CN108117991A - 一种肠道微生物体外模拟培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠道微生物体外模拟培养方法，所述方法为：将粪便样品接种至发酵培养基中，37℃厌氧发酵培养，获得含肠道微生物的发酵液；所述发酵培养基为含6‑10g/L碳水化合物的YCFA基础培养基，所述碳水化合物为多糖、寡糖或糖醇；本发明通过检测肠道微生物在体外模拟发酵系统中对特定碳源的一系列响应值，直接反映肠道微生物的代谢能力以及益生菌的水平，实现肠道微生物这一复杂生态系统功能的直接评估。

Description

一种肠道微生物体外模拟培养方法

(一)技术领域

本发明涉及一种肠道微生物体外模拟培养方法。

(二)背景技术

随着分子生物学技术突飞猛进的发展，特别是完成了人类基因组测序技术和人类肠道微生物16S rRNA基因测序，我们对影响人类健康的因素有了更加深刻的了解。肠道微生物是处理我们人体自身的基因之外另一个与健康的关系非常密切的因素。目前已经证明肠道微生物影响了宿主对食物中能量的转化效率，影响着宿主的体重，参与了代谢综合征、脂肪肝、慢性结肠炎、肠癌等等发病过程。甚至，肠道细菌参与了五羟色胺的代谢，影响到宿主的精神状态。因此，人体健康的概念有了新的含义，除了自身器官的功能正常，还应该包含肠道微生物的功能正常。

最新的研究表明我们人体肠道内，主要是在大肠生活着大量的微生物，其数量是人体细胞数量10倍。肠道微生物目前知道的有1100余种，每个人约有160种，数量上的局限注定了个体差异的巨大。其中大部分是厌氧菌，多数不能单独培养，导致我们对肠道微生物的认识十分有限，因此仅从肠道微生物的组成去判断肠道微生物的功能是否正常，在目前的认知水平是不合理的。

由于肠道微生物数量的庞大，其代谢产物的量也是惊人的，包括乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸(SCFA)、氢气、硫化氢等气体，这些小分子代谢产物集中排放在大肠这约1.5米的管道中，并且被肠粘膜迅速吸收进入血液，其影响范围波及人体各个器官，同时激活肠壁细胞上的各类受体，包括G蛋白偶联受体(GRP)、不仅涉及能量代谢、与体内自由基的氧化还原有关，还影响到神经元的营养与信号传递。乙酸是细菌提供宿主能量的主要来源，有刺激食欲的作用，提供人体日总能量的10％，同时抑制病原菌(Fukuda,et al,2011)。丙酸是通过肠壁吸收进血液在肝脏被代谢，参与丙酮酸逆转化葡萄糖的过程，同时抑制脂肪的合成过程，并影响胆固醇的合成(Raman,et al,2016)。丁酸直接被肠壁细胞作为能源利用，有抑制炎症的作用。丙酸和丁酸还能够激活能够诱导肠激素肽YY(PYY)和GLP-1的另一个游离脂肪酸受体FFAR3，促进胰岛素分泌，产生饱腹感。此外，SCFAs(例如丙酸酯)通过与G蛋白偶联受体GRP41和GRP43的相互作用调节交感神经系统的活性。气体分子与细胞内的氧化应激，线粒体失衡和其他细胞疾病相关。硫化氢涉及多种生理过程的调节，包括炎症反应、细胞凋亡和平滑肌张力。在生理浓度下，主要作用靶标是心血管和神经系统，涉及ATP敏感的钾通道、钙和氯通道，还能够调节5-羟色胺神经元的活性，并诱导促肾上腺皮质激素释放激素的释放。肠道微生物是当之无愧的人体的超级器官。因此，在个体差异巨大，大部分肠道微生物菌株的功能不明确的情况下，仅通过16S rRNA基因测序，了解微生物的组成是不足以揭示肠道微生物与人体健康、疾病的关系，我们更加关注的是肠道微生物这个生态系统的代谢功能是否正常。

粪便作为排泄物，包含食物残渣和大量的肠道微生物，是无创检测：包括宿主肠道自身的疾病排查以及肠道微生物菌群结构分析的最佳检测对象。然而对于肠道微生物代谢产物的检测，却不能真实反应肠道微生物的代谢状况。因为粪便中这些短链脂肪酸和气体的含量，是微生物生产量与宿主肠壁吸收量的一个差值。要检测肠道微生物代谢产物，必须规避宿主肠壁细胞吸收的影响。

肠道微生物的体外模拟发酵系统的最大的特点就是能够模拟肠道微生物在宿主体内的发酵。作为体外发酵系统，自然就避免人体吸收微生物代谢产物的影响，从而能够直接获得反映肠道微生物的代谢状况的数据。肠道微生物体外模拟系统有多种形式，主要包括批量快速发酵模型、单级连续发酵模型、多级连续发酵模型，SMIT系统等。欧洲科学家最早开展这方面研究，获得了欧洲人肠道微生物代谢对不同碳水化合物、蛋白质代谢的特征数据，而且还验证了人体肠道体外模拟系统的可靠性。我们的前期研究也表明YCFA培养基能够在体外肠道微生物模拟系统中模拟人肠道微生物的组成，相似率达到70％以上(Yin,et al.,ISME J,2010,4(3),367-76)。由于连续发酵系统比较复杂、操作繁琐，到达平衡态的时间需要7天以上，而批量发酵，不仅系统简单、操作容易，而且可以让能够利用培养基中的碳源的肠道微生物在在较短的时间，比如24小时，生长起来，为快速了解肠道微生物对特定碳源的利用水平与代谢特性提供了可能。

由于肠道微生物是与我们共生的微生物，尽管种类很多，其营养源的种类却是相对固定的，全部属于我们宿主的食物范围。因此，当我们选用不同的食物组分作碳源，并且当这些碳源的数量足够多的话，批量发酵就能覆盖绝全部肠道微生物的生长条件，从而为全面研究人体的肠道微生物提供了可能。另一方面，由于肠道微生物个体差异巨大，很难从众多的微小的、非显著性的差异中，区分哪些是个体差异造成的，哪些是疾病引起的。而单一碳源的体外批量发酵，能够引导某一类肠道微生物的过度生长，从而放大肠道微生物之间的细微的差异，为寻找疾病引起的肠道微生物差异提供了新的方法。

淀粉是我们人体能够消化吸收的碳水化合物，而大部分天然植物性食物中除了淀粉和不可溶的纤维素，还有很多可溶的、却不能被人体消化的碳水化合物，往往是一些与淀粉类似的由葡萄糖、果糖、半乳糖以及甘露糖、木糖等等单糖聚合而成的多(聚)糖和低聚糖，由于人体缺少水解这类碳水化合物的酶，所以这些食物成分就随着食糜直接被排入大肠，成为肠道微生物的营养源。在上个世纪九十年代初，人体实验证明来自植物菊苣的菊粉—一种以葡萄糖为一端连接数十个果糖的多糖，及其降解产物低聚果糖能够选择性地刺激大肠中双歧杆菌的生长。双歧杆菌是人体的益生菌，因而这类能够选择性促进益生菌生长的不消化的碳水化合物被称为益生元。目前，我国已经有十余种益生元，包括多糖和低聚糖被收录在卫计委的新食品资源目录中。由于这些益生元不被人体消化，因此这些益生元的发酵产物被认为是肠道微生物的代谢产物。临床采用呼气试验检测小肠细菌过度繁殖就是利用乳果糖的这个特点，即乳果糖被细菌作为营养源发酵后产氢气的特点，检测患者服用乳果糖后氢气的响应值，作为判断这类疾病的一个临床检测指标。

本发明就是利用十余种国家新食品资源目录中收录的益生元，加上我们食物中含量最多的淀粉，开展肠道微生物的体外批量发酵(以下简称体外发酵)，通过接种粪便悬浊液，检测在不同益生元培养基中生长的肠道微生物的代谢产物(包括短链脂肪酸和气体)的含量，即特定碳源的体外发酵的代谢响应值，以这一组对不同益生元的代谢响应值来反映这个宿主的全体肠道微生物的代谢活性。进一步，通过开展不同人群间的肠道微生物的体外发酵及其代谢产物的检测，就能够比较不同人群肠道微生物对同一碳源的代谢活性的差异，从而为寻找特定人群之间，如婴儿与成人，疾病与健康人群的代谢特征提供方法，为寻找疾病的生物标记物提供了手段，并且还有可能通过进一步的测序，找到菌群结构的差异，从而为揭示肠道微生物与疾病的关联机理提供检测手段。此外，由于批量发酵操作简单，发酵时间短，非常适合多样本的平行试验，这也为高通量的检测提供了可能。

综上所述，本发明利用体外模拟发酵系统可以规避人体宿主对肠道微生物代谢产物的吸收的优势，同时结合益生元不被人体消化的特点，以肠道微生物在体外发酵产生的代谢响应值来直接反映其在体内的代谢活性为基础，建立一套以新食品资源目录收录的益生元为特定碳源的肠道微生物体外模拟培养的方法，通过检测体外发酵系统中的短链脂肪酸和气体等代谢响应值，实现高通量肠道微生物的体外代谢活性检测，以此来判断个体肠道微生物的代谢能力，评估其肠道的健康水平。

(三)发明内容

本发明通过个体粪便在肠道微生物体外模拟发酵培养，检测肠道微生物对特定的碳水化合物发酵后产生的一系列代谢产物和益生菌的响应值，综合判断该个体肠道微生物的代谢能力和益生菌的水平，对个体的肠道微生态是否失衡做出评估。解决了现代医学对肠道微生态的健康与否没有检测手段的难题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种肠道微生物体外模拟培养方法，所述方法为：将粪便样品接种至发酵培养基中，37℃厌氧发酵培养，获得含肠道微生物的发酵液；所述发酵培养基为含6-10g/L(优选8g/L)碳水化合物的YCFA基础培养基，所述碳水化合物为多糖、寡糖或糖醇，所述YCFA基础培养基终浓度组成为：酪胨10g/L，酵母提取物2.5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L，血红素0.05g/L，NaCl 4.5g/L，CaCl₂·6H₂O 0.09g/L，KH₂PO₄ 0.45g/L，K₂H PO₄ 0.45g/L，MgSO₄·7H₂O 0.09g/L，微量元素，溶剂为去离子水，pH值自然，其中微量元素在YCFA基础培养基中的终浓度组成如下：刃天青0.1mg/L、生物素10μg/L、钴胺素10μg/L、对氨基苯甲酸30μg/L、叶酸50μg/L、吡哆胺150μg/L、硫胺素50μg/L、核黄素50μg/L。

进一步，所述粪便样品按如下方法制备：取粪便与经灭菌、厌氧处理的pH7.0、0.1MPBS涡旋混匀，过800目滤网，取滤液即为粪便样品。

进一步，所述寡糖是指以α-1,4糖苷键或者α-1,6糖苷键链接的单一或者多个单糖的聚合物(聚合度为2-60)，其中的单糖为下列之一：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和木糖。

进一步，所述寡糖为下列之一或多种：乳果糖(lactulose(LAU)，由半乳糖与果糖缩合的二糖，分子量342.30)、棉子糖(raffinose(RAF)，由半乳糖、葡萄糖和果糖缩合成的三糖，分子量504.43)、水苏糖(stachyose(SCY)，由2个半乳糖、葡萄糖和果糖缩合成的四糖，分子量666.58)、低聚果糖(Fructooligosaccharides(FOS)，以一个葡萄糖基为链的端基，由α-果糖以β-1,2糖苷键连接，聚合度2-8，分子量344-1300)、低聚半乳糖(galactooligasaccharideslactulose(GOS)，由α-果糖以β-1,2糖苷键连接，分子量300-2000)、低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides(IMO)，由葡萄糖分子以α-1，6糖苷键连接而成，分子量300-2000)、低聚甘露糖(Mannose oligosaccharideslactulose(MOS)，聚合度2-10，分子量342.3-1639.44)或低聚木糖(Xylo-oligosaccharide(XOS)，聚合度2-7，分子量282.28～942.93)。

进一步，所述糖醇为下列之一或多种：甘露糖醇(Mannitol，MAI)、木糖醇(Xylitol，XYI)、山梨糖醇(Sorbitol，SOI)或赤藓糖醇(Erythritol，ERI)。

进一步，所述多糖为下列之一或多种：菊粉(inulin(INU)，又称多聚果糖(polyfructose)由α-果糖以β-1,2糖苷键连接，分子式(C₆H₁₂O₆)-(C₆H₁₂O₅)n(n＝2～60)，分子量344-11400)、可溶性淀粉(starch，STA)或抗性淀粉(CMS)。

本发明将待测个体粪便悬浊液和正常个体粪便悬浊液分别接种于发酵培养基进行肠道微生物的体外培养，检测发酵液中肠道微生物对特定碳水化合物的一系列的代谢产物的响应值，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等短链脂肪酸的含量(表10)，产气量(表11)以及寡多糖自身的降解率(表12)，分析个体肠道微生物的代谢能力；同时检测发酵液中双歧杆菌和乳酸菌的响应值(表13)，以评价该个体肠道中益生菌的水平，实现肠道微生态健康状况的全面评估，指导饮食以及益生菌、益生元的补充。由于单一益生元的体外模拟发酵能够选择性富集以此为碳源的肠道微生物，就能够得到更多的这类肠道微生物的代谢产物，通过11种不同碳源的体外培养，就能够把在粪便中很小的代谢产物的差异，通过十余种不同碳源的富集培养而放大，这种较大的差异有可能出现在所有的碳源培养中，也可能只出现在个别碳源发酵液里。尽管粪便中SCFA发酵前没有差异，但经过体外发酵，IBS组对特定寡多糖发酵产生的SCFA响应值与健康组有了显著的差异。目前医学界对IBS没有临床诊断方法，只能通过问卷打分的方式判断疾病与否，对于IBS与肠道菌群的关系也没有明确的结论。而本发明涉及的体外发酵，能够通过体外发酵微生物的代谢产物，主要短链脂肪酸(SCFA)的值的差异，将IBS与正常组区分开了，揭示出IBS病人的肠道微生态存在一定程度的紊乱。尽管在粪便的肠道微生物代谢产物检测值上看不到与正常组的差异，在特定碳源的体外发酵过程中检测到了IBS比正常组偏高的丙酸值。

表10.体外发酵液中短链脂肪酸的含量

表11.体外发酵产气量

益生元	发酵后产气量(kPa)
		空白对照YCFA	12.1-14.1
乳果糖LAU	14.4-21.7
		棉子糖RFU	16.5-25.0
低聚果糖FOS	15.5-23.6
		低聚半乳糖GOS	15.8-23.4
低聚异麦芽糖IMO	16.4-24.2
		低聚甘露糖MOS	25.1-36.4
低聚木糖XOS	15.5-22.0
		菊粉INU	18.9-27.0
可溶性淀粉STA	18.1-27.0
		甘露糖醇MAI	34.7-46.0
木糖醇XYI	16.6-21.3

表12.体外发酵益生元的降解率

益生元	降解率(％)
		乳果糖LAU	87.1-93.8
棉子糖RFU	53.0-66.5
		低聚果糖FOS	43.4-59.2
低聚半乳糖GOS	42.4-58.5
		低聚异麦芽糖IMO	57.7-68.5
低聚甘露糖MOS	53.0-64.0
		低聚木糖XOS	53.9-68.4
菊粉INU	15.9-25.7
		可溶性淀粉STA	26.1-35.7

表13.体外发酵后益生菌的含量

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明通过检测肠道微生物在体外模拟发酵系统中对特定碳源的一系列响应值，直接反映肠道微生物的代谢能力以及益生菌的水平，实现肠道微生物这一复杂生态系统功能的直接评估。检测手段主要涉及气相色谱，薄层层析色谱，qPCR分析等各个领域的成熟可靠的分析手段。凭借体外培养的高通量与快速的优势，不仅可以针对单一个体的肠道微生物，一次性检测几种乃至几十种特定底物的代谢活性，而且可以同时开展多个人的检测，能够满足临床对体外检测样本数量大的要求。而且本发明，可以在检测肠道微生物的代谢响应值之后，继续进行肠道微生物的16S rRNA基因的深度测序，结合测序技术的优势，进一步提高本发明对肠道微生物与健康、疾病的评估水平。

(四)附图说明

图1含三种底物培养基及空白培养基产气量比较。

图2体内氢呼气AUC值于体外发酵24小时压强间的关系。

图3发酵液中便秘组与健康组乙酸含量比较。

图4发酵液中便秘组与健康组异丁酸含量比较。

图5发酵液中便秘组与健康组戊酸含量比较。

(五)具体实施方式

通过实施例1的结果可以得到健康的成人对特定寡多糖的代谢响应值与益生菌响应值，以表征健康的肠道微生物的代谢活性。

通过实施例2的结果可以看到IBS病人组在短链脂肪酸的响应值，尤其是丙酸的响应值与健康组的显著性差异，提示体外发酵液中反应出的较高的丙酸值是IBS病人肠道微生态失衡的特征。

通过实施例3的结果可以看到便秘病人组在短链脂肪酸的响应值与健康人也是有明显差异的，也提示便秘病人的肠道微生态出现了一定程度的失衡。

通过这些实施例的结果，可以看到，利用肠道微生物的体外模拟发酵系统，可以对整个肠道菌群的代谢能力有个全面的检测，尽管这些代谢产物的数值都是针对特定碳水化合物发酵的响应值，但是这些响应值能够让肠道微生物代谢功能上微小的差异，在没有宿主吸收干扰的体外模拟发酵过程中被放大，并且被本发明的检测系统所捕获，反映出粪便代谢产物检测体现不出的肠道微生物功能上的差异，作为区别疾病与健康一种手段。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1肠道微生物经体外批量发酵对特定寡多糖的响应值-健康成人

1、培养基配制

YCFA基础培养基的配方如下：酪胨10g/L，酵母提取物2.5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L，血红素0.05g/L，NaCl 4.5g/L，CaCl₂·6H₂O 0.09g/L，KH₂PO₄ 0.45g/L，K₂H PO₄0.45g/L，MgSO₄·7H₂O 0.09g/L，微量元素，溶剂为去离子水，pH值自然。微量元素在YCFA基础培养基中的终浓度组成如下：刃天青0.1mg/L、生物素10μg/L、钴胺素10μg/L、对氨基苯甲酸30μg/L、叶酸50μg/L、吡哆胺150μg/L、硫胺素50μg/L、核黄素50μg/L。

YCFA-寡糖培养基是在YCFA基础培养基中加入终浓度8g/L的寡糖或糖醇。寡糖是指以α-1,4糖苷键或者α-1,6糖苷键链接的单一或者多个单糖的聚合物，其中的单糖为下列之一：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和木糖，聚合物的聚合度为2-60。寡糖为下列之一：乳果糖(LAU，分子量342.30)，棉子糖(RAF，分子量504.43)，水苏糖(SCY，分子量666.58)，低聚果糖(FOS，聚合度2-8)，低聚半乳糖(GOS，聚合度2-8)，低聚异麦芽糖(IMO，聚合度2-10)，低聚甘露糖(MOS，聚合度2-10)和低聚木糖(XOS，聚合度2-7)。糖醇为下列之一：甘露糖醇(MAI)、木糖醇(XYI)、山梨糖醇(SOI)和赤藓糖醇(ERI)。

YCFA-多糖培养基是在YCFA基础培养基中加入终浓度8g/L的多糖，其中多糖为下列之一：菊粉(INU)，可溶性淀粉(STA)和抗性淀粉(CMS)。

培养基厌氧处理：在充氮的环境中，将加热的YCFA-寡糖培养基或YCFA-多糖培养基装瓶，加盖，121℃高压灭菌20min，冷却备用。

2、人体粪便样品的制备

人体粪便样品由志愿者提供，志愿者要求身体健康，采样前2个月内没有服用过抗生素、益生元等。以15ml离心管称取0.8g粪便，加入8ml经过灭菌，厌氧处理的pH7.0、0.1MPBS，蜗旋混匀，以800目滤网过滤，去除大颗粒，获得0.1g/ml的粪便悬浊液。

3、接种与培养

按体积浓度10％的接种量，取500μL的粪便悬浊液接种到装有5mL YCFA基础培养基、YCFA-寡糖培养基或者YCFA-多糖培养基(配方见表1，Y是指YCFA基础培养基)容器中，37℃厌氧发酵培养24h。

4、培养过程中的样品采集与预处理

4.1发酵培养24h，摇匀后，取发酵液500μL，加100μL、75mM巴豆酸偏磷酸溶液，混匀后-30℃冻结保存作为短链脂肪酸(SCFA)的测定样品；再取发酵液50μL进行寡多糖的TLC检测或-20℃保存备用。巴豆酸偏磷酸溶液配制：以3.125M偏磷酸水溶液为溶剂配制75mM巴豆酸偏磷酸溶液。

4.2将发酵培养24h后的发酵液，4℃、14000rpm离心10min，取上清与沉淀分别在-20℃保存备用，其中的沉淀用于DNA提取。

5、体外发酵后肠道微生物代谢响应值的检测

5.1短链脂肪酸检测--气相色谱

肠道微生物的主要代谢产物是短链脂肪酸(SCFA)，包括乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸，异戊酸，以75mM巴豆酸偏磷酸溶液为内标与酸化剂，利用气相色谱(GC)检测粪便样品以及发酵液中的短链脂肪酸的含量。

5.1.1仪器

GC plus 2010(岛津)、氮气瓶、氢气瓶、空气发生器；柱子：DB-FFAP(安捷伦)

5.1.2仪器与方法参数

升温程序：升温至70℃，再以25℃/min升至240℃，维持4min，共13.8min；

SPL1温度：250℃，FID1温度：250℃；

载气类型：H₂；

FID1尾吹流量：20.0mL/min，氢气流量：40.0mL/min，空气流量：400.0mL/min；

进样模式：分流，分流比20：1；

线速：46.0cm/sec；

进样体积：1.0μL，进样模式：正常注入，进针速度中。

洗瓶程序：进样前MQ清洗2次，样品清洗2次。

5.1.3短链脂肪酸标准曲线的制备：

将相同体积的6种标准有机酸水溶液混匀，获得标准有机酸混合液，各组分的终浓度分别如下：25.26mM乙酸，8.32mM丙酸，3.34mM丁酸，3.34mM异丁酸，3.24mM戊酸，3.24mM异戊酸。以此混合液为标准有机酸混合液的最高浓度，用去离子水以2倍稀释法配制4个浓度梯度各1ml，从第二浓度梯度到第五浓度梯度如下：乙酸分别为12.13mM、6.06mM、3.03mM、1.02mM；丙酸分别为4.16mM、2.08mM、1.04mM、0.52mM；丁酸与异丁酸分别为1.67mM、0.84mM、0.42mM、0.21mM；戊酸与异戊酸分别为1.62mM、0.81mM、0.40mM、0.20mM。每个浓度梯度的标准有机酸混合液中分别添加0.2ml、75mM巴豆酸偏磷酸溶液，混匀后-30℃冻结24h，解冻后离心14000rpm 10min，4℃，取上清，用0.22μm过滤器过滤，取滤液(即为混合标准品)150μL移入GC样品瓶的内插管进行SCFA检测，其余滤液-30℃保存备用。按方法5.1.2进行GC检测，获得各个标准有机酸的保留时间和峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标，建立标准曲线，这6种SCFA的方程分别为：乙酸y＝0.177660x(R²＝0.99993)，丙酸y＝3765x(R²＝0.99997)，丁酸y＝0.5531x(R²＝0.99998)，异丁酸y＝0.5674x(R²＝0.99997)，戊酸y＝0.7687x(R²＝0.99994)，异戊酸y＝0.7304x(R²＝0.99996)。

5.1.4样品预处理：

分别取步骤2的粪便悬浊液和步骤3的发酵液1.5ml，离心(14000rpm，5min，4℃)，取上清。分别取1ml上清液，添加0.2ml、75mM巴豆酸偏磷酸溶液，-30℃冻结24h，解冻后离心14000rpm，10min，4℃，取上清，并用0.22μm过滤器过滤，取150μL滤液(即为待测样品)移入GC样品瓶的内插管进行SCFA检测，将得到的图谱中与各个标准有机酸的保留时间一致的峰识别为有机酸峰，以标准曲线方程计算该样品中每种SCFA的含量。

这6种有机酸的总和，称为总酸，也作为一个响应值列入代谢产物的一个指标。

5.1.5结果：

表1粪便及其在不同培养基发酵后的SCFA含量

5.2产气量检测

5.2.1仪器：

气压计(HT-1895,XINTEST)

5.2.2方法：

将气压计与注射器针头连接，将针插入发酵24h的西林瓶，读取气压的最大值并记录。

5.2.3结果

表2发酵后不同培养基产气量的比较

气体压力(kPa)	平均值	标准偏差
			YCFA	13.08	3.509
LAU	18.09	12.54
			RAF	20.88	14.55
FOS	19.68	13.93
			GOS	19.53	13.07
IMO	20.05	13.42
			MOS	31.07	19.25
XOS	18.64	11.21
			INU	22.92	14.08
STA	22.58	15.24
			MAI	40.09	19.49
XYI	18.92	7.991

注：YCAF是指不添加寡糖或多糖的YCAF基础培养基。

5.3寡糖降解检测-薄层层析(TLC)

5.3.1材料与试剂

TLC硅胶板(Merck)高度为50mm。

展开剂为甲酸/正丁醇/水＝6/4/1(体积比)。

显色剂为2g/L地衣酚(3，5-二羟基甲苯)的乙醇溶液，4℃保存。

5.3.2点样：利用激光定位装置，标记距硅胶板下边缘10mm处，每隔5mm点一个样品(步骤4.1发酵液)，每个样品点样0.2μL，马上用吹风机吹干。

5.3.3层析：用镊子将硅胶板放入层析缸(已加入展开剂30ml)，待展开剂到达上缘，将硅胶板取出，吹风机吹干。

5.3.4显色：将吹干硅胶板在显色剂中浸润，取出吹干，置于100℃烘箱，显色1min。

5.3.5分析：将显色硅胶板置于TLC扫描仪中，获取TLC图像，利用图像处理软件Quantity One(Bio-Rad)计算每一个样品列中不同聚合度的寡糖的灰度，将一个样品列的灰度值之和作为这个样品的总灰度值，将培养基的总灰度值减去发酵样品的总灰度值，再与培养基的总灰度值相除，即得到该发酵样品的降解率。

5.3.6结果：

表3发酵后不同培养基中特定碳源的降解率

降解率(％)	平均值	标准偏差
			LAU	90.43	11.26
RAF	58.33	23.92
			FOS	49.61	28.01
GOS	35.36	41.37
			IMO	63.11	18.03
MOS	55.6	22.13
			XOS	59.73	25.42
INU	20.8	14.07
			STA	30.88	15.2

5.4益生菌含量检测——qPCR

5.4.1仪器：实时定量荧光PCR：CFX 96(Bio-Rad)

5.4.2试剂：双歧杆菌的引物为Bif164F：GGGTGGTAATGCCGGATG，Bif601R：TAAGCCATGGACTTTCACACC(Invitrogen)。qPCR预混液：Pre-mixture:Thunderbird SYBRqPCR mix QPS 201(TOYOBO)。

5.4.3样品DNA：采用QIAamp DNA Stool Mini Kit，取粪便样品0.18-0.22克以及步骤4.2粪便发酵液1ml的沉淀，按试剂盒方法提取，分别作为粪便样品DNA和待测样品DNA。

5.4.4标准样品：采用5.4.2提及的双歧杆菌的引物，以粪便样品DNA为模板，PCR扩增双歧杆菌和乳杆菌的特异性片段，以pEASY-T1Cloning Kit(Transgen)为载体，将这些双歧杆菌或乳杆菌的特异性片段导入大肠杆菌DH5a感受态细胞(Takara)，经过蓝白斑筛选，获得导入双歧杆菌或乳杆菌的特异性片段的质粒，将经测序确认为已经插入双歧杆菌或者乳杆菌的特异性片段的菌落进行37℃摇菌培养，提取菌液中的质粒DNA(Qiagen)作为双歧杆菌或乳杆菌的qPCR的标准样品。

5.4.5 qPCR方法：

采用SYBRGreenⅠ法检测样品DNA中的双歧杆菌的绝对含量。采用步骤5.4.4导入双歧杆菌特异性片段的质粒DNA用超纯水配制双歧杆菌标准样品溶液，以双歧杆菌标准样品所对应的菌数的Log值(x)为横坐标，以起始循环数(y)为纵坐标建立双歧杆菌标准曲线，方程式为y＝-3.836x+46.127(R²＝0.996)。

PCR反应体系：使用市售qPCR预混液(东洋纺)，采用20μl反应体系，其中H₂O 8μl，qPCR pre-mix 10μl，primer各0.5μl，DNA模板1μl，蒸馏水补足20μl。待测样品DNA浓度为20ng/ul，每个待测样品重复3次。

qPCR反应程序包含溶解曲线流程，具体运行参数如下：95℃预变性1min；95℃变性15sec，退火温度35sec，72℃延伸35sec，循环40次。退火温度：双歧杆菌属为58℃。

5.4.6分析方法：

采用外标法计算待测样品中乳酸杆菌和双歧杆菌属在样品中占的百分含量。在以溶剂曲线确定每个样品的扩增产物的单一性后，利用双歧杆菌标准曲线计算样品中双歧杆菌的绝对含量，并换算成每克湿粪便中的双歧杆菌数量。

5.4.7结果：

表4粪便及其在不同培养基中每克湿粪便发酵后的双歧杆菌的含量的对数值

双歧杆菌菌数Log值	平均值	标准偏差
			粪便	4.238	1.171
YCFA	5.455	0.5978
			LAU	6.924	0.5936
RAF	6.833	0.7798
			FOS	6.651	0.9486
GOS	7.068	0.5089
			IMO	7.172	0.5236
MOS	6.448	0.6851
			XOS	6.989	0.6723
INU	6.628	0.728
			STA	6.777	0.7736
MAI	5.557	1.156
			XYI	5.311	0.5937

实施例2肠道微生物体外发酵揭示出IBS病人的肠道微生物存在菌群失衡。。

本实施例，主要检测了IBS组与健康组的粪便及其体外发酵液中的代谢产物的含量。发现尽管粪便中SCFA两组没有差异，但经过体外发酵，IBS组对特定寡多糖发酵产生的SCFA响应值与健康组有了显著的差异。目前医学界对IBS没有临床诊断方法，只能通过问卷打分的方式判断疾病与否，对于IBS与肠道菌群的关系也没有明确的结论。而本发明涉及的体外发酵，能够通过体外发酵微生物的代谢产物，主要短链脂肪酸(SCFA)的值的差异，将IBS与正常组区分开了，揭示出IBS病人的肠道微生态存在一定程度的紊乱。尽管在粪便的肠道微生物代谢产物检测值上看不到与正常组的差异，在特定碳源的体外发酵过程中检测到了IBS比正常组偏高的丙酸值。

1、粪便样品的制备

人体粪便样品由志愿者(CON，即健康组)和肠易激综合征(Irritable bowelsyndrome,IBS)腹泻型患者各14人提供。志愿者要求身体健康，采样前2个月内没有服用过抗生素、益生元等。以15ml离心管称取0.8g粪便，加入8ml经过灭菌，厌氧处理的pH7.0、0.1MPBS，蜗旋混匀，以800目滤网过滤，去除大颗粒，获得粪便悬浊液。

2、粪便样品中SCFA含量的测定

SCFA含量的测定同实施例1，结果见表6。IBS组与健康组的粪便中的SCFA的含量没有太大差异。只有异戊酸的含量，IBS比CON有显著性增加(p<0.05)。

表6 IBS组与健康组粪便SCFAs水平比较

#非正态分布或方差不齐数据，采用Mann-Whitney U检验

3、粪便样品体外发酵后SCFA含量的测定

发酵培养同实施例1，SCFA含量的测定同实施例1，结果见表7-表9，IBS组发酵后的针对多个特异性寡糖的SCFA的响应值显著增加。

3.1 IBS组粪便体外发酵后，针对四种寡糖XOS、IMO、LAU、MOS，以及糖醇XYI的总酸的响应值(表7)，比CON显著性增加(P<0.05)。

表7发酵后各个培养中总酸的响应值比较

#非正态分布或方差不齐数据，采用Mann-Whitney U检验

3.2 IBS组粪便体外发酵后，针对寡糖XOS的乙酸的响应值(表8)明显提高(P<0.05)，是CON组的1.3倍。

表8发酵后各个培养基中乙酸的响应值比较

#非正态分布或方差不齐数据，采用Mann-Whitney U检验

3.3 IBS组粪便体外发酵后，针对四种寡糖IMO、FOS、LAU、MOS，以及糖醇XYI的丙酸的响应值高于健康对照者(p<0.05)(表9)。

表9发酵后各个培养基中丙酸的含量比较

#非正态分布或方差不齐数据，采用Mann-Whitney U检验

实施例3肠道微生物体外发酵揭示便秘患者的肠道微生态存在一定程度的失衡。

本实施例，主要检测了便秘组与健康组的粪便及其体外发酵液中的代谢产物短链脂肪酸(SCFA)的含量。发现尽管粪便中SCFA两组没有差异，但经过体外发酵，便秘组对特定寡多糖发酵产生的SCFA响应值与健康组有了显著的差异。

1、粪便样品的制备

人体粪便样品由健康志愿者(健康组)和便秘患者(便秘组)各14人提供。志愿者要求身体健康，采样前1个月内没有服用过抗生素、益生元等。粪便样本制备方法同实施例1。

2、粪便样品中SCFA含量的测定

SCFA含量的测定同实施例1。乙酸、异丁酸和戊酸的响应值出现了非常显著的变化，而粪便中的这三种短链脂肪酸的含量，便秘组与健康组的没有太大差异。粪便中SCFA含量差异不大，经11个特定寡聚糖的发酵后其响应值出现非常显著的差异。

在所有11种特定碳水化物的培养基中，乙酸的响应值便秘组都大大高于健康组，见图3。

异丁酸的响应值则不同，除了两个糖醇，甘露糖醇(MAI)和木糖醇(XYI)，其他寡多糖发酵后，便秘组都低于健康组，见图4。

同样，对于戊酸的响应值，便秘组更是显著低于健康组。尽管，便秘组的粪便中戊酸的含量与健康组相差不多，但响应值的差异变得非常巨大。只有低聚甘露糖(MOS)和两个糖醇：MAI和XYI，便秘组与健康组的组间差异不是那么大，而木糖醇(XYI)反而是便秘组高于健康组，见图5。

Claims (6)

1.一种肠道微生物体外模拟培养方法，其特征在于所述方法为：将粪便样品接种至发酵培养基中，37℃厌氧发酵培养，获得含肠道微生物的发酵液；所述发酵培养基为含6-10g/L碳水化合物的YCFA基础培养基，所述碳水化合物为多糖、寡糖或糖醇，所述YCFA基础培养基终浓度组成为：酪胨10g/L，酵母提取物2.5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L，血红素0.05g/L，NaCl 4.5g/L，CaCl₂·6H₂O 0.09g/L，KH₂PO₄ 0.45g/L，K₂H PO₄ 0.45g/L，MgSO₄·7H₂O0.09g/L，微量元素，溶剂为去离子水，pH值自然，其中微量元素在YCFA基础培养基中的终浓度组成如下：刃天青0.1mg/L、生物素10μg/L、钴胺素10μg/L、对氨基苯甲酸30μg/L、叶酸50μg/L、吡哆胺150μg/L、硫胺素50μg/L、核黄素50μg/L。

2.如权利要求1所述肠道微生物体外模拟培养方法，其特征在于所述粪便样品按如下方法制备：取粪便与经灭菌、厌氧处理的pH 7.0、0.1M PBS涡旋混匀，过800目滤网，取滤液即为粪便样品。

3.如权利要求1所述肠道微生物体外模拟培养方法，其特征在于所述寡糖是指以α-1,4糖苷键或者α-1,6糖苷键链接的单一或者多个单糖的聚合物，其中的单糖为下列之一：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和木糖，所述聚合物的聚合度为2-60。

4.如权利要求1所述肠道微生物体外模拟培养方法，其特征在于所述寡糖为下列之一或多种：乳果糖、棉子糖、水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖或低聚木糖。

5.如权利要求1所述肠道微生物体外模拟培养方法，其特征在于所述糖醇为下列之一或多种：甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇或赤藓糖醇。

6.如权利要求1所述肠道微生物体外模拟培养方法，其特征在于所述多糖为下列之一或多种：菊粉、可溶性淀粉或抗性淀粉。