CN108085265B - 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料 - Google Patents

凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料 Download PDF

Info

Publication number
CN108085265B
CN108085265B CN201611025225.8A CN201611025225A CN108085265B CN 108085265 B CN108085265 B CN 108085265B CN 201611025225 A CN201611025225 A CN 201611025225A CN 108085265 B CN108085265 B CN 108085265B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus coagulans
feed
strain
cfu
cgmcc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611025225.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108085265A (zh
Inventor
汪攀
易敢峰
孙自博
朱传忠
付维来
刘婷
韩科厅
陈丽仙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Dabei Nonghuayou Aquatic Technology Group Co ltd
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Fujian Dabeinong Fisheries Science & Technology Co ltd
Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Dabeinong Fisheries Science & Technology Co ltd, Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd filed Critical Fujian Dabeinong Fisheries Science & Technology Co ltd
Priority to CN201611025225.8A priority Critical patent/CN108085265B/zh
Publication of CN108085265A publication Critical patent/CN108085265A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108085265B publication Critical patent/CN108085265B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株拮抗链球菌的凝结芽孢杆菌及其应用，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.12196。将该菌株制成菌粉，可添加到动物饲料中，也可作为拮抗链球菌的微生物制剂应用，用含有该菌株的饲料饲喂罗非鱼可有效防治链球菌病。将该菌和枯草芽孢杆菌、约氏乳杆菌进行混合，制成复合微生态制剂，可以提高罗非鱼的生长性能、提高肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和血清中溶菌酶的活力。另外，该菌发酵液还可以用作养殖环境改良剂，将上述菌的发酵液泼洒到罗非鱼养殖池塘，可降低养殖水体中链球菌的数量，还可以在低氧条件下清除水体中的亚硝酸盐。

Description

凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料
技术领域
本发明属于饲料微生态领域，具体涉及一株凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料。
背景技术
中国是世界上最大的罗非鱼生产国，产量、出口量和出口额均居世界首位，罗非鱼为国内最具国际竞争力的淡水养殖品种，也是最具产业化发展条件的品种，已成为中国南方地区的支柱性产业，在国内有着较强的发展优势。然而，由无乳链球菌、海豚链球菌引起的罗非鱼病害，在夏、秋季易爆发，该病传染性强，幼鱼与成鱼的发病率达10％～30％，死亡率可达25％～80％，甚至更高，给罗非鱼养殖业造成了极大的经济损失，而且还有不断加剧的趋势。
目前在罗非鱼养殖生产上，人们主要是通过使用抗生素类的化学药物对链球菌引起的病害进行防治，但大量、长期地使用广谱抗生素、化学药物和水体消毒剂，对生态环境及公众健康造成的负面影响受到了人们的关注。近年来，水产疫苗虽然取得了一定的进展，但受疫苗免疫途径、水体环境、病原变异、鱼类自身特点等因素的制约，其在生产上的推广使用尚需时日。因此，迫切需要寻找一种安全、高效的手段来防治罗非鱼链球菌病害。
益生菌制剂可以调节肠道微生物区系的平衡、促进肠道的生长发育、增强机体的免疫力进而促进机体生长。且由于其无抗药性、无残留、无污染等特性，成为抗生素的良好替代品之一。凝结芽孢杆菌作为益生菌的一种，既具有乳酸菌产酸的特性，又具有芽孢杆菌耐高温、抗逆性强和耐储存的优点。欧盟已通过了凝结芽孢杆菌的安全认定，批准其在饲料中应用。《中华人民共和国农业部公告第2045号》批准凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂使用。
亚硝酸盐中毒一直是养殖过程中碰到的另一个比较棘手的问题，往往给养殖户带来比较惨重的损失。亚硝酸盐的生物降解大都需要氧的参与，而目前的高密度养殖导致池塘中氧气并不充裕，我们需要开发出在低氧条件下就能降解亚硝酸盐的新产品。
目前，国内尚未有将凝结芽孢杆菌作为链球菌拮抗剂的产品，该菌在罗非鱼饲料中的应用也未见报道。将该菌做成拮抗链球菌的产品，同时在低氧条件下降解亚硝酸盐，对实现罗非鱼健康养殖意义重大。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和应用。
首先，本发明提供一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)新菌株。
该菌株分离自土壤，在MRS平板上呈白色菌落，直径1～2mm，中级隆起，表面稍干燥，边缘不整齐，正反面颜色一致，不透明，菌体杆状，单独存在，芽孢椭圆。测定该菌株的16S rDNA，与 GenBank公布的凝结芽孢杆菌HM-08的同源性最高(99％)，结合生理生化试验结果，该菌被鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.12196。
本发明还提供凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的发酵方法，包括如下的步骤：
1、平板培养复壮：将凝结芽孢杆菌菌种接种于MRS平板培养基上，于42℃培养12-24h，使菌复壮，并形成单菌落；
2、一级种子液的制备：从平板上挑取单菌落，接种于装有 MRS液体培养基的三角瓶(100mL/250mL)中，置于42℃摇床培养约10h，100rpm，OD600nm在0.7以上，获得一级种子液；
3、二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子液5ml接种于装有500mL MRS液体培养基的三角瓶中(接种2瓶)，置于42℃摇床100rpm上培养约7h，OD600nm在0.7以上，获得二级种子液。；
4、凝结芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照3～10％的接种量接种到装有0.5M3发酵培养基的发酵罐中，温度42℃，转速220～300rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1：0.6～0.8，培养16～20h，至芽孢形成率90％以上，则中止发酵，得凝结芽孢杆菌发酵液，其活菌数不低于5×109CFU/ml；
所述的发酵培养基为：葡萄糖1％，玉米面2％，豆粕2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.05％；
本发明还提供凝结芽孢杆菌菌粉的制备方法，以凝结芽孢杆菌 CGMCC No.12196为发酵菌株，经活化和发酵得到该菌发酵液，将发酵液中加入20～25％的辅料，进行喷雾干燥，得到水分含量低于 5％，活菌数不低于5×1010CFU/g的菌粉。
其中，喷雾干燥过程中，进风温度120～130℃，排风温度 40～50℃，雾化器转速15000～18000rpm。
本发明还提供一种复合微生态制剂，其含有凝结芽孢杆菌 CGMCC No.12196。
在本发明一个实施方案中，所述的复合微生态制剂还含有枯草芽孢杆菌、约氏乳杆菌和/或辅料，所述的辅料为沸石粉、碳酸钙、米糠、稻壳粉、淀粉、糊精、葡萄糖中的一种或几种。
其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为可用于饲料的所有菌株，优选既可用于水产也可用于畜禽的菌株，更优选为
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.12195分离自罗非鱼养殖水域，能够显著抑制无乳链球菌的生长，形成显著透明抑制圈。枯草芽孢杆菌CGMCC No.12195的芽孢耐温性能良好，芽孢在 85℃水浴10min，芽孢存活率80％以上，于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为： CGMCC No.12195。
其中，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)为可用于饲料的所有菌株，优选既可用于水产也可用于畜禽的菌株，更优选为约氏乳杆菌CGMCC No.4926(已公开，不提供保藏证明)。
其中，所述凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、约氏乳杆菌的重量配比优选为1-5:1-5:1-5。
其中，凝结芽孢杆菌的活菌数为1×108～1111CFU/g、枯草芽孢杆菌的活菌数为1×107～1110CFU/g、约氏乳杆菌的活菌数为1× 108～1111CFU/g。
本发明还提供含有凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的微生物饲料，饲料中所述的凝结芽孢杆菌含量为1×105CFU/g～107CFU/g。
其中，所述饲料可为畜禽和水产饲料，优选为水产饲料。
本发明还提供所述微生物饲料制备方法，将凝结芽孢杆菌 CGMCC No.12196菌粉添加到饲料中，或者，
将凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196菌粉与水混合制成菌悬液，将菌悬液与饲料拌匀，或者，
将凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196发酵液与饲料拌匀，使得饲料中所述的凝结芽孢杆菌含量为1×105CFU/g～107CFU/g。
本发明还提供凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196在养殖水体环境改良中的应用，按0.5～1L/亩·米用量，全池泼洒所述的凝结芽孢杆菌发酵液，用于清除水体中的亚硝酸盐和或降低水体中链球菌数量。
本发明的凝结芽孢杆菌分离自土壤，没有溶血活性，对海豚链球菌和无乳链球菌有显著的抑菌效果。同时，本发明的凝结芽孢杆菌可以有效降解亚硝酸盐，24h的降解率达到90％，到48小时几乎全部降解。用本发明的凝结芽孢杆菌制成的生物饲料可以效防治罗非鱼的链球菌病。本发明的凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌、约氏乳杆菌制成微生态制剂应用于罗非鱼养殖，可以提高罗非鱼的生长性能、降低饵料数、提高成活率。本发明的凝结芽孢杆菌发酵液应用水体后，水体中亚硝酸盐浓度可降低至0.15mg/L，链球菌数量也降低一个数量级，且用后不再反弹，为罗非鱼的健康生长创造良好水质条件。
附图说明
图1所示为凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196 16S rDNA的系统进化树。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的分离鉴定
1、菌株分离：称取土壤样品1g，置于100ml已灭菌的改良MRS (MRS培养基中添加α甲基葡萄糖苷10g/L，山梨酸钾1g/L)液体培养基中，震荡10min，置于42℃培养箱中富集培养4天，每天摇动一次。富集结束后，取2mL液体，90℃水浴10分钟，之后进行10倍梯度稀释。选取稀释10倍、100倍和1000倍三个稀释度的稀释液，分别吸取100μl接入MRS平皿，每个稀释度3个重复，用无菌涂布器涂匀，42℃倒置培养24小时。挑取单个菌落革兰氏染色、镜检，分离到一株革兰氏阳性、杆状，有芽孢的细菌，对其平板划线纯化三次，取单菌落保存。该菌在MRS平板上呈白色菌落，直径1～2mm，中级隆起，表面稍干燥，边缘不整齐，正反面颜色一致，不透明，菌体杆状，单独存在，芽孢椭圆。
2、菌株的鉴定：对分离到的菌株进行生理生化鉴定(参照《伯杰细菌鉴定手册》)，结果见表1。同时进行16S rDNA的序列测定及系统发育树的构建：利用细菌16S rDNA通用引物 5’-gagagtttgatcctggctcag-3’和5’-cggctaccttgttacgactt--3’扩增细菌16S rDNA片段。测序工作在英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。所得序列与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的16S rDNA序列进行分析比对。并用MEGA4软件构建系统发育树(图1)。结果显示该菌与NCBI公布的凝结芽孢杆菌HM-08的同源性最高(99％)，结合生理生化试验结果，该菌被鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
表1 菌株生理生化特征
项目 结果 项目 结果
形成芽孢 + D-葡萄糖 +
革兰氏染色 + D-甘露醇 -
接触酶 + D-甘露糖 +
氧化酶 + L-阿拉伯糖 -
V-P测定 + D-木糖 +
空气中生长 + 淀粉 +
45℃生长 + 明胶液化 －
15℃生长 + 酪氨酸水解 －
pH9.6生长 + 柠檬酸利用 －
pH4.5生长 + 硫化氢产生 －
6.5％NaCl生长 + 吲哚产生 －
实施例2 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的溶血性测试
将分离的到的凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196划线接种到新鲜的血液培养基上，37℃培养24小时。经观察，未发现溶血环。表明该菌株没有溶血活性，是较为安全的菌株。
实施例3 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的抑菌能力测试
将三角瓶中的100mL营养肉汤琼脂(含1％葡萄糖)融化，冷却至45℃。分别加入100ul过夜培养的海豚链球菌和无乳链球菌，混匀，倒入无菌平板，每皿倒入15-20ml。每个平板上预先放置2只牛津杯，琼脂凝固后将牛津杯取出，平板上形成琼脂孔。向琼脂孔中加入150μL待测菌液，设置3个重复，盖好皿盖，小心移至37℃培养箱，平皿正放，静置培养。同时与市售的两种凝结芽孢杆菌菌粉进行对比。培养20小时后，打开皿盖，用卡尺测量抑菌圈直径。通过试验，发现凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196对海豚链球菌和无乳链球菌有显著的抑菌效果(表2)，抑菌圈直径是市售同类产品的2 倍以上。
表2 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196对链球菌的抑制效果
Figure BDA0001158300450000071
注：凝结芽孢杆菌A为山东向日葵生物科技有限公司凝结芽孢杆菌菌粉，凝结芽孢杆菌B为沧州旺发生物技术研究所有限公司生产的凝结芽孢杆菌菌粉。
实施例4 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196降解亚硝酸盐能力测试
1、标准曲线绘制：称取分析纯亚硝酸钠配置浓度梯度标准溶液，各取200至96孔板中，每孔先后加入格里斯试剂A、B各 20μL。用酶标仪测定550nm波长下的吸光值。以吸光值为横坐标，亚硝酸钠浓度为纵坐标绘制标准曲线。
2、亚硝酸盐降解培养基配制：罗非鱼饲料1g(粉碎，80目)，亚硝酸钠2.5mg，加蒸馏水至1000mL，分装到250mL三角瓶中，每瓶100mL，表明覆盖5mL石蜡油，以隔绝空气。121℃高压灭菌 20min。
3、菌株降解亚硝酸盐能力测定：将过夜培养的菌液按1％接种量转接到亚硝酸盐降解培养基中，在第0小时、24小时和48小时分别取发酵液1ml，离心。吸取200μL上清液至96孔板中，先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于波长550nm测定吸光值。根据标准曲线计算发酵液中亚硝酸钠的浓度。试验发现凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196可以有效降解亚硝酸盐，24小时由初始的2.50mg/L可降到 0.25mg/L，降解率达到90％，到48小时几乎全部降解(表3)。
表3 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196对亚硝酸盐的降解效果
反应时间 0小时 24小时 48小时
亚硝酸钠浓度 2.50mg/L 0.25mg/L 0.02mg/L
降解率 0 90％ 99.2％
实施例5 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196菌粉的制备方法
凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的制备方法，包括如下的步骤：
1、平板培养复壮：将凝结芽孢杆菌菌种接种于MRS平板培养基上，于42℃培养14h，使菌复壮，并形成单菌落；
2、一级种子液的制备：从平板上挑取单菌落，接种于装有 MRS液体培养基的三角瓶(100mL/250mL)中，置于42℃摇床培养约10h，100rpm，OD600nm在0.7以上，获得一级种子液；
3、二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子液5ml接种于装有500mL MRS液体培养基的三角瓶中(接种2瓶)，置于42℃摇床100rpm上培养约7h，OD600nm在0.7以上，获得二级种子液；
4、凝结芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照3～10％的接种量接种到装有0.5M3发酵培养基的发酵罐中，温度42℃，转速250rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1：0.8，培养 18h，至芽孢形成率90％以上，则中止发酵，得凝结芽孢杆菌发酵液，其活菌数为4×1010CFU/mL；
所述的发酵培养基为：葡萄糖1％，玉米面2％，豆粕2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.05％；
5、凝结芽孢杆菌菌粉的制备：在步骤4制备的发酵液中加入 25％的沸石粉，混匀，进行喷雾干燥，进风温度125℃，排风温度 50℃，雾化器转速15000～18000rpm，得到水分含量4％活菌数 1×1011CFU/g的菌粉。
实施例6 枯草芽孢杆菌CGMCC No.12195菌粉制备
1、种子培养基：0.5％牛肉膏、1.0％蛋白胨、0.5％氯化钠
2、发酵培养基：2.0％葡萄糖、4.0％大豆蛋白胨、0.16％硫酸镁、 0.3％磷酸氢二钾、0.3％磷酸二氢钾
3、培养条件：37℃，180rpm，24小时
4、所得发酵液中加入25％的淀粉，混匀，进行喷雾干燥，进风温度125℃，排风温度50℃，雾化器转速15000～18000rpm，得到水分含量4％，活菌数4×1010CFU/g的菌粉。
实施例7 约氏乳杆菌CGMCC No.4926菌粉制备
1、将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养 10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养8～10 小时后作为种子液；
2、以5％～10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；
3、发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、 NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～ 14小时，发酵过程不通气；
4、当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值 (即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌发酵液；
5、所得发酵液用高速冷冻离心机离心，5000rpm，4℃，10min。离心后弃上清得菌泥。用5.0％蔗糖，1.0％谷氨酸钠，1.0％抗坏血酸的水溶液搅拌菌泥混匀，在加入50％脱脂奶粉。先置于-80℃超低温冰箱冷冻，再置于真空冷冻干燥机干燥24-30h，取出粉碎，过60目筛。即得到活菌数为8×1010CFU/g的菌粉。
实施例8 含有凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的复合微生物制剂制备
将制备好的凝结芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、约氏乳杆菌菌粉按质量比1:1:1的比例复配，并用沸石粉进行稀释，使得得成品活菌总数达到1×109CFU/g；
将制备好的凝结芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、约氏乳杆菌菌粉按质量比5:3:2的比例复配，并用沸石粉进行稀释，使得得成品活菌总数达到1×109CFU/g；
实施例9 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196在制备罗非鱼微生物饲料中的应用
将活菌数为1×1010CFU/g的凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196菌粉按0.1％的添加量与罗非鱼饲料原料混合，经超微粉碎、调制、制粒、冷却、除粉、打包等工艺，加工成罗非鱼微生物饲料，饲料中凝结芽孢杆菌含量为0.8×107CFU/g。所述罗非鱼饲料原料配方为：豆粕35％，菜粕15％，面粉18％，棉粕10％，米糠10％，DDGS 5％，豆油3％，磷酸二氢钙2％，预混料2％。
选取50g左右的罗非鱼120条，分成4组，每组30条。试验组饲喂含有凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的罗非鱼微生物饲料，对照组1饲喂普通罗非鱼饲料(配料同上)；对照组2用氟多利(主要成分氟苯尼考粉，用量参考说明书)与普通饲料拌匀，然后进行饲喂对照组3饲喂含有凝结芽孢杆菌A(山东向日葵生物科技有限公司) 的饲料(制备方法同上)。饲喂一个月后进行海豚链球菌和无乳链球菌人工感染试验，方法如下：将海豚链球菌和无乳链球菌分别配成 2×108CFU/mL的菌液，两种菌液混合后，按饲料重量2.5％比例拌料，按正常采食量饲喂罗非鱼，连续感染7天。停止人工感染后，继续饲喂15天，观察记录死亡情况。从表4可以看出饲喂含有凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196饲料的试验组死亡率低于各对照组，效果最优。可见含有凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196的饲料可以有效防治链球菌病。
表4 人工感染试验结果
组别 死亡数/总数 死亡率
试验组 5条/30条 16.7％
对照组1 26条/30条 86.7％
对照组2 8条/30条 26.7％
对照组3 17条/30条 56.7％
注：凝结芽孢杆菌A为山东向日葵生物科技有限公司凝结芽孢杆菌菌粉；氟多利为广州利洋水产科技股份有限公司生产产品，主要成分为氟苯尼考。
实施例10 复合微生物制剂在罗非鱼养殖上的应用
池塘基本情况：地点位于广东茂名，选取5个面积10亩左右池塘，水深3米，每个池塘配备4台叶轮式增氧机。
试验采用单因子试验设计，罗非鱼苗平均初重11.2g左右，密度3000尾/亩。基础饲料配方为：豆粕35％，菜粕15％，面粉18％，棉粕10％，米糠10％，DDGS 5％，豆油3％，磷酸二氢钙2％，预混料 2％。
实验分成5组：池塘1饲喂基础饲料；池塘2在基础饲料中添加 0.1％凝结芽孢杆菌A(山东向日葵生物科技有限公司)；池塘3在基础饲料中添加0.1％“益多水乐”(复合微生物制剂，主要成分为枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等，上海国龙生物科技有限公司)；池塘4在基础饲料中添加0.1％实施例5制备的凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196菌粉；池塘5在基础饲料中添加0.1％实施例8所述复合微生物制剂。按上述配方将原料混合后，经超微粉碎、调制、制粒、冷却、除粉、打包等工艺，加工成罗非鱼饲料。
试验周期60天，测试指标如下：
增重率WG(％)＝(终均重-初均重)×100/初均重
成活率SR(％)＝试验结束时剩鱼尾数×100/试验开始放鱼尾数
饲料系数FCR＝饲料投喂量/(终末体重-初始体重)
肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、
血清中溶菌酶(LZM)的酶活力。
结果如表5所示：通过各个池塘对比可看出，饲料中添加本发明复合微生态制剂和凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196菌粉的池塘，罗非鱼的生长明显优于其他池塘，从肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和血清中溶菌酶(LZM)的酶活力来看，同样优于其他池塘。这说明本发明的微生态制剂或凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196菌粉能够促进罗非鱼的生长，提高肝脏超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)和血清中溶菌酶(LZM)的酶活力。
表5 复合微生态制剂对罗非生长及免疫指标的影响
Figure BDA0001158300450000121
实施例11 凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196在养殖环境改良中的应用
池塘基本情况：地点位于福建漳浦，池塘面积6亩，水深2.5 米，配备3台叶轮式增氧机，放养罗非鱼规格0.5斤/条，密度5500 尾/亩。选取4个池塘进行试验，试验池塘按0.5～1L/亩·米用量，全池泼洒所述的凝结芽孢杆菌发酵液，每天泼洒一次，连续泼洒3天；对照塘1按照说明书用量泼洒凝结芽孢杆菌A(山东向日葵生物科技有限公司)，方法同上；对照塘2按照说明书用量泼洒氟多利(主要成分氟苯尼考粉，用量参考说明书)；对照塘3泼洒亚硝克星(按说明书操作)；对照塘4正常管理，不用任何产品。于试验开始前和试验结束后检测池塘中链球菌数量和亚硝酸盐的含量，同时记录溶氧值。结果如表5所示。测试结果表明凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196发酵液的应用效果明显优于凝结芽孢杆菌A产品。亚硝酸盐浓度和链球菌数量在应用之后不反弹，作用较持久。氟多利在抑制链球菌方面效果虽然与本发明相当，但在停药后很快链球菌数量很快反弹。亚硝克星对亚硝酸盐的降解效果也是如此，用药有效果，停药后马上反弹。
表5 凝结芽孢杆菌在养殖水体环境改良中的应用
Figure BDA0001158300450000131
注：凝结芽孢杆菌A为山东向日葵生物科技有限公司凝结芽孢杆菌菌粉；氟多利为广州利洋水产科技股份有限公司生产产品，主要成分为氟苯尼考；亚硝克星为上海阳农生物科技有限公司产品，主要成分为离子螯合剂、增效剂、硝化促进剂和稳定剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建大北农水产科技有限公司
北京大北农科技集团股份有限公司
<120> 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggctacctt gttacgactt 20

Claims (9)

1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)菌株，其保藏号为CGMCC No.12196。
2.一种复合微生态制剂，其含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株。
3.根据权利要求2所述的复合微生态制剂，其特征在于，还含有枯草芽孢杆菌CGMCCNo.12195、约氏乳杆菌CGMCC No.4926和沸石粉。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1×108～1111CFU/g、枯草芽孢杆菌的活菌数为1×107～1110CFU/g、约氏乳杆菌的活菌数为1×108～1111CFU/g。
5.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株的菌粉制备方法，其特征在于，以凝结芽孢杆菌CGMCC No.12196为发酵菌株，经活化和发酵得到凝结芽孢杆菌发酵液，在发酵液中加入20～25％的辅料，进行喷雾干燥，得到水分含量低于5％，活菌数不低于5×1010CFU/g的菌粉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，喷雾干燥过程中，进风温度120～130℃，排风温度40～50℃，雾化器转速15000～18000rpm。
7.含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株的微生物饲料，其特征在于，饲料中所述的凝结芽孢杆菌含量为1×105CFU/g～107CFU/g。
8.权利要求7所述的微生物饲料的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株的菌粉添加到饲料中；或者，将权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株的菌粉与水混合制成菌悬液，将菌悬液与饲料拌匀；或者，将权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株的发酵液与饲料拌匀，使得饲料中所述的凝结芽孢杆菌含量为1×105CFU/g～107CFU/g。
9.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株在改良养殖水体环境中的应用，其特征在于，按0.5～1L/亩•米用量，全池泼洒权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株的发酵液，用于清除水体中的亚硝酸盐或降低水体中链球菌数量。
CN201611025225.8A 2016-11-22 2016-11-22 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料 Active CN108085265B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611025225.8A CN108085265B (zh) 2016-11-22 2016-11-22 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611025225.8A CN108085265B (zh) 2016-11-22 2016-11-22 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108085265A CN108085265A (zh) 2018-05-29
CN108085265B true CN108085265B (zh) 2021-09-28

Family

ID=62169416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611025225.8A Active CN108085265B (zh) 2016-11-22 2016-11-22 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108085265B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110669693A (zh) * 2019-10-24 2020-01-10 海南大学 一种提高尼罗罗非鱼耐盐性能的嗜盐芽孢杆菌及其应用
CN111748497B (zh) * 2020-07-07 2022-02-08 山东农业大学 一株大山芽孢杆菌及其在快速降解亚硝酸盐中的应用
CN111763644B (zh) * 2020-07-24 2023-05-09 天津开发区坤禾生物技术有限公司 一种防治鱼类肝胆综合症的复合菌剂及其制备方法和应用
CN111909868A (zh) * 2020-07-24 2020-11-10 天津开发区坤禾生物技术有限公司 一种防治草鱼厌食死鱼的复合菌剂及其制备方法和应用
CN115322921B (zh) * 2022-06-20 2024-04-12 中国农业大学 一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101390571A (zh) * 2007-09-21 2009-03-25 北京大北农科技集团有限责任公司 一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法
CN102399733A (zh) * 2011-12-14 2012-04-04 北京大北农科技集团股份有限公司 约氏乳杆菌及其菌剂、应用和预混料
WO2014076638A1 (es) * 2012-11-13 2014-05-22 Siegfried Rhein S.A. De C.V. Composición antiparasitaria de amplio espectro de nitazoxanida, probióticos y prebióticos
WO2015061755A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Phibro Animal Health Corporation Combination and/or composition comprising bacillus, and yucca, quillaja or both and a method for making and using
CN105130679A (zh) * 2015-09-22 2015-12-09 江苏农林职业技术学院 一种高效大水面渔用菌藻平衡生物肥
CN105462872A (zh) * 2014-09-11 2016-04-06 北京大北农科技集团股份有限公司 一种复合微生态制剂及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101390571A (zh) * 2007-09-21 2009-03-25 北京大北农科技集团有限责任公司 一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法
CN102399733A (zh) * 2011-12-14 2012-04-04 北京大北农科技集团股份有限公司 约氏乳杆菌及其菌剂、应用和预混料
WO2014076638A1 (es) * 2012-11-13 2014-05-22 Siegfried Rhein S.A. De C.V. Composición antiparasitaria de amplio espectro de nitazoxanida, probióticos y prebióticos
WO2015061755A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Phibro Animal Health Corporation Combination and/or composition comprising bacillus, and yucca, quillaja or both and a method for making and using
CN105462872A (zh) * 2014-09-11 2016-04-06 北京大北农科技集团股份有限公司 一种复合微生态制剂及其制备方法
CN105130679A (zh) * 2015-09-22 2015-12-09 江苏农林职业技术学院 一种高效大水面渔用菌藻平衡生物肥

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株凝结芽孢杆菌的分离鉴定及益生性研究;汪攀等;《中国畜牧兽医》;20170430;第44卷(第4期);第1195-1202页 *
凝结芽孢杆菌对病原菌的拮抗作用及对异育银鲫生长、免疫的影响;张维娜;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20160515(第5期);正文第6-7,9-31页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108085265A (zh) 2018-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108085265B (zh) 凝结芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂和饲料
CN103766650B (zh) 一种蛋鸡饲料添加剂及其制备
CN106260540B (zh) 一种用于教槽料的生物饲料及教槽料
CN109749957B (zh) 一种具有水产病原菌拮抗特性的格氏乳杆菌制剂的制备及应用
CN102067941B (zh) 一种饲用复合微生物制剂的生产方法
CN106957810B (zh) 一种乳酸片球菌及其用途
CN106260504B (zh) 一种利用啤酒酵母泥生产微生物发酵湿饲料的方法
CN103614307A (zh) 一种固体海洋红酵母制剂及其制备方法和应用
CN109423465A (zh) 一种控制黄曲霉毒素b1的复合生物制剂及其应用
CN104673726A (zh) 一种猪源嗜酸乳杆菌冻干制剂及其应用
CN106721026A (zh) 一种无抗蛋鸡产蛋期复合预混合饲料及其制备方法与应用
CN111700157A (zh) 一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂
CN1057563C (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN110982753A (zh) 凝结芽孢杆菌mes847、菌剂、鸡饲料、制备方法及应用
CN114921385A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在饲料添加和无抗养殖中的应用
CN105524855A (zh) 一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用
CN107189947B (zh) 蛹虫草固态发酵生产富耐热蛋白酶及虫草素的饲料添加剂的方法
CN102925374B (zh) 酿酒酵母新菌株，及含有其的饲料添加剂，配合料
JP5128020B2 (ja) 海洋由来のＢａｃｉｌｌｕｓｂａｒｂａｒｉｃｕｓＳＣＳＩＯ０２４２９及びこれを用いたイカオリゴペプチドの調製方法
CN104381596A (zh) 一种鸡用饲料添加剂产品
CN114790428B (zh) 一种提高肉食性水产动物健康和生长的预消化饲料
CN105961824A (zh) 一种鸡用饲料添加剂产品
CN115572691A (zh) 一种含植物乳杆菌的水产发酵剂及其制备方法和应用
CN107183352A (zh) 一种抗菌肽生物饲料的制备工艺
KR101670955B1 (ko) 양식어류용 사료 조성물 및 이를 이용하여 양식시킨 양식어류

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 100080, Zhongguancun building, No. 27 Zhongguancun street, Beijing, Haidian District, China, 14 floor

Patentee after: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd.

Patentee after: Fujian Dabei nonghuayou Aquatic Technology Group Co.,Ltd.

Address before: 100080, Zhongguancun building, No. 27 Zhongguancun street, Beijing, Haidian District, China, 14 floor

Patentee before: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd.

Patentee before: FUJIAN DABEINONG FISHERIES SCIENCE & TECHNOLOGY Co.,Ltd.