CN114149947A - 一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2‑0296的保藏编号为：CCTCC NO：M 20211236。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2‑0296能够产尿酸氧化酶，具有直接降解尿酸的能力；同时还具有黄嘌呤氧化酶的抑制活性，能够显著提高降尿酸和预防痛风的效果。

Description

一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
禽痛风是禽类的一种常见的营养代谢性疾病，发病原因主要是由于体内嘌呤代谢异常活跃导致尿酸生成过量，或因肾脏功能障碍所致肾脏排尿酸受阻造成体内尿酸水平过高。禽类与人类相似，在生物的进化过程中尿酸氧化酶基因发生突变，体内缺乏尿酸氧化酶，尿酸为嘌呤的最终代谢产物。近年来禽痛风发病率逐年上升，禽痛风发病的原因主要有：营养性因素、传染性因素、中毒性因素、饲养管理性因素、肠粘膜屏障功能损伤等。容易发生痛风的动物有鹅、鸡等。禽痛风常呈群体发生，有较高的发病率和病死率，患病后对禽类产蛋量、生长速度、繁育能力等方面影响较大，对饲养者的经济造成损害。
黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶是体内嘌呤代谢为尿酸过程中的关键酶。黄嘌呤氧化酶将次黄嘌呤转化为黄嘌呤，然后该酶将黄嘌呤转化为尿酸，因此抑制黄嘌呤氧化酶有助于减少尿酸的产生。尿酸氧化酶将尿酸转化成易溶于水的尿囊素，加速尿酸的排泄，尿酸氧化酶有利于尿酸的排泄。目前研究表明，直接使用尿酸氧化酶对结节性痛风、尿结石及肾病功能衰竭所致高尿酸血症有良效，但是会引起全身性荨麻疹样发痒等过敏反应，肌注局部发红。所以有必要开发能够产尿酸氧化酶同时抑制黄嘌呤氧化酶的益生菌，通过补充益生菌来间接发挥两种酶的作用，起到降尿酸的效果。
植物乳杆菌可产生酶、有机酸、细菌素、短链脂肪酸等物质，在机体内这些物质能够发挥抑制病原菌的作用。植物乳杆菌的定植还会限制有害微生物的生长，维持肠道的菌群平衡。植物乳杆菌还能刺激动物机体产生免疫球蛋白从而提高防病能力。植物乳杆菌在动物营养、肠道健康、机体免疫方面能够发挥巨大作用。
目前有少量关于植物乳杆菌在降尿酸或治疗痛风中的报道，例如，专利CN110055199A公开了一株植物乳杆菌UA149株，该菌株以核苷酸为氮源，将其利用，可减少嘌呤合成，可显著降低血清中尿酸水平，抑制黄嘌呤氧化酶活性。专利CN108048368A公开了一株植物乳杆菌UA-416株，该菌株可以有效降低血尿酸水平，提高尿素氮、肌酐水平，抑制血清中黄嘌呤氧化酶活性。专利CN112175860A公开了一株植物乳杆菌TCI227，该菌株能够降低痛风患者的尿酸值，达到治疗痛风的功效。但上述报道的植物乳杆菌多是通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来实现降低尿酸水平，而能够产尿酸氧化酶，同时还能抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌还未见有报道。因此，筛选能够产尿酸氧化酶，同时具有抑制黄嘌呤氧化酶效果的乳酸菌，具有重大意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明从蛋鸡肠道内容物中分离得到一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0296能够产尿酸氧化酶，具有直接降解尿酸的能力；同时还具有黄嘌呤氧化酶的抑制活性，能够显著提高降尿酸和预防痛风的效果。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296，该菌株已于2021年09月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学)，其保藏编号为：CCTCC NO：M 20211236。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296分离自蛋鸡肠道内容物，具有如下特征：
菌株BLCC2-0296在MRS琼脂培养基上生长20h，形成明显乳白色、圆形菌落，中央凸起，边缘光滑整齐。菌株BLCC2-0296在显微镜下观察呈杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性。
含有上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的菌剂也属于本发明的保护范围。
所述菌剂中除包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296外，还可包括辅料或载体基质等；如海藻糖、葡萄糖、羟甲基纤维素、糊精、可溶性淀粉等。
所述菌剂中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296可以以被培养的活菌或者活菌的发酵液的形式存在。
所述菌剂的剂型可以为液剂、乳剂、悬浮剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。
进一步的，本发明还提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的种子液接种至MRS液体培养基中，36-38℃发酵19-21h；发酵结束后离心，收集沉淀物，干燥，制备得到菌剂。
本发明的第二方面，提供上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296或者植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)制备具有降尿酸功能的产品；
(2)制备预防痛风的药物；
(3)制备降低肾脏和输尿管的尿酸盐沉积的药物；
(4)制备提高动物脾脏指数的产品。
本发明的第三方面，提供上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296在同时生产尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。
本发明的第四方面，提供一种同时生产尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
将保藏编号为CCTCC NO：M 20211236的植物乳杆菌BLCC2-0296的种子液接种至液体发酵培养基中，36-38℃发酵19-21h；发酵结束后离心，分别收集发酵上清液和菌体沉淀，其中：
所述发酵上清液中含有黄嘌呤氧化酶抑制剂；
将菌体沉淀洗涤，然后悬浮在Tris-HCl溶液中，并在冰浴条件下超声波破碎，得到菌体破碎液；将菌体破碎液离心，收集上清液，所述上清液中含有尿酸氧化酶。
优选的，上述方法中，所述液体发酵培养基中含有：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-80 1mL/L；调节pH至5.5-6.5。
优选的，上述方法中，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.05M，pH为8.0。
优选的，上述方法中，超声波破碎的破碎能量1000w，每次破碎3s，间隙3s，破碎30min。
优选的，上述方法中，菌体破碎液离心的条件为：12000r/min离心10min。
上述方法生产的尿酸氧化酶具有直接降尿酸的活性；黄嘌呤氧化酶抑制剂能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸的生成。将尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂组合使用，能够从直接和间接两方面起到降尿酸的效果，具有协同增效作用。
本发明的第五方面，提供一种降低个体的尿酸水平的方法，该方法包括给予面临高尿酸血症疾病风险或经诊断患有高尿酸血症的受试者防治有效量的上述保藏编号为CCTCC NO：M 20211236的植物乳杆菌BLCC2-0296或者菌剂。
保藏编号为CCTCC NO：M 20211236的植物乳杆菌BLCC2-0296或者菌剂的给药量是对降低受试对象的尿酸水平有效的用量。本领域技术人员很容易通过，例如计算受试对象血液中尿酸浓度的变化确定有效用量。
本发明的有益效果：
本发明首次分离得到一株植物乳杆菌BLCC2-0296，该菌株能够产尿酸氧化酶，同时还具有黄嘌呤氧化酶抑制活性，将其应用于降尿酸和预防痛风，具有显著的协同增效作用。
附图说明
图1为菌株BLCC2-0296的菌体形态(油镜观察)。
图2为菌株BLCC2-0296 PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果。
图3为菌株BLCC2-0296系统进化分析。
图4为菌株BLCC2-0296生长曲线。
图5为尿酸含量标准曲线。
图6为不同浓度的发酵上清液对黄嘌呤氧化酶的抑制率。
图7为试验的第0～21天死亡并有沉积的解剖图。
图8为试验的第21天有沉积的解剖图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明从蛋鸡肠道内容物中分离得到一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0296，结果意外的发现，与现有乳酸菌明显不同的是：该植物乳杆菌本身能够产尿酸氧化酶，具备直接降解尿酸的能力。
而且，本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296具有优异的耐酸、耐胆盐能力，可以在动物体内稳定定植；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的发酵代谢产物对黄嘌呤氧化酶也具有较高的抑制活性。因此，将本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296应用于动物体后，可以从直接和间接两个方面实现快速、高效降尿酸的效果，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-80 1mL/L；调节pH至5.5-6.5。
实施例1：菌株的分离和纯化
1、试验材料
1.1含尿酸的MRS琼脂培养基：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL/L、尿酸0.2g/L，pH6.0，琼脂1.5％，121℃灭菌30min。
1.2MRS琼脂培养基：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL/L、pH 6.0，琼脂1.5％，121℃灭菌30min。
1.3蛋鸡肠道内容物
取自山东淄博皇城镇蛋鸡养殖场的蛋鸡肠道内容物。
2、菌株分离和纯化
称量10g蛋鸡肠道内容物，加入装有90mL无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，于37℃下充分振荡摇匀。然后取摇匀后液体1mL注入含尿酸的MRS琼脂培养基上，用涂布棒均匀涂布，置于37℃培养24h。然后挑取培养后的单菌落在MRS琼脂培养基上进行划线，37℃培养24h后，挑取单菌落进行革兰氏染色，选出革兰氏染色结果为阳性的菌株，在斜面上进行保存。
3、结果
纯化得到9株菌，分别命名为BLCC2-0290、BLCC2-0291、BLCC2-0292、BLCC2-0293、BLCC2-0294、BLCC2-0295、BLCC2-0296、BLCC2-0297、BLCC2-0298，保藏于山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心。
实施例2：有降解尿酸能力的菌株的筛选
1、试剂
1.10.1mol/L磷酸钠溶液：称量分析纯磷酸钠38.0g，加水溶解后，转移到容量瓶定容至1L，用磷酸调节pH＝7.0。
1.2 0.2g/L尿酸-0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)：称取一定质量的尿酸溶解于0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)中，使尿酸浓度为0.2g/L。
2、尿酸检测：
尿酸(UA)检测试剂盒(比色法)，购自南京建成生物工程研究所。
3、菌株培养
将实施例1筛选出的9株菌BLCC2-0290、BLCC2-0291、BLCC2-0292、BLCC2-0293、BLCC2-0294、BLCC2-0295、BLCC2-0296、BLCC2-0297、BLCC2-0298分别进行活化培养，之后按4％(体积分数)接种量，分别接入MRS液体培养基中，于37℃培养20h。
4、降解过程
取上述培养得到的菌悬液2mL，于4℃、转速为5000r/min条件下离心10min，收集沉淀获得菌体。以生理盐水洗涤菌体，重复3次。在菌体中加入750μL的0.2g/L尿酸-0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)，空白对照为不加菌体的750μL的0.2g/L尿酸-0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)。在37℃、150r/min转速下反应1h，然后沸水浴10min终止反应，离心得上清。用试剂盒法测定尿酸含量，按如下公式计算尿酸降解率：
降解率％＝(C0-C)/C0×100％
C0：空白对照的尿酸浓度，g/L
C：反应后的尿酸浓度，g/L。
5、结果分析
表1不同菌株对尿酸的降解率
Figure BDA0003389573120000061
从筛选到的不同菌株降解尿酸的结果可以看出，降解尿酸效果最佳的菌株为菌株BLCC2-0296，对尿酸的降解率为30.01％，选取该菌株进行后续试验。
实施例3：耐酸和耐胆盐试验
1、耐酸试验
取发酵20h的BLCC2-0296菌悬液10mL，于3000r/min离心15min，弃上清，将菌体用生理盐水洗涤3次，先加入生理盐水5mL，用10mol/L的盐酸调节乳酸菌的菌悬液的pH值分别为2.0、3.0、4.0、6.0，然后用生理盐水定容至l0mL，于37℃处理2h。取菌悬液，在平皿上作菌落计数，从而计算出乳酸菌的存活率，以pH 6.0的菌液为对照。
存活率(％)＝(待测pH的菌液活菌数/pH 6.0的菌液活菌数)×100％
2、耐胆盐试验
取发酵20h的BLCC2-0296菌悬液按5％(v/v)接种于猪胆盐浓度分别为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％(w/v)的MRS培养基中，以不加胆盐的MRS培养基为对照，于37℃培养2h，取样进行平板菌落计数，计算乳酸菌存活率。
3、结果分析
3.1菌株BLCC2-0296的耐酸性试验结果
表2菌株BLCC2-0296的耐酸性试验结果
Figure BDA0003389573120000071
从表2中可以看出菌株BLCC2-0296在pH值2.0、3.0、4.0时的存活率分别为88.6％，93.7％，98.3％，结果表明该菌株具有较强的耐酸性。
3.2菌株BLCC2-0296的耐胆盐试验结果
表3菌株BLCC2-0296的耐胆盐试验结果
Figure BDA0003389573120000072
由表3可以看出，菌株BLCC2-0296在猪胆盐浓度为0.1％环境下存活率为100％。在猪胆盐浓度为0.3％时存活率为56.88％，存活率仍超过50％，因此能够在肠道内增殖。在猪胆盐浓度为0.4％时存活率仍可达到38.44％，因此，该菌株具有较好的耐胆盐效果。
实施例4：菌株鉴定
1、生理生化鉴定
根据分离菌的菌落和菌体形态，革兰氏染色以及生理生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株BLCC2-0296进行初步归属。
2、16S rDNA的扩增与序列分析
目的菌株接种于新鲜的MRS培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：1492r 5'-ggttaccttgttacgactt-3'，27f 5'-agagttgatcctggctcag-3'，PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等)，上下游引物各lμL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性l min，52℃退火l min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。
3、系统发育分析
登录GenBank对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索，并下载相关属种的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等软件进行同源性分析，并构建系统进化树。
4、结果分析
4.1形态观察
菌株BLCC2-0296在MRS琼脂培养基上生长20h，形成明显乳白色、圆形菌落，中央凸起，边缘光滑整齐。菌株BLCC2-0296在显微镜下观察呈杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性，如图1所示。
4.2生理生化性质
主要测试结果见表4。
表4菌株BLCC2-0296生理生化性质
Figure BDA0003389573120000081
注：“+”为阳性反应，“—”为阴性反应
4.3菌株BLCC2-0296的16S rDNA序列分析
菌株BLCC2-0296的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
菌株BLCC2-0296的16S rDNA PCR电泳图如图2所示，条带在1000～2000bp之间，约为1500bp。
将菌株BLCC2-0296的16S rDNA序列在NCBI中进行BLAST比对分析后发现其与Lactobacillus plantarum有较高的同源性(100％)。从Genebank中调取并下载相似性最大和该属内其他种相关的16S rDNA，利用MEGA3.1软件的Neighboring-joining方法构建系统发育树，如图3所示。
从图3中可知菌株BLCC2-0296与Lactobacillus plantarum自然聚为一支，经过同源性比对发现菌株BLCC2-0296与Lactobacillus plantarum的16S rDNA序列同源性超过99％。综合菌株BLCC2-0296的生理生化特点及16S rDNA系统进化分析，确定该菌株为乳酸杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
将菌株BLCC2-0296在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息为：保藏号为CCTCCNO：M 20211236，保藏日期为2021年09月29日，保藏单位地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072。
实施例5：生长曲线的测定
1、取发酵20h的BLCC2-0296菌悬液按照2％(体积分数)的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养，分别于0h、4h、8h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、28h、32h取样测定活菌数，以培养时间为横坐标，相应的活菌数的对数值为纵坐标，绘制生长曲线，确定菌株生长的阶段。后续试验采用稳定生长期的液体菌种作为种子液。
2、结果分析
由图4可以看出，菌体在2～12h内迅速生长，在4h左右进入对数期，随后进入稳定期，持续时间长，并在20h时活菌数最高为20.8×108CFU/mL。所以选择培养20h的处于稳定期的菌悬液作为种子液开展试验。
实施例6：植物乳杆菌BLCC2-0296体外降解尿酸试验
1、试剂
1.1 0.1mol/L磷酸钠溶液：称量分析纯磷酸钠38.0g，加水溶解后，转移到容量瓶定容至1L，用磷酸调节pH＝7.0。
1.2 0.10g/L尿酸-0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)：称取一定质量的尿酸溶解于0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)中，使尿酸浓度为0.10g/L。
2、尿酸检测：
尿酸(UA)检测试剂盒(比色法)，购自南京建成生物工程研究所。
3、乳酸菌发酵培养
将活化培养的植物乳杆菌BLCC2-0296的菌悬液按照2％(体积分数)的接种量，接入MRS液体培养基中，于37℃进一步富集培养20h，得到菌悬液。
4、降解过程
取上述植物乳杆菌BLCC2-0296菌悬液2mL，于4℃下转速为5000r/min条件下离心10min，收集沉淀获得菌体。以生理盐水洗涤菌体，重复3次。向菌体中加入750μL的0.10g/L尿酸-0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)，空白对照为不加菌体的750μL的0.10g/L尿酸-0.1mol/L磷酸钠溶液(pH＝7.0)。在37℃、150r/min转速下分别反应1h、3h、5h、7h、24h，然后沸水浴10min终止反应，离心得上清。用试剂盒法测定尿酸含量，计算尿酸降解率。
5、计算
降解率％＝(C0-C)/C0×100％
C0：空白对照的尿酸浓度，g/L
C：反应后的尿酸浓度，g/L
6、结果
表5植物乳杆菌BLCC2-0296对尿酸的降解情况
Figure BDA0003389573120000101
从表5中可以看出，植物乳杆菌BLCC2-0296与0.10g/L的尿酸反应24h，降解率为85.47％。
据了解，健康人的血清尿酸溶解度男性为416μmol/L(0.07g/L)，女性为357μmol/L(0.06g/L)，超出这个范围则会析出晶体，可确诊为高尿酸血症。禽类血清中尿酸含量超过480μmol/L(0.08g/L)，认为痛风高尿酸血症造模成功。本发明的植物乳杆菌BLCC2-0296主要是应用于体内降尿酸。因此，在进行体外试验时，本发明将尿酸的浓度设定为0.10g/L，通过考察其体外对该浓度的尿酸的降解效果，为其体内应用奠定了基础。
实施例7：尿酸氧化酶粗酶活的测定
1、试剂
0.05M Tris-HCl(pH 8.0)溶液：称量6.06gTris加入到1000mL烧杯中，然后加入950mL超纯水，分别用浓盐酸调pH至8.0，定容到1000mL。
2mM尿酸溶液：称量67mg的尿酸加入到250mL烧杯中，然后加入0.05M Tris-HCl(pH8.0)溶液定容到200mL。
0.4mM尿酸溶液：用移液管吸取50mL的2mM尿酸溶液至烧杯中，然后加入200mL的0.05M Tris-HCl(pH 8.0)溶液，充分混匀。
20％KOH溶液：称取KOH 20g，加入到80mL水中，充分溶解。
2、尿酸氧化酶酶活的测定原理
采用酶反应-紫外分光光度法，其原理是：尿酸氧化酶特异性地将尿酸氧化为尿囊素，尿酸在293nm有光吸收，通过检测尿酸的吸光度的降低来测定氧化酶的酶活性。酶活性单位定义：在30℃、pH8.0下，每分钟催化1μmol尿酸分解所需要的酶量定义为1个酶活力单位。
3、尿酸溶液标准曲线测定
试验组试管中分别加入4.0mL、3.8mL、3.6mL、3.4mL、3.2mL、3.0mL、2.8mL的0.05MTris-HCl(pH 8.0)溶液，然后依次加入0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL的0.4mM尿酸。空白管为4.0mL 0.05M Tris-HCl(pH 8.0)溶液。各管摇匀后静置约1min，加入20％KOH 0.5mL，混匀。以不加尿酸的空白管调零，用分光光度计测定293nm处的光吸收值A。以尿酸浓度对293nm处的光吸收值作图，得到尿酸浓度标准曲线，见图5。
4、粗酶液的制备
将植物乳杆菌BLCC2-0296接种到液体MRS培养基中，于37℃培养20h得到菌悬液。将菌悬液在4℃、8000r/min离心10min，通过离心获得的湿菌经0.05M Tris-HCl(pH8.0)溶液洗涤3次。将洗后的菌体悬浮在等体积的0.05M Tris-HCl(pH8.0)溶液中，并在冰浴条件下超声波破碎，破碎能量1000w，每次破碎3s，间隙3s，破碎30min。将菌体破碎液12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
5、粗酶活测定
测定管：先加入600μL 0.4mM尿酸溶液和3mL 0.5M Tris-HCl(pH8.5)溶液于试管中，于30℃水浴中保温10min。加入400μL适当稀释的粗酶液到试管中，准确反应10min后，加入0.5mL 20％KOH终止反应。
空白管：先加入600μL 0.4mM尿酸溶液和3mL 0.5M Tris-HCl(pH8.5)溶液于试管中，于30℃水浴中保温10min。先加入0.5mL 20％KOH，准确反应10min。再加入400μL适当稀释的粗酶液，立即混匀。
根据尿酸于293nm处的特征吸收，测定尿酸被尿酸氧化酶氧化生成尿囊素后，剩余尿酸在293nm处吸光值。
6、粗酶活力计算
在30℃、pH8.0下，每分钟催化1μmol尿酸分解所需要的酶量定义为1个酶活力单位。
Figure BDA0003389573120000121
Vt：总体积(4.5mL)，Vs：酶样品体积(0.4mL)，t：反应时间(10min)，K：尿酸标准曲线斜率，df：稀释倍数。
7、测定结果
经测定，由植物乳杆菌BLCC2-0296所生产的尿酸氧化酶的粗酶活为1.5U/mL。
实施例8：抑制黄嘌呤氧化酶的效果
1、试剂：
0.2mol/L Na2HPO4：称取35.8g Na2HPO4·12H2O溶于超纯水中定容至500mL；
0.2mol/LNaH2PO4：称取2.4g NaH2PO4溶于超纯水中定容至100mL。
0.2mol/L(pH7.5)磷酸盐缓冲液：将上述500mL 0.2mol/L Na2HPO4和50mL 0.2mol/L NaH2PO4混合即得0.2mol/L(pH7.5)磷酸盐缓冲液。
0.6mmol/L黄嘌呤溶液：称取黄嘌呤溶于1mL 1mol/L氢氧化钠溶液中，用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.6mmol/L的黄嘌呤溶液。
0.9U/mL黄嘌呤氧化酶：将黄嘌呤氧化酶溶解于少量0.2mol/L(pH7.5)磷酸盐缓冲液中，分装置于-20℃保存。用时取出配制成18U/mL、1.8U/mL、0.9U/mL浓度的酶溶液。
1mol/L NaOH溶液：称量40g氢氧化钠粉末，用少量蒸馏水溶解。冷却到室温。将冷却后的溶液转移到1L的容量瓶中定容。
1mol/L HCl溶液：量取分析纯浓盐酸(12mol/L)83mL，倒入预先盛有适量蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，将烧杯内的溶液移入1000mL标准容量瓶中进行定容。
2、抑制黄嘌呤氧化酶试验方法
2.1原理
黄嘌呤氧化酶可以催化黄嘌呤生成尿酸，产物尿酸在293nm处有特征吸收峰。利用紫外分光光度法通过测定反应体系在一定时间内吸光度值的变化，即尿酸的生成量，可以衡量黄嘌呤氧化酶活性的变化。
2.2发酵上清液抑制黄嘌呤氧化酶活性的试验方法
将植物乳杆菌BLCC2-0296接种到液体MRS培养基中，于37℃培养20h得到菌悬液。将菌悬液于4℃下转速为5000r/min，离心10min，收集得到发酵上清液。测定该上清液的pH为4.16。取部分上清液，用1mol/LNaOH溶液将pH调节至7.5。
抑制剂为上述两种发酵后的上清液(pH＝4.16和pH＝7.5)，反应体系为3.5mL，依次加入0.2mol/L(pH 7.5)磷酸盐缓冲液、0.6mmol/L黄嘌呤底物溶液、抑制剂(0.1mL和0.3mL)、0.9U/mL黄嘌呤氧化酶溶液，黄嘌呤氧化酶使用前先在25℃水浴下预温30min，依次加样后立即混匀，反应一定的时间，在293nm波长下测定吸光值。以空白组调零，测定样品组的吸光值A；以阴性对照组调零，测定阳性对照组吸光值B。抑制率的计算：黄嘌呤氧化酶抑制％＝(1-A/B)×100％。各组具体加样顺序及其加样量见表6。
表6上清液抑制黄嘌呤氧化酶加样情况
Figure BDA0003389573120000131
2.3发酵的菌体抑制黄嘌呤氧化酶活性的试验方法
将植物乳杆菌BLCC2-0296接种到液体MRS培养基中，于37℃培养20h得到菌悬液。将菌悬液于4℃下转速为5000r/min，离心10min，收集得到菌体。
抑制剂为上述发酵培养物的菌体，分别取上述1mL、2mL、3mL菌悬液离心后得到的菌体作为抑制剂。反应体系为4.3mL，依次加入0.2mol/L(pH 7.5)磷酸盐缓冲液、0.6mmol/L黄嘌呤底物溶液、抑制剂、0.9U/mL黄嘌呤氧化酶溶液，黄嘌呤氧化酶先在25℃下预温30min。依次加样后立即混匀，反应30min，加入浓度为1mol/L的HCl溶液终止反应。然后在4000r/min条件下离心10min，将上清液倒入比色皿中，在293nm波长下测定吸光值。以空白组调零，测定样品组的吸光值A；以阴性对照组调零，测定阳性对照组吸光值B。抑制率的计算：黄嘌呤氧化酶抑制％＝(1-A/B)×100％。具体加样顺序及其加样量见表7。
表7菌体抑制黄嘌呤氧化酶加样情况
Figure BDA0003389573120000141
3、结果与分析
表8上清液对黄嘌呤氧化酶的抑制率情况(上清液为0.1mL)
Figure BDA0003389573120000142
从表8可以看出：抑制率随着反应时间的增长而升高。pH＝4.16、pH＝7.5这两种发酵上清液与酶充分反应30min后，对黄嘌呤氧化酶的抑制率差别较小。当pH＝4.16的发酵上清液作为抑制剂加入量为100μL时，反应30min时对黄嘌呤氧化酶的抑制率为37.78％。
表9上清液对黄嘌呤氧化酶的抑制率结果(上清液为0.3mL)
Figure BDA0003389573120000143
从表9可以看出，当抑制剂加入量为300μL时，反应5min时对黄嘌呤氧化酶的抑制率可达100％。考虑到发酵上清液是酸性，会影响酶活反应，所以采用调至中性的上清液进行对比，发现两种发酵上清液对黄嘌呤氧化酶的抑制效果较好，排除了低pH抑制黄嘌呤氧化酶的影响。
表10菌体对黄嘌呤氧化酶的抑制率情况
Figure BDA0003389573120000151
从表10中看出，以乳酸菌发酵的菌体作为抑制剂时，对黄嘌呤氧化酶几乎没有抑制作用。所以该乳酸菌(植物乳杆菌BLCC2-0296)发酵菌悬液中对黄嘌呤氧化酶有抑制作用的是发酵后的上清液。
4、通过测定和计算得出发酵上清液对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度
4.1抑制剂：将植物乳杆菌BLCC2-0296接种到液体MRS培养基中，于37℃培养20h得到菌悬液。将菌悬液于4℃下转速为5000r/min条件下离心10min，收集得到上清液。用缓冲液将上清液稀释成不同的体积浓度：25％、33％、40％、50％、60％、80％、100％。
表11不同浓度的发酵上清液抑制黄嘌呤氧化酶的加样情况
Figure BDA0003389573120000152
4.2计算半数抑制浓度
从图6可以看出，随着发酵上清液浓度的增大，抑制率随着增大。以抑制剂浓度为自变量，以抑制率为因变量作图，利用SPSS对试验数据进行回归分析，可以求出发酵上清液对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度IC50为49.24％。
实施例9：体内降解尿酸的效果验证
1、动物试验设计
1.1试验动物
1日龄肉鹅，品种为杂交三花，购自山东临沂鸿宇禽业。
1.2动物分组及饲粮
预饲5天后，将54只肉鹅随机分为3组：对照组、高蛋白高钙组、乳酸菌组。每组3个平行，每个平行6只，开始试验，试验期为21d。
对照组饲喂基础日粮；高蛋白高钙组和乳酸菌组饲喂高钙高蛋白饲料；其中，基础日粮中蛋白质含量为19％(质量分数)、钙含量为1％(质量分数)；高钙高蛋白饲料由基础日粮、豆粕和轻钙配制而成，其蛋白质含量为23％(质量分数)、钙含量为3％(质量分数)。
基础日粮的具体组成见表12。
表12基础日粮组成及营养水平
Figure BDA0003389573120000161
试验期为21d。试验期间各组肉鹅均自由采食，每天集中饮水；其中：对照组和高蛋白高钙组给予清水；乳酸菌组是在清水中添加植物乳杆菌BLCC2-0296的菌粉，使饮水中植物乳杆菌BLCC2-0296的活菌数为6×107CFU/mL。
植物乳杆菌BLCC2-0296的菌粉由如下方法制备而成：
将植物乳杆菌BLCC2-0296接种到液体MRS培养基中，于37℃培养20h得到菌悬液。将菌悬液离心后收集菌体沉淀，再用清水清洗2-3遍后，加入保护剂进行冷冻干燥(保护剂由脱脂奶粉、蔗糖和甘油按质量比20:8:1复配而成；保护剂与菌体沉淀的重量比为1:1)，粉碎，即为菌粉成品，活菌数为2×1011CFU/g。
对照组、高蛋白高钙组和乳酸菌组的其他饲养管理保持一致。
1.3原理
禽类的高蛋白日粮会干扰嘌呤代谢途径，诱导黄嘌呤氧化酶，增强其活性，加速黄嘌呤向尿酸转化，致使血尿酸水平升高，从而引发痛风。使用高钙日粮，过多的钙在体内生成钙盐，经肾脏排泄时会造成肾损伤，肾脏损伤后排尿酸受阻造成体内尿酸水平过高，也会引发痛风。
1.4指标
1)记录死亡时间和只数，对死亡的鹅进行解剖观察；
2)定期取血，检测血清中尿酸含量；
3)试验结束时，解剖观察肾脏和输尿管的尿酸盐沉积，统计脾脏指数、法氏囊指数；
2、结果分析
2.1血清中尿酸含量结果分析
表13血清中尿酸情况
Figure BDA0003389573120000171
注：同列数据肩标含相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)
从表13中可以看出：
在试验的第0天(6日龄)，各个组别的尿酸含量无显著性差异。在试验的第7天，高蛋白高钙组的尿酸含量显著高于对照组；乳酸菌组与高蛋白高钙组相比，尿酸含量显著降低了44.18％。在试验的第21天，乳酸菌组与高蛋白高钙组相比，尿酸含量显著降低了39.71％；乳酸菌组的尿酸水平已与对照组相近。
上述结果表明：植物乳杆菌BLCC2-0296能够在体内快速降低血清中尿酸含量；并且，植物乳杆菌BLCC2-0296在体内的作用时间长，对由日粮中高蛋白高钙引起的动物血尿酸水平的升高有持续的预防作用。
2.2对免疫器官指数的影响
表14肉鹅在试验的第21天脾脏指数和法氏囊指数
Figure BDA0003389573120000172
注：同列数据肩标含相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)
从表14看出，乳酸菌组的脾脏指数显著高于高蛋白高钙组和对照组。各组的法氏囊指数无显著性差异。
2.3肾脏和输尿管出现尿酸盐沉积统计
2.3.1试验的第0～21天死亡并有沉积的统计
对照组、高蛋白高钙组、乳酸菌组在试验的第0～21天死亡并有沉积的鹅分别为1只、3只、1只，结果见图7。
2.3.2试验的第21天解剖肾脏或输尿管有尿酸盐沉积的统计
对照组、高蛋白高钙组、乳酸菌组在试验的第21天全部解剖后肾脏或输尿管有尿酸盐沉积的鹅分别为3只、11只、6只，结果见图8。
2.4肾脏或输尿管出现尿酸盐沉积的发病率
表15发病率统计(试验的第0～21d)
Figure BDA0003389573120000181
表15结果表明，正式试验的第0～21天中，尿酸盐沉积发病率最高的为高蛋白高钙组，发病率77.8％。乳酸菌组的尿酸盐沉积发病率比高蛋白高钙组降低了50％，说明乳酸菌能够降低肾脏和输尿管的尿酸盐沉积发病率。
小结：通过乳酸菌在禽体内的预防痛风试验表明，该乳酸菌能够降低血清中尿酸水平，减少肾脏或者输尿管中的尿酸盐沉积，有助于提高脾脏指数。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司
<120> 一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其应用
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1432
<212> DNA
<213> 菌株BLCC2-0296
<400> 1
tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 60
tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa 120
acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagcttgaa agatggcttc 180
ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc 240
atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300
cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 360
agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 420
catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 540
aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 600
gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720
acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccataccg 780
taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg atacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc 1260
attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt aggaaccagc cg 1432
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agagttgatc ctggctcag 19

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296，其保藏编号为：CCTCCNO：M 20211236。
2.含有权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括辅料和/或载体。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。
5.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的种子液接种至MRS液体培养基中，36-38℃发酵19-21h；发酵结束后离心，收集沉淀物，干燥，制备得到菌剂。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296或者权利要求2-4任一项所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296的菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)制备具有降尿酸功能的产品；
(2)制备预防痛风的药物；
(3)制备降低肾脏和输尿管的尿酸盐沉积的药物；
(4)制备提高动物脾脏指数的产品。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0296在同时生产尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。
8.一种同时生产尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将保藏编号为CCTCC NO：M 20211236的植物乳杆菌BLCC2-0296的种子液接种至液体发酵培养基中，36-38℃发酵19-21h；发酵结束后离心，分别收集发酵上清液和菌体沉淀，其中：
所述发酵上清液中含有黄嘌呤氧化酶抑制剂；
将菌体沉淀洗涤，然后悬浮在Tris-HCl溶液中，并在冰浴条件下超声波破碎，得到菌体破碎液；将菌体破碎液离心，收集上清液，所述上清液中含有尿酸氧化酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基中含有：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-80 1mL/L；调节pH至5.5-6.5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，超声波破碎的破碎能量1000w，每次破碎3s，间隙3s，破碎30min。
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