CN110747146B - 具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌lg08及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用。本发明的格氏乳杆菌LG08，已于2018年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16131，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其具有优异的核苷及核苷酸降解能力，可分解大部分尿酸合成的前体，减少机体对尿酸合成前体的吸收，还可直接高效分解进行肠道中的尿酸，并通过降低血清内毒素水平及抑制黄嘌呤氧化酶活性，进一步抑制尿酸的生成并缓解炎症等副反应。

Description

具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用。

背景技术

近年来，随着人们物质生活水平的不断提高，大众对海鲜、肉类及啤酒等含高嘌呤食物的摄入量不断增加，这在提升舌尖幸福感的同时也带来了众多慢性代谢性疾病，如高尿酸血症。据统计，我国目前高尿酸血症患者大约有1.2亿，接近总人口数的10％，其中，中老年男性和绝经后女性是高发人群。正常情况下人体内的尿酸是不断地生成和排泄的，并维持在一定的浓度范围内。然而一旦该平衡被打破，就易引发血液中尿酸含量升高并最终导致高尿酸血症。

目前，传统的治疗高尿酸血症的方法包括药物、限制饮食等，其中，应用于临床上的药物主要为排尿酸药、抑制尿酸生成药和碱性药物等，其通过增加尿酸排泄、抑制尿酸生成或碱化尿液等方式来缓解高尿酸症状。但需要指出的是，上述药物存在低耐受性、高药物依赖性及并发症副作用多等问题，成为当前治疗方法特别是药物疗法中亟待解决的问题。在饮食控制方面，由于大多数食品中因含动植物细胞而含有嘌呤，因此，精确限制嘌呤摄取极其困难，且嘌呤酸摄取的限制易造成营养失衡。此外，嘌呤摄取的限制还需限制次黄苷酸等的摄取，由此削弱了食物的味道，结果导致人们很难长时间遵循嘌呤限制的膳食。因此，寻找新型高效的治疗方案已成为目前研究的热点。

人体内的尿酸，大约70％是通过肾脏排泄，其余部分在人体肠道中排泄或由肠道内菌群进行分解。益生菌作为肠道中重要的生理菌群，已成为基于微生态改善高尿酸的重要开发方向。目前，针对降尿酸益生菌的开发主要集中在筛选可高效代谢尿酸合成前体核苷或核苷酸的菌株上，即通过分解食物中的尿酸合成前体核苷或核苷酸，减少人体对上述前体物质的吸收，从而减少人体内尿酸的合成。如大连医科大学选育获得了一株短乳杆菌DM9218及其重组蛋白(中国专利公开号CN106834162A)，其对肌苷和鸟苷的分解率分别为99.31％和99.64％。坪井洋等(中国专利申请号201110453933.2)筛选出可分别降解肌苷和鸟苷的口乳杆菌OLL2779和格氏乳杆菌OLL2959，经大鼠实验验证发现上述两株菌具有抑制血清尿酸值上升的作用。但是，其代谢产物主要为次黄嘌呤和鸟嘌呤，上述两种物质进入机体后仍可经由黄嘌呤最终生成尿酸，因此并未从根本上消除过量摄入嘌呤可能引起的尿酸增加风险。金(降血尿酸益生菌株的筛选和降血尿酸机理的探索，《微生物学通报》2018年第8期1757-1769页)等则在此基础上，进一步拓宽降解的底物范围，选育出一株不仅可高效降解核苷(腺苷和鸟苷)，还可高效降解核苷酸(腺苷酸和鸟苷酸)的干酪乳杆菌ZM15。

上述菌株均可一定程度上缓解高尿酸血症症状。但需要指出的是，食物中含有的可合成尿酸的前体众多，如一些改善风味的鲜味剂中不仅含有5’-鸟苷酸二钠，还含有5’-肌苷酸二钠，而上述菌株均未见其对降解肌苷酸的作用有所报道。此外，尿酸在人体自身代谢过程中也会不断生成，上述菌株虽可高效代谢部分尿酸合成前体，却未报道上述菌株是否可降解已生成的尿酸，这直接影响其对因尿酸排泄减少而造成的高尿酸血症的缓解作用，如因肾小球滤过减少、肾小管重吸收的增加以及肾小管分泌减少等造成的原发性高尿酸血症，而这类高尿酸血症占到了原发性高尿酸血症的90％左右。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用；该格氏乳杆菌LG08具有优异的核苷及核苷酸降解能力，可分解大部分尿酸合成的前体，减少机体对尿酸合成前体的吸收，还可直接高效分解进行肠道中的尿酸，并通过降低血清内毒素水平及抑制黄嘌呤氧化酶活性，进一步抑制尿酸的生成并缓解炎症等副反应。

本发明第一方面提供一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌，命名为LG08，已于2018年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16131，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明第二方面提供一种格氏乳杆菌LG08在制备用于缓解高尿酸血症的药物中的应用。

进一步的，所述药物中所包含的格氏乳杆菌LG08为活菌株、干菌株或菌株代谢物。

进一步的，所述药物包括药学上可接受的载体，其剂型为包括片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉中一种或多种的口服制剂。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1)根据基本的益生特性及对核苷(腺苷、鸟苷和肌苷)、核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸和肌苷酸)及5’-鸟苷酸二钠等的降解作用，筛选具有优异核苷及核苷酸降解性能的益生菌。筛选获得的LG08细胞质对腺苷、鸟苷和肌苷的降解速率分别为3.91mmol/g/h、4.04mmol/g/h和3.83mmol/g/h，对腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠的降解速率分别为4.29mmol/g/h、4.56mmol/g/h、4.32mmol/g/h和3.92mmol/g/h。

2)对降解尿酸性能进行测试，结果表明格氏乳杆菌LG08对尿酸的降解速率达1.36mmol/g/h。

3)在Caco-2细胞模型中评价粘附性能，结果表明格氏乳杆菌LG08对Caco-2细胞的粘附性能可达15.2个/细胞。

4)利用体外实验进行菌株胃酸及胆盐耐受性能评价，格氏乳杆菌LG08在pH 3.0条件下胁迫3h存活率可达79.1％，在0.3％猪胆盐胁迫3h后存活率可达82.6％。

5)以给大鼠腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食建立高尿酸血症模型。造模成功后模型组血尿酸水平达241.13μmol/L，灌胃LG08发酵液28天，LG08干预组大鼠血尿酸水平显著降低。此外，血清内毒素降低49％，黄嘌呤氧化酶活性降低26.4％。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明中不同乳酸菌菌株在模拟胃液中的存活率；

图2是本发明中不同乳酸菌菌株在模拟胆盐液中的存活率；

图3是本发明中格氏乳杆菌LG08对尿酸的降解能力；

图4是本发明中不同干预方式对血尿酸水平的影响；

图5是本发明中格氏乳杆菌LG08干预对血清内毒素的影响；

图6是本发明中格氏乳杆菌LG08干预对黄嘌呤氧化酶活性的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一具有降解尿酸作用的菌株筛选

1)菌株筛选

提取来自中国广西壮族自治区河池市巴马镇健康老人粪便(采集前人群均未服用过抗生素类药物，无益生菌服用史，无胃肠病史)的稀释液5mL，10倍系列稀释至10^-6，每个稀释浓度取200μL涂布于选择性MRS培养基，37℃厌氧培养48-72h，分离获得平板上不同的单菌落。用灭菌后的接种环挑取前述不同单菌落在MRS固体培养基上划线纯化，37℃厌氧培养48h，得到纯乳酸菌菌株共9株，分别命名为L1-L9。

2)分离菌株对模拟胃液的耐受能力分析

收集培养后菌体于8000rpm、4℃离心15min，收集菌体重悬于生理盐水中，按活菌数10⁹CFU/mL接入到pH 3.0的模拟胃液中，37℃培养3h后进行活菌数检测并计算存活率，其存活率如图1所示，不同菌株在模拟胃液中的存活率差异较大，其中菌株L8在模拟胃液中的存活率最高，达79.1％。

3)分离菌株对模拟胆盐液的耐受能力分析

收集培养后的菌体于8000rpm、4℃离心15min，收集菌体重悬于生理盐水中，按活菌数10⁹CFU/mL接入到添加0.3％猪胆盐的模拟液中，37℃培养3h后进行活菌数检测并计算存活率，其存活率如图2所示。菌株L5、L6和L8在模拟胆盐液中的存活率较高，分别为76.5％、75.1％和82.6％。

4)分离菌株对Caco-2细胞的粘附性能分析

将培养后的菌体于8000rpm、4℃离心15min，收集菌体用PBS缓冲液洗涤3次，再用DMEM调节菌液浓度至10⁹CFU/mL，将菌悬液加入到已培养好的Caco-2单层细胞中，37℃共培养2h，再用甲醇固定30min后革兰氏染色，在电镜下观察20个视野100个细胞，计算不同乳酸菌对细胞的粘附力，其中菌株L8对细胞粘附性能最佳，达15.2±0.5个/细胞。

表1菌株对Caco-2细胞的粘附性能

菌株	粘附力(个/细胞)
		L1	5.1±0.1
L2	9.3±0.3
		L3	13.2±0.5
L4	9.1±0.4
		L5	14.3±0.3
L6	11.7±0.2
		L7	10.7±0.3
L8	15.2±0.5
		L9	7.8±0.3

5)菌株降解核苷及核苷酸性能分析

分别考察上述菌株对核苷(腺苷、鸟苷和肌苷)及核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠)的降解能力，以上核苷和核苷酸均为尿酸合成前体，降解核苷和核苷酸可有效减少尿酸的合成。

将培养后菌株于8000rpm、4℃离心15min获得菌体，用PBS缓冲液洗涤3次后分别加入腺苷-鸟苷-肌苷磷酸钾缓冲液、腺苷酸-鸟苷酸-肌苷酸磷酸钾缓冲液或5’-鸟苷酸二钠磷酸钾缓冲液中混合并按菌体干重浓度0.4g/L进行调节，37℃混合培养30min后，离心去上清液，加入高氯酸溶液终止反应并进行HPLC分析。

其中，腺苷-鸟苷-肌苷磷酸钾缓冲液制备方法为：在0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)中分别加入4mmol/L的腺苷、鸟苷和肌苷。

腺苷酸-鸟苷酸-肌苷酸磷酸钾缓冲液制备方法为：在0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)中分别加入4.0mmol/L的腺苷酸、鸟苷酸和肌苷酸。

5’-鸟苷酸二钠磷酸钾缓冲液制备方法为在0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)中分别加入4mmol/L的5’-鸟苷酸二钠。

降解能力结果如表2所示，菌株L8对核苷(腺苷、鸟苷、肌苷)和核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠)的综合降解能力最强，其中对腺苷、鸟苷、肌苷的降解速率分别为3.91mmol/g/h、4.04mmol/g/h、3.83mmol/g/h，对腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠的降解能力分别为4.29mmol/g/h、4.56mmol/g/h、4.32mmol/g/h和3.92mmol/g/h。

表2菌株降解核苷及核苷酸性能分析

应当说明的是，益生菌发挥降尿酸性能需满足两个前提条件：1)菌株以高存活率通过胃酸及胆盐胁迫并进入肠道后可高效定植于肠道细胞；2)菌株可高效降解尿酸合成前体如核苷、核苷酸等。依据这两个筛选条件，以菌株在模拟胃液和模拟胆盐液中存活率高、对细胞(本研究采用Caco-2细胞)粘附性能强及降解核苷和核苷酸性能强为筛选指标，综合分析发现菌株L8在上述指标中综合性能最优。

实施例二菌株鉴定

根据实施例一获得的菌株L8，鉴定方法如下：

对获得的菌株L8利用16s rDNA测序鉴定和生理生化鉴定，16s rDNA通用引物序列27F为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Seq ID No：1)，1492R为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(Seq ID No：2)。

对菌株L8的16s rDNA基因序列进行扩增和测序，PCR扩增产物送上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序，菌株L8的16S rDNA的核苷酸序列如Seq ID No：3所示。经过16s rDNA基因对比，与Genebank中的Lactobacillus gasseri菌株比对相似率达100％，结合生理生化鉴定结果菌株L8鉴定为一株格氏乳杆菌，命名为格氏乳杆菌LG08，其生理生化性质如表3所示。

表3菌株L8生理生化鉴定结果

注：+：阳性结果；-：阴性结果

实施例三格氏乳杆菌LG08降解核苷及核苷酸产物分析

本实施例提供一种对格氏乳杆菌LG08降解腺苷、鸟苷、肌苷、腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠后的代谢物进行检测的方法，具体包括以下步骤：

在乙酸铵缓冲液中分别加入5mmol/L腺苷、鸟苷、肌苷、腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸及5’-鸟苷酸二钠，并按菌体干重浓度0.4g/L加入PBS缓冲液洗涤后菌体，37℃混合培养2h后采用超声波破碎，破碎条件为：将悬浊液放入冰水浴中采取超3s停5s的策略(250w)，然后4℃、12000rpm离心15min，取上清液采用质谱法测定代谢物(次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、尿酸)的浓度。

质谱条件如下：三重四级杆质谱仪(Agilent 1290系列)，反相色谱柱：Dikmaspursil C18-EP，流速1mL/min，柱温25℃，测定波长254nm，进样20μL，流动相：A相为10mmol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇溶液，梯度程序设置如下：0min，1％B；20min，70％B；22min，95％B；24min，1％B；30min，1％B。

结果如表4所示，格氏乳杆菌LG08对核苷和核苷酸共降解29.5μmol/L。进一步分析其代谢产物组成发现，除有少量黄嘌呤和次黄嘌呤产生外，在代谢产物中未检测到尿酸的生成。上述结果表明格氏乳杆菌LG08能够有效地降解尿酸合成的前体嘌呤类物质，且代谢产物中不含有尿酸等。

表4格氏乳杆菌降解核苷及核苷酸产物分析

注：ND表示未检测出

实施例四格氏乳杆菌LG08降解尿酸性能分析

本实施例提供一种对格氏乳杆菌LG08降解尿酸性能进行检测的方法，具体包括以下步骤：

在乙酸铵缓冲液中分别加入3mmol/L尿酸，并按菌体干重浓度0.4g/L加入PBS缓冲液洗涤后菌体，37℃混合培养1、2和3h后采用超声波破碎，破碎条件为：将悬浊液放入冰水浴中采取超3s停5s的策略(250w)，然后4℃、12000rpm离心15min，取上清液采用质谱法测定尿酸的浓度，结果图3所示。随着培养时间的延长，LG08对尿酸的降解性能不断提高，在培养3h后，其可降解1.63mmol/L尿酸，对应降解尿酸速率为1.36mmol/g/h。上述结果表明格氏乳杆菌LG08不仅具有降解核苷及核苷酸性能，还具有直接代谢尿酸的性能。

现有的具有缓解尿酸的菌株，主要为短乳杆菌DM9218、口乳杆菌OLL2779、格氏乳杆菌OLL2959及干酪乳杆菌ZM15等，表5中还列出了前述菌株降解物的范围，相比于上述菌株，格氏乳杆菌LG08不仅对尿酸合成前体具有更广的降解范围，可降解范围包括腺苷、鸟苷、肌苷、腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸，此外，对常见的鲜味剂中含有的5’-鸟苷酸二钠也具有降解能力。更为重要的是，格氏乳杆菌LG08还可直接降解尿酸，可从减少尿酸合成前体和直接降解尿酸两个方面帮助减少尿酸的水平。

表5不同菌株降解底物范围

注：“-”代表不可降解该底物；“+”代表可降解该底物

实施案例五格氏乳杆菌LG08干预大鼠高血尿酸血症的影响

1)格氏乳杆菌LG08干预对大鼠血尿酸水平的影响

高尿酸大鼠模型采用给大鼠腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食建立，实验动物采用雄性Wistar大鼠40只，在室温下饲养，自由饮食采食，经1周适应性饲养后，随机分成正常对照组、高尿酸血症模型组、别嘌呤治疗组和益生菌治疗组，每组10只。然后正常对照组喂食普通鼠粮，后三组大鼠饲喂高嘌呤鼠粮并按每100g体重每天250mg标准腹腔注射氧嗪酸钾-羧甲基纤维素钠混悬液。第7天开始，后三组继续饲喂高嘌呤鼠粮辅以腹腔注射氧嗪酸钾-羧甲基纤维素钠混悬液，其中益生菌干预组：每只大鼠按照每天2×10⁹CFU标准灌胃LG08；别嘌呤组：每只大鼠按每100g体重每天4.2mg标准腹腔注射别嘌呤醇-羧甲基纤维素钠混悬液；持续28d。

图4显示连续腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食7天后，模型组、LG08干预组和别嘌呤药物干预组大鼠血尿酸含量均显著升高，表明高尿酸血症模型建立成功。随后开始对干预组分别给予LG08和别嘌呤药物干预，连续干预28天。从结果来看，LG08连续灌胃14天后，LG08干预组血尿酸水平与模型组大鼠相比显著降低(P<0.05)。连续灌胃28天后，血尿酸水平与灌胃14天相比进一步显著降低(P<0.05)，表明LG08具有降低大鼠血尿酸的作用。另一方面，考察灌胃LG08与别嘌呤药物干预差异发现，LG08灌胃28天后血尿酸降低水平进一步接近别嘌呤药物组降低水平，上述结果进一步表明灌胃LG08具有降低大鼠血尿酸的作用。此外，对比金等(降血尿酸益生菌株的筛选和降血尿酸机理的探索，《微生物学通报》2018年第8期1757-1769页)报道的干酪乳杆菌Z25干预大鼠作用结果，本研究采用的格氏乳杆菌干预后血尿酸水平略低于对照组别嘌呤药物组水平，而干酪乳杆菌Z25报道的效果与对照组别嘌呤药物组仍有一定差距，其在干预结束后血尿酸水平仍高于对照组，故格氏乳杆菌LG08缓解高尿酸血症作用优于干酪乳杆菌Z25。

2)格氏乳杆菌LG08干预对大鼠血清内毒素及黄嘌呤氧化酶活性的影响

高尿酸血症往往伴随全身慢性低度性炎症，研究表明，这可能与肠道菌群失衡引起肠道内环境改变，肠道通透性增加继而导致血液循环中内毒素水平升高相关。需要指出的是，血清内毒素水平升高引起的慢性炎症常伴有黄嘌呤氧化酶活性增高，而黄嘌呤氧化酶是尿酸生成的关键酶。为此，考察灌胃格氏乳杆菌对血清内毒素水平及黄嘌呤氧化酶活性的影响。检测方法如下：对前述不同组别大鼠分别在第0、7、21和35天取血清样，内毒素检测参照金斯瑞ToxinSensorTM内毒素检测试剂盒说明书，黄嘌呤氧化酶检测参照艾美捷科技黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒说明书。

实验数据表明(图5、6)，与正常大鼠项目，高尿酸导致血清中内毒素含量及黄嘌呤氧化酶活性明显升高(P<0.05)，而经益生菌干预后，大鼠体内内毒素含量及黄嘌呤氧化酶活性水平在各时间点明显降低(P<0.05)，比初始时分别降低49％和26.4％。以上结果表明，益生菌干预可降低高尿酸血症大鼠内毒素含量及血清黄嘌呤氧化酶活性水平，帮助缓解高尿酸副反应等。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏微康生物科技有限公司

<120> 具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08及其应用

<130> 2019

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> universal probe

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> universal probe

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> Lactobacillus gasseri

<400> 3

ctgcaggtcg agcgagcttg cctagatgaa tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata 60

caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac 120

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gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt 540

gggcgtaaag cgagtgcagg cggttcaata agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg 600

gagaattgca tcagaaactg ttgaacttga gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg 660

tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct 720

gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac ctggtagtcc 780

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cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

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gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccatga gagtctgtaa cacccaaagc cggtgggata acctttatag g 1431

Claims (4)

1.一种具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌LG08，其特征在于：已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16131，分类命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。

2.根据权利要求1所述的格氏乳杆菌LG08，在制备用于缓解高尿酸血症的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物中所包含的格氏乳杆菌LG08为活菌株、干菌株或菌株代谢物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物包括药学上可接受的载体，其剂型为包括片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉中一种或多种的口服制剂。

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