CN102041238A

CN102041238A - 一种植物乳杆菌及其细菌素发酵和制备方法与用途

Info

Publication number: CN102041238A
Application number: CN2010105283526A
Authority: CN
Inventors: 张日俊; 刘开健; 韩冰; 黄燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2030-10-22
Also published as: CN102041238B

Abstract

本发明提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)新菌株YJG，于2009年3月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.2994。本发明植物乳杆菌菌株YJG能够高产广谱抑菌活性细菌素，对革兰氏阴性菌Staphylococcus aureus、Salmonella、E.coli及革兰氏阳性菌L.plantarum、L.brevis、Streptococcus、Bacillus等有抑菌表现，高剂量攻毒试验表明，其对动物体是安全的。本发明植物乳杆菌YJG及其发酵菌液可以用于制备动物绿色饲料添加剂，其细菌素可以用于制备绿色生物兽药、食品生物防腐剂、生防药物等。

Description

一种植物乳杆菌及其细菌素发酵和制备方法与用途

技术领域

本发明涉及微生物应用技术，具体地说是涉及一种高产广谱细菌素的植物乳杆菌新菌株，本发明还涉及该菌株及其所产细菌素的应用。

背景技术

自二十世纪五十年代以来在动物饲养和饲料中广泛长期和大量使用抗生素、化学合成药物等促生长保健剂，导致了畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细菌多重耐药性、耐药菌株增多，给人类大众健康安全和生态环境带来很大威胁。由于抗生素的诸多副作用，特别是近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色生物兽药和生物饲料添加剂，以替代或减少抗生素等药物的使用。

细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或低分子量多肽物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物饲料添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。

在众多微生物添加剂中，乳酸菌是饲用微生物添加剂中应用最为广泛。有大量报道证明这类饲用微生物添加剂具有良好的生物学功能，并且已在饲料工业中得到广泛应用，但未见高产细菌素的乳酸菌作为微生物饲料添加剂和生物兽药。乳酸菌的代谢产物，包括细菌素、乳酸、消化酶等，它们对动物的主要作用有：(1)乳酸菌是多种动物消化道主要的共生菌，对稳定、平衡和优化消化道菌群结构有重要作用；(2)调节宿主肠道菌群，提高机体免疫力，增强抗病能力；(3)其代谢产物可以促进营养物质分解，促进营养物质吸收；(4)其代谢产生的乳酸和乳酸菌素可以有效抑制肠道腐败菌和有害的繁殖及有害物质的产生等。基于以上特性，我们把乳酸菌作为本案筛选获取优秀菌株的主要种类。

在工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的最主要因素有三个：生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。因此从自然界中寻找性能优秀的菌株成为一项十分重要的工作，运用常规方法从自然界分离菌种时，工作量大，效率低下，针对性不强，难以在短时间内获得符合生产要求的菌株。为提高效率，迫切需要一种有效的筛选方法，本发明所提及的定向筛选方法很好的解决了这一问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于是提供一株具有高产广谱抑菌活性细菌素的植物乳杆菌新菌株YJG。

本发明的另一个目的是提供上述菌株或其所产细菌素在制备绿色生物兽药或生物饲料添加剂中的应用。

本发明通过点种法和牛津杯法从鸡肠道中分离得到一株具有高产广谱抑菌活性细菌素的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)YJG。该菌株已于2009年03月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏号为CGMCCNo.2994。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YJG，细胞形状呈杆状，在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形凸起，电子显微镜测量为0.5～1.2×1.0～10.0μm(长1.0～10.0μm，直径0.5～1.2μm)，呈现革兰氏染色阳性；不生孢子，无鞭毛，不运动；厌氧或兼性厌氧；化能异养菌，需要营养丰富的培养基；发酵分解糖代谢，终产物50％以上是乳酸；接触酶和氧化酶皆为阴性，最适生长温度30～40℃。菌株YJG通过法国生物梅里埃公司API-50CHL生化鉴定试剂条快速鉴定，记录24h和48h的糖发酵结果(表1)，将结果在apiweb在线数据库中进行鉴定，所得鉴定结果均为Lactobacillus plantarum 1，其鉴定概率(％id)分别是是99.9％和99.0％，期望值(T)分别是0.90和0.90，均为极好的鉴定结果，因此判定菌株YJG为植物乳杆菌。

表1.菌株YJG在24h和48h的糖发酵结果

注：“+”代表明显阳性反应，“-”代表阴性反应，“？”代表阳性反应小明显

本发明还提供所述植物乳杆菌YJG的发酵方法，包括如下步骤：

1.种子培养

将植物乳杆菌YJG接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液(活菌数约为10⁷～10⁹cfu/ml)。

液体培养基的配制如下：蛋白胨9～11g，牛肉膏9～11g，酵母浸粉3～7g，葡萄糖15～20g，柠檬酸胺1～3g，三水合乙酸钠3～6g，磷酸氢二钾1～ 3g，吐温800.5～1.5mL，硫酸镁0.1～0.2g，硫酸锰0.03～0.06，水1000mL。

2.发酵培养

将步骤1)得到的种子液按接种量1～15％接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件：30～37℃，通气量0.5～2.5vvm，转速150～300rpm，发酵30～48小时。

所述发酵培养基包括碳氮比为1∶2～20(w/w)的发酵底物，发酵底物按照与水比为3～20∶100(w/w)配制成发酵培养基。发酵底物应当粉碎至40～120目，加入水后在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到37℃，即可接种种子液。

所述的发酵底物氮源为选自大豆蛋白、谷蛋白或它们的混合物；

所述的大豆蛋白来自豆粕、豆饼；

所述的谷蛋白包括玉米蛋白和小麦蛋白；

所述的碳源包括玉米淀粉、红糖、食用白糖、玉米糖浆、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。

抑菌试验表明，本发明植物乳杆菌YJG对革兰氏阴性菌Staphylococcusaureus、Salmonella、E.coli及革兰氏阳性菌L.plantarum、L.brevis、Streptococcus、Bacillus等有抑菌表现，具有广谱抑菌活性。

将制备得到植物乳杆菌发酵液经脱水浓缩，与辅料按1∶1比例(质量比)混合，所得添加剂以2％(质量百分比)的浓度添加到浓缩料中，即可用于动物生产中，其对包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在内的革兰氏阴性菌及其他的杂菌很好的抑制作用。

用YJG所产的乳酸菌素进行急性攻毒试验，脏器系数、血液的生理指标及血浆的生化指标表明，在乳酸菌素浓度高达2g/kg.BW的情况下，已超过实际使用量100倍时，并没有对小鼠的生长、代谢、免疫功能造成损害，仍然是安全的，因此可以认定该制剂在使用安全，毒性级别应属于“安全无毒级”，是一种安全的制剂。

本发明细菌素可通过如下方法制备获得：乳酸菌发酵得到的发酵液通过12000转/分钟离心15分钟后取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，直至硫酸铵饱和度达80％。上清液于4℃静置过夜，然后将其在10000转/分钟常温条件下离心20～30分钟，得到细菌素沉淀粗提物。将样品进一步采用Sephadex G-25凝胶过滤层析进行纯化，凝胶柱用10mM硫酸钠缓冲液(pH7.0)进行预平衡，然后将硫酸铵沉淀的样品溶解于0.10M的磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)后上柱，上柱体积为15ml，固定流速0.5ml/min，分段收集，每段2ml，通过抑菌实验检测每段收集液活性，有活性的收集液通过疏水层析进行脱盐，最后通过反相高效液相层析进行进一步纯化，从而得到纯品乳酸菌素，将其命名为LJ-23。

本发明还提供将YJG产生的广谱细菌素在制备绿色生物兽药中的应用，其可用于动物疾病的预防和治疗。具体地说：使用本发明植物乳杆菌YJG进行发酵，将发酵液经色谱柱层析后纯化得到高于99.99％纯度的乳酸菌素。在将其用于动物预防和治疗时，口服和注射均适用。口服制剂使用时较为简单，直接添加到配合饲料中拌服或溶于水灌服均可，细菌素用量为：20～100mg/kgBW，每天口服2～3次，连续3～7d，即可达到治愈效果。使用针剂注射时，将细菌素溶于生理盐水配置成10～100mg/mL注射液，按10～100mg/kg.BW用量进行注射，每天1～2次，连续注射3～7d即可达到治愈效果。

本发明还提供将YJG产生的广谱细菌素作为绿色饲料添加剂应用于动物生产生。具体可采取以下方法制备：植物乳杆菌YJG发酵后，不经提纯工序(注：乳酸菌菌体是益生菌，对改善动物肠道健康有益，作为饲料添加剂使用时不必除去，同时还可节省成本)，直接脱水浓缩，将细菌素同菌体一起混合到辅料中作为饲料添加剂。其中辅料由30～40％次粉、10～20％轻质CaCO3、20～30％麦饭石、和20～30％玉米芯粉组成，细菌素菌体复合物同辅料的比例根据需求的不同从0.2～1∶1～5均可(以上百分数均为质量百分比)。该饲料添加剂使用时，可按0.5～2％(质量百分比)的比例添加到浓缩料中，对抑制动物肠道有害菌，促进乳酸菌等有益菌生长，改善肠道微生物菌群结构，进而提高动物的生产性能，改善畜产品品质有很好的作用。

术语“通气量”是指每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比(V/ V·min)。如：内装3m³培养液的发酵罐，若每分钟通入1.5m³的无菌空气，则通气比为3∶1.5＝1∶0.5，简称通气量为0.5(V/V·min，亦作vvm)。

本发明植物乳杆菌菌株YJG能够高产广谱抑菌活性细菌素，对革兰氏阴性菌Staphylococcus aureus、Salmonella、E.coli及革兰氏阳性菌L.plantarum、L.brevis、Streptococcus、Bacillus等有抑菌表现，高剂量毒攻试验表明，其对动物体是安全的。本发明植物乳杆菌YJG及其发酵菌液可以用于制备动物饲料添加剂，其细菌素可以用于制备生物兽药。

附图说明

图1所示的是YJG生长曲线及抑菌活性曲线；

图2～图3显示的实施例4中的碳源的单因素实验，分别是葡萄糖、蔗糖、玉米粉三种碳源，其中葡萄糖组明显能增加细菌生物量，而对细菌素LJ-23的产生蔗糖和葡萄糖均效果较好；

图4～图5显示的实施例4中的氮源的单因素实验，分别是酵母浸粉、豆粕粉、肽粉三种氮源，其中酵母浸粉能增加植物乳酸杆菌YJG的生物量，而对细菌素LJ-23的产生在三者中也起到最好的促进作用；

图6～图7显示的实施例4中的刺激因子吐温80对植物乳酸杆菌YJG及其产生细菌素LJ-23的影响，结果证明，0.1％的吐温80可以促进细菌生物量的增加，0.2％吐温最能促进细菌素的产生；

图8～图10显示的实施例4中的缓冲盐类对pH值和生物量的影响，结果对比发现，在磷酸氢二钾和磷酸二氢钾数量一定的前提下，提高碳酸钙的数量，可以显著控制发酵终点pH值，但是却不能明显提高细菌素的产生量。在碳酸钙一定前提下，改变磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的比例在提高细菌素产量方面没有明显的规律，但是可以控制发酵重点pH值，起到较好的缓冲作用。

图11显示的实施例中PB因子初筛实验的结果，最后表明四个因素(因素A、因素B、因素C、因素D)是影响显著因素。为下一步实验做好基础。

图12显示的是实施例5中各处理断奶仔猪平均末重情况，其中一组、二组、三组和抗生素组分别比对照组提高7％、1％、17％和5％，三组与其它四组间差异显著(p＜0.05)，其它各组间差异均不显著(p＞0.05)；

图13显示的是实施例5中各处理断奶仔猪平均日增重情况，其中一组、二组、三组及抗生素组分别比对照组提高11％、2％、27％和8％，但差异均不显著(p＞0.05)；

图14显示的是实施例5中各处理断奶仔猪平均日采食情况，其中一组、二组及抗生素组的平均日采食量较对照组均稍有下降，只有三组的平均日采食量较对照组有所增加，各组间差异均不显著(P＞0.05)；

图15显示的是实施例5中各处理断奶仔猪料重比情况，其中一组、二组、三组、抗生素组较对照组分别降低12％、4％、15％和14％，但差异均不显著(P＞0.05)；

图16显示的是实施例5中各处理组仔猪腹泻率情况，其中一组、二组、三组及抗生素组的腹泻率显著低于对照组，分别比对照组降低70％、43％、48％和48％，而试验组之间差异不显著。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

实施例1菌株的筛选及鉴定

1.生境乳酸杆菌的分离

初筛时首先将采集的样品用生理盐水稀释，一般稀释3～4个数量级(视样品而定，样品中含菌丰富可以稀释到5个数量级，含量极少的稀释2个数量级即可)，将最后两个稀释数量级的含菌溶液添加100ul到含有0.02％溴甲酚紫指示剂的改良MRS平板上，涂布均匀，24小时37℃挑选在MRS培养基上使溴甲酚紫由紫变黄的菌落进行分离培养，得到的纯细菌分别标记编号。

2.点种法抑菌初筛

以致病性的大肠杆菌CVCC195和鸡白痢沙门氏菌CVCC79301作为指示菌，取其种子菌液按一定比例稀释后分别涂布于制备好的相应检测平板上，再用牙签挑取以上编号菌落点种于检测平板中，37℃下培养24小时，观察是否产生透明抑菌圈。能够产生抑菌圈的菌株，经过革兰氏染色为G⁺后进入下一步的复筛。

3.牛津杯法抑菌复筛

依据乳酸菌所产细菌素普遍具有对同源细菌的抑制作用，在筛选时我们选用G-的细菌作为指示菌，复筛时增大指示菌的范围，以致病性菌：大肠杆菌CVCC195、大肠杆菌CVCC222、鸡白痢沙门氏菌CVCC79301、肠炎沙门氏菌CVCC2181、金黄色葡萄球菌CVCC1885为指示菌(购自中国农业科学院中国兽药监察所菌种保藏中心)。这5种指示菌(见表1)均是致病性耐药菌株，保证了筛选的菌株具有先天的优良的抑菌效果。

表2.复筛选用的指示菌：五种致病性耐药菌株

将复筛菌株接种于50mLMRS液体培养基中37℃发酵48小时。培养液在12000r/min，20min离心，除去菌体，得到上清液的通过滴加2N mol/L NaOH调pH到6.5，然后按200IU/mL添加过氧化氢酶，37℃反应1h，排除了酸和过氧化物对抑菌作用的影响，再采用牛津杯法以5种致病性的耐药菌株作为指示菌测定抑菌活性，以此作为最终的筛选结果。

牛津杯法测定时将灭菌的不锈钢牛津杯(外径为8.00mm)放置到涂布好指示菌的检测平板上，每个平板放3个，再吸取发酵液离心上清液100μL，以无菌操作加入到检测平板牛津杯内，然后37℃培养24小时，测定透明抑菌圈直径(取平均值)。

通过上述方法筛选得到一株具有良好抑菌效果的菌株，命名为YJG。该菌株细胞形状呈杆状，在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形凸起，电子显微镜测量为0.5～1.2×1.0～10.0μm(长1.0～10.0μm，直径0.5～1.2μm)，呈现革兰氏染色阳性；不生孢子，无鞭毛，不运动；厌氧或兼性厌氧；化能异养菌，需要营养丰富的培养基；发酵分解糖代谢，终产物50％以上是乳酸；接触酶和氧化酶皆为阴性，最适生长温度30～40℃。菌株YJG通过法国生物梅里埃公司API-50CHL生化鉴定试剂条快速鉴定，记录24h和48h的糖发酵结果(表1)，将结果在apiweb在线数据库中进行鉴定，所得鉴定结果均为Lactobacillus plantarum 1，其鉴定概率(％id)分别是是99.9％和99.0％，期望值(T)分别是0.90和0.90，均为极好的鉴定结果，因此判定菌株YJG为植物乳杆菌。

实施例2植物乳杆菌菌株YJG的生理生化特性

1效价标准曲线和拟合方程

菌株YJG发酵后离心上清液经二倍稀释法测得在1/128稀释浓度下仍有抑菌活性，而在1/256稀释浓度下没有抑菌活性，得出YJG的抑菌活力是1280AU/mL。

通过一剂量法测定效价值作出标准曲线，测定数据用SAS统计分析得到菌株YJG的效价拟合方程为：

y＝2.8540+0.0862x R²＝0.9392

x-待测样品与中心浓度细菌素液的抑菌圈直径差值

y-待测样品效价值取log10所得值

R²-相关系数

2.生长曲线和效价变化曲线

YJG在起始pH 6.5的MRS培养基中37℃下培养的生长曲线及抑菌活性曲线如图1所示，由图1可见，YJG在培养4h即进入对数生长期，并在14h左右进入平台期，从56h开始进入衰亡期。细菌素的合成与菌体数量并不同步增长，在对数生长后期(8h)细菌素开始产生，进入稳定期后细菌素产量持续增加，稳定中后期(44h左右)细菌素产量达到最大值，达到1325AU/mL，在56h后效价值又急剧减小，可能是由于部分细菌素被发酵液中的某些蛋白酶降解的缘故。起始阶段pH值随着发酵的进行持续降低，在40h小时左右开始进入平稳期，降低程度极小，说明从40h开始乳酸杆菌伴随着生长的停滞，产酸作用也趋于停滞状态。

实施例3乳酸菌素的制备及其抑菌作用

一、乳酸菌素的制备

1.制备种子液

将YJG接入灭菌后的液体培养基中，于30℃培养36小时，得到种子液，其活菌数约为10⁷～10⁹cfu/ml。

所述液体培养基按下述比例配制：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖18g，柠檬酸胺2g，三水合乙酸钠4g，磷酸氢二钾2g，吐温801mL，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04，水1000mL。

2.植物乳杆菌发酵液大规模发酵制备

取豆粕5kg、玉米蛋白3kg、红糖10kg、糖蜜10kg加入到发酵罐中，加水280kg混匀，0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌20分钟，冷却到37℃。按接种量10％接种步骤1得到种子液，混合均匀后在32℃，以2.0vvm的速度通入无菌空气，以250rpm速度搅拌发酵40小时，得到植物乳杆菌发酵液。

3.乳酸菌素的提纯

通过上述乳酸菌发酵方法得到的发酵液经12000转/分钟离心15分钟后取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，添加硫酸铵固体的同时用玻璃棒进行搅拌，直至饱和度达80％，4℃静置过夜，然后将其在10000转/分钟常温条件下离心20～30分钟，得到细菌素沉淀粗提物。将沉淀物溶解于0.10M的磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)，将其进一步采用SephadexG-25凝胶过滤层析进行纯化，凝胶柱用10mM硫酸钠缓冲液(pH7.0)进行预平衡，固定流速0.5ml/min，分段收集，每段2ml，通过抑菌试验检测每段收集液活性，有活性的收集液通过疏水层析进行脱盐，最后通过反相高效液相层析进行进一步纯化，从而得到纯品乳酸菌素，将其命名为LJ-23。

二、植物乳杆菌菌株YJG所产乳酸菌素LJ-23的抑菌活性(LJ-23是一种新蛋白)

乳酸菌素LJ-23对于常见病因菌及动物肠道常见菌的抑菌范围测试结果见表5，结果显示，乳酸菌素LJ-23对革兰氏阴性菌Staphylococcus aureus、Salmonella、E.coli及革兰氏阳性菌L.plantarum、L.brevis、Streptococcus、Bacillus等有抑菌表现，是一具有广谱抑菌活性的细菌素。

表3乳酸菌素LJ-23的抑菌谱

实施例4植物乳酸杆菌YJG发酵条件的初步优化

1、碳源的单因素实验

表4碳源对细菌生长的影响和细菌素产量的影响

碳源因素	添加量(g)	48h的活菌数(cfu)	48h的抑菌圈直径(mm)
				葡萄糖	2	7.63E+11	12.37
蔗糖	1.89	3.30E+10	13.13
				玉米粉	1.71	5.37E+10	7.10

从表格和图例(图2、图3)结果可以看出，不同碳源同样的C源添加量，但是对细菌的生长的影响却差别很大，玉米粉由于有较强的吸附作用，虽然产生较多数量的细菌数量，但是却产生很少的细菌素，很大部分是因为玉米粉的吸附作用，导致细菌素含量的降低。同时，单糖和双糖对细菌素的产生都有较好的效果，但是只有单糖对细菌生长有较好的促进作用。

2、氮源的单因素实验

表5氮源对细菌生长的影响和细菌素产量的影响

氮源因素	添加量(g)	48h的活菌数(cfu)	48h的抑菌圈直径(mm)
				酵母浸粉	3.81	1.04E+12	16.43
豆粕粉	3.42	4.40E+09	8.50
				肽粉	2.13	2.23E+10	13.23

根据三种氮源所含N的比例，分别添加相应比例的氮源保证三种氮源有相同的N的添加量，从表5和图4、图5的结果可见，酵母浸粉的效果最好，不管是对细菌的生长还是细菌素的产生。豆粕粉由于颗粒还是较大，而且不溶于水，所以利用效果不是很理想。

3、刺激因子对乳酸杆菌YJG发酵的影响

本实验中指的刺激因子主要是吐温80，很多文献中报道吐温80对细菌的生长和细菌素的产生均有一定的促进作用，本实验为了确定吐温80的添加量进行设计。

表6吐温80对细菌生长的影响和细菌素产量的影响

吐温80的添加量(％)	48h活菌数(cfu)	48h抑菌圈直径(mm)
			0.1	5.70E+10	15.17
0.2	4.00E+09	15.30
			0.3	2.57E+10	14.67

结果(表6、图6、图7)表明，吐温对细菌生长的影响和细菌素的影响并不成正比，也就是说，当某点达到细菌数量最大的时候，细菌素并一定就是最大值，即细菌数量和细菌素无直接关系。

4、缓冲盐类对乳酸菌YJG发酵的影响

本实验采用正交实验设计(见表7)，选用碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾三种缓冲盐。(结果见图8～10)

表7缓冲盐的正交设计

处理序	碳酸钙(％)	磷酸氢二钾(％)	磷酸二氢钾(％)
				1	0.5	0.1	0.1
2	0.5	0.2	0.15
				3	0.5	0.3	0.2
4	1	0.1	0.1
				5	1	0.2	0.15
6	1	0.3	0.2
				7	1.5	0.1	0.1
8	1.5	0.2	0.15
				9	1.5	0.3	0.2

通过三种缓冲盐的添加，在一定程度上对溶液系统的ph值起到了一定的缓冲作用，从结果可见，处理9添加缓冲盐最多，在很大程度了缓冲的溶液ph值的变化，并使溶液ph值维持在较高水平，但是活菌数却很少，乳酸菌需要达到一定的ph值才能有较大活菌数量，如果pH值因为缓冲液的作用不能降低，会阻碍乳酸菌的生长和繁殖。从图中不难看出，处理7的活菌数达到最大值，但是虽然如此，由于碳酸钙的添加量过多，覆盖在发酵瓶底部，但是从抑菌结果可以看出，碳酸钙并没有影响细菌素的产生或吸附细菌素。所以处理5是较佳选择。

5、PB实验设计

本实验是利用软件design expert进行设计，目的是为了优化工业发酵配方进行因子的初步筛选。选定葡萄糖、氮源A、氮源B、氮源C、吐温80、碳酸钙、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、温度、接种量等11个因素，随机分成12个处理，每个因素两个水平，以抑菌圈直径作为响应值，详细结果见图11。

实施例5使用本发明的乳酸菌素LJ-23对仔猪生产性能的影响

按体重相近，公母各半的原则，选取健康的杜长大三元杂交28日龄断奶仔猪进行试验，采用单因素试验设计，共设5个处理(见表8)，每组3个重复，每个重复6头，共计90头。日粮配制参照NRC(1998)10-20kg体重仔猪的营养需要设计，基础日粮组成(％)为：玉米58.45、豆粕20.0、鱼粉5.0、乳清粉10.0、脂肪酸钙2.0、石粉0.8、磷酸氢钙1.0、食盐0.25、复合酶(仔猪)1.0、预混料1.0、防霉剂0.5(以上比例均为质量百分比)。主要营养指标为消化能13.99MJ/kg、粗蛋白质18.4％、钙0.94％、磷0.68％、食盐0.36％、赖氨酸1.17％。乳酸菌素由中国农业大学饲料生物技术实验室制备，含量为1000AU/mL。复合抗生素(白霉素10％+磺胺二甲嘧啶10％)由拜耳(四川)动物保健有限公司提供。

表8.乳酸菌素LJ-23对仔猪生产性能影响的试验设计

试验在辽宁省锦州晟农牧业种猪场进行，整个试验期为39天，其中预试期4天，正试期35天。试验期间，试验猪只自由采食，自由饮水、少喂、勤添，保持新鲜，每天打扫料槽，记录剩余料量，记录每次倒入料槽的饲料量，每日清底记录剩余料量。腹泻仔猪不使用药物治疗，其它卫生和防疫工作按猪场的常规程序进行。试验结束后，对记录的生产性能、腹泻率、死亡率等数据采用SAS进行统计分析，可以看出(见表9)添加乳酸菌素1000IU、5000IU、25000IU和复合抗生素组的平均末重分别比对照组提高7％、1％、17％和5％(见图12)；平均日增重分别比对照组提高11％、2％、27％和8％(见图13)，其中添加25000IU组能极显著提高猪只的日增重；各组间平均日采食量差异不显著(见图14)；添加乳酸菌素1000IU、5000IU、25000IU和复合抗生素组的料重比12％、4％、15％和14％(见图15)。猪只在试验期间的腹泻和死亡情况如表5，从表中可以看出，整个试验期各重复猪只均无死亡；添加乳酸菌素1000IU、5000IU、25000IU和复合抗生素组的腹泻率显著低于对照组，分别比对照组降低70％、43％、48％和48％，而试验组之间差异不显著(见图16)。

表9.猪只的初始重、末重、日增重及料重比的影响情况

表10.猪只在试验期间的腹泻和死亡情况

实施例6使用本发明的乳酸菌素LJ-23在动物肠道疾病治疗中的应用

将108只30日龄肉仔鸡随机分成A、B、C三组，每组设36只重复。试验前期以拌服致命性鸡白痢沙门氏菌进行攻毒，连续饲喂2d，A组为对照组，在整个试验期不做任何治疗处理，B组为添加本发明的乳酸菌素组，试验期间以在20mg/kg.BW添加到饲料中，早、晚各1次，连续拌服3d，3天后正常饲喂处理，C组为抗生素处理组，以氨基苄青霉素50mg/kg.BW灌服，早、晚各1次，连续3d，3天后正常饲喂处理。整个试验周期为10d，整个过程中观察并记录鸡的患病和死亡情况，试验期结束后进行数据统计分析(见表11)。

表11乳酸菌素LJ-23对肉仔鸡肠道疾病的影响

从试验结果可以看出，乳酸菌素LJ-23对致病菌引起的肠道疾病的防治效果比抗生素较好，能有效的取代抗生素的治疗作用，从食品安全的角度出发，今后的动物肠道疾病治疗中应逐步由具有生物活性的细菌素制剂替代具有药物残留的抗生素产品。

实施例7急性攻毒安全性试验

选取健康48只小白鼠，随机分成4组，每组12只，公母各半，A组为对照组，腹腔注射生理盐水，B、C、D组分别按乳酸菌素0.2g/kg.BW、1g/kg.BW、2g/kg.BW注射，每隔2天注射1次，共饲养60d。小鼠自由采食，每天记录小鼠的采食量、体重并观察中毒症状。

饲养结束时，空腹12h，小鼠用乙醚麻醉后，眼球采血，再取肝、肾、脾、肺，测定全血的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞，血浆的肌酐、尿酸、总蛋白、白蛋白、丙氨酸转氨酶、谷氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶，计算脏器系数并进行小鼠解剖观察和组织病理学检查。

1、检测指标和方法

(1)全血指标：由全自动血球计数仪MEK-6318K测定

(2)血浆指标：全自动生化分析仪RA-1000^TM

(3)脏器系数：脏器湿重/活体重

(4)发酵液的细胞浓度

2、试验结果

(1)乳酸菌素对小鼠脏器系数的影响

对试验动物进行解剖检查是药物毒理试验的常规观察项目，简便易行并能提供重要资料，测定动物死后脏器的湿重是常用的指标之一，可以从标本大概地估计内脏器官病变程度，特别适用于某些可致内脏水肿、实质细胞肿胀、间质纤维组织增生或脏器萎缩等药物的研究。经过60天的饲养，4组小鼠外观和饮食正常，神态健康，无一例死亡，病理检查和微生物分离培养均没发现异常。

由表12可知，各试验组的脏器系数和对照组相比略有提高，但差异不显著(p＞0.05)。由于不同的器官在肌体中担当不同的角色，对同一浓度的注射液反应也不同。B组的肝脏、脾脏、肾脏系数，与对照组相差最多，分别提高了14.5％、28.1％、14.2％；C组的肾脏系数与对照组相差最大，提高了29.1％；而D组的脏器系数几乎是三个注射组中最低的。表明乳酸菌素浓度越高，对各脏器的影响也越大，但剖检并未发现各组的脏器有出血、充血、血栓、硬化、肿瘤及肥大现象，且其它脏器也未见异常，说明乳酸菌素对肝、肾、脾、肺无不良影响。因为在实际应用中，作为饲料添加剂的菌液浓度多为小于或等于10亿个/mL，所以，本试验的新菌株UN2对动物各脏器基本无毒害作用。

表12乳酸菌素对小鼠脏器系数的影响

注：右肩上标有*的为与对照组相比差异显著(p＜0.05)

右肩上标有**的为与对照组相比差异极显著(p＜0.01)

(2)乳酸菌素对小鼠血液指标的影响

如表8所示，注射组的各项检测指标与对照组差异不显著(p＞0.05)。随着乳酸菌素浓度的升高，试验组的白细胞、血小板数量也在增加，且各注射组的白细胞数均比对照组低，这可能是由于白细胞的吞噬作用使自身破坏，死亡的结果，D组的血小板比对照组低了4.6％，但小鼠表皮并没发现紫癜现象；各注射组的淋巴细胞数均比对照组高，说明乳酸菌素增强了机体的特异性免疫力；C、D组的红细胞数量比对照组高，而B组的比对照组低，但B组的血红蛋白在三个组中最高，说明高剂量的乳酸菌素不会影响到红细胞的结合氧的能力。

肌酐为肌酸的代谢产物，由肾小球滤过后，肾小管无任何重吸收而全部从尿中排出，当肾功能正常时，即使血浆中的肌酐来源明显超过正常，由于肾脏的有效排泄，血中的肌酐水平并不增加，当肾功能发生障碍时，血肌酐水平明显升高。尿酸是蛋白质的正常代谢产物，当肾小球的滤过功能降低时，血清中含量增加，提示肾小球损伤。由表14可知，反映小鼠肾功能指标的肌酐、尿酸含量小量升高，但和对照组相比差异不显著(p＞0.05)，说明没达到小鼠肾功能损伤程度，只是肌体代谢加快；白蛋白是血液缓冲系统的组分之一，具有营养作用，是维持血液胶体渗透压的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体，血浆中总蛋白、白蛋白数值有升高趋势，但和对照组相比差异不显著(p＞0.05)；碱性磷酸酶反映胆汁郁积性损害，丙氨酸转氨酶、谷氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶反映肝实质细胞损害，本试验中丙氨酸转氨酶、谷氨酸转氨酶、碱性磷酸酶含量升高，但和对照组相比差异不显著(p＞0.05)，说明肝功能并无破坏，但肌肉代谢加快，乳酸脱氢酶上升较高亦表明小鼠的心肌或肌肉代谢加强。

表13乳酸菌素对小鼠血常规指标的影响

注：右肩上标有*的为与对照组相比差异显著(p＜0.05)

右肩上标有**的为与对照组相比差异极显著(p＜0.01)

表14乳酸菌素对小鼠血浆生化指标的影响

注：右肩上标有*的为与对照组相比差异显著(p＜0.05)

右肩上标有**的为与对照组相比差异极显著(p＜0.01)

脏器系数、血液的生理指标及血浆的生化指标表明，在乳酸菌素浓度高达2g/kg.BW的情况下，已超过实际使用量100倍时，并没有对小鼠的生长、代谢、免疫功能造成损害，仍然是安全的，因此可以认定该制剂在使用安全，毒性级别应属于“安全无毒级”，是一种比较安全的制剂。

实施例8使用本发明的乳酸菌素LJ-23对蛋鸡生产性能的影响

试验选取日龄相近、产蛋率和体重相近、健康状况良好的海兰灰蛋鸡225只，采用单因子完全随机试验设计(见表15)，分5个处理，每个处理5个重复，每个重复9只鸡，乳酸菌素由中国农业大学动物科技学院饲料生物技术教研室制备，日粮配方采用玉米-豆粕-棉粕型蛋鸡日粮，按照海兰灰蛋鸡营养标准配置。

饲养试验在河北凯特集团旗下的金凯牧业有限公司进行。采用密闭式鸡舍，四层立体笼养，同一行连着3个笼(45×40cm)为一个重复，每笼饲养3只鸡。每天早上八点准时喂料一次并定时对水槽进行清理和消毒。试验开始后每天上午八点准时进行喂料，并记录每个重复的喂料量，每天以重复为单位，记录产蛋量、总蛋重、日采食量、死亡淘汰数等(结果见表16)。试验最后一天，从每个重复中随机挑选10枚鸡蛋进行蛋品质的检测，检测与分析指标包括蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数、蛋黄色泽等(结果见表17)。

表15乳酸菌素LJ-23对蛋鸡生产性能影响的试验设计

表16乳酸杆菌素LJ-23对蛋鸡生产性能的影响

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，同列肩标不同大写字母者表示差异极显著(P＜0.05)。

从以上结果看出，与对照组相比，日两种添加乳酸杆菌素均能极显著提高蛋鸡的产蛋率(P＜0.01)，其中，日粮中添加500AU/kg和1500AU/kg的乳酸杆菌素对产蛋率的提升幅度最大。日粮中添加不同水平的乳酸杆菌素对蛋鸡的料蛋比均有不同程度的降低，与对照组相比差异均显著(P＜0.05)。

表17乳酸杆菌素对蛋鸡蛋品质的影响

注：同列没有肩标字母者表示差异不显著。

从上表看出，与对照组相比，添加乳酸菌素对蛋壳强度、蛋形指数、蛋黄色泽、哈氏单位均有不同程度的改善。

Claims

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YJG，保藏号为CGMCC No.2994。

2.由权利要求1所述菌株产生的细菌素。

3.权利要求1所述菌株的发酵培养方法，其包括步骤：

1)种子培养

将植物乳杆菌YJG接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液，

液体培养基的配制如下：蛋白胨9～11g，牛肉膏9～11g，酵母浸粉3～7g，葡萄糖15～20g，柠檬酸胺1～3g，三水合乙酸钠3～6g，磷酸氢二钾1～3g，吐温800.5～1.5mL，硫酸镁0.1～0.2g，硫酸锰0.03～0.06，水1000mL；

2)发酵培养

将步骤1)得到的种子液按接种量1％～15％接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件：30～37℃，通气量0.5～2.5vvm，转速150～300rpm，发酵30～48小时，

所述发酵培养基包括碳氮比为1∶2～20的发酵底物，发酵底物按照与水比为3～20∶100配制成发酵培养基。

4.一种制备权利要求2所述细菌素的方法，其包括如下步骤：

1)制备发酵液：发酵培养权利要求1所述的菌株，得到发酵液；

2)分离细菌素粗品：将得到的发酵液离心沉淀菌体等、取上清，在上清中加硫酸铵至饱和度为80％，4℃下静置8～16小时，离心弃去上清得到细菌素粗品；

3)纯化：将沉淀物溶解于0.10M pH6.8的磷酸盐缓冲液，上经10mMpH7.0硫酸钠缓冲液预平衡的Sephadex G-25凝胶柱，固定流速0.5ml/min，分段收集洗脱液，并收集具有抑菌活性的洗脱峰。

5.权利要求1所述菌株或权利要求2所述细菌素在制备绿色生物兽药或绿色饲料添加剂中的应用。

6.含有权利要求1所述菌株或权利要求2所述细菌素的绿色生物兽药或绿色饲料添加剂。