粉B按重量百分比计的组成为：反硝化细菌10-30％；麸皮20-30％；滑石粉35-45％；所述菌粉B的反硝化细菌的活菌数为10-30亿/g；所述培养基C按质量体积比的组成为：红糖10-50g/L，玉米蛋白胨10-40g/L，酵母浸粉5-10g/L，氯化钠0.5-2g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，硫酸镁0.25-1g/L，轻质碳酸钙0.5-2g/L。
5.一种权利要求1-4任一项所述的含植物乳杆菌的水产发酵剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
菌粉A的制备：将配方量的植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、酿酒酵母菌与二分之一配方量的玉米淀粉进行初级预混，得到菌粉A初级预混物；然后将该菌粉A初级预混物与配方量的枯草芽孢杆菌、葡萄糖、硫酸镁、氯化钠，以及剩余二分之一配方量的玉米淀粉进行二级混合，即得所述菌粉A；
菌粉B的制备：将配方量的反硝化细菌、麸皮与滑石粉混合均匀，即得所述菌粉B；
培养基C的制备：分别将配方量的氯化钠、硫酸锰、硫酸镁、轻质碳酸钙与三分之一配方量的红糖进行初级预混，得到培养基C初级预混物。然后将该培养基C初级预混物与配方量的酵母浸粉、玉米蛋白胨，以及剩余三分之二配方量的红糖进行二级混合，即得所述培养基C。
6.如权利要求5所述的含植物乳杆菌的水产发酵剂的制备方法，其特征在于，所述菌粉A初级预混的转速20-40r/m，混合时间为200-300秒；所述菌粉A二级混合的转速40-60r/m，混合时间为120-180秒；所述菌粉B的混合转速为20-40r/m，混合时间为200-300秒；所述培养基C的初级预混的转速为20-40r/m，混合时间为200-300秒；所述培养基C二级混合的转速40-60r/m，混合时间为120-180秒。
7.一种权利要求1-4任一项所述的含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备发酵菌液和制备水产发酵饲料中的应用。
8.如权利要求7所述的含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备发酵菌液和制备水产发酵饲料中的应用，其特征在于，
所述水产发酵饲料包括鱼料、虾料、蟹料、蛙料、甲鱼料或龟料；
所述应用是以豆粕、花生粕、鱼粉、面粉、麸皮、磷酸二氢钙、氯化钠为发酵基质，以植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌为主要组分的菌粉A为发酵菌剂，发酵基质组分和发酵菌剂组分的重量比为(500-1000)：1。
9.如权利要求7所述的含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备发酵菌液和制备水产发酵饲料中的应用，其特征在于，所述含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备水产发酵饲料中的应用，包括如下步骤：
A)发酵菌剂的活化：将1-3kg所述菌粉A用30-60L的10-50g/L红糖水于30-35℃的温水中活化1-3h，即得发酵菌剂活化液；
B)发酵基质混合物的制备：先将豆粕、菜籽粕、花生粕先粉碎后过60-80目筛，制成豆粕粉、菜籽粕粉、花生粕粉，然后将质量分数比为20-35％豆粕粉、20-30％菜籽粕粉、10-20％花生粕粉、5-15％鱼粉、20-30％高筋面粉、4-8％麦麸、3-4％豆油、1-2％磷酸二氢钙、0.5-2％氯化钠、0.25-0.5％硫酸镁充分搅拌均匀，即得发酵基质混合物；
C)发酵：将上述步骤A)制得的发酵菌剂活化液均匀喷洒在步骤B)制得的发酵基质混合物中，用透明密封袋装好后置于发酵桶中，常温密闭发酵3-5天，发酵后物料色泽均一、质地松软、无霉变结块、气味柔和，即制成发酵饲料，其水分含量为30wt％-40wt％、pH值低于5.00、粗蛋白质含量为30-40wt％、酸溶蛋白含量为18-20wt％。
D)将上述步骤C)新鲜制成的发酵饲料按水产动物日投喂量的5-20％wt额外泼洒于池塘中，每天投喂1次。
10.如权利要求7所述的含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备发酵菌液和制备水产发酵饲料中的应用，其特征在于，所述含植物乳杆菌的水产发酵剂在制备发酵菌液中的应用，包括如下步骤：
1)菌粉A的扩培：将0.25-0.5kg菌粉A，使用5-10L的10-50g/L红糖水于30-35℃温水活化0.5-3h；将培养基C使用100℃沸水溶解后，降温至25-35℃，调pH值至6.0-7.0，装液量70-80％(v/v)，定容至90-95L备用；将活化完成的菌粉A按质量体积比1:400-1:200接种于得到的培养基C溶液中，搅拌均匀，于25-35℃密闭培养24-72h，获得菌粉A扩培液；
2)菌粉B的活化：将0.25-0.5kg菌粉B使用5.0-10L的10-50g/L，30-37℃红糖温水活化0.5-3h；
3)将菌粉A扩培液与菌粉B活化液，按体积比20:1-5:1充分混合均匀，即得发酵菌液；
4)将步骤3)新鲜制备的发酵菌液按体积比1:2000-1:100泼洒于鱼、虾、蟹、蛙、甲鱼或龟的水产养殖池塘水体中，每7-10天使用一次。
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