CN114854643B - 一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基及其应用 - Google Patents
一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基及其应用，所述培养基按质量百分含量计包括如下组分组成：益生元组合物2‑5%、蛋白胨0.5‑5%、牛肉膏0.5‑2%、酵母浸膏0.1‑2%、柠檬酸氢二铵0.05‑1%、K2HPO4 0.05‑1%、MgSO4 0.01‑1%、MnSO4 0.01‑1%、吐温‑80 0.05‑1%、L‑半胱氨酸盐酸盐0.05‑1%；所述益生元组合物包括质量比为(1‑2):(1‑2):(0.1‑1)的水苏糖、低聚甘露糖和低聚木糖。本发明复合益生元培养基能够明显提高乳杆菌和双歧杆菌的增殖和产酸能力，高密度培养确保肠道常见有益菌的活性和功能，使其能够有效定植肠道。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基及其应用。
背景技术
益生元是指不可被人体消化利用但可选择性促进肠道益生菌增殖和代谢的碳水化合物，其本质就是低聚糖、双歧因子，如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚木糖、水苏糖、抗性糊精等，为内源益生菌提供有效的碳源，刺激其生长并控制，同时间接地保护肠道健康和促进营养物质的吸收，一般不会产生过敏等免疫反应。益生元是非有机活体，以未消化形式到达肠道，不存在活率问题。
益生菌是对人和动物有益的微生物，通常被人们熟知的有乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属等，是有机活体，需要经过强酸和胆盐的考验，只有部分能活着到达肠道，补给益生菌，定植人体肠道，抑制有害菌生长，改善肠道微环境。因此如何促进其增殖、产酸及其培养，产业化成为当前研发工作者关注的重点。
CN106434492A公开了一种延长乳酸菌存活期的培养基及其制备方法。该有效延长乳酸菌存活期的培养基，以蛋白胨、酵母浸粉、甘露寡糖、脱脂奶粉、脱脂豆粕、七水硫酸镁、七水硫酸锰、玉米浆干粉、复合添加剂、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸钠、吐温80和酿酒酵母为原料制成，其虽然能在一定程度上使乳酸菌在常温下长时间保持活菌量，但其无法实现促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的目的，而且由于该配方对于乳酸菌存活友好，可能在一定程度上会抑制双歧杆菌的增值。
CN101058796A公开了一种双歧杆菌发酵的复合培养基及其制备方法，所述复合培养基由以下成分组成：螺旋藻粉50-150 g，水苏糖40-80 g，5%猪肝浸液30-100 mL，蒸馏水补足1000 mL。该发明所选婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌3种双歧杆菌在该培养基中均生长良好，该培养基其同样存在无法实现促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的目的。
CN107653196A公开了一种保拉迪酵母菌增菌培养基及其制备方法，所述布拉迪酵母菌增菌培养基以100 mL无菌水所含的物质计，含葡萄糖4-6 g，酵母浸粉2-3 g，低聚果糖0.2-0.6 g，磷酸氢二钠0.2-0.5g，氯化钙0.1-0.5g，蛋白胨1-3g，玉米浆2-3 g，大豆低聚糖0.2-0.5 g，低聚木糖0.3-0.6 g，该培养基其同样存在无法实现促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的目的。
CN112063679A公开了一种混合益生菌发酵复合碳水化合物制备短链脂肪酸的方法，所述的发酵培养基每100 mL中包括如下含量的组分：碳源1~2 g，黏蛋白0.2~0.6 g，酪蛋白0.2~0.6 g，蛋白胨0.3~0.7 g，胰蛋白胨0.3~0.7 g等成分，其中碳源为低聚糖、非淀粉多糖、抗性淀粉和糖醇的混合物，其可实现进行体外产短链脂肪酸的目的，但培养过程中双歧杆菌属和乳杆菌属并不能进行共同培养，也无法实现促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的目的。
因此，若能开发一种能够促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，并将其应用在生产中，实现高产高性能，使其充分定植宿主肠道，发挥其益生作用的同时显著提高肠道内二代益生菌如AKK菌的丰度，跨越其因分离鉴定、培养生产、创新药物开发繁琐流程和漫长时间等难题，实现安全、有效地发挥其功能作用，使得众多炎症性肠病、结直肠癌以及代谢等疾病的患者摆脱药物治疗带来的恐惧和副作用，无复发，具有极高的应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基及其应用。所述培养基能够明显提高乳杆菌和双歧杆菌的增殖和产酸能力，高密度培养确保肠道常见有益菌的活性和功能。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计包括如下组分：益生元组合物2-5%、蛋白胨0.5-5%、牛肉膏0.5-2%、酵母浸膏0.1-2%、柠檬酸氢二铵0.05-1%、K2HPO4 0.05-1%、MgSO4 0.01-1%、MnSO4 0.01-1%、吐温-80 0.05-1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05-1%。
以所述培养基总质量为100%计，所述益生元组合物的含量为2-5%，例如可以是2%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3%、3.2%、3.4%、3.6%、3.8%、4%、4.2%、4.4%、4.6%、4.8%、5%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述蛋白胨的含量为0.5-5%，例如可以是0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%、2.2%、2.4%、2.5%、2.6%、2.8%、3%、3.2%、3.4%、3.6%、3.8%、4%、4.2%、4.4%、4.6%、4.8%、5%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述牛肉膏的含量为0.5-2%，例如可以是0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述酵母浸膏的含量为0.1-2%，例如可以是0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述柠檬酸氢二铵的含量为0.05-1%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述K2HPO4的含量为0.05-1%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述MgSO4的含量为0.01-1%，例如可以是0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述MnSO4的含量为0.01-1%，例如可以是0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述吐温-80的含量为0.05-1%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述L-半胱氨酸盐酸盐的含量为0.05-1%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
其中，所述益生元组合物包括质量比为(1-2):(1-2):(0.1-1)的水苏糖、低聚甘露糖和低聚木糖，例如可以是1:1:0.1、1:1:0.2、1:1:0.4、1:1:0.6、1:1:0.8、1:1:1、1:1.2:0.1、1:1.4:0.2、1:1.6:0.4、1:1.8:0.6、1:2:0.8、1.2:1:0.1、1.4:1:0.2、1.6:1:0.4、1.8:1:0.6、2:1:0.8等。
在本发明中，所述益生元组合物包括特定比例的水苏糖、低聚甘露糖和低聚木糖，三种益生元相互配合，能够明显提高乳杆菌和双歧杆菌的增殖和产酸能力，高密度培养确保肠道常见有益菌的活性和功能，使其能够有效定植肠道，从而提高宿主肠道有益菌数量，保护肠道健康以及促进营养物质的吸收。且该复合益生元培养基能够帮助乳杆菌和双歧杆菌协同增殖，提高菌株生长速度；使用本发明协同增殖的培养基后，在动物和人群体内试验中发现其有效提高了二代益生菌，如阿克曼菌菌的丰度，解决了因二代益生菌分离鉴定和培养等问题。
优选地，所述益生元组合物包括质量比为(1-1.5):(1-1.5):(0.5-0.7)的水苏糖、低聚甘露糖和低聚木糖，例如可以是1:1:0.5、1:1:0.6、1:1:0.7、1:1.1:0.5、1:1.2:0.6、1:1.3:0.7、1:1.4:0.7、1:1.5:0.7、1.1:1:0.5、1.1:1.1:0.6、1.2:1.2:0.6、1.2:1.2:0.7等。
优选地，所述低聚甘露糖的HPLC分子式为(C6H10O5)n，n为2-10（例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10）。
优选地，所述低聚木糖称木寡糖，是由2-7个（例如可以是2、3、4、5、6、7等）木糖分子以β-1,4糖苷键结合而成的功能性聚合糖。
优选地，所述培养基按质量百分含量计包括如下组分组成：水苏糖1-1.5%、低聚甘露糖1-1.5%、低聚木糖0.5-0.7%、蛋白胨0.5-5%、牛肉膏0.5-2%、酵母浸膏0.1-2%、柠檬酸氢二铵0.05-1%、K2HPO4 0.05-1%、MgSO4 0.01-1%、MnSO4 0.01-1%、吐温-80 0.05-1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05-1%，余量为水。
以所述培养基总质量为100%计，所述水苏糖的含量为1-1.5%，例如可以是1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述低聚甘露糖的含量为1-1.5%，例如可以是1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%等。
以所述培养基总质量为100%计，所述低聚木糖的含量为0.5-0.7%，例如可以是0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%等。
优选地，所述益生元组合物中还包括阿拉伯树胶和/或燕麦β-葡聚糖，优选为阿拉伯树胶和燕麦β-葡聚糖的组合。
优选地，所述阿拉伯树胶的添加量占所述益生元组合物总质量的0.1-5%（例如可以是0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%等），燕麦β-葡聚糖的添加量占所述益生元组合物总质量的0.1-2%（例如可以是0.1%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2%等）。
优选地，所述培养基中还包括0.1-1%（例如可以是0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等）的氨基酸复合物。
其中，所述氨基酸复合物包括质量比为(5-6):(2-3):(1-2):(0.5-1)的L-缬氨酸、L-蛋氨酸、γ-氨基丁酸和γ-聚谷氨酸，例如可以是5:2:1:0.5、5:2.5:1:0.5、5:3:1:0.5、6:2:1:0.5、6:2.5:1:0.5、6:3:1:0.5、5:2:2:0.5、5:2.5:2:0.5、5:3:2:0.5、5:2:1:0.6、5:2.5:1:0.8、5:3:1:7等。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基在促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖中的应用。
在本发明中，所述乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌LRa05、干酪乳杆菌LC89、嗜酸乳杆菌LA85或植物乳杆菌Lp90中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述双歧杆菌选自动物双歧杆菌乳亚种BLa80、长双歧杆菌BL21、两歧双歧杆菌BBi32或短双歧杆菌BBr60中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供一种乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
（1）将乳杆菌和双歧杆菌混合后，接种于活化培养基中，进行活化，得到活化复合菌；
（2）将步骤（1）得到的活化复合菌接种于第一方面所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基中，进行培养，得到发酵液。
在本发明中，步骤（1）中，所述活化培养基为改良MRS液体培养基，所述改良MRS液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：蛋白胨0.5-5%、牛肉膏0.5-2%、葡萄糖1-3%、酵母浸膏0.1-2%、柠檬酸氢二铵0.05-0.5%、K2HPO4 0.05-1%、MgSO4 0.01-1%、MnSO4 0.01-0.03%、吐温-80 0.05-0.5%，余量为水。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述蛋白胨的含量为0.5-5%，例如可以是0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%、2.2%、2.4%、2.5%、2.6%、2.8%、3%、3.2%、3.4%、3.6%、3.8%、4%、4.2%、4.4%、4.6%、4.8%、5%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述牛肉膏的含量为0.5-2%，例如可以是0.5%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述葡萄糖的含量为1-3%，例如可以是1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%、2.2%、2.4%、2.5%、2.6%、2.8%、3%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述酵母浸膏的含量为0.1-2%，例如可以是0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.5%、1.6%、1.8%、2%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述柠檬酸氢二铵的含量为0.05-0.5%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.5%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述K2HPO4的含量为0.05-1%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述MgSO4的含量为0.01-1%，例如可以是0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述MnSO4的含量为0.01-0.03%，例如可以是0.01%、0.02%、0.03%等。
以所述改良MRS液体培养基总质量为100%计，所述吐温-80的含量为0.05-1%，例如可以是0.05%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.5%等。
在本发明中，步骤（1）中，所述活化的具体步骤为：
将质量比为(0.5-2):1（例如可以是0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1等）的乳杆菌和双歧杆菌混合得到混合菌种，以1-5 vol%（例如可以是1 vol%、1.5 vol%、2 vol%、2.5 vol%、3 vol%、3.5 vol%、4 vol%、4.5 vol%、5 vol%等）的接种量接种于活化培养基中，在35-40℃（例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等）下培养12-24 h（例如可以是12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h等）后，以7000-9000 g（例如可以是7000 g、7500 g、8000 g、8500 g、9000 g等）的离心力离心5-15 min（例如可以是5min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min、15 min等），分离得到混合菌泥；再将混合菌泥重悬于生理盐水中，所述混合菌泥和生理盐水的质量比为1:(9-15)（例如可以是1:9、1:10、1:12、1:13、1:15等），得到活化复合菌。
在本发明中，步骤（2）中，所述培养的具体步骤为：
将步骤（1）得到的活化复合菌以1-5 vol%（例如可以是1 vol%、1.5 vol%、2 vol%、2.5 vol%、3 vol%、3.5 vol%、4 vol%、4.5 vol%、5 vol%等）的接种量接种于所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基中，于厌氧条件35-40℃（例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等）下培养15-25 h（例如可以是15 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、25 h等）后，得到发酵液。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明制备的复合益生元培养基能够明显提高乳杆菌和双歧杆菌的增殖和产酸能力，高密度培养确保肠道常见有益菌的活性和功能，使其能够有效定植肠道，从而提高宿主肠道有益菌数量，保护肠道健康以及促进营养物质的吸收；
（2）本发明制备的复合益生元培养基能够帮助乳杆菌和双歧杆菌协同增殖，提高菌株生长速度，使其达到产业化生产需求，为菌株产业化提供依据；
（3）使用本发明的协同增殖的培养基后，在动物和人群体内试验中发现其有效提高了二代益生菌，如阿克曼菌菌的丰度，一定程度上解决了因二代益生菌分离鉴定和培养等问题而难实现产业化的问题，这对患有代谢疾病（糖尿病、肥胖、高血压等）的患者具有显著的调节作用，充分调节肠道菌群代谢，实现真正意义上替代药品，自主调控机体的健康。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
I. 本发明采用的各菌种信息如下所示：
① 鼠李糖乳杆菌LRa05为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株，保藏编号为CGMCC No.1.12734，保藏日期为2020年07月20日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
② 动物双歧杆菌乳亚种BLa80为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa80菌株，保藏编号为CGMCC No.15410，保藏日期为2018年03月05日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
③ 长双歧杆菌BL21为长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株，保藏编号为CGMCC No.10452，保藏日期为2015年01月27日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
④ 干酪乳杆菌LC89为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株，保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年03月05日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
⑤ 嗜酸乳杆菌LA85为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA85菌株，保藏编号为CGMCC No.1.12735，保藏日期为2020年07月20日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
⑥ 两歧双歧杆菌BBi32为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32菌株，保藏编号为CGMCC No.16923，保藏日期为2018年12月10日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
⑦ 短双歧杆菌BBr60为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr60菌株，保藏编号为CGMCC No.12915，保藏日期为2016年08月29日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
⑧ 植物乳杆菌Lp90为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株，保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年01月27日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
II. 本发明采用的部分原料来源如下所示，其他无特殊说明，均可从商业途径得到：
水苏糖购于承德京天食品科技有限公司；低聚木糖购于山东龙力生物科技有限公司，分子量为152.14578；低聚甘露糖购于山东龙力生物科技有限公司，分子量为342.3；阿拉伯树胶购于阿拉丁，分子量为262.64；燕麦β-葡聚糖购于山东西唐生物科技有限公司，平均分子量80万。
III. 本发明采用的对照培养基配方如下，在后续实施例中不再赘述：
① 改良MRS培养基（阳性对照，MRS-C）：蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖2%、乳糖1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-800.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
② 无糖培养基（阴性对照，MRS-N）：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%。
实施例1
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.6%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例2
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.0%、低聚甘露糖1.5%、低聚木糖0.5%、蛋白胨0.8%、牛肉膏1.2%、酵母浸膏0.4%、柠檬酸氢二铵0.25%、K2HPO4 0.15%、MgSO4 0.05%、MnSO4 0.025%、吐温-80 0.08%、L-半胱氨酸盐酸盐0.12%，余量为水。
实施例3
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.5%、低聚甘露糖1.0%、低聚木糖0.7%、蛋白胨1.2%、牛肉膏0.8%、酵母浸膏0.6%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.1%、MgSO4 0.08%、MnSO4 0.015%、吐温-80 0.12%、L-半胱氨酸盐酸盐0.08%，余量为水。
实施例4
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.52%、阿拉伯树胶0.08%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO40.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例5
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.55%、燕麦β-葡聚糖0.05%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO40.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例6
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.5%、阿拉伯树胶0.07%、燕麦β-葡聚糖0.03%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例7
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.5%、阿拉伯树胶0.07%、燕麦β-葡聚糖0.03%、L-缬氨酸0.5%、γ-氨基丁酸0.1%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4· 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例8
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.5%、阿拉伯树胶0.07%、燕麦β-葡聚糖0.03%、L-蛋氨酸0.4%、γ-聚谷氨酸0.2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例9
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.5%、阿拉伯树胶0.07%、燕麦β-葡聚糖0.03%、L-缬氨酸0.3%、L-蛋氨酸0.15%、γ-氨基丁酸0.1%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例10
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.2%、低聚甘露糖1.2%、低聚木糖0.5%、阿拉伯树胶0.07%、燕麦β-葡聚糖0.03%、L-缬氨酸0.36%、L-蛋氨酸0.12%、γ-氨基丁酸0.06%、γ-聚谷氨酸0.06%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO40.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
实施例11
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，与实施例1的区别仅在于，水苏糖含量为2%、低聚甘露糖2%、低聚木糖0.1%，其他组分含量与实施例1相同。
实施例12
本实施例提供一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，与实施例1的区别仅在于，水苏糖含量为1%、低聚甘露糖1%、低聚木糖1%，其他组分含量与实施例1相同。
对比例1
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：低聚甘露糖3%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO40.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例2
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：低聚木糖3%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例3
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖3%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例4
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.5%、低聚甘露糖1.5%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例5
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：低聚甘露糖1.8%、低聚木糖1.2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例6
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：水苏糖1.8%、低聚木糖1.2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例7
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：低聚果糖1.2%、低聚木糖1.2%、大豆低聚糖0.6%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
对比例8
本对比提供一种培养基，所述培养基按质量百分含量计由如下组分组成：低聚半乳糖1.2%、葡聚糖1.2%、木糖醇0.6%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，余量为水。
应用例1
本应用例提供促进鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种和嗜酸乳杆菌协同增殖方法：
测试样品：实施例1-12提供的促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基和对比例1-8提供的培养基；
增值方法：
（1）活化：将置于-80℃冰箱于40%甘油管中保存的鼠李糖乳杆菌LRa05、动物双歧杆菌乳亚种BLa80和嗜酸乳杆菌LA85取出，待甘油管化冻后，分别吸取2%的样本加到20 mL的改良MRS液体培养基中，于37℃培养18 h后，取出并离心（8000 g离心10 min）得到分离的菌泥，将其用9 mL无菌生理盐水重悬，并震荡均匀，分别得到LRa05组、BLa80组和LA85组；
同时将置于-80℃冰箱于40%甘油管中保存的鼠李糖乳杆菌LRa05、动物双歧杆菌乳亚种BLa80和嗜酸乳杆菌LA85取出，待甘油管化冻后，以质量比为1:1:1的比例混匀后，得到混合样本，并于无菌操作台中吸取同样为2%的混合液加到20 mL的改良MRS液体培养基中，于37℃培养18 h后，取出并离心（8000 g离心10 min）得到分离的菌泥，将其用9 mL无菌生理盐水重悬，并震荡均匀得到复合菌组；
上述改良MRS液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖2%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%，余量为水；
（2）培养：使用前将培养基分装于离心管中，并于高压灭菌锅中121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至室温，于无菌操作室中将其按顺序倒入Growth Profiler 960高通量筛选设备（荷兰公司Enzyscreen）中待用。将活化重悬的菌液按照1%比例分别接入对应的96孔母版中，于37℃恒温条件下培养，每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
不同培养基中益生菌生长曲线的高通量测定：
Growth Profiler 960高通量筛选设备是一种可筛选、计算生长速率的一种便捷精简的测量手段。每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
各组的生长速率结果如表1：
表1
阴性对照为不含碳源的培养基MRS-N，空白对照为未接种菌液的各组培养基本体，阳性对照为常规培养基MRS-C；
由表1结果得到，在上述各组所述培养基中进行培养后，本发明提供的混合培养基组对各组的生长均出现最高生长促进作用，且在复合菌组呈现出协同共生的良好状态。培养基种的乳杆菌和双歧杆菌菌体通过分泌相关酶将培养基中的碳源分解为菌株基础营养物质，以促进其生长繁殖与代谢。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌增殖能力测试
测试方法：
另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液分别按体积分数1%接入对用的发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，测定OD600值和活菌数。
活菌数测定：取发酵液直接进行梯度稀释测定，选择稀释梯度7，8，9，测定方法采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度。同时使用选择培养基倾注，SM1（检测嗜酸乳杆菌LA85）、SM2（检测BLa80）、SM3（耗氧培养，检测LRa05，嗜酸乳杆菌在SM3培养基上基本不长）；
其中，SM1、SM2、SM3配置方法如下所示：
选择培养基（SM1）：在MRS-C基础上添加2%琼脂粉，将培养基配方按总体积1 L调配好，调整培养基pH至6.86左右，于灭菌锅121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至40-45，于无菌操作室中操作，加入抗生素盐酸氯林可霉（Sigma C5269，2 mg盐酸氯林可霉素加蒸馏水定容至10 mL，按0.05%添加）和环丙沙星（BAYER 02838560，20 mg盐酸环丙沙星加蒸馏水定容至10 mL，按0.5%添加），混合均匀备用；
选择培养基（SM2）：在MRS-C（改良MRS培养基）基础上添加2%琼脂粉，将培养基配方按总体积1 L调配好，调整培养基pH至6.86左右，于高压灭菌锅121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至40-45℃，于无菌操作室中操作，加入抗生素莫匹罗星锂盐（购于海博生物，每支添加于100 mL培养基中），混合备用。
选择培养基（SM3）：在MRS-N基础上添加2%琼脂粉和3%的甘露醇，将培养基配方按总体积1 L调配好，调整培养基pH至6.86左右，于高压灭菌锅121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至40-45℃，放置无菌操作室中操作，混合备用。
结果如表2和表3（为了方便测算，表中数值为三组平行实验的发酵液稀释5倍后测定值的平均值）所示：
表2
表2续
表3
根据表2，从各培养基的空白组结果来看，该测试具有可行性，可以保证本体不对益生菌生长产生影响，发酵液中OD600值的结果均能反应益生菌的生长情况。相较于MRS-C阳性对照组，组合培养基组中的益生菌呈现较好的生长状态，OD600值显著大于阳性对照组。其中复合菌组在本发明提供的培养基中的生长均很好，即在同样的培养条件和时间下，本发明提供的培养基对乳杆菌和双歧杆菌具有协同生长作用，使得常规条件下生长较慢的双歧杆菌属BLa80得以快速生长，结合表3的活菌数结果来看，本发明提供的培养基中对各组益生菌的活菌数都呈现10倍左右的增长情况，使其菌体量增大，实际的活菌数也同步增长。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌产酸能力测试
测试方法：另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液按体积分数1%接入对应的发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，测定初始和终末pH值，取其差值pH；结果如表4所示：
表4
在发酵培养基中，益生菌在代谢培养基中营养物质的同时，也会产酸，如短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）等，降低环境的pH值。从结果来看，4组组合培养基实验组对益生菌的促增殖能力和促产酸能力基本规律相似。相比于阳性对照组，对比例各组对益生菌的促产酸能力基本跟常规培养基无差别，但组合培养基组对益生菌的产酸具有显著的促进作用，尤其是复合菌组，其中本发明提供的培养基的效果最明显，可能在组合培养基中的营养物质较为丰富，给予菌株充足的碳源、氮源，从而为促其协同增殖。
验证组合培养基促乳杆菌和双歧杆菌耐胃酸耐胆盐能力测试
另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液按体积分数1%接入发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，取1.0 mL培养的复合菌组（浓度为1×1010 CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度）至pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0的9.0 mL无菌PBS中，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理（3 h）后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：存活率（%）=N1/N0×100%，其中，N1：不同pH的无菌PBS处理3 h后的活菌数；N0：0 h的活菌数。测试结果如表5：
表5
由表5可以看出，本发明所述组合培养基促进乳杆菌和双歧杆菌增殖的同时，使其具有良好的耐酸能力，正常健康肠道pH值范围内，可认为该组合所培养的菌株具有良好的耐酸能力，可以在肠道中正常定植，这为其制备改善人体肠道微生态的产品创造了条件。
应用例2
本应用例提供一种促进长双歧乳杆菌、植物乳杆菌和短双歧杆菌协同增殖的方法：
测试样品：实施例1-12提供的促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基和对比例1-8提供的培养基；
增值方法：
（1）活化：将置于-80℃冰箱于40%甘油管中保存的长双歧杆菌BL21、短双歧杆菌BBr60和植物乳杆菌Lp90取出，待甘油管化冻后，分别吸取2%的样本加到20 mL的改良MRS液体培养基中，于37℃培养18 h后，取出并离心（8000 g离心10 min）得到分离的菌泥，将其用9 mL无菌生理盐水重悬，并震荡均匀，分别得到LRa05组、BLa80组和LA85组；
同时将置于-80℃冰箱于40%甘油管中保存的长双歧杆菌BL21、短双歧杆菌BBr60和植物乳杆菌Lp90取出，待甘油管化冻后，以质量比为1:1:1的比例混匀后，得到混合样本，并于无菌操作台中吸取同样为2%的混合液加到20 mL的改良MRS液体培养基中，于37℃培养18 h后，取出并离心（8000 g离心10 min）得到分离的菌泥，将其用9 mL无菌生理盐水重悬，并震荡均匀得到复合菌组；
上述改良MRS液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖2%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%，余量为水；
（2）培养：使用前将培养基分装于离心管中，并于高压灭菌锅中121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至室温，于无菌操作室中将其按顺序倒入Growth Profiler 960高通量筛选设备（荷兰公司Enzyscreen）中待用。将活化重悬的菌液按照1%比例分别接入对应的96孔母版中，于37℃恒温条件下培养，每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
不同培养基中益生菌生长曲线的高通量测定：
Growth Profiler 960高通量筛选设备是一种可筛选、计算生长速率的一种便捷精简的测量手段。每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
各组的生长速率结果如表6：
表6
阴性对照为不含碳源的培养基MRS-N，空白对照为未接种菌液的各组培养基本体，阳性对照为常规培养基MRS-C；
由表6结果得到，对比阴性对照和阳性对照组，乳杆菌和双歧杆菌出现不同程度的生长状态，其中，双歧杆菌属，长双歧和短双歧在常规培养基中生长状态较弱，增殖难度大，但在组合培养基的作用下出现明显的生长增速。在复合菌组中，发现组合培养基对乳杆菌和双歧杆菌具有协同增殖作用，在组合营养条件的作用下，各菌株间得到相互地生长促进作用，出现明显的加速效果。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌增殖能力测试
测试方法：
另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液分别按体积分数1%接入对用的发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，测定OD600值和活菌数。
活菌数测定：取发酵液直接进行梯度稀释测定，选择稀释梯度7，8，9，测定方法采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度。同时使用选择培养基倾注，SM4（厌氧培养，检测BBr60，用于区分BBr60和BL21）、SM5（厌氧培养，检测BL21，用于区分BBr60和BL21）。
其中，SM4、SM5配置方法如下所示：
选择培养基（SM4）：在MRS-N基础上添加2%琼脂粉和3%的甘露醇，将培养基配方按总体积1 L调配好，调整培养基pH至6.86左右，于高压灭菌锅121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至40-45℃，于无菌操作室中操作，加入抗生素莫匹罗星锂盐（购于海博生物，每支添加于100 mL培养基中），混合备用。
选择培养基（SM5）：在MRS-N基础上添加2%琼脂粉和3%的L-阿拉伯糖，将培养基配方按总体积1 L调配好，调整培养基pH至6.86左右，于高压灭菌锅121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至40-45℃，于无菌操作室中操作，加入抗生素莫匹罗星锂盐（购于海博生物，每支添加于100 mL培养基中），混合备用。
结果如表7和表8（为了方便测算，表中数值为三组平行实验的发酵液稀释5倍后测定值的平均值）所示：
表7
表7续
表8
培养基对益生菌的生长培养增殖情况通常以发酵液的OD600值作为指标以评价菌体数量，根据表7和8结果，从各培养基的空白组结果来看，该测试具有可行性，可以保证本体不对益生菌生长产生影响，发酵液中OD600值的结果均能反应益生菌的生长情况。相较于MRS-C阳性对照组，我们可以发现BL21和BBr60在常规培养基中生长较缓慢，这与其所需培养条件较严苛，对氧敏感有关，但是在组合培养基的作用下，双歧杆菌属有了明显的增殖，另外，通过复合菌组的组，可以得到培养基对乳杆菌和双歧杆菌具有协同生长作用。生长OD600值和活菌数明显提高。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌产酸能力测试
测试方法：另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液按体积分数1%接入对应的发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，测定初始和终末pH值，取其差值pH；结果如表9所示：
表9
从上表结果来看，4组组合培养基实验组对益生菌的促增殖能力和促产酸能力基本规律相似。其中在BL21和BBr60组影响较明显，可见组合培养基对双歧杆菌这类生长较困难的菌株增殖效果较明显，当双歧杆菌和乳杆菌在本发明提供的组合培养基中培养时，各菌株出现积极的协同增殖效果。
验证组合培养基促乳杆菌和双歧杆菌耐胃酸耐胆盐能力测试
另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液按体积分数1%接入发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，取1.0 mL培养的复合菌组（浓度为1×1010 CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度）至pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0的9.0 mL无菌PBS中，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理（3 h）后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：存活率（%）=N1/N0×100%，其中，N1：不同pH的无菌PBS处理3 h后的活菌数；N0：0 h的活菌数。测试结果如表10。
表10
由表10可以看出，本发明所述组合培养基促进植物乳杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌增殖的同时，使其具有良好的耐酸能力。正常健康肠道pH值范围内，可认为该组合所培养的菌株具有良好的耐酸能力，可以在肠道中正常定植，这为其制备改善人体肠道微生态的产品创造了条件。
应用例3
本应用例提供一种促进嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌协同增殖的方法：
测试样品：实施例1-12提供的促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基和对比例1-8提供的培养基；
增值方法：与应用例1提供的方法相同，区别仅在于，采用嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌的组合，具体地4个实验组（LA85、BBi32、LC89、以及LA85-BBi32-LC89复合菌组）。
不同培养基中益生菌生长曲线的高通量测定：
Growth Profiler 960高通量筛选设备是一种可筛选、计算生长速率的一种便捷精简的测量手段。每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
各组的生长速率结果如表11：
表11
阴性对照为不含碳源的培养基MRS-N，空白对照为未接种菌液的各组培养基本体，阳性对照为常规培养基MRS-C；
由表11结果得到，对比阴性对照和阳性对照组，乳杆菌和双歧杆菌出现不同程度的生长状态，其中，双歧杆菌属，两歧双歧在常规培养基和单一益生元为碳源的培养基中生长状态较弱，增殖难度大，是几组双歧杆菌属最难培养的菌株，但在本发明所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基的作用下两歧双歧杆菌BBi32能有效提高生长速率，虽然其增殖程度还是低于其他乳杆菌和双歧杆菌。在复合菌组中，本发明提供的组合培养基对乳杆菌和双歧杆菌具有协同增殖作用，在组合营养条件的作用下，各菌株间得到相互地生长促进作用，出现明显的加速效果。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌增殖能力测试
测试方法：
与应用例1提供的方法相同，区别仅在于，采用嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌的组合，具体地4个实验组（LA85、BBi32、LC89、以及LA85-BBi32-LC89复合菌组）。
结果如表12和表13（为了方便测算，表中数值为三组平行实验的发酵液稀释5倍后测定值的平均值）所示：
表12
表12续
表13
培养基对益生菌的生长培养增殖情况通常以发酵液的OD600值作为指标以评价菌体数量，根据表12和13结果，从各培养基的空白组结果来看，该测试具有可行性，可以保证本体不对益生菌生长产生影响，发酵液中OD600值的结果均能反应益生菌的生长情况。相较于MRS-C阳性对照组，我们可以发现两歧双歧杆菌BBi32在常规培养基和单一的低聚甘露糖、低聚木糖以及水苏糖中生长较缓慢，但我们意外发现，在三者益生元以一定比例搭配作为培养基碳源时，能在一定程度上提高其增殖的菌体量和活菌数。在组合培养基的作用下，干酪乳杆菌LC89、嗜酸乳杆菌LA85以及两歧双歧杆菌BBi32三者协同增殖效果比单菌株培养效果更好，生长OD600值和活菌数明显提高。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌产酸能力测试
测试方法：与应用例1提供的方法相同，区别仅在于，采用嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌的组合，具体地4个实验组（LA85、BBi32、LC89、以及LA85-BBi32-LC89复合菌组）；结果如表14所示：
表14
从结果来看，4组组合培养基实验组对益生菌的促增殖能力和促产酸能力基本规律相似。其中两歧双歧杆菌BBi32组影响较明显，对其产酸能力有明显地促进作用。当双歧杆菌和乳杆菌在组合培养基中培养时，各菌株在协同增殖同时提高产酸能力。
验证组合培养基促乳杆菌和双歧杆菌耐胃酸耐胆盐能力测试
与应用例1提供的方法相同，区别仅在于，采用嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌的组合，具体地（LA85-BBi32-LC89复合菌组）；结果如表15所示。
表15
由表15可以看出，本发明所述组合培养基促进干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌增殖的同时，正常健康肠道pH值范围内，可认为该组合所培养的菌株具有良好的耐酸能力，可以在肠道中正常定植，这为其制备改善人体肠道微生态的产品创造了条件。
应用例4
本应用例提供一种促进4株双歧乳杆菌和4株乳杆菌协同增殖的方法：
测试样品：实施例1、10提供的促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基和对比例1-3提供的培养基；
增值方法：
（1）活化：将置于-80℃冰箱于40%甘油管中保存的鼠李糖乳杆菌LRa05、动物双歧杆菌乳亚种BLa80、长双歧杆菌BL21、干酪乳杆菌LC89、嗜酸乳杆菌LA85、两歧双歧杆菌BBi32、短双歧杆菌BBr60、植物乳杆菌Lp90取出，待甘油管化冻后，以质量比为1:1:1:1:1:1:1:1的比例混匀后，得到混合样本，并于无菌操作台中吸取同样为2%的混合液加到20 mL的改良MRS液体培养基中，于37℃培养18 h后，取出并离心（8000 g离心10 min）得到分离的菌泥，将其用9 mL无菌生理盐水重悬，并震荡均匀得到复合菌组。
（2）使用前将培养基分装于离心管中，并于高压灭菌锅中121℃、20 min灭菌后，迅速冷却至室温，于无菌操作室中将其按顺序倒入Growth Profiler 960高通量筛选设备（荷兰公司Enzyscreen）中待用。将活化重悬的菌液按照1%比例分别接入对应的96孔母版中，于37℃恒温条件下培养，每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
不同培养基中益生菌生长曲线的高通量测定：
Growth Profiler 960高通量筛选设备是一种可筛选、计算生长速率的一种便捷精简的测量手段。每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸随时间变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。
各组的生长速率结果如表16：
表16
虽然每种益生菌含有的基因不同导致表达产生的酶系不同，因而对不同益生元的嗜好性差异较大，即体现出不同的生长速率，但是结合表16结果和应用例1-3所示实验结果，组合培养基能够在一定程度上促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖，该培养基可作为一种促乳杆菌和双歧杆菌培养的通用培养基，最大化且最高效实现对各类菌株的增殖，同时我们发现协同增殖过程中，各菌株呈现显著地相互促进，提高整体生长速度，可以解决菌株产业化问题。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌增殖能力测试
测试方法：
另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液分别按体积分数1%接入对用的发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，测定OD600值和活菌数。
活菌数测定：取发酵液直接进行梯度稀释测定，选择稀释梯度7，8，9，测定方法采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度。
结果如表17（为了方便测算，表中数值为三组平行实验的发酵液稀释5倍后测定值的平均值）所示：
表17
结合表17结果和应用例1-3实验结果，组合培养基能显著提高乳杆菌和双歧杆菌的协同增殖作用。益生菌广泛存在于宿主体内，对营养要求极高且生长缓慢，对氧条件苛刻，尤其是双歧杆菌，低pH的抵抗能力差，生存期较短，而组合培养基在一定程度上解决了该问题。组合培养基中拥有多方面益生菌生长所需营养物质，且具有合适比例，使得乳杆菌和双歧杆菌协同作用，协同利用营养物质，跨越生长停滞期，进入生长对数期，呈现高活菌数，同时增强其益生功能。
培养基促乳杆菌和双歧杆菌产酸能力测试
测试方法：另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液按体积分数1%接入对应的发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，测定初始和终末pH值，取其差值pH；结果如表18所示：
表18
结合表18结果和应用例1-3实验结果，组合培养基促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的同时对其产酸能力也有一定的促进作用。单菌株生长促产酸能力各有差异，但协同作用下，乳杆菌和双歧杆菌可根据所需利用一定量的低聚甘露糖，水苏糖和低聚木糖，供能或提供酸类物质或其代谢产物，调节微生态环境pH。
验证组合培养基促乳杆菌和双歧杆菌耐胃酸耐胆盐能力测试
另外同步将上述步骤（1）活化后的菌液按体积分数1%接入发酵液体培养基中，于厌氧条件下37℃连续培养20 h，取1.0 mL 中培养的复合菌组（浓度为1×1010 CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度）至pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0的9.0mL无菌PBS中，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理（3 h）后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：存活率（%）=N1/N0×100%，其中，N1：不同pH的无菌PBS处理3 h后的活菌数；N0：0 h的活菌数。测试结果如表19。
表19
由表19可以看出，本发明所述组合培养基促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的同时，使其具有良好的耐酸能力，在pH为2.0时孵育3h，存活率可达83%以上；在pH为3.0时孵育3 h，存活率可达89.3%以上；在pH为4.0时孵育3 h，存活率可达94.3%以上；在pH为5.0时孵育3 h，存活率可达95.6%以上。正常健康肠道pH值范围内，可认为该组合所培养的菌株具有良好的耐酸能力，可以在肠道中正常定植，这为其制备改善人体肠道微生态的产品创造了条件。
验证对体内AKK菌丰度的提高实验
以最常见的代谢疾病之一的糖尿病为例。该实验通过高脂饮食有道小鼠产生胰岛素抵抗从而造模2型糖尿病小鼠模型，对比小鼠粪便中的AKK菌的变化，从而验证组合培养基对乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的同时也促使其增进在体内的益生功能。
将复合培养基液在8000 g下离心10 min，取上清液过0.22 μm无菌滤膜，得到复合菌上清液；使用PBS重悬菌体，得到复合菌悬液。
SPF级C57BL/6J雄性小鼠30只，体重23 g±2 g，由上海市实验动物研究中心提供，已获得上海实验动物研究中心动物伦理委员会（伦理号：2021082003）的伦理批准。小鼠经过1周的适应性喂养后，1周后随机分为3组，空白对照组（CTL）、模型组和益生菌组合组。分组后前5周实验期间，CTL组继续喂食普通饲料，其余组喂食高脂饲料，同时益生菌组合组喂食混合益生菌剂（实施例1的益生元组合物由1.2份水苏糖、1.2份低聚甘露糖和0.6份低聚木糖组成，实施例10的益生元组合物由1.2份水苏糖、1.2份低聚甘露糖、0.5份低聚木糖、0.07份阿拉伯树胶、0.03份燕麦β-葡聚糖组成）。第5周，所有小鼠禁食8小时以上，CTL组小鼠腹腔注射生理盐水，其余各组小鼠注射新鲜的链脲佐菌素STZ（sigma公司，按100 mg/kg体重注射）。造模1周后，所有小鼠开始喂食普通饲料，同时益生菌组合组喂食混合益生菌剂。
粪便样本的采集及小鼠肠道AKK菌丰度的检测：分别于高脂干预前和干预后第10周，收集动物粪便。收集小鼠的新鲜粪样于冻存管中置于-80℃保存。用粪便基因DNA提取试剂盒提取小鼠肠道微生物总DNA，用微量分光光度计测定DNA浓度与纯度。
扩增AKK菌所用引物参考文献，上游引物：5'-AGAGGTCTCAAGCGTTGTTCGGA-A-3'，下游引物：5'-TTTCGCTCCCCTGGCCTTCGTGC-3'，扩增片段大小285 bp。以PCR扩增AKK菌16SrDNA条带为靶片段，经切胶回收后作为目标菌DNA标准品，操作过程严格按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司）说明进行。将标准品稀释到浓度梯度10-1-10-8 copies/μL的DNA样本为阳性模板，并将最后一个浓度梯度设置为起始拷贝数(LogSQ)=1，同时以去核酸水为阴性对照，每个样品都设置复孔，进行荧光定量PCR，扩增体系：目标菌上下游引物各1μL，荧光染料SYBR Green II 12.5μL，样品(粪菌总DNA) 2 μL，dd H2O 8.5 μL。反应条件：预变性95℃、3min，变性95℃、15s，退火65℃、30s，共40个循环。AKK菌丰度水平的影响结果如表20所示。
表20
注：a P<0.05表示与空白组对比，有显著性差异。
根据表20结果来看，与空白组相比，模型组的AKK菌丰度明显下降，而组合益生菌组在复合益生菌干预治疗后，AKK菌丰度能恢复正常水平略高状态。这意味着该组合培养基促进复合益生菌协同生长增殖的同时，也实现益生菌功能的协同增效，可能在多株有益菌乳杆菌和双歧杆菌能顺利定植肠道后，使其对机体肠道上皮细胞黏膜层具有保护作用，使肠道上皮细胞黏膜层黏蛋白含量丰富，从而在一定程度上提高肠道内二代益生菌，如AKK菌得以将黏膜层作为其能量来源，充分利用，提高其丰度，处于竞争优势，保护肠道免受病原体侵害，从而起到预防/治疗疾病的作用。
应用例5
通过组合培养基协同增殖乳杆菌和双歧杆菌的组合益生菌药物的制备
本应用例提供一种经组合培养基协同增殖培养的复合益生菌的药物，可改善各种常见代谢疾病、调节肠道微生态环境。所述改善各种常见代谢疾病、调节肠道微生态环境的药物通过以下方法进行制备：
将鼠李糖乳杆菌LRa05、动物双歧杆菌乳亚种BLa80、长双歧杆菌BL21、干酪乳杆菌LC89、嗜酸乳杆菌LA85、两歧双歧杆菌BBi32、短双歧杆菌BBr60、植物乳杆菌Lp90共同接种于组合培养基base4（实施例1提供的液体培养基）中，37℃下培养18 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于组合培养基base4（实施例1提供的液体培养基）中，37℃下培养16 h，得到菌液；将菌液在8000 g下离心10 min，得到复合益生菌菌体；
将菌体用质量浓度为10%的脱脂奶粉重悬至浓度为1×1011 CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在37℃下预培养1 h后冻干，得到所述改善\治疗代谢疾病、调节肠道微生态的药物。
应用例6
本应用例提供一种组合培养基协同增殖乳杆菌和双歧杆菌的组合益生菌药物（应用例5提供的药物）在肥胖代谢疾病人群中的功能验证：
肥胖症患者是指BMI超过30 kg/m2的人群，我国肥胖人数居全球首位。该应用例选取了100名患有肥胖及其代谢综合征的志愿者（纳入标准：BMI>30 kg/m2且了解试验内容，并同意参与本试验。排除标准：神志不清、无法正常沟通者；中途退组者；试验开始前曾接受其他各类药物治疗；存在心血管、肾脏以及其他器质性病变），随机分为2组，每组50名，对该100名志愿者在接受所供益生菌的治疗前称重，服用益生菌粉（如实施例6所制备）每日1次，每次1袋，用温水或直接加入牛奶、米糊等流质食品中调匀饮用。共服用2个月。
观察100名志愿者治疗前后体重变化情况。收集数据，使用RStudio 4.2.0分析，结果如表21：
表21
从表21结果可以得到，通过对比100名志愿者治疗前后体重变化情况，治疗前后体重发生明显变化（P <0.05）。即可说明，该组合培养基协同增殖乳杆菌和双歧杆菌的同时确保其功能有效，调节肠道菌群，有助于调节肥胖人群的代谢，从而改善肥胖等代谢性疾病。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，其特征在于，所述培养基按质量百分含量计包括如下组分：益生元组合物2-5%、蛋白胨0.5-5%、牛肉膏0.5-2%、酵母浸膏0.1-2%、柠檬酸氢二铵0.05-1%、K2HPO4 0.05-1%、MgSO4 0.01-1%、MnSO4 0.01-1%、吐温-80 0.05-1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05-1%；
其中，所述益生元组合物包括质量比为(1-2):(1-2):(0.1-1)的水苏糖、低聚甘露糖和低聚木糖；
所述乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合；
所述双歧杆菌选自动物双歧杆菌乳亚种、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，其特征在于，所述益生元组合物中还包括阿拉伯树胶和/或燕麦β-葡聚糖；
其中，所述阿拉伯树胶的添加量占所述益生元组合物总质量的1-5%，燕麦β-葡聚糖的添加量占所述益生元组合物总质量的0.5-2%。
3.根据权利要求1所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基，其特征在于，所述培养基中还包括0.1-1%的氨基酸复合物；
其中，所述氨基酸复合物包括质量比为(5-6):(2-3):(1-2):(0.5-1)的L-缬氨酸、L-蛋氨酸、γ-氨基丁酸和γ-聚谷氨酸。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基在促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖中的应用；
所述乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合；
所述双歧杆菌选自动物双歧杆菌乳亚种、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌LRa05、干酪乳杆菌LC89、嗜酸乳杆菌LA85或植物乳杆菌Lp90中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述双歧杆菌选自动物双歧杆菌乳亚种BLa80、长双歧杆菌BL21、两歧双歧杆菌BBi32或短双歧杆菌BBr60中的任意一种或至少两种的组合。
7.一种乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
（1）将乳杆菌和双歧杆菌混合后，接种于活化培养基中，进行活化，得到活化复合菌；
（2）将步骤（1）得到的活化复合菌接种于权利要求1-3中任一项所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基中，进行培养，得到发酵液；
所述乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合；
所述双歧杆菌选自动物双歧杆菌乳亚种、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌或短双歧杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求7所述的乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述活化培养基为改良MRS液体培养基，所述改良MRS液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：蛋白胨0.5-5%、牛肉膏0.5-2%、葡萄糖1-3%、酵母浸膏0.1-2%、柠檬酸氢二铵0.05-0.5%、K2HPO4 0.05-1%、MgSO4 0.01-1%、MnSO4 0.01-0.03%、吐温-80 0.05-0.5%，余量为水。
9.根据权利要求7所述的乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述活化的具体步骤为：
将质量比为(0.5-2):1的乳杆菌和双歧杆菌混合得到混合菌种，以1-5 vol%的接种量接种于活化培养基中，在35-40℃下培养12-24 h后，以7000-9000 g的离心力离心5-15min，分离得到混合菌泥；再将混合菌泥重悬于生理盐水中，所述混合菌泥和生理盐水的质量比为1:(9-15)，得到活化复合菌。
10.根据权利要求7所述的乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养的具体步骤为：
将步骤（1）得到的活化复合菌以1-5 vol%的接种量接种于所述促进乳杆菌和双歧杆菌协同增殖的培养基中，于厌氧条件35-40℃下培养15-25 h后，得到发酵液。
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| GR01 | Patent grant | ||
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