CN102618460A - 一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌及检测方法 - Google Patents

Abstract

一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。本发明还公开了其检测方法。

Description

一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌及检测方法

技术领域

本发明涉及一株可以调节人肠道中短链脂肪酸(SCFA)和总胆汁酸(TBA)代谢的益生菌。应用高效液相色谱(HPLC)技术检测发现：每日服用该菌株可以促进肠道中短链脂肪酸的代谢，应用酶联免疫分析(ELISA)技术检测发现：每日服用该菌株可以抑制肠道中总胆汁酸的代谢，从而达到调节肠道菌群平衡、改善肠道功能及调控基因表达等效果。 

背景技术

在人的肠道内生存着1000多种总数在万亿以上的微生物，由这些微生物产生的化学物质会影响人体的肠道菌群平衡、肠道功能及免疫机制，许多肠道微生物可防止胃肠内的有害菌生长和防止感染。肠道微生物在人体健康和疾病方面有重要作用，如生理功能、营养、免疫反应等均和肠道菌群密切相关。 

益生菌是“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。早在上个世纪初(1907年)著名细菌学家诺贝尔奖得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益寿的假说。益生菌在肠道内的大量繁衍可调节紊乱的肠道菌群结构并提高机体的免疫能力进而帮助恢复健康水平。益生菌主要包括乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌类。双歧杆菌是于1899年由法国巴斯德研究所的Tissier首次从母乳喂养婴儿粪便中分离出来的。益生菌的益生作用主要是通过直接或者间接的调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统的活性来实现的。 

短链脂肪酸主要来自大肠内碳水化合物发酵和蛋白质降解，肠道菌群通过产生SCFA，对人体多个器官和代谢产生较大的影响。SCFA是肠道中抑制病原微生物的重要因素，也可以促进钠离子吸收、结肠细胞增殖和粘膜生长，提供代谢能源，增加肠血流，刺激胃肠激素生成，是结肠粘膜的重要营养素。最早Haring等通过肠道灌注SCFA治疗慢性结肠炎取得很好的效果。Blottiere等研究表明SCFA通过直接调节基因影响肠道细胞增殖，对维持肠粘膜细胞健康非常重要。临床研究表明，SCFA能较强地维护肠道形态及功能，并具有一定的治疗作用，可以缓解和治疗转流性结肠炎、远段溃疡性结肠炎、袋囊炎、放射性结肠炎、短肠综合征、全肠外营养所致肠失用等多种肠道外科疾病。通过测定生物基质中SCFA的水平可以整体诊断体内厌氧菌的变化，SCFA的含量也可以反映细菌活性。总之，SCFA对机体具有调节肠道菌群平衡、改善肠道功能等重要作用，因 此SCFA的测定对营养、微生物和环境的研究有重要的意义。 

SCFA含量的早期测定方法是滴定法，该法特异性不强，准确度差。随着色谱技术的发展，高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)以及毛细管电泳(CE)已广泛用于SCFA的测定。但极性大、挥发性强和水溶性大的特点使SCFA难以定量，生物基质的复杂性也更增加了定量工作的难度。 

胆汁酸在肝脏中合成，贮存于胆囊中，释放到小肠中。总胆汁酸(TBA)包括正常人肝脏合成的胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)和代谢中产生的脱氧胆酸(DCA)、少量的石胆酸(LCA)及微量熊脱氧胆酸(UDCA)。在人粪便中的胆汁酸主要是DCA和LCA等次级胆汁酸。在某些情况下，DCA会在血液、胆汁和粪便中聚积，这就增加了患胆结石和结肠癌的风险，而且次级胆汁酸是恶性肿瘤的启动子并对人体危害众多。临床研究表明，在肠道细菌、DCA含量和胆结石疾病之间存在着一定程度的联系。细菌在人及动物体内会受到胃酸、肠道胆汁酸等环境胁迫压力，适应并耐受胆汁酸的毒性是人及动物肠道细菌保证自身存活的主要因素。所以更好地了解胆汁酸对细菌的抑制机制，对于发展在肠道高浓度游离胆汁酸情况下可存活的微生态制剂也很重要。近年来，乳酸菌或双歧杆菌(Bifidobacterium)经常作为益生菌或微生态制剂添加到人体中，它们可以很好的应对肠道内的游离型胆汁酸的胁迫。 

发明内容

本发明的目的是提供一株调节肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌及检测方法。 

本发明的目的通过如下技术方案实现：一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillus plantarum P8）分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：植物乳杆菌，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。 

调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌的检测方法，其特征是包括下列步骤： 

(I)、高效液相色谱用于短链脂肪酸的测定 

(1)仪器和材料 

Agilent1100液相色谱系统、Agilent色谱工作站、5μm，4.6mm×150mm的Zorbax SB-Aq色谱柱、水的电阻大于17MΩ的水净化系统、乙腈、甲醇、乙酸、丙酸、丁酸、浓度为0.015mol/L磷酸-磷酸盐缓冲液(pH＝2.5)；标样：浓 度为0.1mol/L乙酸、丙酸、丁酸和浓度为0.01mol/L的混合样； 

(2)粪便样品预处理 

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取1mL浊液加4mL浓度为1mol/L的盐酸溶液振荡30s，离心(4500g)10min，取清液经0.45μm膜过滤待进样分析； 

(3)色谱条件 

流动相：甲醇和缓冲溶液的体积比为3∶97，所述缓冲溶液为浓度为0.015mol/L、pH＝2.5的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为5μL。 

(II)ELISA用于总胆汁酸的测定 

(1)粪便样品预处理 

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取5mL浊液，离心(8000g)10min，取1mL清液，离心20分钟(2000-3000转/分)，仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用； 

(2)标准品的稀释与加样 

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉；稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为9μmol/L、6μmol/L、3μmol/L、1.5μmol/L和0.75μmol/L； 

(3)加样 

分别设空白孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，样品最终稀释度为5倍；加样将样品加于酶标板孔底部，晃动混匀； 

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟； 

(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用； 

(6)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复多次并拍干； 

(7)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

(8)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟； 

(9)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复多次并拍干； 

(10)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，震荡混匀，37℃避光显色15分钟； 

(11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应； 

(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度，在加终止液后15分钟内进行。 

本发明的效果是：Lactobacillus plantarum P8分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，是一株经过系统研究的益生菌。它有免疫调节特性，并已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产，及作为活疫苗在医学上提供更广泛的治疗。本发明征集志愿者服用Lactobacillus plantarum P8片剂，通过测定服用前、中、后的肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸的含量来探究Lactobacillus plantarum P8对于人肠道中短链脂肪酸和胆汁酸是否具有调节作用，从而是否可以调节肠道功能。 

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。 

附图说明

图1为益生菌Lactobacillus plantarum P8对志愿者SCFA代谢水平影响图； 

图2为益生菌Lactobacillus plantarum P8对志愿者胆汁酸代谢水平影响图。 

具体实施方式

一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌，所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。 

调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌的检测方法，包括下列步骤： 

1.短链脂肪酸的测定 

1.1试验样品的采集 

本试验共征集33名健康志愿者，分为三组，青年组(Y group，11人，男性5人，女性6人)，年龄25-29岁，平均年龄为26.2±1.2岁；中年组(M group，12人，男性6人，女性6人)，年龄48-53岁，平均年龄为50.9±1.4；老年组(E group，10人，男性5人，女性5人)，年龄71-80岁，平均年龄为75.1±3.3岁。男女比例为16∶17。每个志愿者每天饭后咀食Lactobacillus plantarum P8片剂3粒，每粒含Lactobacillus plantarum P8活菌2×10¹⁰CFU，连续服用28天后停止服用。分别在第0天，14天，28天，以及停止服用后7天(连续35天)、14天(连续42天)、28天(连续56天)采集志愿者粪便。样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在48小时内完成粪便样品的预处理。 

1.2粪便样品预处理 

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取1mL浊液加4mL浓度为1mol/L的盐酸溶液振荡30s，离心(4500g)10min，取清液经0.45μm膜过滤待进样分析。 

1.3上样分析 

通过对青年组、中年组和老年组志愿者0天，14天，28天，35天，42天和56天粪便中短链脂肪酸的测定发现，服用益生菌Lactobacillus plantarum P8前，青年组肠道内乙酸含量＞中年志愿者＞老年志愿者，而三个组别志愿者丙酸丁酸代谢水平相当。服用益生菌Lactobacillus plantarum P8后，所有志愿者机体肠道内乙酸丙酸代谢水平均显著增高，且中年志愿者肠道内乙酸含量增幅最大，老年志愿者肠道内丙酸含量增幅最大。而丁酸代谢水平在各个时期的志愿者体内变化均不显著(图1，注：图1中，“***”代表显著水平P＜0.0001)。 

2.总胆汁酸的测定 

2.1试验样品的采集 

本试验共征集33名健康志愿者，分为三组，青年组(Y group，11人，男性5人，女性6人)，年龄25-29岁，平均年龄为26.2±1.2岁；中年组(M group，12人，男性6人，女性6人)，年龄48-53岁，平均年龄为50.9±1.4；老年组(Egroup，10人，男性5人，女性5人)，年龄71-80岁，平均年龄为75.1±3.3岁。男女比例为16∶17。每个志愿者每天饭后咀食Lactobacillus plantarum P8片剂3粒，每粒含Lactobacillus plantarum P8活菌2×10¹⁰CFU，连续服用28天后停止服用。分别在第0天，14天，28天，以及停止服用后7天(连续35天)、14天(连续42天)、28天(连续56天)采集志愿者粪便。样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在48小时内完成粪便样品的预处理。 

2.2粪便样品预处理 

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取5mL浊液，离心(8000g)10min，取1mL清液，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 

2.3标准品的稀释与加样 

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为9μmol/L，6μmol/L，3μmol/L，1.5μmol/L，0.75μmol/L)。 

2.4加样 

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 

2.5温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 

2.6配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 

2.7洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 

2.8加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

2.9温育：操作同4。 

2.10洗涤：操作同6。 

2.11显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 

2.12终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 

2.13测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。 

通过对志愿者胆汁酸代谢水平测定发现(图2，注：图2中，“***”代表显著水平P＜0.0001)，青年志愿者胆汁酸代谢水平低于中年志愿者低于老年志愿者。但是不论对于哪个年龄段，在服用益生菌Lactobacillus plantarum P8后，胆汁酸代谢水平均明显降低。 

Claims (2)

1.一株调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

2.调节人肠道中短链脂肪酸和总胆汁酸代谢的益生菌的检测方法，其特征是包括下列步骤：

(I)、高效液相色谱用于短链脂肪酸的测定

(1)仪器和材料

Agilent1100液相色谱系统、Agilent色谱工作站、5μm，4.6mm×150mm的Zorbax SB-Aq色谱柱、水的电阻大于17MΩ的水净化系统、乙腈、甲醇、乙酸、丙酸、丁酸、浓度为0.015mol/L磷酸-磷酸盐缓冲液(pH＝2.5)；标样：浓度为0.1mol/L乙酸、丙酸、丁酸和浓度为0.01mol/L的混合样；

(2)粪便样品预处理

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取1mL浊液加4mL浓度为1mol/L的盐酸溶液振荡30s，离心(4500g)10min，取清液经0.45μm膜过滤待进样分析；

(3)色谱条件

流动相：甲醇和缓冲溶液的体积比为3∶97，所述缓冲溶液为浓度为0.015mol/L、pH＝2.5的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm，柱温为35℃，进样量为5μL。

(II)ELISA用于总胆汁酸的测定

(1)粪便样品预处理

把粪便样品解冻后称取1g置于15mL PBS中充分悬浮，离心(350g)5min，吸取5mL浊液，离心(8000g)10min，取1mL清液，离心20分钟(2000-3000转/分)，仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用；

(2)标准品的稀释与加样

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉；稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为9μmol/L、6μmol/L、3μmol/L、1.5μmol/L和0.75μmol/L；

(3)加样

分别设空白孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，样品最终稀释度为5倍；加样将样品加于酶标板孔底部，晃动混匀；

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；

(6)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复多次并拍干；

(7)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(8)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(9)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复多次并拍干；

(10)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应；

(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度，在加终止液后15分钟内进行。

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