CN115287239A

CN115287239A - 一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115287239A
Application number: CN202211115570.6A
Authority: CN
Inventors: 罗学刚; 操俊; 王佳丽; 王雪芳; 李中媛; 宋亚囝; 周飒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2022-09-14
Publication date: 2022-11-04

Abstract

本发明公开一株体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的名称为：LTJ1，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.25123，保藏日期：2022年6月20日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)来源于天津市芦台镇发酵过程中的酒醅，属于公认安全的可用于食品的菌种。本发明植物乳杆菌具有优秀的体外降解核苷、嘌呤能力，并能在细胞水平降低尿酸水平。

Description

一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

高尿酸血症的主要病因由两部分组成：嘌呤代谢紊乱导致尿酸生成过多；尿酸排泄减少。其特征为血尿酸(UA)浓度异常升高，当血尿酸超过饱和浓度时，尿酸盐晶体析出可直接沉积在关节、软骨、输尿管等处，从而引起人体局部组织的无菌性炎症反应，进而引起痛风。研究表明，近20％的高尿酸血症患者最终将发展为痛风。此外，高尿酸血症还与多种高发性代谢疾病有关，如糖尿病、高血压、血脂异常等代谢性疾病，成为继“高血压、高血糖、高血脂”之后的第四“高”。在全球范围内，由遗传因素和生活方式导致的高尿酸血症发病率在逐年上升。

人体内尿酸约70％通过肾脏排泄，其余随粪便排出或经肠道菌群进一步分解代谢。少部分在人体肠道内排泄或由肠道内菌群分解。近年来，基于肠道微生态改善高尿酸血症等传统代谢疾病已成为新的开发方向，多项研究表明，通过益生菌、益生元等调节肠道微生态，在调节血清尿酸和体内尿酸分布方面发挥着重要作用并有助于高尿酸血症和痛风的治疗。最新的临床数据表明，高尿酸血症和痛风患者的肠道菌群发生变化，包括肠道菌群多样性减少和条件致病菌的丰度，增加(如拟杆菌属)。也有学者发现益生菌能够改善高尿酸小鼠肠屏障从而降低血尿酸水平。

当前市场上已有的降尿酸药物分为黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制剂类，例如别嘌呤醇(AP)和促尿酸排泄类，例如苯溴马隆。通过减少尿酸生成和增加尿酸排泄两种方式缓解高尿酸血症症状。但上述药物均存在耐受性低、药物依赖性过高及并发症副作用多等问题，并且只有20％的患者最终会发展为痛风，所以降尿酸的普遍药物治疗是否值得其对应的风险仍存在争议。因此通过调整饮食，改变生活方式，包括通过有目的的摄入益生菌来改善肠道菌群成为一种风险更低且更易接受的治疗选择。

植物乳杆菌是乳酸菌的一种，与人类的生活存在十分密切的联系。其已经实验证实的保健功能有：免疫调节作用、对致病菌的拮抗作用、降低血清胆固醇基对心血管疾病的预防作用。除此之外，植物乳杆菌还具有维持肠道内菌群平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等多种功能，具有广阔的应用前景。但植物乳杆菌作为益生菌对高尿酸血症的菌株和研究依旧较少，因此寻找能够缓解高尿酸血症的植物乳杆菌，并进一步探究其对高尿酸血症及此类代谢疾病的调理作用育有重要意义。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一株可缓解高尿酸血症的植物乳杆菌及其用途(CN112795500B)，该植物乳杆菌为植物乳杆菌grx03，从广西巴马长寿村人群肠道中分离所得，本发明菌株发酵传统药食同源中草药菊苣表现出良好的降尿酸能力，可以与其他益生乳酸菌复配开发降尿酸发酵乳产品或乳酸菌饮料。

上述专利公开文献中菌株降尿酸方面主要在体外检测菌株对核苷的降解能力，且需辅以发酵菊苣，没有检测菌株对嘌呤的降解能力，而嘌呤作为尿酸的直接前体，降解嘌呤的能力在植物乳杆菌降尿酸功能中更具说服力。更进一步的，本篇专利在细胞水平对植物乳杆菌LTJ1代谢物进行降尿酸检测，在细胞层面证明其降尿酸能力。上述专利公开文献注重于植物乳杆菌LTJ1自身作为肠道益生菌的降尿酸功能，为降尿酸益生菌提供能力更加全面的菌株。

因此，通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，所述植物乳杆菌的名称为：LTJ1，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCCNo.25123，保藏日期：2022年6月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，所述植物乳杆菌具有能在体外降解核苷、嘌呤能力。

进一步地，所述植物乳杆菌在体外能够高效降解肌苷、腺苷、鸟嘌呤和次黄嘌呤。

进一步地，所述植物乳杆菌具有能在细胞水平降低尿酸特性。

如上所述的植物乳杆菌在降低尿酸方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备降尿酸食品方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备降低尿酸保健品方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备降低尿酸药品方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)来源于天津市芦台镇酒醅，属于公认安全的可食用菌种。

2、本发明植物乳杆菌LTJ1，体外降解实验显示8小时后植物乳杆菌LTJ1对鸟嘌呤的降解率达到98.01％；对次黄嘌呤的降解率达到12.01％；对腺苷的降解率达到100％；对肌苷的降解率到达99.48％。除此之外，体外细胞实验表明添加15％体积的菌上清能显著降低HepG2细胞尿酸生成。因此，作为能够在体外高效降解核苷和嘌呤的植物乳杆菌，其在降嘌呤、降尿酸方面具有广阔的应用前景。

3、本发明植物乳杆菌具有优秀的体外降解核苷、嘌呤能力，并能在细胞水平降低尿酸水平。

4、本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)能在细胞层面降低尿酸水平。

附图说明

图1为本发明植物乳杆菌CGMCC No.25123的菌落形态和细胞形态图；

图2为本发明中植物乳杆菌CGMCC No.25123的16S rDNA系统发育树图；

图3为本发明中植物乳杆菌的体外核苷、嘌呤降解图；其中，(a)为嘌呤标准品的液相图，(b)为嘌呤标准品经植物乳杆菌LTJ1处理后的液相图，(c)为核苷标准品的液相图，其中8.197min出峰为肌苷、12.716min出峰为腺苷，(d)为核苷标准品经植物乳杆菌LTJ1处理后的液相图；

图4为本发明中植物乳杆菌的细胞层面降尿酸图；其中，M为高尿酸模型组，1为加入LTJ1代谢物处理组。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，其特征在于：所述植物乳杆菌的名称为：LTJ1，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.25123，保藏日期：2022年6月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

较优地，所述植物乳杆菌具有能在体外降解核苷、嘌呤能力。

较优地，所述植物乳杆菌在体外能够高效降解肌苷、腺苷、鸟嘌呤和次黄嘌呤。

较优地，所述植物乳杆菌具有能在细胞水平降低尿酸特性。

如上所述的植物乳杆菌在降低尿酸方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备降尿酸食品方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备降低尿酸药品方面中的应用。

具体地，以下实施例分别从菌株的体外核苷、嘌呤降解能力测定、细胞水平降尿酸能力测定来说明本发明的技术方案，具体内容如下。

实施例1植物乳杆菌LTJ1的分离鉴定

以下实验均在无菌条件下操作。

1.菌株的富集

称取天津市芦台镇酿酒过程中的酒醅25g，加入225mL无菌生理盐水混匀，将得到的菌液稀释10³～10⁵倍后取100μL涂布于MRS平板上，于37℃条件下倒置培养24h，观察菌落生长状况。

所述的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，酵母浸粉4g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃灭菌20min备用。

2.菌株的分离

挑取步骤1中得到的菌落，用革兰氏染色法进行镜检，观察菌体形态特征，选取革兰氏阳性菌作为目的菌株。

3.菌株的纯化

挑取步骤2中所得的菌落在MRS平板上进行划线，反复纯化直至无其他杂菌，记录不同菌落的状态。

4.菌株的鉴定

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取乳酸菌菌株基因组，并以此为模板进行PCR扩增。将扩增成功的PCR产物测序后拼接得到DNA序列，使用NCBI的BLAST检索系统对序列同源性进行比对分析。选择与其相似性最高的已知菌株，对其相似性进行分析。使用MEGA5软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)建立系统发育树。

对步骤3中获得的纯菌进行生理生化实验研究，发现该菌株具有很强的酒精耐受能力，该菌株在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G⁺，菌体呈小短杆状(如图1所示)。

用BLAST软件经同源性比较，结果见图2，结合菌落形态特征、细胞形态特征和16SrDNA基因序列结果，确定为乳杆菌属中的一株新的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株已于2022年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.25123，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2植物乳杆菌LTJ1体外核苷、嘌呤降解能力测定

将菌株以1％接种于MRS培养基中，37℃培养12h，4000rpm离心3分钟得到菌体，弃上清用生理盐水重悬后离心，重复两次。用PBS缓冲液溶解0.2g/L肌苷和腺苷，制成肌苷腺苷混合液。用PBS缓冲液溶解0.2g/L鸟嘌呤和次黄嘌呤，制成嘌呤混合液孵育重悬菌体并于37℃孵育8h。最后通过高效液相色谱检测上清液中剩余成分。

通过液相检测，结果显示8h后溶液中肌苷、腺苷和鸟嘌呤含量大幅减少，次黄嘌呤含量减少(如图3所示)，其中鸟嘌呤的降解率达到98.01％；对次黄嘌呤的降解率达到12.01％；对腺苷的降解率达到100％；对肌苷的降解率到达99.48％。图中(a)为嘌呤样本的液相图，其中5.301min出峰为次黄嘌呤，8.954min出峰为鸟嘌呤，(b)为使用植物乳杆菌LTJ1处理后，其中4.906min出峰为黄嘌呤，5.445min出峰为次黄嘌呤，可见鸟嘌呤基本降解，且嘌呤含量降低。(c)为核苷样品的液相图，其中8.197min出峰为肌苷、12.716min出峰为腺苷。(d)为使用植物乳杆菌LTJ1处理后液相图，其中4.820min出峰为黄嘌呤、5.259min出峰为次黄嘌呤，可见腺苷、肌苷基本降解。

与已有专利公开文献顾瑞霞发明的植物乳杆菌grx03相比，植物乳杆菌grx03对肌苷、鸟苷的降解率达到100％；而植物乳杆菌LTJ1对肌苷、腺苷的降解率达到100％、99.48％；可见植物乳杆菌LTJ1对核苷的降解能力与植物乳杆菌grx03相当，但该专利公开文献并没有检测植物乳杆菌grx03对嘌呤的降解能力。由于目前对降解嘌呤乳酸菌的筛选研究与降解核苷乳酸菌相比较少，能够高效降解嘌呤的乳酸菌与降解核苷的乳酸菌相比更为少见。因此此处选择处理方式最为相近的研究进行比较，在刘慧敏的研究中筛选50株乳酸菌种有43株对嘌呤具有降解能力，其中能够显著降解(5.44％-87.85％)鸟嘌呤的平均降解率仅为28％，效果最好的为鼠李糖乳杆菌YZULr026经过5小时对鸟嘌呤的降解率达到87.85％，对次黄嘌呤的降解率达到12.17％，其降解率随时间延长不在增加。植物LTJ1与鼠李糖乳杆菌YZULr02相比，LTJ1鸟嘌呤降解率达到98.01％，显著高于鼠李糖乳杆菌YZULr02，而对次黄嘌呤的降解率为12.01％，与鼠李糖乳杆菌YZULr02的12.17％相比也相差无几。综合比较，植物乳杆菌LTJ1的降解嘌呤能力是要强于鼠李糖乳杆菌YZULr02。与现有研究的乳酸菌相比，植物乳杆菌LTJ1是一株核苷、嘌呤降解能力更加全面更为高效的菌株。

实施例3植物乳杆菌LTJ1在细胞水平降尿酸能力测定

将对数生长期的该菌株离心清洗，用细胞培养基DMEM重悬后孵育12h。离心并将上清过滤膜得到无菌培养基，将过膜的培养基以15％体积分数的量处理HepG2细胞24h后构建细胞高尿酸模型，检测其尿酸生成量。通过加入0.25mmol/L腺苷培养24小时构建高尿酸细胞模型。模型组为不予上清处理，仅加入0.25mmol/L腺苷培养24小时.检测给予上清组与模型组的尿酸生成量并进行对比。

通过尿酸试剂盒检测，结果显示给予菌代谢上清组尿酸水平较模型组显著降低(如图4所示)。细胞水平降尿酸能力的检测为益生菌在体内是否能够降尿酸提供模拟与参考，同时与体外植物乳杆菌降解核苷、嘌呤能力对应，能够更全面的体现出菌株的降尿酸能力。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一株具有体外降解核苷、嘌呤及降尿酸能力的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，其特征在于：所述植物乳杆菌的名称为：LTJ1，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.25123，保藏日期：2022年6月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌具有能在体外降解核苷、嘌呤能力。

3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌在体外能够高效降解肌苷、腺苷、鸟嘌呤和次黄嘌呤。

4.根据权利要求1至3任一项所述的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌具有能在细胞水平降低尿酸特性。

5.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在降低尿酸方面中的应用。

6.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在制备降尿酸食品方面中的应用。

7.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在制备降低尿酸保健品方面中的应用。

8.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在制备降低尿酸药品方面中的应用。