CN109897803B - 一种水产益生菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水产益生菌剂，包括沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW‑GJ106，所述沼泽红假单胞菌HEW‑GJ106于2018年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17021。所述水产益生菌剂还包括粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母菌中的一种或几种。本发明还提供上述水产益生菌剂的制备方法和应用。本发明的益生菌剂不但可以提高水产动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动物的生产性能、免疫性能和抗逆性。

Description

一种水产益生菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及益生菌剂，具体涉及一种水产益生菌剂及其制备方法和应用，更具体涉及一种含沼泽红假单胞菌的水产益生菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

益生菌作为饲用添加剂的积极作用已被公认，但也存在急待解决的问题：(1)目前国内已确认的适宜作益生菌的菌种仅有乳酸杆菌、链球菌、芽孢杆菌、双歧杆菌以及酵母菌等12种；(2)活菌制剂在饲料加工、运输、贮存过程中容易失去活性，降低生物活性作用；(3)活菌制剂进入动物消化道后多难以经受低pH值的盐酸、胆汁酸等的作用，难以有足够的活菌数量到达肠道或定植肠道而发挥作用；(4)活菌制剂进入肠道后生长速度慢，难以在微生物竞争中处于优势地位，形成优势菌群。因此，有些益生菌剂在实验室条件下虽具有良好的效果，但在生产条件下往往难以达到预期效果。为了提高益生菌剂的利用率，人们正在积极探索提高益生菌剂有效性的方法。

随着养殖业的发展，由于养殖水体恶化、化学药品长期使用导致药物残留等都会影响养殖动物的生长，甚至会对养殖动物造成伤害，间接危害人类健康。而且水产动物的养殖难免要面临各种应激因素的刺激如水污染、长途运输、缺氧、气候骤变等，不同的应激反应会影响动物的正常发育，并导致机体免疫力下降，诱发疾病甚至死亡。现有的水产益生菌剂成分单一，功能单一，达不到治理养殖水体的作用，仅对一种恶劣环境应激反应有效，效果不理想。因此，越来越多的人开始关注益生菌对水产养殖环境的修复作用，这样既能降低成本，又不会产生二次污染，还能解决水体中剩余饵料、排泄物、及其他有害物质大量积累的问题，达到净化水质的目的，从而使水产动物处于健康状态。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于，提供一种水产益生菌剂及其制备方法和应用，以解决水产益生菌剂中菌种生物活性低等问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种水产益生菌剂，包括沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)HEW-GJ106于2018年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.17021，分类命名为沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustris。

作为优选，其中所述水产益生菌剂还包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)中的一种或几种。

作为优选，其中当所述水产益生菌剂由沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)HEW-GJ106、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)组成时，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)混合的质量比为(1-3):(1-2):(1-2):(0.5-1):(1-4):(0.5-1)。

作为优选，其中所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106是从河北某水产养殖场的养殖水底泥中分离的光合细菌沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106。

为了达到上述目的，本发明提供了一种上述水产益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将菌种的发酵液进行离心分离获得其的活性菌泥；

2)将步骤1)得到的活性菌泥与稳定化保护剂按(0.5-3):(1-4)的质量比均匀混合，得菌湿粉；将该菌湿粉进行预冷冻，然后进行冷冻干燥，以得到所述水产益生菌剂。

作为优选，其中所述均匀混合的时间为15-30min，搅拌转速为25-65r/m。

作为优选，其中所述预冷冻的温度为-20～-45℃，冷冻干燥的温度为-40～-70℃。

作为优选，其中所述菌种包括沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106。

作为优选，其中所述菌种还包括包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)中的一种或几种。

作为优选，其中当所述菌种由沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)组成时，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)混合的质量比为(1-3):(1-2):(1-2):(0.5-1):(1-4):(0.5-1)。

作为优选，其中所述沼泽红假单胞菌HEW-GJ106通过以下培养方法得到：

S11.将-20℃冷冻保存(20wt％甘油)的沼泽红假单胞菌HEW-GJ106解冻后，在无菌条件下于光合细菌培养基上划线，20-40℃，光照强度为1500-5000LX，培养3-6d，获得沼泽红假单胞菌HEW-GJ106单菌落，挑取1-2环单菌落于种子培养基中，20-40℃，光照强度为1500-5000LX，培养3-6d，获得沼泽红假单胞菌HEW-GJ106种子液，活性达到4.2×10⁸-1.0×10¹⁰CFU/mL；

S12.取步骤S11得到的沼泽红假单胞菌HEW-GJ106种子液接种于35L二级发酵培养基，进行二级发酵；

S13.将步骤S12得到的二级发酵培养液接种于三级发酵培养基中，进行三级发酵。

作为优选，其中所述光合细菌培养基成分按重量百分比计的具体组成为：碳酸氢钠0.1-2％；七水硫酸镁0.01-0.1％；硫酸铵0.04-1％；磷酸氢二钾0.01-0.2％；氯化钠0.01-0.3％；乙酸钠0.05-2％；酵母粉0.05-1％，琼脂0.8-2％；余量为水，pH6.0-8.0。更优选为：碳酸氢钠0.5％；七水硫酸镁0.05％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.05％；氯化钠0.02％；乙酸钠0.5％；酵母粉0.15％；琼脂1.5％；余量为水，pH7.0±0.2。

作为优选，其中所述种子培养基成分按重量百分比计的具体组成为：胰蛋白胨0.05-1.0％；酵母提取物0.05-1.0％；乙酸钠0.05-1.0％；丙酸钠0.1-1.0％；七水硫酸镁0.01-0.5％；无水氯化钙0.01-0.1％；氯化铵0.02-0.2％；磷酸氢二钾0.05-0.5％；氯化镁0.01-0.2％；碳酸氢钠0.1-1.0％；氯化钠0.05-0.5％；余量为水，pH7.0±0.2；更优选为：胰蛋白胨0.5％；酵母提取物0.15％；乙酸钠0.6％；丙酸钠0.4％；七水硫酸镁0.03％；无水氯化钙0.04％；氯化铵0.06％；磷酸氢二钾0.05％；氯化镁0.03％；碳酸氢钠0.5％；氯化钠0.08％；余量为水，pH7.0±0.2。

作为优选，其中所述二级发酵培养基和三级发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：蛋白胨0.02-1.0％；酵母膏0.02-1.0％；乙酸钠0.02-1.0％；硫酸铵0.01-0.5％；氯化钙0.01-0.1％；磷酸氢二钾0.01-0.2％；氯化镁0.01-01％；氯化铵0.01-0.2％；余量为水，pH7.0±0.2；更优选为：蛋白胨0.2％；酵母膏0.2％；乙酸钠0.8％；硫酸铵0.05％；氯化钙0.02％；磷酸氢二钾0.06％；氯化镁0.06％；氯化铵0.04％；余量为水，pH7.0±0.2。

作为优选，其中所述二级发酵和三级发酵的培养条件均为：发酵温度25-37℃，装液量40-80％(v/v)，pH值5.5-8.5，光照强度1500-5000LX，发酵时间72-120h；更优选为：发酵温度为30℃，装液量75％(v/v)，pH值7.2，光照强度4000LX，发酵时间90h。

本发明沼泽红假单胞菌HEW-GJ106具有显著的益生性，可有效抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellasp.)嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的生长繁殖，可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能；而且其繁殖速度快、益生性更强、既能提高动物生产性能又能改善水质的益生性更强。

作为优选，其中所述粪肠球菌通过以下培养方法得到：

S21.将甘油保存的粪肠球菌，于MRS平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于MRS斜面上划线培养，斜面菌种挑取1-2环接种于液体种子培养基，得到活菌浓度为10⁹CFU/mL的种子液；种子液的培养基和培养条件与摇瓶发酵的培养基和培养条件相同)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养。

S22.取3mL种子液接种于300mL摇瓶种子培养基中，发酵温度30-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.5-7.5，转速为100-300r/m，得到摇瓶种子液；取该摇瓶种子液接种于二级发酵种子培养基，装液量为40-80％，接种量为0.4-1.2％，发酵温度为30-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.5-7.5，搅拌转速100-300r/min，得到二级发酵罐种子液；

S23.取步骤S22得到的二级发酵罐种子液接种于三级发酵培养基，装液量为40-80％，接种量为0.4-1.2％，发酵温度为30-45℃，发酵时间6-12h，pH值6.5-7.5，搅拌转速80-100r/mi，发酵时间8h得到发酵液。

所述液体种子培养基、摇瓶种子培养基、二级发酵种子培养基按重量百分比计的具体组成为：蔗糖1-5％；大豆蛋白胨0.5-2.5％；酵母提取物0.1-1.0％；MgSO₄·7H₂O 0.05-0.2％；MnSO₄·4H₂O 0.01-1.0％；NaCl 0.1-2.0％；柠檬酸二铵0.1-0.5％；CaCO₃ 0.1-1.0％；余量为水；pH7.0±0.2；其中；优选为：蔗糖2.5％；大豆蛋白胨1.8％；酵母提取物0.4％；MgSO₄·7H₂O 0.2％；MnSO₄·4H₂O 0.045％；NaCl 0.2％；柠檬酸二铵0.2％；CaCO₃0.6％；余量为水，pH7.0±0.2。

所述三级发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：红糖0.1-1.8％；大豆蛋白胨0.1-1％；酵母提取物0.1-1.5％；硫酸镁0.05-1％；硫酸锰0.005-0.1％；氯化钠0.05-1.2％；柠檬酸二铵0.1-1.5％；碳酸钙0.05-0.5％；消泡剂0.001-0.1％；余量为水；pH5.5-6.8。更优选为：红糖1.5％；大豆蛋白胨0.5％；酵母提取物0.4％；硫酸镁0.2％；硫酸锰0.045％；氯化钠0.2％；柠檬酸二铵0.5％；碳酸钙0.1％；消泡剂0.005％；余量为水，pH6.6。

作为优选，其中所述植物乳杆菌通过以下培养方法得到：

S31.将甘油保存的植物乳杆菌于MRS平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于MRS斜面上划线培养，30-45℃培养16-40h，将斜面加入1-3mL灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液0.5-1.5mL转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，培养条件为：发酵温度30-45℃，转速为150-220r/m，发酵时间5-20h，制成摇瓶发酵液；

S32.取步骤S31得到的摇瓶发酵液接种于二级发酵培养基，进行二级发酵培养；

S33.将步骤S32得到的二级发酵培养液接种于三级发酵培养基中，进行三级发酵培养。

作为优选，其中所述种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-2％；蔗糖0.5-2.5％；酵母膏0.5-2％；胰蛋白胨0.5-1.5％；磷酸氢二钾0.02-0.10％；硫酸镁0.01-0.15％；氯化钠0.1-0.5％；碳酸钙0.1-0.5％；余量为水，pH6.8±0.2；更优选为：葡萄糖0.5％；蔗糖1.2％；酵母膏0.8％；胰蛋白胨1.0％；磷酸氢二钾0.05％；硫酸镁0.05％；氯化钠0.25％；碳酸钙0.17％；余量为水，pH6.8±0.2。

作为优选，其中所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-45℃，转速为150-220r/m，发酵时间5-20h；更优选为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。

作为优选，其中所述二级发酵培养基和三级发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：蔗糖1-4％；玉米淀粉0.5-2.0％；玉米浆干粉1-3％；酵母提取物0.5-3％；磷酸氢二钾0.01-0.15％；硫酸镁0.01-0.2％；氯化钠0.1-0.5％；碳酸钙0.05-0.4％；硫酸锰0.01-0.05；余量为水；pH6.8±0.2；优选地；由下述组分组成：蔗糖1.5％；玉米淀粉2.0％；玉米浆干粉1.2％；酵母提取物1.4％；磷酸氢二钾0.08％；硫酸镁0.05％；氯化钠0.2％；碳酸钙0.15％；硫酸锰0.03％；余量为水，pH6.8±0.2。

作为优选，其中所述二级发酵培养和三级发酵培养的条件为：发酵温度为30-45℃，发酵时间5-20h，搅拌转速100-220r/min；优选为发酵温度为37℃，搅拌转速120r/min，发酵时间10h。

作为优选，其中所述乳酸片球菌通过以下培养方法得到：

S41.将甘油保存的乳酸片球菌，于MRS平板上划线分离培养获得单菌落，30-45℃，20-72h，优选为：30℃，24h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30-45℃，120-200r/min，震荡培养20-72h，获得一级种子液；

S42.将一级种子液按照0.5-3％(V/V)的接种量接种于50L发酵罐中，进行二级发酵，发酵5-14h获得二级种子液；

S43.将二级种子液按照0.5-2.5％(V/V)的接种量接种于5000L发酵罐中，进行三级发酵，发酵15-30h获得乳酸菌片球菌发酵液。

作为优选，其中所述种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-2.5％；乳糖0.5-2.5％；酵母提取物0.2-2.0％；蛋白胨0.5-2.0％；硫酸镁0.01-1.0％；磷酸氢二钾0.01-0.5％；碳酸钙0.05-0.5％；氯化钠0.05-1.0％；硫酸锰0.01-0.5％；余量为水，pH6.8±0.2。更优选为：葡萄糖1.5％；乳糖0.5％；酵母提取物0.4％；蛋白胨1.5％；硫酸镁0.05％；磷酸氢二钾0.02％；碳酸钙0.15％；氯化钠0.2％；硫酸锰0.02％；余量为水，pH6.8±0.2。

作为优选，其中所述二级、三级发酵培养共同的条件为：装液量为30％-65％(V/V)，发酵温度为25-40℃，搅拌转速为80-150r/min。更优选为：装液量为55％(V/V)，发酵温度40℃，搅拌转速为100r/min。

作为优选，其中所述二级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-1.5％；蔗糖1.0-2.5％；酵母膏0.5-2.0％；牛肉浸膏0.5-2.0％；硫酸镁0.01-0.2％；磷酸氢二钾0.01-0.15％；碳酸钙0.05-1.02％；氯化钠0.05-0.5％；硫酸锰0.01-0.2％；吐温800.05-0.15％；余量为水，pH5.8-7.2。更优选为：葡萄糖1.2％；蔗糖1.5％；酵母膏0.8％；牛肉浸膏1.4％；硫酸镁0.06％；磷酸氢二钾0.04％；碳酸钙0.2％；氯化钠0.1％；硫酸锰0.04％；吐温80 0.05％，余量为水，pH6.5±0.2。

作为优选，其中所述三级发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：蔗糖0.5-2.0％；糖蜜0.5-2.0％；红糖0.5-2.0％；酵母提取物0.5-2.5％；玉米浆干粉0.1-2.0％；硫酸镁0.01-0.2％；磷酸氢二钾0.01-0.15％；硫酸锰0.01-0.2％；吐温80 0.05-0.15％；余量为水，pH5.8-7.2。优选为：蔗糖1.0％；糖蜜0.8％；红糖0.5％；酵母提取物0.75％；玉米浆干粉0.8％；硫酸镁0.07％；磷酸氢二钾0.05％；硫酸锰0.1％；吐温80 0.11％，余量为水；pH6.5±0.2。

作为优选，其中所述枯草芽孢杆菌通过以下培养方法得到：

S51.将甘油保存的枯草芽孢杆菌，于牛肉膏蛋白胨平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨斜面上划线培养，取枯草芽孢杆菌斜面菌种1-2环接种于一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为20-45℃、转速100-200r/min，发酵时间10-20h，得到一级种子液；

S52.将一级种子液转接到二级种子培养基中，接种量为1-2％(v/v)，装液量为30％-75％、发酵温度为20-45℃、拌转速100-180r/min，发酵时间5-10h，得到二级种子液；

S53.将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量为2-6％(v/v)，接种后，温度控制在20-45℃，搅拌转速120-180r/m，培养30-48h得到枯草芽孢杆菌发酵液。

作为优选，其中所述斜面培养基为牛肉膏或蛋白胨培养基；

作为优选，其中所述一级、二级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-2.5％；玉米浆干粉0.1-1.2％；豆粕粉0.5-2.5％；酵母提取物0.05-1％；MgSO₄·7H₂O0.01-0.5％；MnSO₄·4H₂O 0.01-0.6％；余量为水，pH6.0-8.5；更优选为：葡萄糖2％；玉米浆干粉0.6％；豆粕粉2％；酵母提取物0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.1％；MnSO₄·4H₂O 0.02％；余量为水，pH7.0±0.2；

作为优选，其中所述发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：红糖0.5-2.2％；酵母粉0.1-1.8％；玉米粉0.4-1.5％；NaCl0.1-1.2％；MgSO₄·7H₂O 0.05-0.8％；MnSO₄·4H₂O 0.01-0.2％；余量为水，pH6.0-8.5；更优选为：红糖1.5％；酵母粉0.5％；玉米粉1.5％；NaCl0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.1％；MnSO₄·4H₂O 0.02％；余量为水，pH7.0±0.2。

作为优选，其中所述酿酒酵母菌通过以下培养方法得到：

S61将甘油保存的酿酒酵母，于PDA平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于PDA斜面上划线培养，.取酿酒酵母菌斜面菌种1-2环接种于100-400mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为20-35℃、转速100-200r/min，发酵时间8-15h，得到一级种子液；

S62.将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为1-2％(V/V)，装液量为30-70％、发酵温度为20-35℃、搅拌转速80-150r/min，发酵时间5-10h，得到二级种子液；

S63.将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量5-10％(V/V)，接种后，温度控制在20-35℃，搅拌转速100-150r/m，培养30-72h得到酿酒酵母菌发酵液。

作为优选，其中所述斜面培养基为PDA培养基；

作为优选，其中所述一级、二级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-3％；酵母粉0.5-2.5％；大豆蛋白胨1-3％；余量为水，pH6.2-7.8；更优选为：葡萄糖2％；酵母粉1％；大豆蛋白胨2％；余量为水，pH7.0±0.2；

作为优选，其中所述发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：糖蜜0.2-2.8％；酵母提取物0.1-2.2％；黄豆饼粉0.5-3.0％；余量为水，pH6.2-7.8。更优选为：糖蜜2％；酵母提取物0.7％；黄豆饼粉1.2％；余量为水，pH7.0±0.2。

作为优选，其中所述的稳定化保护剂按重量百分比计的具体组成为：玉米淀粉1-10％；微晶纤维素1-5％；海藻酸钠1-15％；羧甲基纤维素钠1-5％；葡聚糖0.5-5％；羟丙基甲基纤维素1-5％；甘油1-5％；卡拉胶3-5％；低聚寡糖1-5％；低聚木糖1-5％；脱脂奶粉1-10％；麦芽糊精1-8％，余量为水。

作为优选，其中所述沼泽红假单胞菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为1.42:2，对应的所述稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉7.25％；微晶纤维素1.24％；海藻酸钠3.66％；羧甲基纤维素钠2.2％；葡聚糖0.82％；羟丙基甲基纤维素3.72％；甘油4.35％；卡拉胶3％；低聚寡糖2.64％；低聚木糖4.86％；脱脂奶粉8.67％；麦芽糊精5.84％，余量为水。

作为优选，其中所述粪肠球菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为0.64:1，对应的所述稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉5.42％；微晶纤维素2.16％；海藻酸钠1.85％；羧甲基纤维素钠1.48％；葡聚糖0.55％；羟丙基甲基纤维素2.64％；甘油3.72％；卡拉胶2.26％；低聚寡糖1.96％；低聚木糖3.48％；脱脂奶粉9.46％；麦芽糊精4.23％，余量为水。

作为优选，其中所述植物乳杆菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为0.86:1，对应的所述稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉6.78％；微晶纤维素2.14％；海藻酸钠3.66％；羧甲基纤维素钠2.25％；葡聚糖1.32％；羟丙基甲基纤维素2.18％；甘油3.98％；卡拉胶3.54％；低聚寡糖1.12％；低聚木糖3.69％；脱脂奶粉7.58％；麦芽糊精6.47％，余量为水。

作为优选，其中所述乳酸片球菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为1.14:1.5，对应的所述稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉6.48％；微晶纤维素2.54％；海藻酸钠3.24％；羧甲基纤维素钠1.62％；葡聚糖1.58％；羟丙基甲基纤维素2.58％；甘油3.26％；卡拉胶2.27％；低聚寡糖3.48％；低聚木糖4.25％；脱脂奶粉7.56％；麦芽糊精6.28％，余量为水。

作为优选，其中所述枯草芽孢杆菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为1.75:2，对应的所述稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉8.78％；微晶纤维素2.15％；海藻酸钠3.17％；羧甲基纤维素钠1.28％；葡聚糖1.97％；羟丙基甲基纤维素1.88％；甘油5.63％；卡拉胶2.62％；低聚寡糖1.59％；低聚木糖5％；脱脂奶粉9.28％；麦芽糊精4.95％，余量为水。

作为优选，其中所述酿酒酵母菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为0.48:1，对应的所述稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉5.87％；微晶纤维素1.16％；海藻酸钠2.25％；羧甲基纤维素钠1.89％；葡聚糖1.24％；羟丙基甲基纤维素4.26％；甘油3.68％；卡拉胶3.16％；低聚寡糖1.24％；低聚木糖3.59％；脱脂奶粉9.85％；麦芽糊精4.79％，余量为水。

为了达到上述目的，本发明提供了一种上述水产益生菌剂在水产饲料或池塘养殖中的应用。

作为优选，其中所述应用包括：将益生菌剂作为添加剂，添加到水产饲料或直接撒入池塘养殖水中。

作为优选，其中所述沼泽红假单胞菌在水产饲料中的添加量为10⁵-10⁷CFU/g饲料；所述沼泽红假单胞菌在池塘养殖中的添加量为10⁶-10⁸CFU/mL。

本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.9353，分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.12554，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

本发明提供的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)HEW-P27，已于2018年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.15419，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明的益生菌剂不但可以提高水产动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动物的生产性能、免疫性能和抗逆性，降低了生产成本，提高了经济效益。

2.本发明的益生菌剂可以改善养殖水质，降低氨氮和亚硝酸盐含量，提高溶氧含量。表明本水产微生态制剂能够降解水体中有机物如饵料、浮游生物残体、排泄物、有机碎屑等，避免有机废物在池中的积累，还可减少池塘中的有机耗氧，间接增加水体溶氧，从而能够保证有机物的氧化、暗话、硝化、反硝化的正常循环，从而保持良好的水质。

3.本发明的益生菌剂用量较少，例如在水产饲料中仅为106CFU/g时即可发挥显著作用，具体表现在：

1)可显著提高鲤鱼的生产性能且净化鱼塘水质。

2)可显著提高罗非鱼的生产性能、免疫性能及抗逆性。

3)可显著提高凡纳滨对虾的生产性能、免疫性及抗逆性，适合大规模推广使用。

4)可显著提高中华绒螯蟹生长性能、免疫性能及抗病力。

附图说明

图1为本发明的沼泽红假单胞菌的菌落形态图；

图2为本发明的沼泽红假单胞菌的革兰氏染色图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例进行说明。

以下各种材料或试剂，若非特别说明，均为市售。

实施例1各菌种发酵液的制备

⑴沼泽红假单菌发酵液制备

将-20℃冷冻保存的沼泽红假单胞菌HEW-GJ106解冻后，在无菌条件下于光合细菌培养基上划线，30℃，光照强度为3500LX，培养4d，获得沼泽红假单胞菌HEW-GJ106单菌落，挑取单菌落于种子培养基中，30℃，光照强度为3500LX，培养4d，获得沼泽红假单胞菌HEW-GJ106种子液，活性达到10⁹CFU/mL。

本发明提供的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106具有以下微生物学特征：沼泽红假单胞菌HEW-GJ106是革兰氏阴性菌，在光合细菌培养基上生长迅速，30℃光照培养4d形成的菌落较小，呈红色、圆形、边缘整齐且表面光滑、湿润、直径0.1mm-1.0mm，菌落形态如图1，显微镜下菌体呈杆状，稍有弯曲，厌氧或微氧环境下生长良好，经革兰氏染色后菌株形态如图2；沼泽红假单胞菌HEW-GJ106的生长温度：4℃-45℃；最适pH值为4-10；光照强度：1000-5000LX。沼泽红假单胞菌HEW-GJ106最适生长温度：25℃-35℃；最适pH值为5.5-8.5；最适光照强度：2500-4000LX。部分生理生化特性如表1。沼泽红假单胞菌接触酶试验、明胶液化试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、硫化氢试验及柠檬酸试验均为阳性，V-P试验和甲基红试验为阴性，可利用甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、蔗糖、葡萄糖、硫代硫酸钠、丙三醇等，

表1沼泽红假单胞菌HEW-GJ106部分生理生化特性

注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。

所述的光合细菌培养基按重量百分比计的具体组成为：碳酸氢钠0.5％；七水硫酸镁0.05％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.05％；氯化钠0.02％；乙酸钠0.5％；酵母粉0.15％；琼脂1.5％；余量为水，pH7.0±0.2。

所述的种子培养基按重量百分比计的具体组成为：胰蛋白胨0.5％；酵母提取物0.15％；乙酸钠0.6％；丙酸钠0.4％；七水硫酸镁0.03％；无水氯化钙0.04％；氯化铵0.06％；磷酸氢二钾0.05％；氯化镁0.03％；碳酸氢钠0.5％；氯化钠0.08％；余量为水，pH7.0±0.2。

取沼泽红假单胞菌HEW-GJ106种子液接种于50L光合细菌发酵罐中(37.5L发酵培养基)，进行二级发酵培养。

所述的发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：蛋白胨0.2％；酵母膏0.2％；乙酸钠0.8％；硫酸铵0.05％；氯化钙0.02％；磷酸氢二钾0.06％；氯化镁0.06％；氯化铵0.04％；余量为水，pH7.0±0.2。

所述50L发酵罐的发酵条件为：发酵温度为30℃，装液量75％，pH值7.2，光照强度4000LX，发酵时间90h。

将二级发酵培养液接种于500L光合细菌发酵罐中，进行三级发酵。

500L发酵罐培养基、发酵条件与50L发酵罐相同。

发酵结束后，检测发酵液活菌数为3.6×10¹⁰CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。

⑵粪肠球菌发酵液制备

将甘油保存的粪肠球菌，于MRS平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于MRS斜面上划线培养，斜面菌种挑取1-2环接种于液体种子培养基35℃、180r/min培养3-5h，得到种子液(活菌浓度为10⁹CFU/mL)；取3mL种子液接种于300mL摇瓶种子培养基中35℃、180r/min培养6h，得到摇瓶种子液；取0.30L摇瓶种子液接种于装有30L发酵种子培养基的50L发酵罐中，35℃、110r/min发酵3-5h，得到发酵罐种子液；取30L发酵罐种子液接种于装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中，5-38℃，80-100r/min，培养6-12h得到发酵液；

所述液体种子培养基、摇瓶种子培养基、发酵罐种子培养基按重量百分比计的具体组成为：蔗糖2.5％；大豆蛋白胨1.8％；酵母提取物0.4％；MgSO₄·7H₂O 0.2％；MnSO₄·4H₂O 0.045％；NaCl 0.2％；柠檬酸二铵0.2％；CaCO₃ 0.6％；余量为水，pH7.0±0.2；

所述发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：红糖1.5％；大豆蛋白胨0.5％；酵母提取物0.4％；硫酸镁0.2％；硫酸锰0.045％；氯化钠0.2％；柠檬酸二铵0.5％；碳酸钙0.1％；消泡剂0.005％；余量为水，pH5.5-6.8。

⑶植物乳杆菌发酵液制备

将甘油保存的植物乳杆菌，于MRS平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡15h，制成种子液。可取种子液1-5mL(种子液其活菌浓度以10⁹CFU/mL计)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养。将摇瓶发酵液接种于二级发酵培养基，进行二级发酵培养；将二级发酵培养液接种于三级发酵培养基中，进行三级发酵培养。

所述种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5％；蔗糖1.2％；酵母膏0.8％；胰蛋白胨1.0％；磷酸氢二钾0.05％；硫酸镁0.05％；氯化钠0.25％；碳酸钙0.17％；余量为水，pH6.8±0.2。

其中摇瓶发酵的条件为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。

二级发酵培养的培养基(以50L发酵罐培养)按重量百分比计的具体组成为：蔗糖1.5％；玉米淀粉2.0％；玉米浆干粉1.2％；酵母提取物1.4％；磷酸氢二钾0.08％；硫酸镁0.05％；氯化钠0.2％；碳酸钙0.15％；硫酸锰0.03％；余量为水，pH6.8±0.2。

二级发酵条件包括：发酵温度为37℃，搅拌转速120r/min，发酵时间10h。

50L发酵罐中试发酵条件：装液量为30L培养基，接种量为300mL摇瓶种子液。

三级扩大培养与二级发酵培养的培养基和培养条件相同。

三级发酵培养以5T发酵罐培养，5T发酵罐培养基与二级发酵培养基相同。5T发酵罐发酵条件为：装液量为3.5T培养基，接种量为30L，发酵温度为37℃，搅拌转速110r/min，发酵时间20h得植物乳杆菌发酵液。

⑷乳酸片球菌发酵液制备

将甘油保存的乳酸片球菌，于MRS平板上划线分离培养获得单菌落，30℃培养24h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得一级种子液。将一级种子液按照1％(V/V)的接种量接种于50L发酵罐中，进行二级发酵，发酵7h获得二级种子液。将二级种子液按照1％(V/V)接种于5000L发酵罐中，进行三级发酵，发酵24h获得乳酸菌片球菌发酵液。

所述种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖1.5％；乳糖0.5％；酵母提取物0.4％；蛋白胨1.5％；硫酸镁0.05％；磷酸氢二钾0.02％；碳酸钙0.15％；氯化钠0.2％；硫酸锰0.02％；余量为水，pH6.8±0.2。

其中，二级、三级发酵培养共同的条件为：装液量为55％，发酵温度40℃，搅拌转速为100r/min。

二级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖1.2％；蔗糖1.5％；酵母膏0.8％；牛肉浸膏1.4％；硫酸镁0.06％；磷酸氢二钾0.04％；碳酸钙0.2％；氯化钠0.1％；硫酸锰0.04％；吐温80 0.05％；余量为水，pH6.5±0.2。

三级发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：蔗糖1.0％；糖蜜0.8％；红糖0.5％；酵母提取物0.75％；玉米浆干粉0.8％；硫酸镁0.07％；磷酸氢二钾0.05％；硫酸锰0.1％；吐温80 0.11％；余量为水，pH6.5±0.2。

⑸枯草芽孢杆菌发酵液制备

将甘油保存的枯草芽孢杆菌，于牛肉膏蛋白胨平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨斜面上划线培养，取枯草芽孢杆菌斜面菌种1-2环接种于300mL的一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，酵温度为37℃、转速200r/min，发酵时间15h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量1.2％、装液量为60％、发酵温度为37℃、拌转速150r/min，发酵时间8h得到二级种子液，将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量3％，接种后，温度控制在37℃，搅拌转速140r/m，培养40h得到枯草芽孢杆菌发酵液。

作为优选，其中所述斜面培养基为牛肉膏或蛋白胨培养基；

所述一级、二级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖2％；玉米浆干粉0.6％；豆粕粉2％；酵母提取物0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.1％；MnSO₄·4H₂O 0.02％；余量为水，pH7.0±0.2；

所述发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：红糖1.5％；酵母粉0.5％；玉米粉1.5％；NaCl0.5％；MgSO₄·7H₂O 0.1％；MnSO₄·4H₂O 0.02％；余量为水，pH7.0±0.2。

⑹酿酒酵母菌发酵液制备

将甘油保存的酿酒酵母，于PDA平板上划线分离培养获得单菌落，用接种环挑取单菌落于PDA斜面上划线培养，取酿酒酵母菌斜面菌种1-2环接种于300mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为28℃、转速120r/min，发酵时间12h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为2％(V/V)，装液量为60％(V/V)、发酵温度为28℃、搅拌转速120r/min，发酵时间8h，得到二级种子液，将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量5％，接种后，温度控制在28℃，搅拌转速100r/m，培养48h得到酿酒酵母菌发酵液。

所述斜面培养基为PDA培养基；

所述一级、二级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖2％；酵母粉1％；大豆蛋白胨2％；余量为水，pH7.0±0.2；

所述发酵培养基按重量百分比计的具体组成为：糖蜜2％；酵母提取物0.7％；黄豆饼粉1.2％；余量为水，pH7.0±0.2。

实施例2水产益生菌剂的制备

将沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的发酵液进行离心分离(8000r/m，时间是根据发酵液的量不同时间不同，一般40分钟能出一批菌泥)获得各菌种的活性菌泥。分别将各菌种的活性菌泥与稳定化保护剂按质量比(0.5-3):(1-4)于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀混合25min，搅拌转速40r/m，得菌湿粉，然后将菌湿粉进行与冷冻，然后进行冷冻干燥后得各菌种的益生菌菌粉。

所述的稳定化保护剂由按重量百分比计的原料均匀混合制备：玉米淀粉1-10％；微晶纤维素1-5％；海藻酸钠1-15％；羧甲基纤维素钠1-5％；葡聚糖0.5-5％；羟丙基甲基纤维素1-5％；甘油1-10％；卡拉胶3-5％；低聚寡糖1-5％；低聚木糖1-5％；脱脂奶粉1-10％；麦芽糊精1-8％，余量为水。

优选为：沼泽红假单胞菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为1.42:2，对应的稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉7.25％；微晶纤维素1.24％；海藻酸钠3.66％；羧甲基纤维素钠2.2％；葡聚糖0.82％；羟丙基甲基纤维素3.72％；甘油4.35％；卡拉胶3％；低聚寡糖2.64％；低聚木糖4.86％；脱脂奶粉8.67％；麦芽糊精5.84％，余量为水。

优选为：粪肠球菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为0.64:1，对应的稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉5.42％；微晶纤维素2.16％；海藻酸钠1.85％；羧甲基纤维素钠1.48％；葡聚糖0.55％；羟丙基甲基纤维素2.64％；甘油3.72％；卡拉胶2.26％；低聚寡糖1.96％；低聚木糖3.48％；脱脂奶粉9.46％；麦芽糊精4.23％，余量为水。

优选为：植物乳杆菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为0.86:1，对应的稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉6.78％；微晶纤维素2.14％；海藻酸钠3.66％；羧甲基纤维素钠2.25％；葡聚糖1.32％；羟丙基甲基纤维素2.18％；甘油3.98％；卡拉胶3.54％；低聚寡糖1.12％；低聚木糖3.69％；脱脂奶粉7.58％；麦芽糊精6.47％，余量为水。

优选为：乳酸片球菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为1.14:1.5，对应的稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉6.48％；微晶纤维素2.54％；海藻酸钠3.24％；羧甲基纤维素钠1.62％；葡聚糖1.58％；羟丙基甲基纤维素2.58％；甘油3.26％；卡拉胶2.27％；低聚寡糖3.48％；低聚木糖4.25％；脱脂奶粉7.56％；麦芽糊精6.28％，余量为水。

优选为：枯草芽孢杆菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为1.75:2，对应的稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉8.78％；微晶纤维素2.15％；海藻酸钠3.17％；羧甲基纤维素钠1.28％；葡聚糖1.97％；羟丙基甲基纤维素1.88％；甘油5.63％；卡拉胶2.62％；低聚寡糖1.59％；低聚木糖5％；脱脂奶粉9.28％；麦芽糊精4.95％，余量为水。

优选为：酿酒酵母菌活性菌泥与稳定化保护剂的质量比为0.48:1，对应的稳定化保护剂按重量百分比计的组成为：玉米淀粉5.87％；微晶纤维素1.16％；海藻酸钠2.25％；羧甲基纤维素钠1.89％；葡聚糖1.24％；羟丙基甲基纤维素4.26％；甘油3.68％；卡拉胶3.16％；低聚寡糖1.24％；低聚木糖3.59％；脱脂奶粉9.85％；麦芽糊精4.79％，余量为水。

水产益生菌剂是将沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌菌剂及辅料按照3:1:2:0.5:3:1:4的重量比例均匀混合而成，活性为200亿CFU/g。

所述辅料按重量百分比计的原料组成为：低聚异麦芽糖1-5％；低聚木糖2-10％；葡萄糖0.5-5％，优选为：低聚异麦芽糖3.6％；低聚木糖5.8％；葡萄糖4.3％。

实施例3水产益生菌剂的制备

沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌各菌剂的制备同实施例2，水产益生菌剂是将沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌菌剂及辅料按照2:1.2:2.1:0.8:3.2:1:2的重量比例均匀混合而成，活性为500亿CFU/g。

所述的辅料各组分的重量百分比同实施例2。

实施例4水产益生菌剂的制备

沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌各菌剂的制备方法同实施例2。

优选为：沼泽红假单胞菌活性菌泥与保护剂的质量比为1.5:1，对应的稳定化保护剂各组分的重量百分比同实施例2。

优选为：粪肠球菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.97:1，对应的稳定化保护剂各组分的重量百分比同实施例2。

优选为：植物乳杆菌活性菌泥与保护剂的质量比为1:1，对应的稳定化保护剂各组分的重量百分比同实施例2。

优选为：乳酸片球菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.85:1，对应的稳定化保护剂各组分的重量百分比同实施例2。

优选为：枯草芽孢杆菌活性菌泥与保护剂的质量比为1.75:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

优选为：酿酒酵母菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.56:1，对应的稳定化保护剂各组分的重量百分比同实施例2。

水产益生菌剂是将沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌菌剂及辅料按照3:1:2:0.5:3:1:4的重量比例均匀混合而成，活性为1000亿CFU/g。

所述辅料各组分的重量百分比同实施例2。

实施例5水产益生菌剂的制备

沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌各菌剂的制备方法同实施例2。

优选为：沼泽红假单胞菌活性菌泥与保护剂的质量比为1.25:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

优选为：粪肠球菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.8:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

优选为：植物乳杆菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.8:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

优选为：乳酸片球菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.8:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

优选为：枯草芽孢杆菌活性菌泥与保护剂的质量比为1.2:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

优选为：酿酒酵母菌活性菌泥与保护剂的质量比为0.5:1，对应的稳定化保护剂的重量百分比同实施例2。

水产益生菌剂是将沼泽红假单胞菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌菌剂及辅料按照3:1.5:2.4:0.8:2.8:1:3.2的重量比例均匀混合而成，活性为800亿CFU/g。

所述辅料的重量百分比同实施例2。

实施例6鲤鱼生产性能及水质净化试验

选择择6个大小且水质相近的池塘，每个池塘鲤鱼投放1500尾/亩，同时搭配放养白鲢120尾/亩、花鲢50尾/亩，标记为1、2、3、4、5、6号池，1-3号池为对照组，4-6号池为微生态组。对照组饲喂基础日粮(见表1)，试验组在基础日粮中添加100g/t实施例2所制备的水产用微生态制剂。从试验开始每天定时、定点投喂饵料。每天喂4次(8:00、11:00、14:00、17:00)，投喂量为体重的2％～3％，水温为21-28℃，水体pH值为7.5左右。预饲期10d，试验期50d。分别于试验的开始、结束后，进行打样称重。计算增重率、饵料系数。每一周检测1次水质，氨氮、亚硝酸盐、pH值、溶解氧采用便携式水质分析仪测定。

表1基础日粮组成及营养水平

由表2可见，试验组比对照组增重提高12.45％，差异显著(P<0.05)，饵料系数降低0.43，差异显著(P<0.05)。这说明本发明的水产微生态制剂能够调节鱼类肠道健康，提高饲料消化率。

表2水产微生态制剂对鲤鱼生长性能的影响

项目	对照组	试验组
			初重/g	58.26±0.28<sup>a</sup>	58.21±0.22<sup>a</sup>
末重/g	184.69±1.18<sup>a</sup>	200.39±1.34<sup>b</sup>
			增重	126.43±1.54<sup>a</sup>	142.18±2.09<sup>b</sup>
饵料系数	1.37±0.03<sup>b</sup>	0.94±0.01<sup>a</sup>
			成活率	91％	100％

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

取鱼的前、中、后肠内容物,用稀释液逐级稀释后检测大肠杆菌和乳酸菌数，结果如表3所示，从表3的数据可以看出，饲料中添加水产微生态制剂显著提高鲤鱼鱼肠道内乳酸杆菌菌群数(P<0.05)，显著降低鲤鱼鱼肠道大肠杆菌菌群数(P<0.05)。

表3水产微生态制剂对鱼肠道乳酸菌和大肠杆菌的影响lg(cfu/g)

项目	对照组	试验组
			乳酸菌	5.68±0.12<sup>a</sup>	7.89.±0.18<sup>b</sup>
大肠杆菌	7.43±0.11<sup>b</sup>	5.13±0.12<sup>a</sup>

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

由表4可知，随着水产微生态制剂制剂的添加，水体中氨氮、亚硝酸盐的含量逐渐降低，水体中溶氧逐渐升高。试验第4周，试验组氨氮、亚硝酸盐含量较对照组分别降低51.52％、68.12％，差异显著(P<0.05)，水体中溶氧量提高7.32％，差异显著(P<0.05)。试验第6周，试验组氨氮、亚硝酸盐含量较对照组分别降低72.58％、70.97％，差异显著(P<0.05)，水体中溶氧量提高12.95％，差异显著(P<0.05)。试验第8周，试验组氨氮、亚硝酸盐含量较对照组分别降低90.7％、92.19％，差异显著(P<0.05)，水体中溶氧量提高17.01％，差异显著(P<0.05)。结果表明沼泽红假单胞菌制剂提高了饲料中氮和磷的利用率，同时随粪便排泄到水中的，沼泽红假单胞菌制剂能够继续分解水体中的残饵、粪便等，净化了水质，降低了水体中有毒有害物质的含量。

表4水产微生态制剂对鱼塘水质的影响

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

实施例7罗非鱼生长性能、免疫性能及抗逆性试验

选择大小、体长相近的健康罗非鱼，随机分为两组，对照组和试验组，分别养在6个大小且水质相近的池塘，标记为1、2、3、4、5、6号池，1-3号池为对照组，4-6号池为微生态组。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加100g/t实施例2制备水产益生菌剂。从试验开始每天定时、定点投喂饵料。每天喂3次(8:00、12:00、17:00)，连续饲喂60d，分别于试验的开始每10天进行打样称重。计算增重率、饵料系数。每一周检测1次水质，氨氮、亚硝酸盐、pH值、溶解氧采用便携式水质分析仪测定。

一、提高罗非鱼的生长性能

由表5可知，在试验期间试验组罗非鱼生长状况良好，没有死亡。与对照组相比，第20、40、60天的增重率均显著高于对照组，分别比对照组提高了16.39％、30.42％、21.27％(P<0.05)，饵料系数分别比对照组降低0.12、0.45、0.44(P<0.05)，表明该水产益生菌剂可促进罗非鱼生长，降低饵料系数，节省成本。

表5水产微生态制剂对罗非鱼生长性能的影响

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

二、提高罗非鱼的免疫性能

从对照组和试验组分别随机取20尾罗非鱼，用浓度为6.0×10⁸CFU/mL的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)进行感染试验，每尾腹腔注射嗜水气单胞菌液0.5mL，各组继续饲喂原来的试验饲料饲养，记录感染12、24、36、48、72h内罗非鱼的死亡情况，计算存活率结果如表6所示，可知注射嗜水气单胞菌12h后，试验组只出现零星死亡情况，而对照组则死亡近半。随着感染时间的延长，对照组罗非鱼死亡数量明显在更多，存活率快速下降，试验组存活率下降缓慢，显著高于对照组(P<0.05)，表明该水产微生态制剂可提高罗非鱼的免疫力。

表6水产益生菌对罗非鱼感染后存活率的影响(％)

时间	对照组	试验组
			12h	52.47±3.46<sup>a</sup>	98.96±1.32<sup>b</sup>
24h	5.38±2.21<sup>a</sup>	95.62±2.26<sup>b</sup>
			48h	1.85±1.85<sup>a</sup>	90.44±1.87<sup>b</sup>
36h	1.85±1.85<sup>a</sup>	88.49±2.24<sup>b</sup>
			72h	1.85±1.85<sup>a</sup>	87.67±2.16<sup>b</sup>

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

三、提高罗非鱼的抗低氧性能

从对照组和试验组分别随机取20尾体重相近的罗非鱼，并进行标记后，同时放入盛有10％(V/V)的水族箱中，开始计时并观察罗非鱼的呼吸状况，待40尾试验鱼中有30尾停止鳃盖自主张合动作后，将水族箱中进行连续充氧继续观察2h，记录恢复自主呼吸的鱼体数量，评价鱼的耐低氧能力。结果如表7所示，试验组罗非鱼存活率高达95％，对照组则死亡过半，表明水产微生态制剂可提高罗非鱼的耐低氧能力。

表7水产益生菌对罗非鱼耐低氧能力的影响

时间	对照组	试验组
			实验数(尾)	20	20
死亡数(尾)	10	1
			存活率(％)	50	95

四、提高罗非鱼的抗运输能力

从对照组和试验组分别随机取200尾体重相近的罗非鱼，并进行标记后，置于同一辆长途运输鱼类的水箱中，在不充氧气的条件下，直到近一半的鱼开始死亡，记录不同组别鱼的死亡数，结果如表8所示，试验组罗非鱼存活率高达90.5％，表明水产微生态制剂可提高罗非鱼的抗运输能力。

表8水产益生菌对罗非鱼抗运输能力的影响

时间	对照组	试验组
			实验数(尾)	200	200
死亡数(尾)	63	19
			存活率(％)	68.5	90.5

五、提高罗非鱼的抗干旱能力

从对照组和试验组分别随机取50尾体重相近的罗非鱼，并进行标记后，分别放在干燥的木桶里，并用干燥的棉布覆盖，连续观察罗非鱼的状态，待50尾鱼中有40尾停止鳃盖自主张合动作后，将鱼全部放入玻璃水族箱中，连续充氧继续观察2h，记录恢复自主呼吸的鱼体数量，根据各组停止鳃盖自主张合时间和恢复自主呼吸的鱼的数量，评价罗非鱼的抗干旱能力。结果如表9所示，可知，试验组罗非鱼存活率高达90％，远远高于对照组，表明水产微生态制剂可提高罗非鱼的抗干旱能力。

表9水产益生菌对罗非鱼抗干旱能力的影响

时间	对照组	试验组
			实验数(尾)	50	50
死亡数(尾)	39	5
			存活率(％)	22	90

综上所述，可知在罗非鱼饲料中添加本发明的水产益生菌剂可以提高水产动物的生长性能，提高免疫力，提高对恶劣环境如低氧、运输、低盐度、离水的耐受性，从而提高存活率。

实施例8凡纳滨对虾的生长性能、免疫性能及抗逆性试验

选取体重5±0.02g的对虾600尾，随机分为两组，对照组和试验组，其中每个组6个重复，每个重复50尾，对照组饲喂原厂基础饲粮，试验组在原厂饲粮基础上添加100g/吨的实施例2制备的水产微生态制剂，每天换水量三分之一，饲喂两次，日投饲量为虾体质量的3％-5％，以实际摄食量为准，每次投饵前清理底部残饵和粪便，预饲养一周，饲养条件与预养殖条件相同，实验期6周。

一、提高凡纳滨对虾的生长性能

在养殖试验结束前，从每个重复随机抽取25尾进行称重，计算生长指标，存活率则从养殖开始到结束开始计算。由表10可知，试验组的增重率和存活率均显著高于对照组(P＜0.05)，分别比对照组提高了83.90％、88.90％，这充分体现了水产微生态制剂促进水产动物生长性能的优良特性，试验组饵料系数显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组降低0.55。表明本水产微生态制剂大大提高了对虾的生长速度，降低死亡率，提高了产量，从而大大提高养殖者的经济效益。

表10水产微生态制剂对凡纳滨对虾生长性能的影响

项目	对照组	试验组
			增重率％	100.73±2.36<sup>a</sup>	185.24±3.15<sup>b</sup>
饵料系数	2.26±0.07<sup>b</sup>	1.71±0.04<sup>a</sup>
			存活率％	52.14±0.57<sup>a</sup>	98.49±1.02<sup>b</sup>

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

二、维持肠道菌群平衡

从各重复随机挑取2尾虾，无菌条件虾解剖取其肠道，研磨后进行梯度稀释，检测凡纳滨对虾肠道中细菌总数、乳酸菌数及弧菌数。结果如表11所示，弧菌作为水体中的病原菌，试验组显著低于对照组(P＜0.05)，乳酸菌作为肠道中有益菌，试验组于对照组(P＜0.05)，充分表明本水产微生态制剂对病原弧菌有较强的抑制作用，还可提高肠道中有益菌的含量，维持肠道菌群平衡。

表11水产微生态制剂对凡纳滨对虾肠道微生物的影响lg(CFU/g)

项目	对照组	试验组
			细菌总数	8.14±0.25<sup>b</sup>	7.28±0.31<sup>a</sup>
乳酸菌数	6.29±0.22<sup>a</sup>	7.02±0.11<sup>b</sup>
			弧菌数	6.52±0.17<sup>b</sup>	3.64±0.24<sup>a</sup>

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

三、提高凡纳滨对虾的免疫功能

分别从每个重复中去8尾虾，从对虾围心腔内抽取血淋巴，注入无菌的1.5mL离心管，并与抗凝剂充分混合(以体积比1:2混合)，于无菌离心管中静置过夜，离心10min(3000r/min)，所得上清液用于测定免疫指标，主要检测对虾血清中过氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及酚氧化酶的活性。结果如表12所示，可知试验组过氧化物酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶及碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，分别比对照组提高41.45％、45.87％、65.47％、25.12％，表明本水产微生态制剂可以提高对虾的免疫功能。

表12水产微生态制剂对凡纳滨对虾免疫功能的影响

项目	对照组	试验组
			过氧化物酶(U/mL)	58.29±2.47<sup>a</sup>	82.45±3.26<sup>b</sup>
超氧化物歧化酶(U/mL)	214.34±9.85<sup>a</sup>	312.65±11.24<sup>b</sup>
			酸性磷酸酶(U/mL)	34.32±3.69<sup>a</sup>	56.79±5.83<sup>b</sup>
碱性磷酸酶(U/mL)	156.14±6.97<sup>a</sup>	195.36±13.66<sup>b</sup>

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

四、提高凡纳滨对虾的抗逆性

对对虾进行不同盐度(淡水、盐度4％)、高亚硝酸盐浓度(300mg/L)的抗逆性分析。盐度抗逆性试验在1L的烧杯中进行，每个烧杯中装0.5L含有不同浓度盐的水中(每个实验组每个盐度至少做3个重复，2.5wt％盐度组为对照组)，轻微曝气。对虾迅速放入提前准备好的装有不同盐度海水的烧杯中，每个烧杯30尾，每隔1h记录对虾的死亡数，直到一组对虾全部死亡。高浓度NO2-N抗逆性试验在1L的烧杯中进行，每个烧杯中装0.5LNO₂-N浓度为0.3g/L的海水(每个实验组3个重复，浓度为2.5wt％的普通海水为对照组)，轻微曝气，迅速将对虾放入烧杯中，每个烧杯40尾，每隔1h记录对虾死亡数，直到一组对虾全部死亡。结果如表13所示，淡水胁迫试验中对照组对虾在第8h全部死亡，而试验组仍有56.72％存活；4％盐度胁迫试验中对照组对虾在第4h全部死亡，而试验组仍有62.34％存活；高浓度亚硝酸盐胁迫试验中对照组对虾在第47h全部死亡，而试验组仍有42.65％存活，充分表明本水产微生态制剂可以有效提高对虾的抗逆性。

表13水产微生态制剂对凡纳滨对虾抗逆性的影响

项目	对照组	试验组
			淡水胁迫(7h)存活率％	0	56.72±6.54
4wt％盐度胁迫(3h)存活率％	0	62.34±7.89
			高浓度亚硝酸盐胁迫(47h)存活率％	0	42.65±4.77

五、提高凡纳滨对虾肠道的酶活力

分别从每个重复随机挑取2尾对虾，取肠道去肠道粪便，进行肠道淀粉酶和蛋白酶活菌检测，结果如表14所示，可知，与对照组相比，添加水产微生态制剂可以显著提高肠道淀粉酶活力和蛋白酶活力(P＜0.05)，分别提高了1.51倍和0.41倍。

表14水产微生态制剂对凡纳滨对虾肠道酶活力的影响(U/mg)

项目	对照组	试验组
			淀粉酶	5.12±0.36<sup>a</sup>	12.86±0.45<sup>b</sup>
蛋白酶	20.34±0.28<sup>a</sup>	28.72±0.39<sup>b</sup>

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

综上所述，在凡纳滨对虾饲料中添加本发明的水产益生菌剂可以提高其生长性能、免疫力、抗逆性、存活率及肠道酶活力，并能维持肠道菌群平衡。

实施例9河蟹生长性能、免疫性能及抗病力试验

选择6个较为相近的池塘进行试验，选择体格健壮、大小、体重规格相近的中华绒螯蟹随机分为两组，其中3个作为试验组，3个为对照组，对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮+100实施例2制备的水产微生态制剂，每天投饲2次，时间分别为7:00和18:00，投饲量以略有剩余为准。

一、提高中华绒螯蟹的生长性能

由表15可知，试验组的增重率和存活率均显著高于对照组(P＜0.05)，分别比对照组提高了124.69％、24.35％，这充分体现了水产微生态制剂促进水产动物生长性能的优良特性，试验组饵料系数显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组降低1.09。表明本水产微生态制剂大大提高了中华绒螯蟹的生长速度，降低死亡率，提高了产量，从而大大提高养殖者的经济效益。

表15水产微生态制剂对中华绒螯蟹生长性能的影响

项目	对照组	试验组
			增重率％	150.32±2.36<sup>a</sup>	336.82±11.24<sup>b</sup>
饵料系数	2.78±0.05<sup>b</sup>	1.69±0.09<sup>a</sup>
			存活率％	79.78±0.24<sup>a</sup>	99.21±0.14<sup>b</sup>

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

二、提高中华绒螯蟹的消化酶活性

试验结束后，随机从两组采集5只中华绒螯蟹，取其肠道去粪便，用双蒸水冲洗，滤纸吸干多余水分放入液氮中冷冻，然后置于-80℃保存，检测淀粉酶和蛋白酶活性。结果如表16所示，可知，与对照组相比，添加水产微生态制剂可以显著提高肠道淀粉酶活力和蛋白酶活力(P＜0.05)，分别提高了1.04倍和2.2倍。

表16水产微生态制剂对中华绒螯蟹消化酶活性的影响(U/mg)

项目	对照组	试验组
			淀粉酶	0.51±0.03<sup>a</sup>	1.04±0.02<sup>b</sup>
蛋白酶	0.86±0.06<sup>a</sup>	2.75±0.12<sup>b</sup>

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

三、提高中华绒螯蟹的抗病力

试验结束后，从每组随机取20只蟹，体腔注射致病性嗜水单胞菌(剂量为108CFU/kg)，记录接种2周后蟹的死亡率，结果如表17所示，可知，添加水产微生态制剂可显著提高抗病力，中华绒螯蟹感染后存活率提高了3.5倍。

表17水产益生菌对中华绒螯蟹感染后存活率的影响

时间	对照组	试验组
			实验数(只)	20	20
死亡数(只)	16	2
			存活率(％)	20	90

四、提高中华绒螯蟹的免疫力

试验结束后，随机从两组采集5只中华绒螯蟹，从蟹的第3或第4步足的基关节膜处抽取血淋巴液，自然凝固后，4℃10000r/min离心30min，上清液即为血清，用于测定部分免疫指标。结果如表18所示，可知试验组过酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，分别比对照组提高74.94％、61.54％、14.62％、85.53％、44.27％，表明本水产微生态制剂可以提高中华绒螯蟹的免疫功能。

表18水产微生态制剂对中华绒螯蟹免疫力的影响(U/mL)

项目	对照组	试验组
			酚氧化酶活性	8.78±0.42<sup>a</sup>	15.36±0.39<sup>b</sup>
溶菌酶活性	0.13±0.02<sup>a</sup>	0.21±0.02<sup>b</sup>
			超氧化物歧化酶活性	132.67±11.08<sup>a</sup>	152.07±8.24<sup>b</sup>
酸性磷酸酶活性	7.88±0.09<sup>a</sup>	14.62±0.11<sup>b</sup>
			碱性磷酸酶活性	3.23±0.17<sup>a</sup>	4.66±0.25<sup>b</sup>

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

五、维持中华绒螯蟹的肠道菌群平衡

试验结束后，随机从两组采集5只中华绒螯蟹，取其肠道检测其好氧菌、厌氧菌、乳酸菌、气单胞菌、大肠杆菌，结果如表19所示，可知，与对照组相比，试验组好氧菌减少，厌氧菌略有增多，其中乳酸菌含量显著增加(P＜0.05)，病原气单胞菌和大肠杆菌显著降低(P＜0.05)。

表19水产微生态制剂对中华绒螯蟹肠道菌群的影响(lgCFU/g)

项目	对照组	试验组
			好氧菌	8.62±0.35<sup>a</sup>	7.88±0.26<sup>b</sup>
厌氧菌	7.56±0.29<sup>a</sup>	7.89±0.34<sup>a</sup>
			乳酸菌	6.48±0.16<sup>a</sup>	7.27±0.13<sup>a</sup>
气单胞菌	7.92±0.38<sup>b</sup>	5.24±0.22<sup>a</sup>
			大肠杆菌	6.93±0.17<sup>b</sup>	5.35±0.16<sup>a</sup>

实施例10净化鱼塘和虾塘水质的试验

设计对照组和试验组，试验组用实施例2中的水产微生态制剂对养殖鱼虾蟹池塘使用，使用前将其稀释十倍后溶解于水中，进行全池喷洒，且每月使用一次，对照组为空白对照，不使用水产微生态制剂，一周后分别取鱼塘、虾塘及蟹池的水样，检测溶氧、氨氮、亚硝酸盐、硫化氢、COD含量、pH、大肠杆菌数等。结果如表20所示，鱼塘、虾塘及蟹池试验组氨氮、亚硝酸盐、硫化氢均未检出，COD含量、pH及大肠杆菌数均低于对照组(P<0.05)，溶氧高于对照组，分别提高了1.08倍、2.85倍、0.69倍。表明本水产微生态制剂能够降解水体中有机物如饵料、浮游生物残体、排泄物、有机碎屑等，避免有机废物在池中的积累，还可减少池塘中的有机耗氧，间接增加水体溶氧，从而能够保证有机物的氧化、暗话、硝化、反硝化的正常循环，从而保持良好的水质。

表20水产微生态制剂对鱼塘和虾塘水质的影响

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种水产益生菌剂，其特征在于，益生菌剂由沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)HEW-GJ106、粪肠球菌(Enterococcus faecalis) HEW-A131、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）HEW-A490、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）HEW-P27、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)组成，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris) HEW-GJ106于2018年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17021；所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)HEW-GJ106是从河北某水产养殖场的养殖水底泥中分离，其最适生长温度为25℃-35℃；最适pH值为5.5-8.5；最适光照强度为2500-4000LX；所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis) HEW-A131已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 9353；所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）HEW-A490已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12554；所述乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）HEW-P27，已于2018年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15419。

2.如权利要求1所述的水产益生菌剂，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)混合的质量比为(1-3): (1-2): (1-2): (0.5-1): (1-4): (0.5-1)。

3.一种权利要求1或2所述的水产益生菌剂在制备水产饲料中的应用。

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